CN104480097A - 一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用。所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂由嗜热脂肪地芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌四株菌按比例混合复配，并采用对菌体活力保护最为有效和实用的微胶囊技术，将活性菌包裹在以浒苔多糖为主要组分的囊壁物质中，制成绿藻糖基微胶囊生物菌剂，并具体提供了所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法。本发明提供的绿藻糖基微胶囊生物菌剂无污染，能够达到肥料和农药的配合使用功效，工艺简单、成本低，实现有利于保护环境、抗病性和抗逆性强、提高存活率、易于产业化生产等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
我国是一个农业大国，农作物的产量及质量关系着国计民生。目前，促进和保护作物生长主要靠使用农药、化肥，但农药、化肥的过量滥用，造成土壤板结、土壤盐渍化和重金属污染，严重污染农业生态环境，危害人类的健康。
近年来，在国家政策允许下，一部分农药、化肥逐步被微生态合剂代替，微生态制剂既有肥料的效果，又有农药的功效，把植物保护与植物营养合二为一，同时，微生物肥料也存在着多种菌株共生性较差、无法适应胁迫环境、与无机肥料复配存活率较低等弊端。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对我国化学肥料过量滥用、生物肥料使用的多种弊端，本发明提供了一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用。本发明所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂无污染，能够达到肥料和农药的配合使用功效，工艺简单、成本低，具有有利于保护环境、抗病性和抗逆性强、提高存活率、易于产业化生产等优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂，它包括囊内物质和囊壁物质：所述囊内物质包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌，所述四株菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：嗜热脂肪地芽孢杆菌为CGMCC No.7572、花域芽孢杆菌为CGMCC No.7571、甲基营养型芽孢杆菌菌株为CGMCC NO.7570、西姆芽孢杆菌为CGMCC No.7285；所述囊壁物质主要组分是浒苔多糖。
进一步的，所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂中，四株菌的菌含量为：嗜热脂肪地芽孢杆菌20%、花域芽孢杆菌10%、甲基营养型芽孢杆菌10%、西姆芽孢杆菌60%，按活菌数百分比计算。
本发明还提供了所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法，它包括以下步骤：
(1) 制备一级种子液：将所述四菌株在温度为35℃下恒温摇床培养得到一级种子液；
(2) 制备二级种子液：将所述一级种子液按5%的接种量接种到二级发酵罐中培养得到二级种子液，培养温度与步骤(1) 相同；
(3) 发酵生产：将所述二级种子液分别转接入生产发酵罐中，通气量为100-150 升/ 分钟；以发酵液中芽孢含量超过80% 为指标，终止发酵；
(4) 菌液复配：将四菌株的发酵液混合复配得到混合菌液；
(5) 制备菌剂产品：将所述混合菌液过筛，加入浒苔多糖，复配得到绿藻糖基微胶囊生物菌剂。
进一步的，所述浒苔多糖的制备方法包括以下步骤：
a.预处理：将浒苔粉经过热水浸提得到可溶组分，将所述可溶组分进行过氧化氢预处理；
b.提取：利用生物酶法对所述步骤(a)所得产物进行提取；
c.分级洗脱：将所述步骤(b)所得产物和不同浓度NaCl经DEAE Sepharose Fast Flow分级洗脱，得到所述浒苔多糖。
进一步的，上述绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法中，所述步骤(1) 摇床转速150-220 转/ 分钟，步骤(2) 二级发酵罐转速为100-150 转/ 分钟，步骤(3) 生产发酵罐转速为100-150 转/ 分钟。
所述步骤(2) 中二级种子的发酵培养基分别为：
西姆芽孢杆菌：玉米粉 2.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，豆饼粉 10.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，碳酸钙 5.0 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，硫酸镁 0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0；
嗜热脂肪地芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，豆粕25.0 g/L，蛋白胨2.0g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0；
甲基营养型芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，豆粕10.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.0-7.5；
