CN112322508A - 一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，包括制备灵芝菌丝体PDA种子、制备灵芝菌丝体液体种子和发酵培养灵芝菌丝体。其中发酵培养灵芝菌丝体具体为先制备发酵培养基并灭菌，然后在摇床中培养，培养条件：接种量4%、温度28℃、转速160rpm/min，先培养2.5天，后流加10g灭菌的黄豆粉，再培养两天结束发酵，收集灵芝菌丝体，并对灵芝菌丝体提取灵芝多糖。通过该方法获得的灵芝菌丝球较小、数量更多，发酵周期更短、灵芝多糖含量更高，显著降低了工业化生产成本、提高了企业的经济效益。

Description

一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法
技术领域
本发明涉及灵芝多糖技术领域，特别是涉及一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法。
背景技术
灵芝（Ganoderma spp.）是中国最著名的药用真菌之一，它具有广泛的药理作用和极低的毒性，临床上可用于辅助治疗各种疾病，证明其具有抑制肿瘤、增强免疫、延缓衰老、保肝等功能。研究表明灵芝子实体和菌丝体组成没有明显的差别。传统上，灵芝是通过野外采集或人工栽培获得的。但灵芝子实体形成周期长，所需劳动强度大。随着液体深层发酵技术的发展，已可以对许多大型真菌进行大规模培养。
灵芝多糖是灵芝菌丝体中主要活性成分，已证明灵芝多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血脂、降血糖、抗氧化和抗衰老等作用功能。灵芝多糖主要是通过调节机体免疫功能而达到抗肿瘤目的。灵芝多糖的免疫调节作用是各种作用的基础,其免疫增强作用及免疫恢复作用的实现主要依赖于两个方面：一是对免疫细胞直接作用的结果；另一是通过机体神经一内分泌一免疫系统的相互调节作用的实现。灵芝多糖具有抗肿瘤、抗血栓及抗凝血的作用。
现有技术培养的灵芝菌丝体所获得的灵芝多糖含量不多，这显著影响了灵芝多糖的得率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法。通过该方法获得的灵芝菌丝球较小、数量更多，发酵周期更短、灵芝多糖含量更高，降低了工业化生产成本、显著提高了企业的经济效益。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌丝体PDA种子：首先将PDA培养基于120℃-125℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，将灵芝菌丝体液体种子接种在发酵培养基中，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养2.5天，然后流加10g灭菌的黄豆粉，在同样温度下继续培养两天，结束发酵，收集灵芝菌丝体。
进一步地，步骤（1）于123℃下灭菌30分钟。
进一步地，步骤（2）液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g,KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L。
进一步地，步骤（3）发酵培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖 20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L。
进一步地，步骤（3）灵芝菌丝体液体种子在发酵培养基上的接种量为4%。
本发明的有益效果体现在：
通过本发明方法获得的灵芝菌丝球较小、数量更多，发酵周期更短、灵芝多糖含量更高，显著降低了工业化生产成本、提高了企业的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
其中，下面所述PDA培养基为通用配方，具体组成为土豆200g；葡萄糖20g；琼脂20g，水1000mL。
实施例1 一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌丝体PDA种子：首先将PDA培养基于120℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L；然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，发酵培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖 20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L；将灵芝菌丝体液体种子接种在灭菌后的发酵培养基中，接种量为4%，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养2.5天，然后流加10g灭菌的黄豆粉，在同样温度下继续培养两天，结束发酵，收集灵芝菌丝体。
实施例2 一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌丝体PDA种子：首先将PDA培养基于125℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L；然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，发酵培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖 20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L；将灵芝菌丝体液体种子接种在灭菌后的发酵培养基中，接种量为4%，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养2.5天，然后流加10g灭菌的黄豆粉，在同样温度下继续培养两天，结束发酵，收集灵芝菌丝体。
实施例3 一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌丝体PDA种子：首先将PDA培养基于123℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L；然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，发酵培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖 20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L；将灵芝菌丝体液体种子接种在灭菌后的发酵培养基中，接种量为4%，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养2.5天，然后流加10g灭菌的黄豆粉，在同样温度下继续培养两天，结束发酵，收集灵芝菌丝体。
对比例1 一种灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：
（1）制备PDA灵芝菌丝体种子：首先将PDA培养基于123℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L；然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，发酵培养基配方为：黄豆粉 10 g，酵母泥 5 g，葡萄糖 10 g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L；将灵芝菌丝体液体种子接种在灭菌后的发酵培养基中，接种量为4%，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养4.5天，收集灵芝菌丝体。
对比例2 一种灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：
（1）制备PDA灵芝菌丝体种子：首先将PDA培养基于123℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L；然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，发酵培养基配方为：黄豆粉 10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖 10 g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1L；将灵芝菌丝体液体种子接种在灭菌后的发酵培养基中，接种量为4%，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养4.5天，收集灵芝菌丝体。
试验例 相关实验研究
1、本发明培养方法（实施例3）和对比例1和2所获得的灵芝菌丝体大小和数量对比，结果如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1数据可知，本发明培养方法所获得的灵芝菌丝体在大小上明显小于对比例1和对比例2；在菌丝体数量上明显多于对比例1和对比例2。
2、本发明培养方法（实施例3）和对比例1和2所获得的灵芝菌丝体，其多糖含量的比较。
具体指标和试验方法如下：
（1）多糖含量的测定(苯酚一硫酸法)： 标准曲线的绘制 吸取浓度0．1 g／L的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分别置于试管中，依 次加水至总体积1 mL，同时吸取1 mL蒸馏水于试管 中作为空白对照，分别加入5％的苯酚溶液1 mL，混匀后迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后静置30 分钟，于 490 nm波长处测吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度 值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：取灵芝菌丝体反复洗涤三次，确保菌丝球洗干净，后提取灵芝多糖。取样品稀释液l mL于试管中，加5％的苯酚溶液 1 mL，混匀后迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后静置30 min， 于490 nm波长处测定吸光度值。根据标准曲线计算样品中粗多糖含量。
多糖提取率的计算：多糖提取率=多糖含量／样品干重x100％
(2) 灵芝菌丝体干重 离心（4000rpm/min，20 min）后，50℃烘干沉淀，去掉对照值后计算。具体结果如表2所示。
表2
Figure 121700DEST_PATH_IMAGE002
由表2数据可知，本发明培养方法，灵芝菌丝体干重和多糖提取率均明显大于对比例1和对比例2；故本发明培养方法所获得的灵芝菌丝体品质更高。
3、获得相同数量的菌丝体所需要的发酵时间研究：
分别采用实施例3、对比例1和对比例2的培养方式对灵芝菌丝体进行培养，培养至菌丝体干重至0.3g/100ml，统计其所需的发酵时间，结果如表3所示;
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表3可知，培养至同样干重的情况下，本发明所需的培养时间最短。
综上，通过本发明方法获得的灵芝菌丝球较小、数量更多，发酵周期更短、灵芝多糖含量更高，显著降低了工业化生产成本、提高了企业的经济效益。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (5)

