CN113502232A - 一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法 - Google Patents

一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，包括制备灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液，然后将混合种子液一同接种在混合发酵液培养基中，进行混合发酵培养，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合发酵液。通过本发明方法使得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体能在同一培养环境下共生，相互促进，能够获得较高的菌丝体与多糖产量，共培养下所获得的多糖，其免疫力效果更优。本发明方法显著降低了工业化生产成本、提高了企业的经济效益。

Description

一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法。
背景技术
猴头菇中存在“猴头菇多糖”的活性成分，这种活性成分不被人体所消化，却能和细胞膜上的受体结合，对胃产生影响。经过研究，发现猴头菇多糖能改善多项胃部的不良症状，如食欲不佳、胃胀，或轻微的胃溃疡。同时能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进免疫球蛋白的产生，提升白细胞，提高淋巴细胞的转化率和机体本身的抗病能力，增加机体对化疗、放疗的耐受性，抑制癌细胞的生长与扩散，阻止癌细胞DNA、RNA合成。诱导干扰素的产生、增加抗癌效果等作用。
灵芝多糖是多孔菌科灵芝属真菌菌丝体的次生代谢产物，存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中。灵芝多糖是灵芝的最有效成分之一，因此，也特别受到医药科技工作者的重视，对它的研究报道也最多。已分离到的灵芝多糖有200多种，其中有数十种的结构已被搞清，分子量已被测定。灵芝多糖有多方面的药理活性：能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度，抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA，蛋白质的能力，延长寿命等。
针对于此，本研究旨在提供一种方法，通过该方法能明显促进灵芝菌丝体和猴头菇菌丝体中多糖的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法。通过该方法使得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体之间相互促进，多糖含量有了大幅度提高。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，包括如下步骤：
(1)制备灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液：
取灵芝菌丝体的PDA培养物与猴头菇菌丝体的PDA培养物一同接种在混合种子液培养基中，在摇床中培养2.5天，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液，备用；
(2)将步骤(1)所得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液以5％的接种量先接种在240ml混合发酵液培养基中，于摇床中培养，培养1.5天，然后再一次性流加160ml混合发酵培养液继续培养，培养条件为：温度27℃、时间2.5天、摇床转速160rpm/min，培养完成后，用1mol/L的氨水调节发酵液pH值在6.5左右，再继续摇床培养，直到第四天培养结束，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合发酵液。
优选地，步骤(1)中所述混合种子液培养基的成分为：葡萄糖4.5g，胰蛋白胨1.2g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.4g，水200g。
优选地，步骤(1)中培养条件为：温度27℃，摇床转速160rpm/min。
优选地，步骤(2)中所述混合发酵液培养基的成分为：葡萄糖9g，胰蛋白胨2.4g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁0.8g，水400g。
本发明的有益效果体现在：
通过本发明方法使得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体能在同一培养环境下共生，相互促进，能够获得较高的菌丝体与多糖产量，共培养下所获得的多糖，其免疫力效果更优。本发明方法显著降低了工业化生产成本、提高了企业的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，包括如下步骤：
(1)制备灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液：
取灵芝菌丝体的PDA培养物与猴头菇菌丝体的PDA培养物一同接种在混合种子液培养基中，其中混合种子液培养基的成分为：葡萄糖4.5g，胰蛋白胨1.2g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.4g，水200g；在摇床中培养，培养条件为温度27℃，摇床转速160rpm/min，培养2.5天，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液，备用；
(2)将步骤(1)所得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液以5％的接种量先接种在240ml混合发酵液培养基中，其中混合发酵液培养基的成分为：葡萄糖9g，胰蛋白胨2.4g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁0.8g，水400g；于摇床中培养，培养1.5天，然后再一次性流加160ml混合发酵培养液继续培养，培养条件为：温度27℃、时间2.5天、摇床转速160rpm/min，培养完成后，用1mol/L的氨水调节发酵液pH值在6.5左右，再继续摇床培养，直到第四天培养结束，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合发酵液。
对比例1灵芝菌丝体单独发酵培养，培养方法如下：
