CN111621429B - 一株高产酯毛榛毕赤酵母及其在木枣果酒发酵中的应用 - Google Patents

一株高产酯毛榛毕赤酵母及其在木枣果酒发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属微生物以及酿酒技术领域，提供了一株高产酯毛榛毕赤酵母及其在木枣果酒发酵中的应用。高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），保藏编号为：CGMCC No.12407，保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，从山西老陈醋的酒醪中分离、筛选得产酯能力较强的酵母菌，经鉴定为毛榛毕赤酵母。发酵后总产酯量为38.52±0.19 g/L，可在乙醇浓度8%（v/v）、pH 2.5~4.5、30 g/100mL葡萄糖质量浓度、最高温度不超过39℃的环境中生存。应用其制成的木枣果酒酒精度为10.5%vol，总酯含量1.68 g/100mL，颜色呈琥珀色，有明显的枣香气，浓郁清新，酒体丰满醇厚，酸甜可口。

Description

一株高产酯毛榛毕赤酵母及其在木枣果酒发酵中的应用
技术领域
本发明属于微生物以及酿酒技术领域，具体涉及一株高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）及其在木枣果酒发酵中的应用。
背景技术
枣（Ziziphus jujube Mill.）为鼠李科枣属植物，落叶灌木或小乔木，原产于中国，已有3000多年的栽培历史。山西省是中国红枣的原产地之一，拥有着丰富的枣种质资源和标志性的地域性特色产品，如太谷的壶瓶枣、吕梁的木枣、运城的冬枣等。其中，吕梁地区是我省木枣的主要栽培区，种植面积约13.33×104 hm2，占全省红枣种植面积的40%；年产量约3×108 kg，约占全省红枣产量的60%。当地市场上的木枣产品多以干枣销售为主，辅以宫枣蜜饯、青枣蜜饯、马牙枣等初级加工产品，贮藏、加工产业链短，产品附加值低。在木枣丰收年，常会面临着产品滞销、销售价格低、入不敷出等问题，大量的木枣甚至无人采摘而烂在了地里，严重影响了枣农种植、管理木枣的积极性。
枣果实不仅味道甘甜、营养丰富，同时也是补中益气、养血安神的常用中药，是集营养与保健于一体的优质滋补品。药食同源的枣果实中除了较多的矿元素和多种维生素外，还含有丰富的氨基酸、黄酮类化合物、酚类化合物、环磷酸腺苷（c AMP）、多糖类物质（水溶性的中性多糖、酸性多糖）等功能性物质，具有清除自由基、延缓衰老的功效，提高机体细胞的免疫活性和抗补体等生理活性。干枣总糖含量为51.4% ~ 66.5%，为酵母菌发酵提供了充足的底物。
发明内容
本发明提供了一株高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），从山西老陈醋酒醪中筛选所得产酯能力强的功能酿造菌，及其在木枣果酒发酵中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一株高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），所述高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），保藏编号为：CGMCC No.12407，保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016.4.28。
所述毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）的筛选方法为：分别采集山西老陈醋发酵发酵3d、5d、15d的酒醪，用传统的纯培养方法进行分离，将分离获得的菌株划线培养于YPD固体培养基上，28℃培养1d后再转接一次；从转接后的平板上挑取菌株，接种于YPD液体培养基中，28℃、120 r/min培养36 h活化菌株；将活化后的酵母菌株按4 %的接种量接入产酯发酵液中，28℃静置培养7 d，测定发酵液中的总酯含量，从中筛选出毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）。
所述产酯发酵液为葡萄糖8 %，酵母膏1 %，蛋白胨2 %；总酯含量测定方法为碱夜皂化法。