1.一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌丝体PDA种子：首先将PDA培养基于120℃-125℃下灭菌30分钟，取豆粒大小的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，在28℃的恒温培养基中培养一周，收集PDA试管灵芝菌丝体种子，备用；
（2）制备灵芝菌丝体液体种子：制备液体种子培养基，然后于121℃下灭菌30分钟；将灵芝菌丝体PDA种子在无菌环境下接种在液体种子培养基中，在摇床中培养，培养条件：温度28℃、转速160rpm/min，培养时间5天；收集灵芝菌丝体液体种子，备用；
（3）发酵培养灵芝菌丝体：制备发酵培养基并灭菌，将灵芝菌丝体液体种子接种在发酵培养基中，在摇床中培养，培养条件为：温度28℃、转速160rpm/min；培养2.5天，然后流加10g灭菌的黄豆粉，在同样温度下继续培养两天，结束发酵，收集灵芝菌丝体。
2.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，其特征在于，步骤（1）于123℃下灭菌30分钟。
3.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，其特征在于，步骤（2）液体种子培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖20g，蛋白胨5g, KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1L。
4.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，其特征在于，步骤（3）发酵培养基配方为：酵母浸粉5 g，葡萄糖 20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L。
5.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖含量的灵芝菌丝体培养方法，其特征在于，步骤（3）灵芝菌丝体液体种子在发酵培养基上的接种量为4%。
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