CN108531409B - 一种海洋红酵母高密度发酵方法 - Google Patents

一种海洋红酵母高密度发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种海洋红酵母高密度发酵方法。本发明在使用常规培养基原料的基础上，添加自制土豆浸汁以补充碳源及生长因子，获得优质种子液；然后采用两级发酵工艺，且发酵罐发酵培养14‑16h后，再补加葡萄糖5.0‑7.5g/L，继续发酵8‑10h；最后，添加调节剂完成产品制备。本发明方法操作简单，发酵原料需求量低，生产周期短，类胡萝素总含量高，10t罐发酵液类胡萝卜素含量为41mg/L。

Description

一种海洋红酵母高密度发酵方法
技术领域
本发明属于海洋微生物发酵及综合利用技术领域，具体涉及一种海洋红酵母高密度发酵方法。
背景技术
海洋红酵母是酵母菌中的一种，属于隐形球酵母科，为单细胞真菌，能产生β-胡萝卜素、虾青素、圆酵母素和红酵母红素等多种色素。
鱼、虾、贝、蟹等水产经济动物养殖中，保苗、壮苗、育苗工作十分重要。医用或食用的酵母在海水中不能生存造成死体悬浮；白色酵母因产生黏性物较多，高浓度培养易产生“凝集现象”；海洋红酵母营养要求简单、菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素等，适用于大规模生产，也具有广阔的市场前景。
与白色酵母发酵工艺相比，海洋红酵母发酵难度更大，要求更高：在高活菌的基础上，保证类胡萝卜素等次生代谢产物高产量的稳定并不易。在摇瓶水平下，赵玉巧等分离获得的海洋红酵母Rhodotorula sp.Z44在蔗糖25g/L，酵母膏20.8g/L的培养基中，30℃发酵66h，类胡萝卜素产量为6.72mg/L；梁晓华等研究海洋红酵母Y2在碳源葡萄糖45g/L，氮源蛋白胨为20g/L的培养基中20℃发酵72h，类胡萝卜素产量达到4.97mg/L；专利CN146290A中公开了一种海洋红酵母进行一次性投料液体发酵，放大培养60h，海洋红活菌数达1.2×1010CFU/mL；专利CN106010990A中500L(装液量60％)发酵水平下，28℃发酵96h，类胡萝卜素产量达到36mg/L；
除要求菌株自身代谢性能好以外，菌株的传代稳定性、培养基的优化工艺和多级发酵培养技术对发酵结果至关重要。因此，优化海洋红酵母微生态制剂的制备技术对其产品的大生产及应用意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋红酵母高密度发酵方法。
其中，所述海洋红酵母高密度发酵方法包括步骤如下：
1)种子液制备：将所述海洋红酵母单菌落接种至种子液制备培养基中，180-200rpm，25-28℃培养24-36h；
种子液制备培养基为：葡萄糖5-10g/L，酵母粉2-5g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，KH2PO41.5-2g/L，Na2HPO4 1-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L，自制土豆浸汁200mL，所述的自制土豆浸汁制作方法如下：将新鲜土豆，蒸熟后去皮，按200g/L溶于水中，静置后取上层液进行培养基配制；
2)种子罐发酵：将步骤1)制备的菌株种子液按照1.0-3.0％的接种量接入种子罐进行发酵，发酵温度25-28℃，转速200-250rpm，灌压0.05-0.08Mpa，通风比是1:0.5-1，初始pH值为5.5-6.0，发酵时间20-24h；
3)发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，按照3-5％的接种比例接入发酵罐进行发酵，发酵温度25-30℃，转速200-250rpm，灌压0.06-0.08Mpa，通风比是1:0.5-1，初始pH值为5.5-6.0，发酵培养14-16h后，再补加葡萄糖5.0-7.5g/L，继续发酵8-10h。
种子罐和发酵罐培养基为：葡萄糖16-20g/L，蛋白胨2-3g/L，酵母粉8-10g/L，KH2PO4 1-2g/L，Na2HPO4 1-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L，海盐20g/L。
其中，所述的海洋红酵母优选为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)CGMCCNo.13012。
本发明的的胶红酵母为申请人分离筛选并诱变的一株高产类胡萝卜素的胶红酵母新菌株，其特点是：(1)菌株生长速度快，产类胡萝卜素能力强，50mL/150mL摇瓶水平下，类胡萝卜素含量为8.82mg/L，且菌体含有丰富的蛋白质，粗蛋白≥41％；(2)菌株适宜低温高盐条件，温度为12-28℃，盐度为0-35‰条件下均正常生长，温度越低产类胡萝卜素能力越佳；适用范围广。(3)菌株经过10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，且产类胡萝卜素的能力比原菌显著提高。