所述的高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）在木枣果酒发酵中的应用，具体方法为：（1）去核后的木枣，按照木枣与水的料液比为1:3~1:4加水打浆，加入木枣重量0.02%~0.03%的偏重亚硫酸钾和木枣重量0.1%的抗坏血酸，搅拌均匀后榨汁；（2）80℃保持10 min对木枣果汁进行热处理；冷却至室温后转入发酵罐中，加入木枣重量0.1%~0.15%的果胶酶，将蔗糖熔化成的糖浆煮沸杀菌后加入果浆中，使初始发酵液的糖浓度调整为15 ˚Brix；（3）搅拌均匀，静置8~10 h；控制发酵温度为26~30℃，以发酵液体积为计算基准，接种6~8%高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），有氧发酵24 h；（4）以发酵液体积为计算基准，再接种0.5%的安琪果酒专用酵母有氧发酵24 h，之后封口发酵5d。
所述料液比1:3，高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）的接种量为6%，和安琪果酒专用酵母的接种量为0.5%，发酵温度28℃。
本发明从山西老陈醋的酒醪中分离、筛选获得一株产酯能力较强的酵母菌，经形态学、生理生化和26S rDNA鉴定为毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）。对P. manshurica进行环境耐受性测试，结果表明P. manshurica发酵后的总产酯量为38.52±0.19 g/L，可以在乙醇浓度8%（v/v）、pH 2.5~4.5、30 g/100mL葡萄糖质量浓度、最高温度不超过39℃的环境中生存。将P. manshurica应用于木枣果酒发酵，以发酵液中的酒精含量和总酯含量为指标，通过单因素试验研究料液比、产酯酵母的接种量、发酵温度对酒度和总酯含量的影响，在单因素试验的基础上采用响应面分析，获得的枣果酒发酵工艺为：料液比1:3，P. manshurica和酿酒酵母的顺序接种量分别为6%和0.5%，发酵温度28℃，周期7d。制成的木枣果酒酒精度为10.5% vol，总酯含量1.68 g/100mL，颜色呈琥珀色，有明显的枣香气，浓郁清新，酒体丰满醇厚，酸甜可口。
附图说明
图1为各酵母菌株的产酯量；
图2为菌株Y14的光学显微形态；图中：A为菌株Y14菌落形态图；B为细胞形态图（×400）；
图3为依据26S r DNA基因序列构建的菌株Y14系统发育树；
图4为毛榛毕赤酵母对乙醇的耐受性；
图5为毛榛毕赤酵母对酸度的耐受性；
图6为毛榛毕赤酵母对温度的耐受性；
图7为毛榛毕赤酵母对糖的耐受性；
图8为毛榛毕赤酵母对SO2的耐受性；
图9为初始糖度、接种量和发酵温度交互作用对总酯含量影响的响应曲面及等高。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行具体说明，但本发明的具体实施方式不限于此。
试验中所需要的主要试剂、仪器：
Ezup柱式酵母基因组DNA 抽提试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；
DNA Ladder Mix maker，生工生物工程（上海）股份有限公司；
Fast Pfu 聚合酶、缓冲液、d NTPs，索莱宝生物科技有限公司；
SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；
SanPrep 柱式PCR产物纯化试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；
Dy NA Quant 200浓度测定仪，美国，Pharmacia Biotech；
琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一仪器厂DYY-6C型；
电泳槽，北京六一仪器厂DYCP-31DN型；
凝胶成像系统，英国，UVP；
高速冷冻离心机，德国，Eppendorf 5424；
LS-35LJ型立式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；
DL-CJ-1ND型无菌超净工作台，北京东联哈尔滨仪器设备有限公司；
ZQPL-200型立式恒温振荡培养箱，天津莱玻特瑞设备有限公司；
电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司FA224；
STARER 3100型酸度计，上海奥豪斯仪器有限公司；
孟加拉红培养基、氢氧化钠、无水葡萄糖、浓盐酸、氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂、无水乙醇等。
实施例1：酵母菌的分离、筛选
