CN109652323A - 产酯酵母jjjc-2的扩大培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产酯酵母JJJC‑2的扩大培养方法，该方法包括以下步骤：酵母平板活化、一级液体种子培养，然后制备二级液体种子培养基，接种经过一级液体种子培养的发酵液，发酵过程控制温度20～35℃，含氧量2～15％，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，到此完成菌株的扩大培养。本发明的二级液体种子培养基中将可发酵氮源与无机氮源进行合理搭配，既能满足产酯酵母繁殖和产酯需要，又不引入杂味。酵母的生长需要多种维生素，主要有生物素、泛酸、肌醇和硫胺素。采用本发明的扩大培养方法，培养后鲜酵母浓度为25g/L左右，酵母数达到1亿个/ml，酵母出芽率25％‑30％，有宜人的酯香及培养基香气，无异杂味，酵母质量良好。

Description

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法

技术领域

本发明属于工业菌株领域，具体涉及产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法。

背景技术

目前产酯酵母多以糖蜜和淀粉等原料作为碳源进行生产(包括扩大培养)，应用这些碳源生产出来的产酯酵母发酵所获得的乙酸乙酯发酵液，往往带有相应碳源的香气。如以糖蜜生产的酵母种子液发酵得到的乙酸乙酯发酵液，应用到米香酒中，则带有糖蜜的香气，影响了原有米香型白酒的风格。

中国专利CN 102559519 B公开了产酯酵母JJJC-2及其生产乙酸乙酯和酒精的方法，其菌株的活化和扩大培养包括以下步骤：先在总糖含量为20-120g/L的麦芽汁固体斜面上培养，然后接一环细胞于总糖含量为80-160g/L的麦芽汁或米曲汁液体培养基的三角瓶中，培养后得到液体菌种，再经过至少两级液体种子培养，可用于发酵；所用的液体种子培养基均为总糖含量80-160g/L的糖化液。可见，该专利中，菌种的活化和扩大培养所用的培养基都只是限定了总糖含量，其配方较为简单，不利于提升酵母的质量及产酯能力。

发明内容

针对产酯酵母JJJC-2现有的扩大培养方法中培养基成分简单，不利于提升酵母的质量及产酯能力的缺陷，本发明的目的在于提供一种产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，尤其对二级液体种子培养做出了较大的改进和优化，着力提升了酵母的质量及产酯能力。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

(1)酵母平板活化

制备固体培养基平板(包括灭菌)，接种产酯酵母JJJC-2(Saccharomycescerevisiae)，26-32℃培养2-6d；

活化的酵母菌落健壮，具有产酯酵母典型特征(白色，圆形，边缘为锯齿状白圈)，无霉菌、细菌及其他酵母生长。

所述固体培养基的配方是：酵母膏9-15g，蛋白胨18-22g，葡萄糖18-25g，琼脂粉2％，水1L；

所述的产酯酵母JJJC-2已在中国专利CN 102559519 B中公开，并在指定机构做了保藏；

(2)一级液体种子培养(三角瓶培养)

制备一级液体种子培养基，灭菌后冷却至室温，接种经过酵母平板活化的产酯酵母，26-32℃摇床培养1～3d；

所述一级液体种子培养基的配方是：酵母膏9-15g，蛋白胨18-22g，葡萄糖18-25g，水1L；

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

制备二级液体种子培养基，灭菌后冷却至室温，调节初始pH值3.5～6.0，接种经过一级液体种子培养的发酵液，发酵过程控制温度20～35℃，含氧量2～15％(含氧量能有效促进酵母增殖)，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子，用于下一步的发酵，到此完成菌株的扩大培养；

所述二级液体种子培养基的配方是：碳源的初始糖度为5.0～20°Bx，氮源含量2～15g/L，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L，盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L；

所述的碳源为糖蜜和/或粮食糖化液；

所述的粮食包括大米、小米、玉米、高粱、青稞、小麦、大麦、燕麦、木薯等；

所述的氮源优选可发酵氮源；

所述的可发酵氮源为玉米浆粉、麸皮水解液、黄豆水解液、豆粕水解液、小麦蛋白水解液、酵母膏或牛肉膏中的一种以上；

氮源是构成细胞中所含蛋白质、核算和酶等成分，以及代谢产物中氮素来源的营养物质。本发明的二级液体种子培养基中将可发酵氮源与无机氮源进行合理搭配，既能满足产酯酵母繁殖和产酯需要，又不引入杂味。酵母的生长需要多种维生素，主要有生物素、泛酸、肌醇和硫胺素。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、采用本发明的扩大培养方法，培养后鲜酵母浓度为25g/L左右，酵母数达到1亿个/ml，酵母出芽率25％-30％，有宜人的酯香及培养基香气，无异杂味，酵母质量良好。

2、本发明的扩大培养方法应用到发酵中，按CN 102559519 B公开的方法，将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1:30的比例混合串蒸，产酯量提升30％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

一、产酯酵母种子制备：

(1)酵母平板活化

培养基配方：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉2％，水1L。

培养工艺：固体培养基及平皿经过121℃湿热灭菌15min。无菌室操作台(无菌条件下)倒平板，制得酵母固态平板，要求空白平板无菌落生长。平板无菌条件下接种一环斜面产酯酵母，30℃培养2d。

(2)一级液体种子培养(三角瓶培养)

培养基配方：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，水1L。

培养工艺：培养基经过121℃湿热灭菌15min，冷却到30℃，无菌室操作台(无菌条件下)接种，接种量5％，于30℃条件下摇床转速100r/min培养2d。

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

培养基配方：碳源为糖蜜，初始糖度10°Bx，添加0.2％玉米浆粉，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L。盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L。