本发明中的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)新菌株，已于2016年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13012。
其中，发酵罐发酵完成后，酵母菌活菌数为2.1×1010CFU/mL，粗蛋白≥41％，类胡萝卜素含量≥41mg/L，含有维生素B族生长因子。
本发明中海洋红酵母微生态制剂及其制备方法，其特征在于：(1)是一种具有酒香气(适口性强)的单细胞真菌蛋白制剂；(2)菌体沉降慢，分散性好：一桶5L，浓度为1010CFU/mL的发酵液，完全沉降需要3周多时间，而相同条件的芽孢杆菌液体制剂4h沉降完毕。(3)查阅资料比较可知，本专利菌株Y4-5生长营养需求低，生长代谢周期短，类胡萝卜素产量高。而本专利菌株Y4-5，在50mL/250mL水平下,在葡萄糖10g/L，酵母膏+蛋白胨＝5+2.5g/L培养基中，28℃发酵24h类胡萝卜素产量为9.12mg/L，10吨发酵罐水平下，28℃发酵24h海洋红酵母菌活菌数为2.1×1010CFU/mL，类胡萝卜素产量≥41mg/L(4)菌体富含高价值蛋白，营养全面。粗蛋白≥41％，并含有维生素B族等生长因子。(5)本发明专利提供了，1)种子液培养优化：保证菌株从平板菌落状态到摇瓶液体状态，再到发酵罐发酵液状态，菌株产类胡萝卜素能力稳定转化；2)深层通气两级发酵补加碳源工艺：解决发酵液活菌数浓度低和类胡萝卜素产量再提高问题，实现高质量的工业化生产转化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 海洋红酵母种子液的优化培养试验
接种纯化好的单菌落于液体培养基中，研究培养基成分对海洋红酵母Y4-5生长和类胡萝卜素合成的影响。培养条件为：温度28℃，摇瓶装液量50mL/250mL，转速180rmp，接种量10％，培养基初始pH 6.0，发酵48h取样测定细胞干重和类胡萝卜素产量，计算类胡萝卜素总含量(mg/L)。
(1)培养基单因素试验
碳源的选择：碳源选用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖以及麦芽糖，都分别以15g/L的浓度添加到无碳基础培养基(酵母粉8g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钠5g/L)。
结果表明：菌株Y4-5在乳糖中生长情况较差，葡萄糖、蔗糖、果糖及麦芽糖对提高类胡萝卜素产量提高较有利。又综合考虑原料来源难易和成本，选择碳源为葡萄糖和蔗糖。
葡萄糖浓度优化:分别以5、10、15、20g/L的葡萄糖浓度添加到无碳基础培养基中。结果表明，葡萄糖浓度为5-15g/L范围内，随着糖浓度的增加，生物量和类胡萝卜素产量都随之增加；当糖浓度高于15g/L时，生物量和类胡萝卜素产量开始下降，尤其是色素产量下降明显。同理得，蔗糖浓度高于10g/L时，对类胡萝卜素产量和生物细胞量提高程度不明显。
2)氮源的选择:氮源选用酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾，以5g/L的浓度添加到无氮基础培养基(葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钠5g/L)。结果表明：蛋白胨对酵母细胞生长影响最大，酵母粉对色素产量影响最大。
混合氮源的影响:选择不同比例的酵母粉和蛋白胨进行实验，固定蛋白胨浓度为2.5g/L，使酵母粉与蛋白胨的比例分别为0:1、1:1、2:1、3:1和4:1。结果表明：且酵母粉：蛋白胨＝2:1时，类胡萝卜素的产量最高。
3)无机盐的影响：在确定碳源、氮源的基础上，参考前人研究成果，分别添加磷酸二氢钾0、0.5、1、1.5、2和2.5g/L，其他成分不变。添加0、0.5、1、1.5、2和2.5，其他成分不变。在确定碳源、氮源、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠浓度基础上，分别添加七水硫酸镁0、0.25、0.5、0.75和1.0/L，其他成分不变。在确定碳源、氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和七水硫酸镁浓度基础上，同时进行添加0.2g/L的氯化钙，和不添加对照组实验。
结果表明：当磷酸二氢钾、磷酸氢二钠浓度分别为1g/L时，生物细胞量最高；七水硫酸镁浓度为1g/L时，类胡萝卜素产量最高；氯化钙有利于类胡萝卜素产量的提高，但对生物细胞量无影响。
