CN105349444B - 一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，属于生物工程技术领域。所述菌株为异常威克汉姆酵(Wickerhamomycesano malus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10370。本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0；耐盐性为0～15％(NaCl％)；耐乙醇性为0～10％(v％)，发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发明菌株可作为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发酵行业及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同时增加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。
Description
技术领域
本专利属于生物工程技术领域，具体涉及一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应用。
背景技术
产酯酵母又称生香酵母，不是酵母分类学上的名词，是指可生成较多量酯类物质的酵母的通称，分属于汉逊酵母属、产朊酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等。酯属于一种有机化合物，低级酯是一类具有香气的挥发性液体。产酯酵母大多是一些野生酵母，它们在自然界中分布较广，在酿造工业的原料、制造工序以及制成品中都有不同程度的体现，在我国酿造行业中占有举足轻重的地位，被广泛用于白酒、黄酒、葡萄酒、酱油、豆瓣、甜面酱、食醋等传统发酵食品，是产香的主要菌种之一。
从20世纪60年代开始，产酯酵母便已用于白酒生产，弥补了白酒香气不足和后味较淡的缺点。产酯酵母不但适于液体培养，也适于半固态和固态培养。据报道，当前大多产酯酵母在温度为25～30℃，尤其是28℃时总酯生成量最高。专利号CN102199556A中公开一种高产酯酿酒酵母基因工程及其构建方法，专利号CN102586125A中公开的一株高产酯的东方伊萨酵母菌、其组合物及应用，专利号CN103184167A中公开的一株异常威克汉姆酵母及其应用，这些专利中涉及的菌株均为高产乙醇、乙酸乙酯的菌株，但产酯温度都偏高(25～28℃间)，此外以上报道菌株的代谢产物种类多，在实际应用中，不利于突出产品的特有风味。对于低温条件下产酯高、且代谢产物单一的酵母，尚未见报道。而在发酵食品生产过程中，生产企业为了增加产品的风味物质含量，大多都采用提高发酵温度以创造有利于在较高温度下才能合成酯类物质的微生物的生长环境，可见，产酯酵母发酵温度高，带来的后果是增加工艺难度，能耗增加，生产成本高。
发明内容
为了解决上述发酵食品生产过程中发酵温度高带来的工艺难度大、能耗增加、生产成本高、代谢产物种类多等问题，本发明提供一种耐酸、耐盐、耐乙醇、在低温条件下即能高产乙酸乙酯的酵母菌，本发明目的通过下述技术方案来实现：
一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10370。
作为本发明的一种优选，所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0，耐盐性为0～15％(NaCl％)，耐乙醇性为0～10％(v％)。
作为本发明的一种优选，所述菌株的筛选方式为：将曲药、酿造醅或酿造原料用研钵研磨后称取10g至100mL无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min，稀释涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液酯含量，筛选获得产酯能力强的菌株。
作为本发明的一种优选，所述产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20％、葡萄糖2％、酵母膏1％，琼脂2％、三丁酸甘油酯0.4％，用去离子水配制，自然pH，28～30℃培养1～3天，根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
作为本发明的一种优选，所述摇瓶发酵培养条件为：将大米或麦芽糖化液与麸皮浸提液按照体积比为5-9:3的比例进行配置，调节PH至5.0，在25-35℃，150rpm条件下摇瓶培养24-120h。
作为本发明的一种优选，所述大米或麦芽糖化液的制备为：50g大米或麦芽样品经粉碎后，加2-6倍体积的水，蒸煮0.5-2h，呈糊状，冷却后以每克原料4～8U的量加入糖化酶α-淀粉酶，于60℃水浴0.5-2h，液化完成后用1mol/L的盐酸调节pH至4.0，然后以每克原料40～100U的量加入糖化酶，60℃水浴，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即为大米汁或麦芽汁。
作为本发明的一种优选，所述麸皮浸提液的制备为：称取400g麸皮并加入1-5倍水，90℃水浴1-2h，冷却过滤，滤液即为麸皮浸提液。
本发明还公开了所述菌株在传统发酵行业和食品工业中的应用。
作为本发明的一种优选，所述菌株在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等行业中的应用。