采用传统的纯培养方法进行分离山西老陈醋酒醪：发酵3d，5d，15d的酒醪。将分离获得的菌株，划线培养于YPD固体培养基上，28℃培养1d后再转接一次。从转接后的平板上挑取菌株，接种于YPD液体培养基中，28℃、120 r/min培养36 h。在150 mL三角瓶中配好80mL产酯发酵液（葡萄糖8 %，酵母膏1 %，蛋白胨2 %），将活化后的酵母菌株按4 %的接种量接入，28 ℃静置培养7 d，测定发酵液中的总酯含量。
在150 mL三角瓶中配好80 mL产酯发酵液，28 ℃静置培养7 d，测定发酵液中的总酯含量。测定方法为碱夜皂化法，按GB 19777-2005操作。3次平行试验，取平均值，为该菌株的产酯量。
根据酵母菌的菌落特征及菌体的镜检结果，从发酵第3 d，5 d和15 d的酒醅中分离筛选出23株酵母，编号 Y1，Y2……Y23，对照菌Y24（安琪生香干酵母）。
各酵母菌株产酯能力测定结果如图1所示：与对照菌株Y24相比，菌株Y2、Y5、Y8、Y14和Y18产酯能力较强。其中，菌株Y14的产酯能力最强，为38.52±0.19 g/L，其次是菌株Y18（36.04±0.28 g/L）和Y5（35.32±0.32 g/L）。
实施例2：菌株鉴定
菌株Y14显微形态特征：菌株Y14在YPD培养基上菌落呈圆形，浅白灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐。在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞卵形、球形，大小为（4.6-6.5）×（3.8-6.5）μm。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。菌株Y14的光学显微形态如图2所示。
菌株Y14的理化特性：表1为菌株Y14的发酵的糖类型、碳源、氮源同化等理化特性试验结果。由表1可知，菌株Y14可以发酵或同化利用葡萄糖、D-甘露醇、琥珀酸、乳酸和甘油，不能发酵或同化利用麦芽糖、乳糖、半乳糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖、可溶性淀粉、纤维二糖、L-鼠李糖、柠檬酸、核糖醇和肌醇等。
表1：菌株Y14的理化特性
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：“+”表示阳性反应，“–”表示阴性反应。
酵母菌26S r DNA的测定和系统发育分析：酵母菌 26S r DNA D1/D2 区域序列的测定由上海生工完成。将待测菌株的26S r DNA序列提交GenBank数据库，使用NCBI的BLAST检测系统（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对序列同源性进行比较分析。采用MEGA 7.0生物学软件绘制构建相关菌株的系统发育树，用Neighbor-Join法进行系统发育树构建（Bootstrap=1000）。
以菌株Y14的总DNA为模板，使用NL1（GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG）和NL4（GGT CCG TGT TTC AAG ACG G ）一对引物扩增菌株Y14的26S rDNA近5′端的D1/D2序列并测序。将序列登陆https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行BLAST比对，结果显示菌株Y14与毛榛毕赤酵母的序列具有很高的相似性，达到99%。系统发育树如图3所示。
以Rhodotorula diobovata菌株为外群，通过多序列比对，以邻接法构建进化。结果表明，菌株Y14与毕赤酵母属各菌株的遗传距离较近，而与其它酵母的进化关系较远，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假丝酵母（Candida humilis）。
综合菌株Y14的菌落、显微形态、理化特性及系统发育分析结果，将其初步鉴定为毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），编号： 12407。
实施例3：毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）的环境耐受性分析
