CN108018218B - 一株高产乙酸乙酯酵母菌株及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母菌株及其培养方法与应用，名为Wickerhamomyces anomalus Y3604菌株，已于2016年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.13103；该菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2序列相似性较高；该菌株具有较好的糖耐受性、乙醇耐受性和乙酸乙酯耐受性，生长pH和温度范围宽广；本发明的异常威克汉姆酵母Y3604具有乙酸乙酯产量高的特点，经检测，该菌株乙酸乙酯产量可达19.17 g/L。本发明的菌株可应用于对以酸乙酯有需求的白酒、黄酒、酱油等酿造工业中。

Description

一株高产乙酸乙酯酵母菌株及其培养方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及一株新分离高产乙酸乙酯的酵母菌株及其培养方法与应用。
背景技术
乙酸乙酯是一种具有苹果香、菠萝香等水果香味的液体，它的产生主要依赖于酯的合成和酯的水解之间的平衡关系。乙酸乙酯广泛应用在食品行业中，且食品行业对乙酸乙酯的高需求量，寻求一种廉价而安全的乙酸乙酯生成途径具有深远意义。目前，乙酸乙酯生成主要有3条途径：一是通过化工方法来合成乙酸乙酯，再进行提纯，具有一定风险；二是微生物的发酵生成，主要为异常毕赤酵母等产酯酵母，生成的乙酸乙酯可视为天然乙酸乙酯；三是从菠萝、香蕉等果品中提取，该方法成本较高。随着社会的发展，人类生活质量的提升，综合考虑生产成本和来源途径，通过微生物发酵产乙酸乙酯是一条优先选择的途径。
乙酸乙酯的含量是决定白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品品质好坏的重要因素。乙酸乙酯是我国白酒中含量较多的香味物质之一，尤其是对清香型、凤香型和米香型等白酒的风格及成型具有重要作用；在清爽型黄酒中具有重要的风味贡献作用；乙酸乙酯是酱油中的重要香气成分，对酱油的香气有举足轻重的影响。在这些传统发酵食品中，乙酸乙酯主要来源于微生物发酵产生，少量源于发酵过程中物质的化学反应和原料代入，可见，高产乙酸乙酯的微生物对于白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品的品质具有重要影响。在产乙酸乙酯微生物中，酵母是最为重要的菌株。产酯酵母是传统发酵食品中酯类物质主要产生菌株。从白酒、黄酒和酱油等酿造体系中获得能高产乙酸乙酯的功能微生物，并将其强化应用到白酒酿造体系中，对于提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造中乙酸乙酯含量，提升其品质具有重要意义。
产酯酵母大多属于异型汉逊酵母（Hansenula anaomala），具有较强的氧化特性和产酯能力。汉逊酵母（Hansenula）、球拟酵母（Torulopsis）与假丝酵母（Candida）等多用于白酒生产中；蒙奇球拟酵母（Torulopsis mogii）、易变球拟酵母（Torulopsis utilis）和埃契氏球拟酵母（Torulopsis etchell-sii）等耐盐产酯酵母多用于生产酱油。虽然，已有多种产酯酵母菌种，但还存在产酯水平低，耐受性差等问题，较难应用到实际生产中。一些厂家采用添加人工合成的乙酸乙酯的方法来提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中乙酸乙酯含量。随着国家对食品安全的高度重视，不允许往白酒等发酵食品中添加化学合成的香精香料，因此，选育适应性好、高耐受性、高产乙酸乙酯酵母是解决这一问题的关键。
发明内容
针对乙酸乙酯为白酒中的四大酯，以及提高传统酿造食品白酒中乙酸乙酯含量，提升白酒品质的实际应用，本发明目的在于提供一种从白酒酒曲中新分离的高产乙酸乙酯的菌株，命名为Y3604，并提供Y3604产乙酸乙酯的培养基及培养方法与应用。
本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从古井贡酒曲中筛选获得，为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），该菌株已于申请日前保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13103。
上述所述菌株Y3604菌落特征和生化特性如下：该菌株在固体YPD培养基上菌落呈乳白色，边缘规则，中央突起，湿润易挑起，细胞为椭圆形；该菌株在WL培养基上边缘乳白色中间蓝灰色，边缘规则，中央微突起；发酵产香香味浓，能耐受12%（v/v）的乙醇，对乙酸乙酯的耐受性为24 g/L，能在80%的高糖培养基中生长，pH生长范围为2-10，生长温度范围为20-35 oC。所述的异常威克汉姆酵母Y3604主要用于微生物发酵制备乙酸乙酯，产量可达到19.17 g/L，可以作为提高白酒中乙酸乙酯含量的功能微生物菌株应用到白酒的生产中。
上述异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2序列有99%的相似性。
上述库异常威克汉姆酵母菌株Y3604在制备乙酸乙酯中的应用。
