CN101148643A - 一种海参用海洋胶红酵母的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海洋微生物应用技术及海参养殖，具体的说是一种海参用海洋胶红酵母的生产方法，所采用菌种为常规的海洋胶红酵母菌种，以陈海水为原料，其中添加有占总重量1.0－3.8％葡萄糖及1－3mlEDTA－Fe/每升陈海水，培养温度为15℃～25℃。本发明所采用的发酵培养基，两级发酵过程和离心浓缩等工艺，操作简单，生产周期短，成本低；生产的产品质量高，在海参育苗中应用可以提高幼体各阶段变态率、成活率；可以加快幼体生长发育，可以改善养殖池水体的生态环境，净化水质，深受用户欢迎，易于推广应用。

Description

一种海参用海洋胶红酵母的生产方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物应用技术及海参养殖，具体的说是一种海参用海洋胶红酵母的生产方法。

背景技术

海洋红酵母(Rhodotorula glutinis Harrison)是真菌界、真菌门、粘菌亚门、隐球酵母科，繁殖方式为无性芽殖。其生态分布广泛，主要分布在海水、海泥、海珍品养殖池中。其碳源氮源利用广泛，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、琥珀酸、柠檬酸、木糖、山梨醇、果糖、乙醇和甘油；不能利用鼠李糖、淀粉、纤维二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、赤藓醇、蜜二糖。并具有生长繁殖速度快、容易培养、菌体及代谢产物营养丰富等特点，其产品能广泛用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面；因此，愈来愈受到科技工作者和企业界人士重视。

在以往研究中，人们对海洋红酵母的分类学地位、生理生化特征、发酵条件及其调控等方面均有较深入的研究。对海洋红酵母的应用研究也获得很大的进展。但对海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)的研究报道不多。海洋胶红酵母在分类学上属于海洋红酵母中的一种，其菌体及其分泌物中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素，不饱和脂肪酸、类胡萝卜素和虾青素等生物活性物质。经测定：海洋胶红酵母中所含的虾青素(类胡萝卜素)≥8000ppm，蛋白质≥50％，赖氨酸100ppm，精氨酸100ppm，蛋氨酸100ppm，在农业环保、保健医药、尤其是在水产养殖中均有较高的应用价值。

目前，在海参养殖中，经常使用的海参幼体饵料有鸡蛋黄、豆浆、食用酵母、酿酒酵母和单细胞藻类等代用饵料。鸡蛋黄、豆浆，容易造成水质污染，食用酵母和酿酒酵母在海水中不能存活且分散性、悬浮性不好，也容易造成水质污染。单细胞等藻类应用效果好，但大量培养时需要大量占用育苗场地和设施并受气候环境影响和制约，常常影响育苗。而低温型海参用海洋胶红酵母的营养成分好、在高渗透压的海水中能存活繁殖且悬浮性好，活性物质稳定、不造成水质污染。可以利用发酵罐工厂化生产，不受场地、设施、环境的影响和制约。

海洋红酵母在海参育苗中的应用国内外报导很多，但低温型海参用海洋胶红酵母的分离、生产及应用未见报导。海洋胶红酵母在海参育苗和养成中应用，可以提高种苗繁殖能力和存活能力，可以促进个体生长、增强免疫力、抗病力和皮肤肌肉色泽，可以促进营养消化吸收。并且可以净化水质、分解水中有机物、硫化氢、氨化物等对海参不利的污染物，无毒、无害、无任何副作用，正常使用不会导致海参产生耐受性，是一种绿色的生物饵料添加剂。具有广阔的市场前景。

近年来，人们非常重视海洋资源的开发和利用，尤其是在海珍品的育苗和养殖上应用海洋酵母取得了非常理想的结果，现在存在的主要问题是：①常规的培养方法菌株生长繁殖速度慢、培养时间长，含菌浓度低。②菌株特性不明显，营养中的虾青素和赖氨酸含量不高，菌种不纯、易退化，不能满足生产应用的需求。国内科研单位正在筛选含有虾青素和赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸含量高的红酵母菌种。根据虾青素、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸的特性和在诸多方面的功能，我们已经分离、纯化、鉴定出多株海洋红酵母，经过驯化、培育、提高得到一株含有虾青素、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸含量高、活性好、生长速度快的低温型海参用的海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)，其应用效果非常好，已在大连地区的旅顺、长兴岛、交流岛等沿海地区广泛应用，并且实现产品的商品化生产。