1、产酯酵母的环境耐受性分析：酒精发酵中，产酯酵母的生长及其发酵性能与多种因素有关，如发酵液的乙醇含量、pH、发酵温度、含糖量及SO2含量等。环境耐受性分析主要包括酵母菌对酒精度、温度、酸度、糖度的耐受性，试验均以YPD 液体培养基为基础，根据所需测定条件的不同调整培养基中的成分，培养3d，离心后根据菌体湿重来判断其对特定环境的耐受程度。每个梯度重复3次，取平均值。
2、耐乙醇性能测定：将乙醇浓度梯度为0%、6 %、8 %、10 %、12 %的YPD 培养基分装试管，每管10 mL，接种活化后酵母菌悬液0.3 mL，28℃培养24h。使用紫外可见分光光度计仪，以未接种的YPD液体培养基做空白对照，测定不同乙醇浓度下酵母的OD630值。
乙醇是酒精发酵阶段最重要的物质之一，是酵母菌的主要代谢产物。发酵液中乙醇含量的积累也会对参与发酵的微生物产生一定的抑制和毒害作用，菌株的乙醇耐受力与乙醇产率密切相关，可以将其作为筛选高产乙醇酵母的一个参考依据。耐乙醇性能测定结果如图4所示，毛榛毕赤酵母对乙醇的耐受性，随着酒精体积分数增大，其生长逐渐受到抑制。当酒精度在0%~6%之间时，OD630值呈缓慢下降趋势，此时的酒精度基本不影响毛榛毕赤酵母的正常生长；当酒精度达到8%时，OD630值降为0.68，表明菌株Y14的生长受到抑制，生长较缓慢；当酒精度超过8%后，OD630值迅速降低，菌株Y14的生长受到严重抑制，基本不生长。由上可知，毛榛毕赤酵母的最高耐受酒精度为8%。
3、耐高温性能测定：接种活化后酵母菌悬液3%于含10 mL YPD培养基试管中，分别置于28 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42℃和45℃条件下培养24h，测定方法同上。
酵母菌是典型的嗜温型生物，生长温度在20~40 ℃之间，最适生长温度不超过40℃。菌株Y14的温度耐受性如图6所示，当温度在28~30 ℃时，OD630值基本保持平稳，该温度区间适合菌株Y14的生长繁殖；当温度在30~39 ℃时，OD630值呈持续下降趋势，表明菌株Y14的生长受到了影响，随着温度的升高，菌株的繁殖明显减弱；当温度超过42℃后，可能由于高温导致酶失活，细胞新陈代谢减弱，菌体的生长繁殖基本停止。由上可知，毛榛毕赤酵母的最高耐受温度为39℃。
4、耐酸性能测定：将pH梯度为4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0的YPD 培养基分装试管，每管10 mL，接种量为3 %，于28 ℃培养24h，测定方法同上。
山西老陈醋是我国传统的谷物酿造醋，是自然富集的多菌种共同发酵的过程，含有丰富的微生物资源。随着酒化时间的延长，酒醪的pH值逐渐降低，至发酵结束时，pH值由发酵初期的3.92降至3.22，这就要求参与发酵的微生物，必须具有一定的耐酸性。结果如图5所示，菌株Y14先到达适宜生长的最佳pH值，随着pH的继续降低其生长繁殖逐渐受到抑制。当pH值在3.5~4.5之间时，OD630值呈逐渐上升趋势，且在pH3.5时达到峰值，表明该pH值范围适合菌体的生长；当pH值在2.5~3.5之间时，OD630值开始降低，表明菌株Y14的生长受到抑制，生长较缓慢；当pH值在2~2.5之间时，OD630值迅速降低，菌株Y14的生长受到严重抑制，基本不生长。由上可知，毛榛毕赤酵母的最佳培养pH为3.5，可以耐受的pH区间是2.5~4.5。
5、糖度耐受性试验：培养基葡萄糖浓度梯度为10 %、15%、20 %、25%、30 %、35 %，培养测定方法同上。
果酒酿造过程中，糖是酒精发酵的底物，也是酵母菌赖以生存的根本。在一定范围内，酵母的发酵能力随着糖浓度的增大而增强。但是，过高浓度的糖会对酵母菌的生长产生抑制作用，同时，高渗透压也会造成酵母细胞的水分流失，致使其活性降低。毛榛毕赤酵母对不同质量浓度葡萄糖的耐受性如图7所示，随着葡萄糖质量浓度的升高，其耐受性先升高后降低。菌株Y14对葡萄糖的耐受性较好，OD值随着葡萄糖浓度的升高而增大，当浓度超过30%的时候其吸光度值才开始下降。山西老陈醋的糖化阶段，还原糖含量通常不会超过20g/100mL，而果酒酒精发酵阶段的初始糖浓度一般不会超过25 g/100mL（按葡萄糖计），毛榛毕赤酵母在该葡萄糖浓度下所受的抑制很小，在果酒酿造上有一定的应用潜力。
6、耐 SO2能力测定：YPD 培养基灭菌之后加入6 % H2SO3，将活化后的酵母菌株以3%的接种量分别接种初始SO2浓度为0 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300mg/L的YPD 培养基分装试管，28℃培养24h，3次重复。测定方法同上。
YPD液体培养基（g/L）：酵母浸粉10 g、蛋白胨20g、葡萄糖20g。
