CN106754401A - 一种中国被毛孢菌的生产方法 - Google Patents

一种中国被毛孢菌的生产方法 Download PDF

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Abstract

一种中国被毛孢菌的生产方法，属于生物发酵领域，应用于冬虫夏草菌的生产。该方法含有如下步骤：(一)摇床培养；(二)发酵种子罐培养；(三)三级、四级发酵培养，培养3‑5天后进行补料，补料至罐体总容积的70‑80％；(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。本发明的有益效果是：缩短了发酵周期，由原来总周期38‑42天缩短到30‑35天，总发酵周期缩短降低了染菌风险，并降低消耗，产品收率由原7‰增加到9‰，产品的各项质量指标也完全达到药典标准的要求。

Description

一种中国被毛孢菌的生产方法
技术领域
本发明涉及一种中国被毛孢菌的生产方法，特别是涉及一种液体深层发酵生产中国被毛孢菌的生产方法。
背景技术
冬虫夏草是我国二级保护物种，是我国名贵的中药材瑰宝，它在我国民间流传应用也已有两千多年的历史。冬虫夏草不仅是具有良好保健功能的药用真菌，而且是具有很高营养价值的高档滋补食用真菌，随着人们生活水平和生活质量的提高，对功能保健产品的需求也日趋扩大。由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身资源比较有限。近年来冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。而冬虫夏草由于可以药食两用，且人们不断发现其新的药理作用，所以多个国家对它的需要倍增，价格逐年上涨，国际市场日益紧缺。因野生资源逐年枯竭，冬虫夏草的资源保护和可持续利用一直是行业内外广泛关注的焦点，人工发酵方法生产的冬虫夏草菌丝粉慢慢被人们知晓和认可。冬虫夏草无性型菌种中国被毛孢(Hirsutella sinensis Lu,Guo,Yu et Zeng)，目前国内许多个人和单位研究和公开冬虫夏草培养基和发酵生产方法，但是，这些技术多采用微生物发酵常用培养基，基本上以蛋、奶、马铃薯作为发酵食源，培养基成分的选择，虽然都是按照微生物学的发酵原理使菌种能够生长，但食源的不同必然造成菌丝体的性质有所差异，所生产的冬虫夏草发酵产品在化学成分和活性物质与天然冬虫夏草有差异，因而现有技术中培育出的冬虫夏草普遍存在质量差，营养成分含量较低以及生产周期长等问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够培育出质量优秀、营养成分含量高并且生产周期短的中国被毛孢菌的生产方法。
本发明的技术方案是其特点在于该方法含有如下步骤：
(一)摇床培养
培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，麸皮1-3％，蛋白胨0.1-1％，葡萄糖1-3％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在小于20℃条件下培养8-10天；
(二)发酵种子罐培养
一级、二级发酵培养基按重量百分比为：葡萄糖1-3％，酵母膏1-3％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；培养基装量为发酵罐总容积的70-80％，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5；一级接种量5-10％，(种液量占培养基的比例)二级接种量8-15％，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在15-18℃条件下培养5-8天；
(三)三级、四级发酵培养
三级、四级发酵基础培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，蛋白胨0.1-1.5％，葡萄糖1-3％，酵母膏0.1-0.6％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；三级、四级罐基础培养基装料量为上一级种子量的3-5倍，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；三、四级前3天控温15-18℃，3天后控温13-17℃；培养3-5天后进行补料，补料至罐体总容积的70-80％，补料培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，蛋白胨0.75-1.5％，葡萄糖1-3％，酵母膏0.4-1％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在13-17℃条件下培养5-8天；
(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。
本发明的另一特点是所述的无菌空气的温度高于实时室外大气温度。
本发明具有如下的优点和效果：1、发酵种子阶段(一级、二级发酵培养)，本阶段需要菌种快速增值，故采用单纯的碳源(葡萄糖)和单纯的速效氮源(酵母膏)合理配比，可在5-7天内完成菌种增值。因培养量少，不考虑配方对最终产品质量的稀释效果。2、发酵后期，为了缩短发酵周期，各级罐，尤其是三、四级罐如果增加接种量，将会使菌体很快进入对数生长期，使整个生长周期缩短，通过增加接种量调节，能使级种子罐阶段时间总体缩短6-9天，减少培养时间，将同时会对降低染菌率有很大影响，所以采用补料发酵方法，即二级转三级保证接种量在总培养液体积的1/3-1/5，按照种子量确定下一级发酵罐中的培养液的量，基础接种培养3-5天进行补料操作。基础料和补料采用不同的培养基和控制参数。原理是：初始培养基中的氮源浓度越高，糖的消耗速率越慢，菌体干重越小。这说明在发酵前期，底物含量充足的情况下，高浓度的氮源相比于低浓度的氮源，不利于菌体的生长，培养基中初始氮源浓度高，对菌体前期的生长不利。所以采用在发酵初期速效氮源(酵母膏)0.1-0.6％+迟效氮源(蛋白胨)0.1-1.5％，发酵三-四天时批补料氮源配比速效氮源(酵母膏)0.4-1％+迟效氮源(蛋白胨)0.75-1.5％，整体上，在发酵培养过程中，保证初始培养基的氨基氮含量在0.15-0.50克每毫升，补料培养基氨基氮含量在0.4-0.8克每毫升。3、发酵过程采用不同的控温，一二级种子罐控制15-18℃，在三四级发酵时，随着菌种量增多，菌丝生长会产生一定量的生物热，故三四级前3天控温15-18℃，3天后控温13-17℃至转罐或放罐。通入的无菌空气保证高于实时室外大气温度，保证供气管路无冷凝水产生。
综上所述，由于各级发酵采用不同的培养基和培养条件，采用加大接种量和补料加富培养基的方法，缩短了发酵周期，可由原来总周期38-42天缩短到30-35天，总发酵周期缩短可降低染菌风险，并降低消耗。产品收率由原7‰增加到9‰。同时由于培养基采用科学的配比，产品的各项质量指标也完全达到药典标准的要求。
具体实施方式
实施例1、该方法含有如下步骤：
(一)摇床培养
培养基按重量百分比为：蚕蛹1％，玉米1％，麸皮1％，蛋白胨0.1％，葡萄糖1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5VVm；在20℃条件下培养8天；
(二)发酵种子罐培养
一级、二级发酵培养基按重量百分比为：葡萄糖1％，酵母膏1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，消泡剂微量，其余为水；培养基装量为发酵罐总容积的70％，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5；一级接种量5％，(种液量占培养基的比例)二级接种量8％，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5VVm；在15℃条件下培养5天；
(三)三级、四级发酵培养
三级、四级发酵基础培养基按重量百分比为：蚕蛹1％，玉米1％，蛋白胨0.1％，葡萄糖1％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，消泡剂微量，其余为水；三级、四级罐基础培养基装料量为上一级种子量的3倍，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5VVm；三、四级前3天控温15℃，3天后控温13℃；培养3天后进行补料，补料至罐体总容积的70％，补料培养基按重量百分比为：蚕蛹1％，玉米1％，蛋白胨0.75％，葡萄糖1％，酵母膏0.4％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5VVm；在13℃条件下培养5天；
(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。
上述的无菌空气的温度高于实时室外大气温度。
实施例2、该方法含有如下步骤：
(一)摇床培养
培养基按重量百分比为：蚕蛹3％，玉米3％，麸皮3％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1.5VVm；在15℃条件下培养9天；
(二)发酵种子罐培养
一级、二级发酵培养基按重量百分比为：葡萄糖3％，酵母膏3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，消泡剂微量，其余为水；培养基装量为发酵罐总容积的80％，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5；一级接种量10％，(种液量占培养基的比例)二级接种量15％，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1.5VVm；在18℃条件下培养8天；
(三)三级、四级发酵培养
三级、四级发酵基础培养基按重量百分比为：蚕蛹3％，玉米3％，蛋白胨1.5％，葡萄糖3％，酵母膏0.6％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，消泡剂微量，其余为水；三级、四级罐基础培养基装料量为上一级种子量的5倍，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1.5VVm；三、四级前3天控温18℃，3天后控温17℃；培养5天后进行补料，补料至罐体总容积的80％，补料培养基按重量百分比为：蚕蛹3％，玉米3％，蛋白胨1.5％，葡萄糖3％，酵母膏1％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1.5VVm；在17℃条件下培养8天；
(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。
上述的无菌空气的温度高于实时室外大气温度。
实施例3、该方法含有如下步骤：
(一)摇床培养
培养基按重量百分比为：蚕蛹2％，玉米2％，麸皮2％，蛋白胨0.5％，葡萄糖2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.03％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1.0VVm；在18℃条件下培养10天；
(二)发酵种子罐培养
一级、二级发酵培养基按重量百分比为：葡萄糖2％，酵母膏2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.03％，消泡剂微量，其余为水；培养基装量为发酵罐总容积的75％，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5；一级接种量7％，(种液量占培养基的比例)二级接种量11％，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1VVm；在16℃条件下培养7天；
(三)三级、四级发酵培养
三级、四级发酵基础培养基按重量百分比为：蚕蛹2％，玉米2％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，酵母膏0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，消泡剂微量，其余为水；三级、四级罐基础培养基装料量为上一级种子量的4倍，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1VVm；三、四级前3天控温16℃，3天后控温15℃；培养4天后进行补料，补料至罐体总容积的75％，补料培养基按重量百分比为：蚕蛹2％，玉米2％，蛋白胨1.1％，葡萄糖2％，酵母膏0.6％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是1VVm；在15℃条件下培养7天；
(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。
上述的无菌空气的温度高于实时室外大气温度。