花域芽孢杆菌：玉米粉8.0-10.0 g/L，淀粉2.0-5.0 g/L，葡萄糖 3.0-5.0 g/L，蛋白胨1.0-3.0 g/L，豆饼粉8.0-10.0 g/L，蔗糖2.0-3.0 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0 g/L，碳酸钙3.0-5.0 g/L，七水硫酸镁0.8-1.0 g/L，硫酸锰0.1-0.5 g/L，消泡剂1.5-3.0 g/L，pH 8.0-8.5。
所述步骤(3) 中发酵培养前10 小时转速为100 转/ 分钟，通气量为100 升/ 分钟；10-16 小时转速为120 转/ 分钟，通气量为150 升/ 分钟；16 小时后至发酵结束，转速为150 转/ 分钟，通气量200 升/ 分钟，四菌株发酵时间为18-24 小时。
本发明还提供了绿藻糖基微胶囊生物菌剂在快速腐熟农牧业废弃物和浒苔中的应用。
其中，所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂对农牧业废弃物和浒苔进行有氧发酵腐熟。
本发明还提供了绿藻糖基微胶囊生物菌剂在开发多种农用系列产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂由嗜热脂肪地芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌四株菌按比例混合复配，并采用对菌体活力保护最为有效和实用的微胶囊技术，将活性菌包裹在以浒苔多糖为主要组分的囊壁物质中，制成绿藻糖基微胶囊生物菌剂，并具体提供了所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法。通过采用本发明的技术方案，可以减少化肥农药的使用率，减轻了农药对环境造成的污染；本发明所选用的四株菌，均是抗病促生耐盐碱功能菌株，抗病性和抗逆性强；浒苔多糖能够保护生物细胞核生物活性物质在不良环境下活性免遭破坏，提高存活率；所述绿藻糖基微胶囊生产成本低、操作简单方便、易于储存和运输，便于工厂扩大化生产，实现产业化；以绿藻基微胶囊为主要活性成分通过技术集成与复配可开发生物菌剂、土壤改良剂、生物肥料等多种农用系列产品，产品有效活菌数最高可达到2000亿/克以上，保质期长达18-24个月，具有良好的技术效果和市场应用前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1 是本发明中绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1、绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备
本发明提供的绿藻糖基微胶囊生物菌剂中，包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌，四株菌的菌含量为：嗜热脂肪地芽孢杆菌20%、花域芽孢杆菌10%、甲基营养型芽孢杆菌10%、西姆芽孢杆菌60%，按活菌数百分比计算，将活性菌包裹在以浒苔多糖为主要组分的囊壁物质中，制成绿藻糖基微胶囊生物菌剂。
浒苔多糖的提取与制备
浒苔原粉经过热水浸提，可分为可溶组分与不溶组分，其中可溶组分大部分为可溶性多糖。将可溶组分进行过氧化氢预处理，预处理时间12 h，温度为50℃，过氧化氢浓度为0.2%，pH原始。最佳条件：温度90度，料液比1:60，反应4小时；所得产物加入蛋白酶、纤维素酶，利用生物酶法提取浒苔多糖，反应条件：温度50度，料液比1:60，反应4小时，最高提取率达95%以上，多糖分离率达到90%以上。经DEAE Sepharose Fast Flow分级，缓冲液和不同浓度NaCl分级洗脱，收集到三个组分：P1、P2、P3。P1组分有优良成膜特性及较好稳定性的特点，HPLC检测平均分子量分别为155万。
本发明所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂选用以下四株菌：嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）LJ-2 、花域芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）、甲基营养型芽孢杆菌菌株（Bacillus methylotrophicus）HD-1和西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis），所述四株菌均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所，嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的保藏编号为CGMCC No.7572，它的保藏时间为2013 年5 月8 日。花域芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）的保藏编号为CGMCC No.7571，它的保藏时间为2013 年5 月8 日。甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）的保藏编号为CGMCC NO.7570，它的保藏时间为2013 年5 月8 日。西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）的保藏编号为CGMCC No.7285，它的保藏时间为2013 年3 月6 日。