上述应用，步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母菌株Y3604接入液体种子活化培养基中，在20-35 oC、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将步骤（1）获得的种子活化液以2-6%（v/v）的接种量接种于高粱浸出液培养基，在20-35 oC、静置或160-240 r/min条件下培养48-96 h，即得。
根据本发明，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
根据本发明，所述步骤（2）中高粱浸出液培养基组分如下：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，8000 r/min离心10min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为10Brix，分装于三角瓶中，灭菌。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中高粱浸出液培养基优化组分如下：葡称取250g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，8000 r/min离心10min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为8 Brix，分装于三角瓶中，灭菌，然后加入乙醇和乙酸，其添加量分别为4%（v/v）和0.1%（v/v）。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中培养温度为25 oC，以210 r/min培养96 h。
本发明的有益效果：
（1）本发明筛选出的菌株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604来源于白酒酿造环境中，具有乙酸乙酯产量高的特点，经检测，该菌株乙酸乙酯产量可达到19.17 g/L；
（2）本发明通过对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌乙酸乙酯的产量。
（3）本发明筛选出的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株乙酸乙酯和乙醇耐受性高，有利于该菌株生产乙酸乙酯及其在白酒酿造中的应用。
附图说明
图1是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株在YPD培养基上的菌落形态照片；
图2是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株的细胞形态照片（放大400倍）；
图3是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株系统进化发育树；
图4是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株高糖耐受性结果；
图5是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株乙酸乙酯耐受性测定结果；
图6是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株最适pH测定结果；
图7是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株最适温度测定结果；
图8是乙酸乙酯标准品高效液相色谱图；
图9是乙酸乙酯标准品制作的标准曲线；
图10是发酵液中乙酸乙酯的高效液相色谱图；
图11是乙醇添加量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图12是乙酸添加量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图13是pH对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图14是温度对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图15是接种量对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图16是转速对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响；
图17是时间对异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604合成乙酸乙酯的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例所用培养基如下：
YPD培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水定容。
WL培养基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸镁0.125 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，pH值为6.5，蒸馏水定容。