Claims (2)

1.一种中国被毛孢菌的生产方法，其特征在于该方法含有如下步骤：
(一)摇床培养
培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，麸皮1-3％，蛋白胨0.1-1％，葡萄糖1-3％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在小于20℃条件下培养8-10天；
(二)发酵种子罐培养
一级、二级发酵培养基按重量百分比为：葡萄糖1-3％，酵母膏1-3％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；培养基装量为发酵罐总容积的70-80％，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5；一级接种量5-10％，二级接种量8-15％，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在15-18℃条件下培养5-8天；
(三)三级、四级发酵培养
三级、四级发酵基础培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，蛋白胨0.1-1.5％，葡萄糖1-3％，酵母膏0.1-0.6％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；三级、四级罐基础培养基装料量为上一级种子量的3-5倍，用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；三、四级前3天控温15-18℃，3天后控温13-17℃；培养3-5天后进行补料，补料至罐体总容积的70-80％，补料培养基按重量百分比为：蚕蛹1-3％，玉米1-3％，蛋白胨0.75-1.5％，葡萄糖1-3％，酵母膏0.4-1％，硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，消泡剂微量，其余为水；用氢氧化钠调节PH值至7.0-7.5，通入无菌空气的压力是0.11-0.15MPa，通气比是0.5-1.5VVm；在13-17℃条件下培养5-8天；
(四)出罐、过滤，得到中国被毛孢菌丝体。
2.如权利要求1所述的通入无菌空气，其特征在于无菌空气的温度高于实时室外大气温度。
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