果酒发酵前期通常需加入适量的SO2，达到防止杂菌污染、抗氧化以及护色等目的，但较高浓度的SO2对发酵主体微生物也有一定的抑制作用。由图8可知，随着SO2浓度的升高，菌株Y14的生长逐渐受到不同程度的抑制。菌株Y14在含有0~150 mg/L SO2的培养液中生长24h后，OD630值略有下降，表明菌株Y14的生长繁殖基本不受影响；当SO2浓度在150~250mg/L时，OD630值迅速降低，表明其生长受到较大程度的抑制；当SO2浓度超过250 mg/L时，生物量基本为零，表明其生长受到严重抑制。果酒发酵初期会添加60~100 mg/L的SO2以抑制或杀死其他杂菌，保证发酵的正常进行，毛榛毕赤酵母在这个范围内基本不受影响，能够正常发挥其生理功能。
实施例4：P. manshurica在木枣果酒中的应用
（1）木枣打浆及酶解处理：木枣产地为吕梁地区。选取新鲜、无病虫害的成熟木枣，清洗，去核，称重。加水打浆，加入木枣重量0.02%~0.03%的偏重亚硫酸钾和木枣重量0.1%的抗坏血酸，搅拌均匀后榨汁。80℃保持10 min对木枣果浆进行热处理。冷却至室温后转入发酵罐中，加入果胶酶，酶制剂用量为木枣质量的0.1%~0.15%，搅拌均匀，静置8~10 h。
（2）调整糖度：将蔗糖熔化成的糖浆煮沸杀菌后加入果浆中，使初始糖浓度达到15˚Brix。
（3）酒精发酵工艺：先接种6%的产酯酵母，有氧发酵24 h，再接种0.5%安琪果酒专用酵母有氧发酵24 h，之后封口发酵5 d。以发酵液中的酒精含量和总酯含量为指标，通过单因素试验研究料液比、产酯酵母的接种量、发酵温度对酒度和总酯含量的影响，然后利用正交试验优化，确定木枣果酒的最佳发酵工艺。
（4）调配：发酵完成后，过滤得到澄清液，用蜂蜜、木枣果汁调制成口感良好、风味独特的木枣果酒。
（5）过滤、杀菌、灌装：调配好的山楂经0.02微米的滤芯除菌过滤，在60~70 ℃下加热 15~20 min 进行巴氏杀菌，最后静置陈酿一段时间，经检验合格进行无菌灌装。
酒精度的测定：采用蒸馏法测定。
数据处理：采用MEGA 7.0生物学软件和Design Expert软件进行实验设计及数据分析。
1、料液比对木枣果酒发酵的影响：原料处理基本同上，不同的是将料液比分别设置为1:2、1:3、1:4、1:5和1:6（初始发酵糖度调整到15%），顺序接种6%的P. manshurica和0.5%安琪果酒专用酵母，置于28℃的环境中进行酒精发酵，周期7 d。同时每天取发酵液检测其酒精含量、总酯含量和糖度。当测得糖度不再降低时，酒精发酵结束。
表 2 料液比对木枣果酒发酵的影响
Figure 388363DEST_PATH_IMAGE002
注：数据差异性分析为0.05水平
由表2可知，5组料液比经过相同的发酵时间后，无论是酒度，还是枣酒的风味口感具明显的差异。当料液比为1:2时，枣酒的酒度最高，达11.2%（v/v），发酵液的果香浓郁，口感偏苦；当料液比为1:3~1:4时，枣酒的酒度在8.8%~10.6%（v/v）之间，总酯含量为1.48~1.64 g/100mL，有浓郁的枣香气和协调的酒香，酒体丰满，酸甜适口；料液比为1:5~1:6时，枣汁浓度较低，发酵而成的枣酒酒度在4.8%~6.2%（v/v）之间，枣香酒香较淡，酒质较粗糙。综上，木枣果酒发酵的适宜料液比范围是1:3~1:4。
2、温度对木枣果酒发酵的影响：选择料液比为1:3，顺序接种6%的P. manshurica和0.5%安琪果酒专用酵母，分别于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃的温度下进行酒精发酵，周期7 d。每天取样测定发酵液中的酒精及总酯含量并记录数据。
表 3 不同发酵温度对木枣果酒发酵的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注：数据差异性分析为0.05水平
低温更有利于产酯酵母发酵，从而提高果酒品质；但是温度过低也会影响酵母的繁殖和代谢速度。从表3可以看出，当发酵温度在24~26℃区间时，发酵液中的酒精含量偏低，为7.6~8.9%（v/v），枣香浓郁，酒香较淡，口感偏甜；当发酵温度在28~32℃区间时，发酵液中的酒精含量为10.8~11.2%（v/v），总酯含量为1.42~1.68 g/100mL，果香、酒香愉悦和谐，滋味可口，无苦味。26~28℃发酵条件下的总酯含量明显高于32℃发酵温度下的，推测可能是略低的发酵温度适合酯类物质的生成。当发酵温度达到30℃时，发酵后的木枣果酒酒度最高，达11.2%（v/v）。