实施例中所述异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604，2016年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13103。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例中所述乙酸乙酯标准品购自美国Sigma公司。
实施例1 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604的分离
将古井贡大曲粉碎并混合均匀后，称取1 g，加入9 mL无菌水，充分振荡后浸泡15min，制成悬液。在无菌操作条件下，取0.1 mL悬液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4、10-5、10-6。取各梯度悬液0.1 mL于YPD平板上，每个稀释梯度做三个平行，由低浓度至高浓度依次涂布。将培养基平板置于30 oC的恒温培养箱中培养2 d，观察菌落生长情况。挑起平板上为球形、表面突起、乳白色、不透明的单菌落，多次划线接种于YPD平板上，直至在显微镜下观察菌体形态一致。将单菌落接种于50 mL高粱浸出液培养基中，30 oC、180 r/min条件下振荡培养48 h。高粱浸出液培养基配方为：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，8000 r/min离心10min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为10 Brix，分装于三角瓶中，灭菌备用，乙醇、乙酸添加量分别为0.5%和0.02%（v/v）。筛选能够将乙醇和乙酸转化生成乙酸乙酯的菌株，并测定乙酸乙酯含量，最终获得一株转化能力较好、能积累较高浓度乙酸乙酯的菌株，即异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604。
实施例2 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604的保存
上述所获得的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604通过以下方法进行保存：
（1）斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72 h后，在4oC冰箱中保存。
（2）甘油管保存：取6 mL 20%甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20%甘油混合，将混合液分装于1.5 mL无菌PE管中，于-80 oC下保存。
实施例3 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604的鉴定
上述所涉及的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604的鉴定包括以下步骤：
步骤1：形态学特征
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：
（1）YPD培养基菌落形态和细胞观察：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于YPD培养基上，于48 h后观察其形态特征（图1），结果如表1，将其在光学显微镜下放大400倍后观察，结果如图2，呈现椭圆形，芽殖。
（2）WL培养基菌落形态观察：将筛选出的菌种接种至YPD上进行活化，培养24-48 h后接种至WL培养基，30 oC下培养，5 d后进行观察，结果如表1。
表1 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604形态培养特征
培养基种类 YPD WL
形态特征 乳白色，边缘规则，中央微突起，湿润易挑起 边缘乳白色中间蓝灰色，边缘规则，中央微突起
步骤2：异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604 Biology96孔板鉴定
将待测菌株划线于YPD平板上，于28 oC下培养24-36 h，取单菌落调节浊度管中的菌悬液浊度，直至浊度仪显示45%+2。将菌悬液加入96孔板中（鉴定酵母专用YT板，碳源种类如表2），并于28 oC条件下培养数天。利用Microstation软件每隔24 h读取鉴定板的数据，直至SIM值大于0.5，为最终结果。
表2 YT鉴定板碳源分布
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
水 乙酸 甲酸/蚁酸 丙酸 琥珀酸 琥珀酸单甲基酯 L-天门冬氨酸 L-谷氨酸 L-脯氨酸 D-葡萄糖酸 糊精 菊糖/天然果寡糖
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12
纤维二糖 龙胆二糖 麦芽糖 麦芽三糖 D-松三糖 D-蜜二糖 异麦芽酮糖 棉子糖 水苏糖 蔗糖 D-海藻糖 松二糖
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