本发明的有益效果：本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0；耐盐性为0～15％(NaCl％)；耐乙醇性为0～10％(v％)，在低温条件下即能使产酯量达到最大，且发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发明菌株可作为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发酵行业及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同时增加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。
附图说明
图1为酵母菌Njsys-HD1的26S rDNAD1/D2区序列系统发育树；
图2为酵母菌Njsys-HD1代谢产物图；
图3乙酸乙酯质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1产酯酵母菌的筛选
将曲药、发酵醅用研钵研磨后分别称取10g至100ml无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min即为菌悬液，进行十倍系列稀释，将稀释液涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株。再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，采用HS-SPME-GC-MS方法测定发酵液酯种类，利用GB/T 10345—2007规定的白酒总酯的测定方法测定发酵液乙酸乙酯含量，筛选获得产乙酸乙酯能力强的菌株。
产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20％(质量百分比，下同)、葡萄糖2％、酵母膏1％，琼脂2％、三丁酸甘油酯0.4％，用去离子水配制，自然pH，28℃培养2天，根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
摇瓶发酵培养的具体过程如下：
①、大米汁发酵培养基的制作：50g大米经粉碎后，加入4.5倍体积的水，蒸煮1h，呈糊状，冷却后以每克原料6U的量加入α-淀粉酶，于60℃水浴1h，液化完成后用1mol/L的盐酸调节pH至4.0，然后以每克原料80U的量加入糖化酶60℃，60℃水浴，直至碘试不显蓝色为止，后煮沸灭酶，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即大米汁备用。
②、麸皮浸提液的制备：称取400g麸皮并加入5倍水，90℃水浴1h，冷却过滤，收集滤液备用，滤液即为麸皮浸提液。
③、摇瓶发酵培养：将麸皮浸提液添加到大米汁发酵培养基中，大米汁与麸皮浸提液的体积比为7:3，调节PH至5.0，在28℃，150rpm的条件下，摇瓶培养24h。
发酵液酯种类的测定：采用HS-SPME-GC-MS方法测定，15mL顶空瓶中加入5～10mL澄清发酵液及1～5gNaCl，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为：三相(Car/DVB/PDMS)萃取头，60℃预热5～10min，萃取吸附30～50min，GC解吸3～10min。发酵液酯种类的测定结果如图2，图3所示。
实施例2产乙酸乙酯酵母菌及其分子生物学鉴定
对获得的产乙酸乙酯酵母菌进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物分别扩增菌株的26SrDNA片段，经凝胶电泳检测。随后进行测序比对，确定所筛得酵母的种属。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母种属及保藏编号为：异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CGMCC NO：10370。
酵母菌的种属确认过程如下：
分离菌株的26SrDNA序列同源性鉴定：酵母菌DNA的提取:将酵母菌活化后接种在液体YPD培养基中，28℃摇床培养12h后，取少量菌体到灭菌的1.5mL EP管中，加入500ulCBTA缓冲液和50ul蜗牛酶(100mg/ul)，37℃，225r/min，震荡2h后，加入100ulSDS，接着在65℃水浴15min和-80℃冰浴20min，反复冻融3次之后，加等体积氯仿酚异戊醇(25:24:1，v/v/v)震荡1min，静置10min，12000g离心10min，取上清液到新的无菌EP管中，取上清液450ul到新的EP中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，常温静置1h后，20℃，13000g离心20min，完成后，弃上清液，加入1ml 70％乙醇，静置10min后4℃，13000g离心15min，弃乙醇溶液(重复洗涤2次)，吹干至无醇味，加入50ul无菌双蒸水，65℃水浴1h，最后琼脂糖电泳检测DNA有无。
26SrDNA基因的扩增：对所提的总DNA进行26Sr DNA的PCR扩增，扩增反应的引物为一对通用引物，正向引物为NL-1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')，反向引物为NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')。
PCR反应体系(50uL)为：无菌超纯水33.5ul，10×PCR Buffer 5ul，dNTP 4ul，Mg2+3ul，两个引物各1ul(10uM/ul)，Taq酶0.5ul，模板1ul。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min，最后通过140V电泳20min检测结果。并寄往上海杰李生物技术公司测序。