(2)培养基优化正交试验：根据前面单因素试验的结果，采用7因素3水平正交设计试验优化发酵培养基，正交设计表为L18(37)如表1。
表1 正交因子水平表
Figure BDA0001239312980000051
得到优化种子液培养基P8配方为:葡萄糖10g/L，蔗糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2.5g/L，KH2PO4 2g/L，Na2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 0.2g/L。类胡萝卜素产量达到8.82mg/L。培养基115℃灭菌，20min。
表2 正交实验结果与极差分析
Figure BDA0001239312980000052
Figure BDA0001239312980000061
实施例2 海洋红酵母优化培养基P8碳源再优化试验
使用实施例1中所得优化培养基P8，进行海洋红酵母的一级和二级摇瓶培养，验证培养基效果。在超净台中，首先将Y4-5菌株单菌落接种至培养基P8中，250mL摇瓶装液量为50mL，转速180rpm，28℃培养30h；然后按照10％的接种量将一级发酵液接入二级摇瓶，1000mL摇瓶装液量为300mL，转速200rpm，28℃培养24h。观察发酵液颜色和测定发酵液色素含量和活菌数。
表3 利用培养基P8一级摇瓶和二级摇瓶培养结果比较
批次 活菌数 类胡萝卜素含量 发酵液颜色
一级种子液 6.2×10<sup>9</sup>CFU/mL 8.82mg/L 鲜艳红色
二级种子液 3.4×10<sup>9</sup>CFU/mL 4.89mg/L 浅橙色
由表3可见，使用培养基P8进行两级种子液制备，所得活菌数无显著差异，但类胡萝卜素含量差异显著，二级摇瓶减少为4.89mg/L，说明使用此培养基不同级发酵液质量并不稳定；另外，蔗糖和葡萄糖等糖类在高温下发生美拉德褐色反应对菌株所产色素有掩盖作用，会影响产品外观性状，不利于肉眼观察。
因此，在培养基P8的基础上进行碳源再优化实验。分别使用自制土豆浸汁、市售土豆粉、玉米黄粉替代优化培养基P8中蔗糖，测试发酵液结果，见表4。培养条件同上。综上所述，由自制土豆浸汁替代培养基P8中的蔗糖效果最佳，并进行重复实验，结果稳定。
最后，确定种子液优化培养基P9配方为：葡萄糖5-10g/L，酵母粉2-5g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，KH2PO4 1.5-2g/L，Na2HPO4 1-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L，自制土豆浸汁200mL。自制土豆浸汁制作方法为：称取200g新鲜土豆，蒸熟后去皮，捣碎溶于1L蒸馏水，静置10min，取上层液进行培养基配制。培养基115℃灭菌，20min。
表4 培养基P8碳源再优化结果
Figure BDA0001239312980000071
类胡萝卜素的提取方法：1)破壁方法：超声波辅助酸热法：取干菌体放入带帽试管中，按照15ml/g干菌体的量加入3mol/L盐酸(需要配制)，浸泡40min。浸泡过程中将试管至于超声波条件下。破壁完成之后，向细胞碎片中加入丙酮。2)2倍于盐酸破壁液体积作为浸提液，浸泡30min，4000r/min离心15min，所得上清液即为丙酮的类胡萝卜素浸提液。将浸提液用484nm测定。
类胡萝卜素含量测定(mg/g)＝OD*D*V/(0.16*W)*1000
(D为稀释倍数；V为有机溶剂体积；W为提取用菌体干重；0.16为有机溶剂消光系数。)测定吸光度，单位：mg/g。
类胡萝卜素总量(mg/L)＝类胡萝卜素含量×细胞干重
实施例3 海洋红酵母种子液制备
(1)菌种使用前活化，即将菌种再接种到活化固体培养基上，在25-28℃下培养，并接代培养2-3代，使其扩大繁殖并茁壮菌落。活化固体培养基为：酵母粉15g/L，MgSO4·7H2O1g/L，蔗糖40g/L，琼脂粉20g/L，海水(20g/L蒸馏水)1000mL。
(2)种子液制备：将海洋红酵母Y4-5单菌落接种至优化培养基P9中，1000mL摇瓶装液量为400mL，200rpm，28℃培养36h。共培养4L种子液。
实施例4 海洋红酵母种子罐(1t)发酵培养
将制得的Y4-5菌株种子液接入种子罐进行发酵(接种比例为1％)，1t发酵罐装液400L，发酵温度25℃，转速180rpm，灌压0.05Mpa，通风比是1:0.5，初始pH值为6.0，发酵时间22h；
种子罐发酵培养基配方P10为：葡萄糖16g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉8g/L，KH2PO4 1g/L，Na2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 0.2g/L，海盐20g/L，115℃灭菌，30min。