N-乙酰基-D-葡萄糖氨 α-D-葡萄糖 D-半乳糖 D-阿洛酮糖 L-山梨糖 水杨苷 D-甘露醇 D-山梨醇 D-阿拉伯糖醇 木糖醇 甘油/丙三醇 吐温80
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12
水 延胡索酸 L-苹果酸 琥珀酸单甲基酯 溴代丁二酸 L-谷氨酸 γ-氨（基）酪酸 α-酮戊二酸 2-酮葡萄酸 D-葡萄糖酸 糊精 菊糖/天然果寡糖
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
D-纤维二糖 龙胆二糖 麦芽糖 麦芽三糖 D-松三糖 D-蜜二糖 异麦芽酮糖 棉子糖 水苏糖 蔗糖 D-海藻糖 松二糖
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
N-乙酰基-D-葡萄糖氨 D-葡萄糖氨 α-D-葡萄糖 D-半乳糖 D-阿洛酮糖 L-鼠李糖 L-山梨糖 α-甲基-D-葡萄糖苷 β-甲基-D-葡萄糖苷 苦杏仁苷 熊果苷 水杨苷
G1 G2 G3 G4G G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
麦芽糖醇 D-甘露醇 D-山梨醇 春福寿草醇 D-阿糖醇 木糖醇 i-赤藻糖醇 甘油/丙三醇 吐温80 L-阿拉伯糖 D-阿拉伯糖 D-核糖
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12
D-木糖/戊醛糖 琥珀酸单甲基酯和D-木糖/戊醛糖 N-乙酰基-L-谷氨酸和D-木糖/戊醛糖 奎宁酸和D-木糖/戊醛糖 D-葡萄糖醛酸和D-木糖/戊醛糖 糊精和D-木糖/戊醛糖 α-D-乳糖和D-木糖/戊醛糖 D-蜜二糖和D-木糖/戊醛糖 D-半乳糖和D-木糖/戊醛糖 m-肌醇和D-木糖/戊醛糖 1，2-丙二醇和D-木糖/戊醛糖 甲基乙酰基甲醇/乙偶姻和D-木糖/戊醛糖
上述异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株的生理生化实验结果如表3
表3 酵母Y3604碳源代谢情况
水 乙酸 甲酸/蚁酸 丙酸 琥珀酸 琥珀酸单甲基酯 L-天门冬氨酸 L-谷氨酸 L-脯氨酸 D-葡萄糖酸 糊精 菊糖/天然果寡糖
- - - - ++ + ++ ++ ++ - ++ ++
D-纤维二糖 龙胆二糖 麦芽糖 麦芽三糖 D-松三糖 D-蜜二糖 异麦芽酮糖/帕拉金糖 D-蜜三糖/棉子糖 水苏糖 蔗糖 D-海藻糖 松二糖
++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++ ++ ++ ++ ++
N-乙酰基-D-葡萄糖氨 α-D-葡萄糖 D-半乳糖 D-阿洛酮糖 L-山梨糖 水杨苷 D-甘露醇 D-山梨醇 D-阿拉伯糖醇 木糖醇 甘油/丙三醇 吐温80
- ++ ++ + - ++ ++ ++ ++ ++ ++ -
水 富马酸/延胡索酸 L-苹果酸 琥珀酸单甲基酯 溴代丁二酸 L-谷氨酸 γ-氨(基)酪酸 α-酮戊二酸 2-酮葡糖酸 D-葡萄糖酸 糊精 菊糖/天然果寡糖
- ++ ++ + + ++ ++ ++ + + ++ ++
D-纤维二糖 龙胆二糖 麦芽糖 麦芽三糖 D-松三糖 D-蜜二糖 异麦芽酮糖/帕拉金糖 D-蜜三糖/棉子糖 水苏糖 蔗糖 D-海藻糖 松二糖
++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++ ++ ++ ++ ++
N-乙酰基-D-葡萄糖氨 D-葡萄糖氨 α-D-葡萄糖 D –半乳糖 D-阿洛酮糖 L-鼠李糖 L-山梨糖 α-甲基-D-葡萄糖苷 β-甲基-D-葡萄糖苷 苦杏仁苷 熊果苷 水杨苷
- - ++ ++ - - - ++ ++ - ++ ++
麦芽糖醇 D-甘露醇 D-山梨醇 春福寿草醇/侧金盏花醇 D-阿糖醇 木糖醇 i-赤藻糖醇 甘油/丙三醇 吐温80 L-阿拉伯糖 D-阿拉伯糖 D-核糖
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - -
D-木糖/戊醛糖 琥珀酸单甲基酯和D-木糖/戊醛糖 N-乙酰基-L-谷氨酸和D-木糖/戊醛糖 奎宁酸和D-木糖/戊醛糖 D-葡萄糖醛酸和D-木糖/戊醛糖 糊精和D-木糖/戊醛糖 α-D-乳糖和D-木糖/戊醛糖 D-蜜二糖和D-木糖/戊醛糖 D-半乳糖和D-木糖/戊醛糖 m-肌醇和D-木糖/戊醛糖 1,2-丙二醇和D-木糖/戊醛糖 甲基乙酰基甲醇/乙偶姻和D-木糖/戊醛糖
++ + + ++ + ++ + + ++ + + +
通过Microstation软件读取鉴定板的数据，其中水、乙酸、甲酸/蚁酸、丙酸、D-葡萄糖酸、D-蜜二糖、N-乙酰基-D-葡萄糖氨、L-山梨糖、吐温80、D-蜜二糖、N-乙酰基-D-葡萄糖氨、D-葡萄糖氨、D-阿洛酮糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖19种碳源不能被利用，其余碳源均可被利用。
步骤3：分子生物学鉴定
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：
（1）菌体培养
上述涉及酵母是按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在YPD固体培养基中进行活化，在30 oC条件下培养48 h后接种于YPD液体培养基中，置于28 oC、160 r/min摇床中，培养48 h。