(1)制备灵芝菌丝体种子液：取灵芝菌丝体的PDA培养物接种在灵芝菌丝体种子液培养基中，在摇床中培养，培养条件为：温度27℃、时间2.5天、摇床转速160rpm/min；灵芝菌丝体种子液培养基的成分为：葡萄糖4g，胰蛋白胨1g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.2g，水200g；
(2)取灵芝菌丝体种子液以5％的接种量，接种到灵芝菌丝体发酵液培养基中，在摇床中培养，其中灵芝菌丝体发酵液培养基的成分为：葡萄糖8g，胰蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁0.8g，水400g；培养条件为：温度27℃、时间4天、摇床转速160rpm/min；即得灵芝菌丝体发酵培养液。
对比例2猴头菇菌丝体单独发酵培养，培养方法如下：
(1)制备猴头菇菌丝体种子液：取猴头菇菌丝体的PDA培养物接种在猴头菇菌丝体种子液培养基中，在摇床中培养，培养条件为：温度27℃、时间2.5天、摇床转速160rpm/min；猴头菇菌丝体种子液培养基的成分为：葡萄糖4g，胰蛋白胨1g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.4g，水200g；
(2)取猴头菇菌丝体种子液以5％的接种量，接种到猴头菇菌丝体发酵液中，在摇床中培养，其中猴头菇菌丝体发酵液培养基成分为：葡萄糖8g，胰蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁0.4g，水400g；培养条件为：温度27℃、时间4天、摇床转速160rpm/min，即得猴头菇菌丝体发酵培养液。
试验例1对实施例1、对比例1和对比例2中的多糖含量和菌丝体干重进行分析
(1)多糖含量的测定(苯酚一硫酸法)：
首先绘制标准曲线：吸取浓度为0.1g/L的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，分别置于试管中，依次加水至总体积1mL，同时吸取1mL蒸馏水于试管中作为空白对照，分别加入5％的苯酚溶液1mL，混匀后迅速加入5mL浓硫酸，摇匀后静置30分钟，于490nm波长处测吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品中多糖含量的测定：称取实施例1、对比例1和对比例2中同等重量的发酵液，取菌丝体反复洗涤三次，确保菌丝球洗干净，后提取多糖。取样品稀释液l mL于试管中，加5％的苯酚溶液1mL，混匀后迅速加入5mL浓硫酸，摇匀后静置30min，于490nm波长处测定吸光度值。根据标准曲线计算样品中粗多糖含量。其中，多糖提取率＝多糖含量/样品干重x100％。
菌丝体干重的测定：将样品离心(4000rpm/min，20min)后，用纯化水洗涤离心三次，50℃烘干沉淀，去掉对照值后计算。结果如表1所示。
表1
分组 对比例1 对比例2 实施例1
多糖提取率 2.4％ 3.1％ 3.6％
菌丝体干重g/100ml 0.28 0.29 0.32
由表1数据可知，多糖提取率与菌丝体干重呈现一个正向的关系，灵芝菌丝体发酵组(对比例1)与猴头菇菌丝体发酵组(对比例2)所获得的多糖与菌丝体量少于两组共培养的发酵方式(实施例1)，由此表明，通过灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体共培养的发酵方式能获得高的灵芝菌丝体产量，提高产能。
试验例2实施例1、对比例1和对比例2中的多糖产物，对肉鸡的抗氧化性能试验
(1)分别提取实施例1、对比例1和对比例2中的多糖后，取同等重量的多糖制备成多糖粉，备用；
(2)选刚孵化的肉鸡，饲喂7日龄左右，分成三组，每组17只肉鸡，先按照上述不同分组饲喂相应的多糖粉，饲喂加量为每天0.1g/只。先饲喂五天，后给每只鸡注射0.3ml的大肠杆菌，使肉鸡患病，在这期间一直饲喂相应的多糖粉，一直喂养20天左右，最后分别以脾脏与胸腺器官重量与动物体重的比值和SOD、GSH值为指标来证明不同多糖粉的抗氧化效果。结果如表2和表3所示。
表2脾脏与胸腺器官重量与动物体重的比值结果
分组 对比例1 对比例2 实施例1
比值大小/％ 0.39 0.34 0.48
表3三组肉鸡的SOD、GSH值
分组 一组 二组 三组
SOD(U/mg) 13.2 14.1 16.2
GSH(ng/mg) 98.5 97.3 103.8
由表2和表3数据可知，实施例1中的各项指标都优于其它两组，即灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体共培养来获得的产物提取的多糖作用效果要优于其单独培养所获得的多糖。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (4)

1.一种灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液：
取灵芝菌丝体的PDA培养物与猴头菇菌丝体的PDA培养物一同接种在混合种子液培养基中，在摇床中培养2.5天，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液，备用；
(2)将步骤(1)所得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合种子液以5％的接种量先接种在240ml混合发酵液培养基中，于摇床中培养，培养1.5天，然后再一次性流加160ml混合发酵培养液继续培养，培养条件为：温度27℃、时间2.5天、摇床转速160rpm/min，培养完成后，用1mol/L的氨水调节发酵液pH值在6.5左右，再继续摇床培养，直到第四天培养结束，制得灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体混合发酵液。
2.根据权利要求1所述的灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合种子液培养基的成分为：葡萄糖4.5g，胰蛋白胨1.2g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.4g，水200g。
3.根据权利要求1所述的灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，其特征在于，步骤(1)中培养条件为：温度27℃，摇床转速160rpm/min。
4.根据权利要求1所述的灵芝菌丝体与猴头菇菌丝体高效共发酵方法，其特征在于，步骤(2)中所述混合发酵液培养基的成分为：葡萄糖9g，胰蛋白胨2.4g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1.6g，硫酸镁0.8g，水400g。
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