所述嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株（Geobacillus stearothermophilus ）LJ-2 的菌体为短杆状，芽孢为圆形，芽孢端生。在营养琼脂平板上37℃培养18h 形成的菌落边缘不规则，直径3.0mm-5.0mm，呈白色，粉质，干燥，无光泽，无凸起。
花域芽孢杆菌菌株SJ，其特征在于：花域芽孢杆菌菌株SJ的菌落为圆形，边缘整齐，直径3.0mm-8.0mm，呈白色，有突起，表面呈膜，里面为粘液，挑起有拉丝，菌体呈短杆状，芽孢端生，圆形。
甲基营养型芽孢杆菌HD-1，菌落2-4 mm，边缘整齐，易挑起，扁平，无突起，粉质，呈白色。
西姆芽孢杆菌生物学特性：革兰氏染色阴性，在平板培养基上形成的菌落直径约3 mm，边缘整齐，湿润光滑，高突起，黏稠，纯白色。菌体形态呈短小杆状，芽孢中生或端生。
试管斜面种子：上述四株菌均以试管斜面形式保存于4℃冰箱，备用。菌株需定期活化、复壮，均采用营养琼脂培养基。
本发明所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
1、制备一级种子液
分别将菌种的试管斜面接种于几个1升三角瓶液体培养基中，培养温度分别为35℃，摇床恒温培养12-18 小时，转速150-220 转/ 分钟。培养基均为LB 培养基，配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，pH 值7.0。
2、制备二级种子液
将上述一级种子按5% 的接种量分别转接入200 升发酵罐中，培养温度与一级种子发酵一致，转速为100-150 转/ 分钟，培养时间为12 小时。
二级种子发酵培养基分别为：
①西姆芽孢杆菌：玉米粉 2.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，豆饼粉 10.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，碳酸钙 5.0 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，硫酸镁 0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0 。
②嗜热脂肪地芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，豆粕25.0 g/L，蛋白胨2.0g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0。
③甲基营养型芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，豆粕10.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.0-7.5 。
④花域芽孢杆菌：玉米粉8.0-10.0 g/L，淀粉2.0-5.0 g/L，葡萄糖 3.0-5.0 g/L，蛋白胨1.0-3.0 g/L，豆饼粉8.0-10.0 g/L，蔗糖2.0-3.0 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0 g/L，碳酸钙3.0-5.0 g/L，七水硫酸镁0.8-1.0 g/L，硫酸锰0.1-0.5 g/L，消泡剂1.5-3.0 g/L，pH 8.0-8.5。
3、发酵罐生产
同二级种子发酵培养基及发酵温度一致，将二级种子分别转接入4 吨生产发酵罐中，发酵培养前10 小时转速为100 转/ 分钟，通气量为100 升/ 分钟；10-16 小时转速为120转/ 分钟，通气量为150 升/ 分钟；16 小时后至发酵结束，转速为150 转/ 分钟，通气量200升/ 分钟。以发酵液中芽孢含量超过80% 为指标，终止发酵，四菌株一般发酵时间为18-24小时。
菌液复配及菌剂产品：
4、菌液复配
本发明西姆芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、花域芽孢杆菌分别经过单菌株深层高密度液体发酵，成芽孢状态时，发酵液经平板菌落计数，根据三菌株的活菌数含量，按菌数进行复配，西姆芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、花域芽孢杆菌分别以60%、20%、10%、10% 的含菌量配比得到混合菌液。
5、制备菌剂产品
发酵结束放罐，发酵菌夜过40目网筛，加入提取的浒苔多糖，辅以乳化剂和稳定剂，浓缩后进行喷雾干燥，所得菌粉可达到2000亿/g。
实施例2、绿藻糖基微胶囊生物菌剂在农牧业废弃物和浒苔中的应用
玉米秸秆：经稀释后5 亿/克的固体菌剂干粉撒施、喷施均可，每吨用原粉5g即可；配合3kg 尿素使用效果更佳。
羊粪：经稀释后5 亿/克的固体菌剂干粉撒施、喷施均可，每吨用量500g 。
浒苔粉：经稀释后5 亿/克的固体菌剂干粉撒施、喷施均可，每吨用量500g 。
利用本发明所述腐熟菌剂对农牧业废弃物和浒苔进行有氧发酵腐熟，可堆置长宽高均大于1 米的堆，4 天左右翻堆一次，以便通氧。腐熟终点以发酵物发黑、软化、发粘、液化、无臭为准。
腐熟后得到的产物均可直接作为有机肥使用，可有效提高农作物品质如果实甜度、叶菜色泽等；可提高农作物产量。
实施例3、绿藻糖基微生物菌剂与大量元素水溶肥料的复配
将菌粉与尿素、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾，微量元素硼、锰、铜、锌按一定比例制备出氮、磷、钾营养构成为12-3-18，有效活菌数≥4亿/g高效复合生物大量元素水溶肥料。将该产品在室温下放置，每隔一段时间对制剂进行平板计数，检测活菌数的稳定性，实验结果见表1。
表1 绿藻糖基微生物菌剂室温下活性降解规律