（2）PCR扩增
上述涉及的酵母菌株基因组DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒方法。
本发明为鉴定所用的扩增引物为酵母26S rDNA基因D1/D2区序列扩增引物，由以下引物组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
正向引物，NL1：5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´；
Figure 447683DEST_PATH_IMAGE002
反向引物，NL4：5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´。
上述所涉及酵母菌株鉴定的PCR条件包括以下：
Figure 780575DEST_PATH_IMAGE001
PCR反应体系：LA PCR Buffer2.5 μL、正反引物各1 μL、dNTP 2 μL、LAtaq酶 0.2 μL、DNA 2 μL、ddH2O补至25 μL；
Figure 14854DEST_PATH_IMAGE002
PCR扩增程序：94 oC预变性5 min，94 oC变性30 s，58 oC退火30 s，72 oC延伸1 min，共30次循环，最后72 oC延伸10 min；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。
（3）序列测定及系统发育树的构建
将（2）中的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株PCR扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），与其它多株异常威克汉姆酵母的26S rDNA D1/D2区序列有99%的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示，将该菌鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。
该菌株已于2016年10月12日送至中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13103。
实施例4 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604的生长特性
本发明所涉及异常威克汉姆酵母Y3604生长特性，其特征在于，步骤如下：
步骤1：糖耐受性
本发明所涉及的酵母菌株糖耐受性，其特征在于，以YPD培养基为基础，配制糖浓度为30%、40%、50%、60%、70%和80%，分装于大试管中，并加入杜氏管，做三个平行，以1%的接种量，于30 oC下培养5 d，以测定OD560作为高糖耐受性结果，结果如图4所示；由图4可以看出该菌株糖耐受能力超过80%以上，具有较好的糖耐受性。
步骤2：乙醇耐受性
本发明所涉及的酵母菌株乙醇耐受性，其特征在于，将灭菌后的YPD琼脂培养基降温至40 oC左右，按8%、10%、12%、14%、16%、18%和20% (v/v)的浓度加入乙醇，接种已活化的待测菌株于上述固体培养基中，在30 oC下培养一周后观察其生长状况，表征其酒精耐受性，结果如表4所示，由表可见该酵母能在12%的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株。
表4 异常威克汉姆酵母Y3604菌株乙醇耐受性结果
浓度 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20%
Y1511 + + + - - - -
步骤3：乙酸乙酯耐受性
本发明所涉及的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604乙酸乙酯耐受性，其特征在于，将活化后的菌株Y3604接种于乙酸乙酯浓度为0-30 g/L的YPD液体培养基中，于30 oC的条件下培养3 d，在560 nm下检测OD值，其结果如图5，可见该菌株在液体培养基上的乙酸乙酯耐受浓度为24 g/L。
步骤4：乙酸耐受性
本发明所涉及的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604乙酸耐受性，其特征在于，将活化后的菌株Y3604划线接种于含有乙酸的YPD固体培养基中，于30 oC的条件下培养1周，观察其生长情况，以Y3604接种于不含乙酸的培养基的生长情况为空白对照，“+”为正常生长，“-”为达到耐受极限，“×”为不能生长，其结果如表5，由表可见该酵母在含有0.4%（v/v）乙酸下达到耐受极限。
表5 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604乙酸耐受性结果
乙酸（v/v） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
生长情况 + + + + - ×
注：+代表生长状况；-代表耐受极限；×代表完全不生长
步骤5：生长pH