发明内容

本发明目的在于提供一种生产方法简单、生产周期短成本低、产品质量高、应用效果好的海参用海洋胶红酵母生物饵料的生产方法。其特点是：所采用菌种是已知的，采用微生物两级发酵技术，原料来源广泛，价格低廉，发酵过程中菌体生长繁殖速度快，后处理工艺简单，产品浓度高、活性高、应用范围广、效果好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

以陈海水、葡萄糖和无机盐为发酵原料，采用低温型海参用海洋胶红酵母菌种，经过两级微生物发酵，离心浓缩，生产制造低温型海参用海洋胶红酵母生物饵料。

具体为：一种海参用海洋胶红酵母的生产方法，所采用菌种为常规的海洋胶红酵母菌种，以陈海水为原料，其中添加有占总重量1.0-3.8％葡萄糖及1-3mlEDTA-Fe/每升陈海水，培养温度为15℃～25℃；经工厂化两级液体发酵生产种子液和发酵液；发酵液经离心浓缩制成高浓度高活性海参用海洋胶红酵母生物饵料。海洋胶红酵母液体生物饵料每毫升活菌数≥10亿个。所述陈海水为天然海水放置到暗处储放2-3周，杂质沉淀后过滤而成，盐浓度为2.8-3.0％。

所述EDTA-Fe即为乙二铵四乙酸二钠与硫酸亚铁螯合而成，螯合液中二价铁浓度为0.1M。所述海洋胶红酵母菌种液体种子罐发酵培养，其培养基的重量组成为：葡萄糖1.0-3.8％、蛋白胨0.5-1.2％、酵母膏0.2-1.0％、硫酸铵0.5-1.0％、磷酸氢二钾0.1-0.3％、磷酸二氢钾0.1-0.3％、硫酸镁0.1-0.5％、余量为陈海水、1-3mlEDTA-Fe/每升陈海水、pH 3.8-8.8；种子罐发酵培养条件为：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶10～120(vvm为每分钟单位体积发酵液，通过压缩空气的体积)、转速220-260rpm，培养温度为15℃～25℃，时间为48～72h。

所述海洋胶红酵母生产罐发酵培养基的重量组成为：葡萄糖1.0-3.8％、蛋白胨0.6-1.5％、酵母膏0.3-1.0％、硫酸铵0.5-1.0％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、硫酸镁0.1-0.5％、余量为陈海水、1-3mlEDTA-Fe/每升陈海水、pH3.8-8.8；生产罐发酵培养条件为：罐压0.05-0.06Mpa、风量100∶10～100∶150vvm、转速200-230rpm，培养温度为15℃～20℃，时间为48～96h。

较好的生产罐发酵培养基重量组成为：葡萄糖3.6％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、余量为陈海水、2mlEDTA-Fe/每升陈海水、pH5.8；生产罐发酵培养条件为：罐压0.06Mpa、风量100∶120vvm、转速200rpm，最适培养温度为22℃，时间为72h。

本发明具有如下优点：

1.生产周期短，发酵工艺成熟，易于生产推广。本发明吸取有关海洋微生物生物制剂生产方法的优点，采用已知的海参用海洋胶红酵母为菌种，以陈海水、葡萄糖和无机盐为原料，生产原料来源广泛、价格低廉。经种子罐、发酵罐两级发酵培养，并将发酵液离心浓缩制成高浓度高活性生物饵料，生产工艺过程简单，两级发酵是在低温酸性条件下，对发酵过程进行全程控制，抗污染能力强，种子罐微生物繁殖速度快，生产罐发酵菌数高，生产周期从常规的120h缩短到72h，节省能源，降低成本。易于进行生产推广。