数据分析：将扩增序列与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对，找出与克隆子序列同源性最高的序列，用于构建系统发育树和确定其分类地位。DNA MAN软件对齐序列，Mega6.0软件的邻位法(Neighbor-joining)构建系统发育树，系统发育树采用Neighbor-Joining(邻位相接)算法、Boottrap 1000次计算，结果如图1所示。Njsys-HD1菌株与Wickerhamomyces·sp在进化树一个分枝上，与Wickerhamomyces anomalus种的菌株在一个类群内而与其他种处于不同的分枝。因此该菌株为异常威克汉姆酵母。
实施例3酵母菌株的耐酸性能试验
调节YPD液体培养基pH至1.0-7.0，以pH 0.5梯度递增，每个梯度做三个平行，接种10％(V/V)酵母菌悬液，在30℃，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。菌株耐酸性结果如下表1所示。
表1菌株耐酸性能(OD600值)
| pH | 2.0 | 2.5 | 3.0 | 3.5 | 4.0 | 4.5 | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 |
| OD600 | 0.002 | 1.085 | 1.291 | 1.341 | 1.335 | 1.403 | 1.403 | 1.425 | 1.421 | 1.417 | 1.433 |
表1表明菌株在pH 2.5时OD600达到1.085，说明在pH2.5的环境下菌株能正常生长，
且随着pH的增大，菌株在酸性环境下仍能很好的生长。但当pH为2.0时，OD600值为0.002，菌株生长受到限制。从本实施例得出本发明酵母菌菌株的耐酸性为pH2.5～7.0。
实施例4酵母菌株的耐盐性能试验
调节YPD液体培养基NaCl浓度为2％、4％、9％、12％、15％、18％(m/V)，每个梯度做三个平行，接种10％(V/V)酵母菌悬液，在30℃下，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。以未添加NaCl的YPD液体培养基为空白，菌株耐盐性能如下表2所示。
表2菌株耐盐性能(OD600值)
| 盐浓度(％) | 0％ | 3％ | 6％ | 9％ | 12％ | 15％ | 18％ |
| OD600值 | 1.754 | 1.673 | 1.526 | 1.309 | 1.186 | 0.105 | 0.008 |
表2表明，在盐度为0％～15％时，菌株能正常生长，当盐度大于15％后OD600减小到0.008，说明当盐度大于15％，菌株不能很好的生长。本实施例得出本发明酵母菌耐盐范围为0％～15％(NaCl％)。
实施例5酵母菌株的耐乙醇性能试验
调节YPD液体培养基乙醇浓度为0％，2％，4％，6％，8％，10％，12％(V/V)，并接种10％(V/V)酵母菌悬液，每个梯度做三个平行，并做一个空白，加入等体积的无菌水代替菌悬液，在30℃，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。菌株耐乙醇性能如下表3所示。
表3菌株耐乙醇性能(OD600值)
| 乙醇浓度(％) | 0％ | 2％ | 4％ | 6％ | 8％ | 10％ | 12％ |
| OD600值 | 1.931 | 1.644 | 1.600 | 1.406 | 0.905 | 0.366 | 0.046 |
表3表明，当乙醇浓度在0％～10％时，OD600有吸光度值，菌株能正常生长。当乙醇浓度大于10％上升为12％使，OD600降低为0.046，说明当乙醇浓度大于10％时，会使菌株的生长受到限制。本实施例表面本发明菌株的耐乙醇范围为0％～10％。
实施例6酵母菌株温度耐受性试验
接种10％(V/V)酵母菌悬液于YPD液体培养基，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，150r/min条件下培养24h，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。菌株温度耐受性如下表4所示。
表4菌株温度耐受性试验(OD600值)
| 温度(℃) | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 |
| OD600值 | 1.714 | 1.755 | 1.624 | 0.319 | 0.015 |
表4表面，当温度在25～40℃时，OD600有吸光度值，菌株能正常生长。当温度大于40℃达到45℃时，OD600降低为0.015，说明当温度大于40℃时，会使菌株的生长受到限制。本实施例表面能使本发明菌株生长的最高温度为40℃。
实施例7酵母菌株产酯条件的确定
1.最适产酯温度的确定：
灭菌大米培养基(50mL)中接种10％(V/V)酵母菌悬液，分别放于16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃静置培养4d，将发酵液用于产酯测定。不同温度下菌株的产酯量如下表5所示。
表5不同温度下菌株的产酯量
| 温度(℃) | 16 | 19 | 22 | 25 | 28 | 31 | 34 |
| 产酯量(g/L) | 2.61 | 5.29 | 6.26 | 5.23 | 2.21 | 1.14 | 0 |
通过在16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃不同温度下菌株产酯量的对比可以看出，菌株在22℃时的产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯温度为22℃。
2.最适产酯pH的确定：
灭菌大米培养基(50mL)加入已灭菌的1mol/L的盐酸或者强氧化钠溶液调节pH，使其pH分别为2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，并接种10％(V/V)酵母菌悬液，于22℃置培养4d，将发酵液用于产酯量测定。不同pH值下菌株的产酯量如下表6所示。