本发明所涉及的酵母菌株生长pH，其特征在于，以YPD培养基为基础，配制pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的液体培养基，接种已活化的待测菌株，于30 oC条件下静置培养3d，测定OD560，结果如图6所示，由图可以看出本发明所涉及菌株生长pH范围比较宽广，为pH2-10，其最适生长pH为5。
步骤6：生长温度
本发明所涉及的酵母菌株生长温度，其特征在于，将已活化的待测菌株接种于YPD培养基中，分别置于20、25、30、35和40 oC条件下静置培养3 d，测定OD560，结果如图7所示，由图可以看出，本发明所涉及菌株的温度生长范围为20-35 oC，其最适生长温度为30 oC。
实施例5 异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604制备乙酸乙酯
本发明所涉及异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604制备乙酸乙酯步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环异常威克汉姆酵母Y3604接入液体种子培养基中，在20-35oC、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将（1）获得的种子活化液以2-6%（v/v）的接种量接种于高粱浸出液培养基，在20-35 oC、静置或160-240 r/min条件下培养48-96 h，即得。
所述步骤（1）中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
所述步骤（2）中的高粱浸出液培养基组成为：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90 oC液化1 h，再加入糖化酶于60 oC下糖化2 h。糖化后，8000 r/min离心10 min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为10 Brix，分装于三角瓶中，灭菌，乙醇、乙酸添加量分别为4%（v/v）和0.1%（v/v）。
产物和产物浓度的确定
采用高效液相色谱法确定和测定乙酸乙酯浓度，高效液相色谱（Agilent 1260infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：KH2PO4=1：1（v/v），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 oC，进样量10μL。
（1）乙酸乙酯标准曲线的绘制
准确称取0.3632 g乙酸乙酯，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，即得36.2837mg/mL的标准贮备液。分别移取30 μL、60 μL、120 μL、200 μL、300 μL和400 μL的标准贮备液，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后得0.1089-1.4513 mg/mL 6个浓度水平的乙酸乙酯标准溶液。
将上述不同浓度梯度的乙酸乙酯标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。乙酸乙酯标准品高效液相色谱图如图8，乙酸乙酯标准品出峰时间在4.9-5.0 min之间，每一浓度重复测定3次，求均值，绘制乙酸乙酯标准曲线，如图9所示，根据该曲线获得的方程式为y=346.19x+3.6866（R2=0.9984）。
（2）样品的制备
取8 mL发酵液于10 mL离心管中，经8000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，经0.22μm水系滤膜过滤得到样品。
高效液相色谱（Agilent 1260 infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAXEclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：KH2PO4=1：1（v/v），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 oC，进样量10 μL。外标法测定乙酸乙酯。
样品的高效液相色谱图如图10所示，由图可看出乙酸乙酯出峰时间在4.9-5.0min之间，与标准品出峰时间一致，样品中含有乙酸乙酯。
高效液相色谱测定样品的峰面积带入标准曲线方程y=346.19x+3.6866（R2=0.9984）中，峰面积为y值，求出乙酸乙酯浓度x。
实施例6：乙醇添加量的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，高粱浸出液培养基中乙醇添加量按照0%、2%、4%、6%、8%和10%（v/v）的比例添加。以2%的接种量，在30 oC、180 r/min的条件下培养72 h。通过图11可以看出，当乙醇添加量达到4%时，酵母Y3604产乙酸乙酯含量最高，达到14.73 g/L。乙醇含量的过高或过低均会影响乙酸乙酯的产量，原因可能在于乙醇含量低时，不能更好的为酵母提供乙酸乙酯的前体；而乙醇含量过高则会对酵母细胞起到一定毒害作用，影响酵母的正常生长，故选择乙醇4%的添加量为宜。