2.产品质量高，营养价值高，应用效果好，对环境友好。本发明采用海参用海洋胶红酵母菌种，采用两级微生物发酵技术，发酵得到的产品每毫升菌悬液含海洋胶红酵母活菌数≥10亿个。生产的海洋胶红酵母中所含的虾青素(类胡萝卜素)≥8000ppm，蛋白质≥50％，赖氨酸100ppm，精氨酸100ppm，蛋氨酸100ppm，不饱和脂肪酸≥15％等生物活性物质，产品质量好。在海参育苗中应用，可使参苗存活率提高20％，在稚参和幼参养殖中应用可以提高抗病力、海参肌肉色泽鲜艳，个体生长加快、营养价值均衡和适口性、营养消化吸收和饲料的消化利用率等方面均有很好的效果。不污染水质，对环境友好，深受用户欢迎，易于生产和推广应用。

具体实施方式

本发明获得的海参用海洋胶红酵母含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素，不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、虾青素等生物活性物质。虾青素化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β-胡萝卜素，是脂溶性艳丽红色色素，具有促生长、抗病、增色作用，具有促进营养消化吸收和对饲料的消化利用作用。

海洋胶红酵母生产发酵步骤如下：

1.种母活化

将海参用海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)等种母，分别移接至新配制的装有海洋胶红酵母培养基的克氏瓶斜面上，活化培养72-96h，温度25℃，活化成熟后的克氏瓶中的菌体称为种子。种母活化用斜面培养基组成为：葡萄糖30g、蛋白胨10g、酵母膏5g、硫酸铵5g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、1mlEDTA-Fe/每升陈海水、陈海水1000mL、琼脂25g、pH6.0；0.8个大气压18分钟灭菌。最适培养温度为22℃，时间为72h。

2.种子罐接种与培养条件

将活化好的克氏瓶中的海参用海洋胶红酵母的种子1瓶，再无菌室内用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差法接种到50立升的种子罐(或100立升的种子罐)中，装液量不超过70％，进行培养，种子罐培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶50vvm、转速230rpm，最适培养温度为22℃，时间为48h。在显微镜下镜检菌体运动活泼，整齐，葡萄串状和分散状各占50％时，无污染，供种子发酵罐进一步扩大繁殖用。

3.生产罐接种与培养条件

将成熟的种子罐中的种子液，用压差法接种到500立升的生产罐(或1000立升的生产罐)中，装液量不超过70％，进行培养，生产罐发酵培养条件为：罐压0.06Mpa、风量100∶120vvm、转速200rpm，最适培养温度为20℃，时间为72h。

4.生产罐发酵与观察

如采用海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)菌种发酵，则出现脂溶性艳丽红色素，可为放罐标志。采样时用三角瓶装入200/500ml发酵液，静置观察，发酵液呈粉红色、橙色和艳丽红色，液体表面有一个环，环越薄越清晰越好，嗅觉感微酸、无异味。显微镜下镜检菌体整齐，健壮，无污染，呈簇状、葡萄串状消失，分散状占100％，含活菌可达到10亿/ml以上。此发酵液含海洋胶红酵母每毫升的活菌数≥10亿个以上，可供离心用。

本实施例采用的海参用海洋胶红酵母菌种发酵，最佳培养基配方及发酵条件为：葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.5％、1mlEDTA-Fe/每升陈海水、余量为陈海水、pH5.6；风量100∶50vvm、转速200rpm、培养温度为22℃，时间为48h。

5.发酵液离心浓缩与产品配制

发酵结束后，将发酵液在离心机上进行4000rpm，10分钟离心，离心后用无菌的陈海水将海参用海洋胶红酵母菌体稀释至所要求的标准。产品为液体菌悬液，标准分别为含海洋胶红酵母100、150、200亿个活菌数/每毫升菌悬液。

6.产品储存和使用方法

将产品速冻后冷藏冷冻存放，-10℃～-20℃冷冻可保存12个月，0℃～4℃冷藏可保存30天，15℃～25℃常温下可保存7天。为保持海洋胶红酵母的生物活性，尽量不要在常温下保藏。使用时在冷水中缓慢溶解溶化，溶化时盖紧瓶盖防止污染，然后将容器中的海洋胶红酵母摇匀，根据计算的用量，用海水进行定量稀释，分散泼洒到海参育苗池中进行应用。