3、P. manshurica接种量对木枣果酒发酵的影响：在料液比为1:3，发酵温度28℃的条件下，分别顺序接种2%、4%、6%、8%、10%的P. manshurica和0.5%的安琪果酒专用酵母进行酒精发酵，周期7 d。每天取样测定发酵液中的酒精及总酯含量并记录数据。
表 4 不同接种量对木枣果酒发酵的影响
Figure 305503DEST_PATH_IMAGE004
注：数据差异性分析为0.05水平
由表4可知，P. manshurica接种量过低，发酵启动慢，24 h后接种的安琪果酒专用酵母快速繁殖成为优势菌，会对P. manshurica的生长繁殖产生竞争性的抑制作用，发酵液中也会积累大量的酒精，抑制了毛榛毕赤酵母的繁殖及代谢，不利于提高发酵液中的总酯含量；当接种量为6~8%时，木枣果酒的酒精度为10.0~10.2%（v/v），总酯含量为1.64~1.68g/100mL，果香、酒香愉悦和谐，口感较好。继续加大接种密度，一方面酵母快速繁殖消耗了大量的营养物质，酒体含糖量降低，另一方面可能会导致发酵液中溶氧不足，进而对酵母菌的生长繁殖产生抑制作用，不利于香气物质的形成，导致口感变差。因此，P. manshurica的适宜接种量为6~8%。
4、发酵时间对木枣果酒发酵的影响：在料液比为1:3，发酵温度28℃的条件下，顺序接种6%的P. manshurica和0.5%的安琪果酒专用酵母进行酒精发酵，发酵周期分别设置为5 d，6 d，7 d，8d和9d。
表 5 不同发酵时间对木枣果酒发酵的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
注：数据差异性分析为0.05水平
由表5可以看出，不同发酵时间对果酒酒精含量的影响不大。当发酵时间为5~6 d时，木枣果酒中的果香和酒香较淡，酒味略重，口感较差，表明发酵不彻底，果酒中的风味物质尚未完全生成；当发酵时间为7 d时，木枣果酒中的总酯含量为1.62 g/100mL，果香和酒香逐渐协调一致，酒体丰满，酸甜可口，同时果酒的酒度达到最大值11.0%（v/v）；随着发酵时间的继续延长（9 d），木枣果酒的酒度略有所降低，此时应结束发酵。同时，考虑到发酵时间对木枣果酒酒度的影响并不明显，故而在响应面试验中发酵时间不作为考察因子进行考虑。
5、响应面优化木枣果酒发酵工艺
(1) 回归模型的建立及方差分析：根据单因素试验结果，设定因素的水平，选择料液比（A）、P. manshurica接种量（B）和发酵温度（C）三个因素，以发酵结束时的酒精含量（Y1）和总酯含量（Y2）为响应值，利用软件Design-Exper 8.0.6的Box-Behnken试验设计3因素3水平的响应面设计。响应面因素和水平见表6。
表6 木枣果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平
Figure 512670DEST_PATH_IMAGE006
响应面试验设计及结果见表7，方差分析见表8。
表7 木枣果酒响应面试验设计及结果
Figure DEST_PATH_IMAGE007
采用软件Design-Exper 8.0.6对表7的数据进行分析和推算，得到回归方程为：
Y1=10.76+0.73A-0.70B-0.17C-0.28AB+0.37AC-0.37BC-0.97A2-0.12B2+0.48C2；
Y2=1.57+0.30A+0.11B+0.22C-0.06AB+0.052AC-0.053BC-0.35A2-0.24B2+0.084C2。
由表8回归方程的方差分析结果可知，两个模型均极显著（P＜0.01），且失拟项均不显著（P=0.29/0.055>0.05），说明此两个模型是可靠的；变异系数 CV=2.09%较小，说明试验操作可信；酒精度和总酯含量的校正决定系数R2 Adj=0.9485/0.9000，表明94.85%/90.00%的响应值变化是由所选变量引起的，相关系数R2=0.9775/0.9562与R2 Adj较接近，说明模型拟合程度较好，误差较小，采用响应曲面法优化建立的木枣果酒发酵工艺回归方程（模型）是有效的。
表8 响应面模型方差分析结果
Figure 845562DEST_PATH_IMAGE008
注：** 为差异极显著（P ＜ 0.01）； * 为差异显著（P ＜ 0.05）；ns为不显著
以酒精度为响应值时，一次项A、B和二次项A2、C2影响极显著（P＜0.01），交互项AB、AC、BC影响显著（P＜0.05），由F检验可以得到因子贡献率为A＞B＞C；以总酯含量为响应值时，一次项A、C和二次项A2、B2影响极显著（P＜0.01），一次项B影响显著（P＜0.05），由F检验可以得到因子贡献率为A＞C＞B。