实施例7：乙酸添加量的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例6的基础上按照0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%（v/v）的量分别在高粱培养基中加入乙酸，并将活化种子液以2%的接种量接种于上述培养基中，于30 oC，180 r/min条件下培养3 d。用高效液相色谱法检测乙酸乙酯，通过图12可以看出，在0.2%以下的乙酸添加量时，酵母能正常生长且乙酸乙酯产量较高。根据结果，选择0.1%的乙酸加入量作为最优添加量，乙酸乙酯产量为15.53 g/L。
实施例8：pH的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例7基础上，将高粱浸出液培养基的pH分别调至3，4，5，6，7以及自然pH。以2%的接种量，在30 oC、180 r/min，的条件下培养3 d。由图13可以看出，酵母Y3604在pH 6的条件下乙酸乙酯产量最高，为17.02 g/L，故选择pH 6为最适pH。
实施例9：温度的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例8基础上，选择温度范围为20-40 oC之间，以5 oC为一个梯度，以2%的接种量培养3 d。结果如图14。温度为25 oC时，发酵液中乙酸乙酯含量为17.45 g/L。因此，Y3604合成乙酸乙酯的最适温度为25 oC。
实施例10：接种量的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例9基础上，分别以2%、4%、6%、8%和10%的接种量将Y3604种子活化液接种于转化培养基中培养3 d。由图15可以看出，接种量为2%时，发酵液中乙酸乙酯含量为17.53 g/L。接种量为4%时，乙酸乙酯产量略大于以2%接种量时乙酸乙酯的产量，综合考虑，选择2%为最优接种量。因此，Y3604合成乙酸乙酯的优选接种量为2%。
实施例11：转速的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例10基础上，在静置和不同转速（120、150、180、210和240 r/min）条件下培养，以2%的接种量，在25 oC条件下培养3 d。由图16可以看出，菌株Y3604在210 r/min条件下合成的乙酸乙酯含量为17.93 g/L。故选择210 r/min为最优转速。
实施例12：时间的优选
采用实施例5的方法培养酵母Y3604，不同之处在于，在实施例11基础上，以2%的接种量，在25 oC条件下培养，从发酵48 h起，每隔12 h取样进行乙酸乙酯的含量测定，由图17可以看出，酵母Y3604当培养时间为96 h时，发酵液中乙酸乙酯含量最高为19.17 g/L，之后，乙酸乙酯含量随时间的增加而减少。因此，酵母Y3604最优培养时间为96 h。

Claims (7)

1.一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)菌株，其特征在于：该异常威克汉姆酵母菌株名为异常威克汉姆酵母菌株Y3604，已于2016年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.13103。
2.如权利要求1所述的异常威克汉姆酵母菌株，该菌株的特征是：形状多为椭圆形，芽殖，菌落颜色为乳白色，能够利用葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、琥珀酸、乙醇、乳酸、核糖、甘油、松三糖和葡萄糖酸作为碳源，糖耐受能力大于80%，在12%的乙醇浓度下能正常生长，该菌乙酸乙酯耐受浓度为24 g/L，最适生长pH和温度分别为5和30℃。
3.如权利要求1或2所述的异常威克汉姆酵母菌株在制备乙酸乙酯中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（1）从斜面上挑取1环所述异常威克汉姆酵母菌株接入液体种子活化培养基中，在20-35℃ 、160-180 r/min条件下，活化14-18 h，获得种子活化液；
（2）将步骤（1）获得的种子活化液以2-6%（v/v）的接种量接种于高粱浸出液培养基，在20-35℃ 、静置或160-240r/min条件下培养48-96 h，即得。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5 g/L，pH自然，蒸馏水定容。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中高粱浸出液培养基配方如下：称取250g高粱粉碎，将粉末与水1：4混合，待煮沸后，加入耐高温α-淀粉酶于90℃液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h；糖化后，8000r/min离心10min，并用4层纱布过滤，取上清液，调节糖度为10 Brix，分装于三角瓶中，灭菌备用。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中培养温度为25℃ ，以210r/min培养96h，得到成熟的乙酸乙酯转化液。
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