申请者们采用了中国科学院沈阳应用生态研究所分离、纯化、鉴定的海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)，在大连五岛海珍品公司养殖基地的生产实践中进行驯化、培育、提高，获得了高浓度高活性的低温型海参用海洋胶红酵母。其应用效果非常好，已在大连地区的旅顺、长兴岛、交流岛等沿海地区广泛应用，并且实现产品的商品化生产。

经驯化、培育、提高，获得高浓度高活性的低温型海参用海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)，在显微镜下观察，细胞形态为：球状或卵圆状，球状直径为2.3-4.3μm，卵圆状直径大小为2.3～3.5μm×3.5～5.0μm，细胞大多呈簇状、葡萄状或单个状排列，繁殖方式是芽殖，多端出芽，好氧。在平皿培养基上观察，菌落形态为：圆形，菌落隆起，边缘圆整，表面湿润、光滑、粘稠、容易挑起，质地均匀，正面与反面以及中央部位颜色一致，无假菌丝，直径为21.2～33.5μm。在麦芽汁或土豆琼脂培养基上可分离纯化出单菌落，呈红色或橙红色，凸起，粘，挑起时感到粘而有弹性。

海参用海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa MY96)，在海参育苗中应用，可使海参成活率提高20％；在幼稚参养殖中应用，可加快生长发育增强免疫功能，提高抗病能力，促进消化吸收，能明显增加海参的皮肤色泽，使艳丽红着色率达到30％，从试验结果可以看出，海参用海洋胶红酵母对海参变态、稚参和幼参养殖中的应用均具非常理想的结果。

Claims (7)

1.一种海参用海洋胶红酵母的生产方法，所采用菌种为常规的海洋胶红酵母菌种，其特征在于：以陈海水为原料，其中添加有占总重量1.0-3.8％葡萄糖及1-3ml EDTA-Fe/每升陈海水，培养温度为15℃～25℃。经工厂化两级液体发酵生产种子液和发酵液；发酵液经离心浓缩制成高浓度高活性海参用海洋胶红酵母生物饵料。

2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述陈海水为天然海水放置到暗处储放2-3周，杂质沉淀后过滤而成，盐浓度为2.8-3.0％。

3.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述EDTA-Fe即为乙二铵四乙酸二钠与硫酸亚铁螯合而成，螯合液中二价铁浓度为0.1M。

4.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述海洋胶红酵母菌液体种子罐发酵培养，其种子发酵培养基的重量组成为：葡萄糖1.0-3.8％、蛋白胨0.5-1.2％、酵母膏0.2-1.0％、硫酸铵0.5-1.0％、磷酸氢二钾0.1-0.3％、磷酸二氢钾0.1-0.3％、硫酸镁0.1-0.5％、余量为陈海水、1-3mlEDTA-Fe/每升陈海水、pH 3.8-8.8；种子罐发酵培养条件为：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶10～120vvm、转速220-260rpm，培养温度为1 5℃～25℃，时间为48～72h。

5.按照权利要求4所述的生产方法，其特征在于：所述液体种子罐发酵培养，其种子发酵培养基的重量组成为：葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、余量为陈海水、1ml EDTA-Fe/每升陈海水、pH6.0；种子罐发酵培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶50vvm、转速230rpm，最适培养温度为22℃，时间为48h。

6.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述海洋胶红酵母菌液体生产罐发酵培养，其发酵培养基的重量组成为：葡萄糖1.0-3.8％、蛋白胨0.6-1.5％、酵母膏0.3-1.0％、硫酸铵0.5-1.0％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、硫酸镁0.1-0.5％、余量为陈海水、1-3mlEDTA-Fe/每升陈海水、pH3.8-8.8；生产罐发酵培养条件为：罐压0.05-0.06Mpa、风量100∶10～100∶150vvm、转速200-230rpm，培养温度为15℃～20℃，时间为48～96h。

7.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：所述液体生产罐发酵培养，其发酵培养基的重量组成为：葡萄糖3.6％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、余量为陈海水、2ml EDTA-Fe/每升陈海水、pH5.5；生产罐发酵培养条件为：罐压0.06Mpa、风量100∶120vvm、转速200rpm，最适培养温度为20℃，时间为72h。