响应曲面分析：三种因素对指标影响的响应面结果见图9。由图可直观地看出料液比、P. manshurica接种量和发酵温度的交互作用对酒精含量（Y1）和总酯含量（Y2）的影响程度。响应面的陡峭程度，表示两个因素之间的交互作用是否明显。在Y1模型中AB、AC、BC交互作用显著，等高线呈现椭圆形，存在极值，曲面较为陡峭，交互作用显著；在Y2模型中，AB、AC、BC交互作用不显著。
（3）通过Design-Expert 8.0.6软件得到的木枣果酒最优发酵条件为料液比1:2.8，毛榛毕赤酵母接种量6.2%，发酵温度28.3℃，木枣果酒的酒精含量为10.6% vol，总酯含量为1.67 g/100mL。实际发酵中为操作方便调整为料液比1:3，顺序接种毛榛毕赤酵母6%、安琪果酒酵母0.5%，发酵温度28℃，发酵周期7d，在优化得出的最佳条件下做3次平行试验进行验证，获得木枣果酒的酒精含量为10.5% vol，总酯含量为1.68 g/100mL，与理论预值接近。
结论：
本发明从山西老陈醋酒醪中共分离到的23株酵母菌，对其进行产酯性能测试，初筛出5株产酯能力高的菌株。产酯能力最强的菌株Y14经鉴定后为P. manshurica，对其进行环境耐受性分析后，结果表明菌株Y14发酵后的总产酯量为38.52±0.19 g/L，可以在乙醇浓度8%（v/v）、最佳培养pH为3.5（可以耐受的pH区间是2.5~4.5）、30 g/100mL葡萄糖质量浓度、最高温度不超过39℃的环境中生存。
将P. manshurica应用于木枣果酒发酵，在单因素试验的基础上采用响应面分析获得的木枣果酒发酵工艺为：料液比1:3，P. manshurica和酿酒酵母的顺序接种量分别为6%和0.5%，发酵温度28℃，周期7d。制成的木枣果酒酒精度为10.5% vol，总酯含量1.68 g/100mL，颜色呈琥珀色，有明显的枣香气，浓郁清新，酒体丰满醇厚，酸甜可口。

Claims (2)

1.高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）在木枣果酒发酵中的应用，其特征在于：所述高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），保藏编号为：CGMCC No.2.5274，保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016.4.28；
所述毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）的筛选方法为：分别采集山西老陈醋发酵3d、5d、15d的酒醪，用传统的纯培养方法进行分离，将分离获得的菌株划线培养于YPD固体培养基上，28℃培养1d后再转接一次；从转接后的平板上挑取菌株，接种于YPD液体培养基中，28℃、120 r/min培养36 h活化菌株；将活化后的酵母菌株按4 %的接种量接入产酯发酵液中，28℃静置培养7 d，测定发酵液中的总酯含量，从中筛选出毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）；
所述产酯发酵液为葡萄糖8 %，酵母膏1 %，蛋白胨2 %；总酯含量测定方法为碱夜皂化法；
具体应用方法为：（1）去核后的木枣，按照木枣与水的料液比为1:3~1:4加水打浆，加入木枣重量0.02%~0.03%的偏重亚硫酸钾和木枣重量0.1%的抗坏血酸，搅拌均匀后榨汁；（2）80℃保持10 min对木枣果汁进行热处理；冷却至室温后转入发酵罐中，加入木枣重量0.1%~0.15%的果胶酶，将蔗糖熔化成的糖浆煮沸杀菌后加入果浆中，使初始发酵液的糖浓度调整为15°Brix；（3）搅拌均匀，静置8~10 h；控制发酵温度为26~30℃，以发酵液体积为计算基准，接种6~8%高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica），有氧发酵24 h；（4）以发酵液体积为计算基准，再接种0.5%的安琪果酒专用酵母有氧发酵24 h，之后封口发酵5d。
2.根据权利要求1所述的高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）在木枣果酒发酵中的应用，其特征在于：所述料液比1:3，以发酵液的体积为计算基准，高产酯毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）的接种量为6%，安琪果酒专用酵母的接种量为0.5%，发酵温度28℃。
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