培养工艺：初始pH值4.5～5.0，接种量5％，发酵温度26～30℃，含氧量6％～10％，培养时间14～18h，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子。

二、过程产品控制标准

(1)酵母活化的指标要求

活化的酵母菌落健壮，具有产酯酵母典型特征，(白色，圆形，边缘为锯齿状白圈)，无霉菌、细菌及其他酵母生长。

(2)种子液的指标要求

A.产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml；检测方法，血球计数法。

B.霉菌、细菌及其他酵母数为0，检测方法为，接种时，随机抽取两瓶，吸取0.1ml已接种的培养基，涂布于麦汁培养基于35℃培养1～2d。评价标准，平板上长有单一典型的产酯酵母菌落(白色，圆形，边缘为锯齿状白圈)，无霉菌、细菌及其他酵母生长。

C.培养1天期细菌检测：革兰氏染色法涂片镜检，如发现有红色阴性菌、长杆菌、球菌、芽孢菌或菌体碎片等，说明污染了细菌。

三、与在先申请CN 102559519 B的扩大培养方法比较，结果见下表：

可以看出，本发明的方法在所有指标上都优于在先申请的方法，着力提升了酵母的质量及产酯能力。

实施例2

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

一、产酯酵母种子制备：

步骤(1)和(2)与实施例1相同。

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

培养基配方：碳源为大米糖化液，初始糖度10°Bx，添加0.5％麸皮水解液，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L。盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L。

培养工艺：初始pH值4.5～5.0，接种量5％，发酵温度26～30℃，含氧量6％～10％，培养时间14～18h，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子。

余下步骤与实施例1相同。

实施例3

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

一、产酯酵母种子制备：

步骤(1)和(2)与实施例1相同。

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

A.培养基配方：碳源为大米糖化液，初始糖度10°Bx，添加0.5％黄豆水解液，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L。维生素，包括盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L。

B.培养工艺：初始pH 4.5～5.0，接种量5％，发酵温度26～30℃，含氧量6％～10％，培养时间14～18h，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子。

余下步骤与实施例1相同。

实施例4

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

一、产酯酵母种子制备：

步骤(1)和(2)与实施例1相同。

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

A.培养基配方：碳源为玉米糖化液，初始糖度10°Bx，添加0.1％玉米浆粉，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L。盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L。

B.培养工艺：初始pH值4.5～5.0，接种量5％，发酵温度26～30℃，含氧量6％～10％，培养时间14～18h，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子。

余下步骤与实施例1相同。

实施例5

产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，包括以下步骤：

一、产酯酵母种子制备：

步骤(1)和(2)与实施例1相同。

(3)二级液体种子培养(种子罐培养)

A.培养基配方：碳源为高粱糖化液，初始糖度10°Bx，添加0.4％麸皮水解液，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L。盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，

FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O16mg/L，KI 0.4mg/L。

B.培养工艺：初始pH 4.5～5.0，接种量5％，发酵温度26～30℃，含氧量6％～10％，培养时间14～18h，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.产酯酵母JJJC-2的扩大培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)酵母平板活化

制备固体培养基平板，接种产酯酵母JJJC-2，26-32℃培养2-6d；

(2)一级液体种子培养

制备一级液体种子培养基，灭菌后冷却至室温，接种经过酵母平板活化的产酯酵母，26-32℃摇床培养1～3d；

(3)二级液体种子培养

制备二级液体种子培养基，灭菌后冷却至室温，调节初始pH值3.5～6.0，接种经过一级液体种子培养的发酵液，发酵过程控制温度20～35℃，含氧量2～15％，培养至产酯酵母数量≥1.0×10⁸个/ml，制得产酯酵母种子，用于下一步的发酵，到此完成菌株的扩大培养；

所述二级液体种子培养基的配方是：碳源的初始糖度为5.0～20°Bx，氮源含量2～15g/L，MgSO₄·H₂O 6～10g/L，(NH)₂PO₄ 8～12g/L，KH₂PO₄ 4～6g/L，盐酸硫胺4mg/L，生物素0.1mg/L，泛酸钙4mg/L，肌醇100mg/L，CaCl₂·2H₂O 18mg/L，FeSO₄·7H₂O 12mg/L，MnCl₂·2H₂O 4mg/L，CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 16mg/L，KI 0.4mg/L；

所述的氮源为可发酵氮源。

2.根据权利要求1所述的扩大培养方法，其特征在于：步骤(1)所述固体培养基的配方是：酵母膏9-15g，蛋白胨18-22g，葡萄糖18-25g，琼脂粉2％，水1L。

3.根据权利要求1所述的扩大培养方法，其特征在于：步骤(2)所述一级液体种子培养基的配方是：酵母膏9-15g，蛋白胨18-22g，葡萄糖18-25g，水1L。

4.根据权利要求1所述的扩大培养方法，其特征在于：步骤(3)所述的碳源为糖蜜和/或粮食糖化液。

5.根据权利要求4所述的扩大培养方法，其特征在于：所述的粮食包括大米、小米、玉米、高粱、青稞、小麦、大麦、燕麦和木薯。

6.根据权利要求1所述的扩大培养方法，其特征在于：步骤(3)所述的可发酵氮源为玉米浆粉、麸皮水解液、黄豆水解液、豆粕水解液、小麦蛋白水解液、酵母膏或牛肉膏中的一种以上。