实施例5 海洋红酵母发酵罐(10t)普通发酵培养
发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，400L接入发酵罐进行发酵，10t发酵罐装液6t，发酵温度28℃，转速200rpm，灌压0.05Mpa，通风比是1:0.6，初始pH值为6.0，发酵培养30h后结束发酵。发酵罐培养基为培养基P10。培养基115℃灭菌，30min。发酵液测定结果为：酵母菌活菌数为7.2×109CFU/mL，粗蛋白≥35％，类胡萝卜素含量≥26mg/L。
实施例6 海洋红酵母发酵罐(10t)补加碳源发酵培养
发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，400L接入发酵罐进行发酵，10t发酵罐装液6t，发酵温度28℃，转速200rpm，灌压0.05Mpa，通风比是1:0.6，初始pH值为6.0，发酵培养16h后，按照浓度5.0g/L补加葡萄糖，继续发酵8h。发酵罐培养基为培养基P10。培养基115℃灭菌，30min。
发酵液测定结果为：酵母菌活菌数为2.1×1010CFU/mL，粗蛋白≥41％，类胡萝卜素含量≥41mg/L。
综上所述，为确保发酵效果，缩短发酵时间，使用发酵罐补料发酵工艺：发酵温度25-30℃，转速200-250rpm，灌压0.06-0.08Mpa，通风比是1:0.5-1，初始pH值为5.5-6.0，发酵培养14-16h后，再补加葡萄糖5.0-7.5g/L，继续发酵8-10h。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)高密度发酵方法，其特征在于，包括步骤如下：
（1）种子液制备：将所述海洋红酵母单菌落接种至种子液制备培养基中，180-200rpm，25-28℃培养24-36h；种子液制备培养基为：葡萄糖5-10g/L，酵母粉2-5g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，KH2PO4 1.5-2g/L，Na2HPO4 1-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L，自制土豆浸汁200mL，所述的自制土豆浸汁制作方法如下：将新鲜土豆，蒸熟后去皮，按200g/L溶于水中，静置后取上层液进行培养基配制；
（2）种子罐发酵：将步骤1)制备的菌株种子液按照1.0-3.0％的接种量接入种子罐进行发酵，发酵温度25-28℃，转速200-250rpm，灌压0.05-0.08Mpa，通风比是1:0.5-1，初始pH值为5.5-6.0，发酵时间20-24h；
（3）发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，按照3-5％的接种比例接入发酵罐进行发酵，发酵温度25-30℃，转速200-250rpm，灌压0.06-0.08Mpa，通风比是1:0.5-1，初始pH值为5.5-6.0，发酵培养14-16h后，再补加葡萄糖5.0-7.5g/L，继续发酵8-10h；种子罐和发酵罐培养基为：葡萄糖16-20g/L，蛋白胨2-3g/L，酵母粉8-10g/L，KH2PO4 1-2g/L，Na2HPO4 1-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L，海盐20g/L；所述的海洋红酵母为胶红酵母CGMCC No.13012。
2.如权利要求1所述的海洋红酵母高密度发酵方法，其特征在于，发酵罐发酵完成后，酵母菌活菌数为2.1×1010CFU/mL，粗蛋白≥41％，类胡萝卜素含量≥41mg/L，含有维生素B族生长因子。
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CN101705193A (zh) * 2009-11-20 2010-05-12 中国水产科学研究院黄海水产研究所 产虾青素海洋红酵母ys-185及其虾青素的制造方法
CN102715358A (zh) * 2012-04-24 2012-10-10 江苏师范大学 一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法
CN104928199A (zh) * 2015-07-01 2015-09-23 青岛大学 一株高产类胡萝卜素的富铜海洋红酵母及其发酵培养方法

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红酵母Y-5菌株产类胡萝卜素发酵条件的研究;唐棠;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技I辑）》;20120515;摘要、正文第2.2.4节 *
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