表6不同pH值下菌株的产酯量
| pH值 | 2.5 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 |
| 产酯量(g/L) | 5.60 | 6.63 | 4.77 | 3.95 | 2.36 | 1.75 |
通过在2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0不同pH值下菌株产酯量的对比可以看出，菌株在pH为3.0时产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯pH为3.0
3.最适的产酯供氧量确定：
灭菌大米培养基(50mL)中接种10％(V/V)酵母菌悬液，在22℃、pH为3.0的条件下，分别放于0r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min条件下摇床培养4d，分别测定各发酵液产酯情况。菌株在不同供氧量条件下的产酯量如下表7所示。
表7菌株在不同供氧量下的产酯量
| 供氧量(r/min) | 0 | 60 | 120 | 180 | 240 |
| 产酯量(g/L) | 7.89 | 0.25 | 1.82 | 6.34 | 1.40 |
通过在0r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min不同供氧量下菌株产酯量的对比可以看出，菌株在供氧量为0r/min，即静置条件下的产酯量最好。
从上述产酯温度、PH及供氧量可以看出，当菌株在温度22℃，pH3.0，静置条件下其产酯量能够达到最好，为最佳产酯条件。
实施例8异常威克汉姆酵母Njsys-HD1在生产中的应用
以生产米酒和制醋酒化阶段所用的酿酒酵母为对照：在大米汁培养基(pH3.0)中分别接种1％(v/v)的酿酒酵母菌悬液和本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1菌悬液，放置于22℃的培养箱，静置培养4d，分别测定发酵的总酯含量。
结果表明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1的发酵液与酿酒酵母菌发酵液中的总酯含量分别为7.89g/L和0.23g/L，本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1的产酯量能达到常规酿酒酵母的34.4倍，具有优良的产酯效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10370；所述酵母菌产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0，耐盐性为耐质量分数为0~15%的NaCl，耐乙醇性为耐体积分数为0~10%的乙醇。
2.如权利要求1所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌的筛选方式为：将曲药、酿造醅或酿造原料用研钵研磨后称取10g至100mL无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min，稀释涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液酯含量，筛选获得产酯能力强的菌株。
3.如权利要求2所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20%、葡萄糖2%、酵母膏1%，琼脂2%、三丁酸甘油酯0.4%，用去离子水配制，自然pH，28～30℃培养1～3天，根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
4.如权利要求2所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述摇瓶发酵培养条件为：将大米或麦芽糖化液与麸皮浸提液按照体积比为5-9:3的比例进行配置，调节PH至5.0，在25-35℃，150rpm条件下摇瓶培养24-120h。
5.如权利要求4所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述大米或麦芽糖化液的制备为：50g大米或麦芽样品经粉碎后，加2-6倍体积的水，蒸煮0.5-2h，呈糊状，冷却后以每克原料4～8U的量加入糖化酶α-淀粉酶，于60℃水浴0.5-2h，液化完成后用1mol/L的盐酸调节pH至4.0，然后以每克原料40～100U的量加入糖化酶，60℃水浴，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即为大米汁或麦芽汁。
6.如权利要求4所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述麸皮浸提液的制备为：称取400g麸皮并加入1-5倍水，90℃水浴1-2h，冷却过滤，滤液即为麸皮浸提液。
7.如权利要求1所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌的应用，其特征在于，所述酵母菌在食品工业中的应用。
8.如权利要求7所述一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌的应用，其特征在于，所述酵母菌在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒行业中的应用。
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