| 时间 | 0d | 60d | 120d | 300d | 360d | 420d | 480d | 540d |
| 有效菌数（亿/g） | 2017 | 2003 | 1996 | 1800 | 1760 | 1600 | 1550 | 1500 |
通过表1看出，该产品在室温下保存，随着时间的延长，菌数稍有下降，保存12个月，菌数由原来的2017亿/g降为1500亿/g，说明含有耐盐活性菌株的大量元素水溶肥料在室温下，有效活菌保存时间长，不易变质。分析其原因主要是该菌株含有耐盐基因，在高盐的环境下仍可长期存活；另外，该菌株为芽孢杆菌，形成芽孢易于贮存和运输，绿藻糖基微胶囊可保护生物体，降低外界对芽孢的侵害。
实施例4、绿藻糖基微生物菌剂在土壤改良方面的应用
以绿藻基微胶囊为主要活性成分，复配牡蛎粉、腐植酸、草炭、浒苔多糖等有效成分生产绿藻糖基微胶囊生物土壤改良剂， 6%比例与土壤混合。试验对烤烟的应用效果：播种27天，调理剂处理的育苗种子发芽率是75%，比对照提高53.1%；播种45天后，调理剂处理的种子成苗率96%，而对照的成苗率为20%。使用绿藻糖基微胶囊土壤调理剂，活性微生物能够优先占领烟苗根际，可大大提高种子的出苗率及成苗率，有利于发挥促生作用。培育壮苗，具有良好的社会价值和经济价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精髓。
Claims (10)
1.一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂，包括囊内物质和囊壁物质，其特征在于：所述囊内物质包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌，所述四株菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：嗜热脂肪地芽孢杆菌为CGMCC No.7572、花域芽孢杆菌为CGMCC No.7571、甲基营养型芽孢杆菌菌株为CGMCC NO.7570、西姆芽孢杆菌为CGMCC No.7285；所述囊壁物质主要组分是浒苔多糖。
2. 根据权利要求1所述的一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂，其特征在于：所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂中，四株菌的菌含量为：嗜热脂肪地芽孢杆菌20%、花域芽孢杆菌10%、甲基营养型芽孢杆菌10%、西姆芽孢杆菌60%，按活菌数百分比计算。
3. 根据权利要求1-2 所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1) 制备一级种子液：将所述四菌株在温度为35℃下恒温摇床培养得到一级种子液；
(2) 制备二级种子液：将所述一级种子液按5%的接种量接种到二级发酵罐中培养得到二级种子液，培养温度与步骤(1) 相同；
(3) 发酵生产：将所述二级种子液分别转接入生产发酵罐中，通气量为100-150 升/ 分钟；以发酵液中芽孢含量超过80% 为指标，终止发酵；
(4) 菌液复配：将四菌株的发酵液混合复配得到混合菌液；
(5) 制备菌剂产品：将所述混合菌液过筛，加入浒苔多糖，复配得到绿藻糖基微胶囊生物菌剂。
4. 根据权利要求3所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法，其特征在于所述浒苔多糖的制备方法包括以下步骤：
a.预处理：将浒苔粉经过热水浸提得到可溶组分，将所述可溶组分进行过氧化氢预处理；
b.提取：利用生物酶法对所述步骤(a)所得产物进行提取；
c.分级洗脱：将所述步骤(b)所得产物和不同浓度NaCl经DEAE Sepharose Fast Flow分级洗脱，得到所述浒苔多糖。
5. 根据权利要求3或4 所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1) 摇床转速150-220 转/ 分钟，步骤(2) 二级发酵罐转速为100-150 转/ 分钟，步骤(3) 生产发酵罐转速为100-150 转/ 分钟。
6. 根据权利要求3或4所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2) 中二级种子的发酵培养基分别为：
西姆芽孢杆菌：玉米粉 2.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，豆饼粉 10.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，碳酸钙 5.0 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，硫酸镁 0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0；
嗜热脂肪地芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，豆粕25.0 g/L，蛋白胨2.0g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.5-8.0；
甲基营养型芽孢杆菌：淀粉3.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，豆粕10.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，碳酸钙5.0 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.1 g/L，pH 值7.0-7.5；
花域芽孢杆菌：玉米粉8.0-10.0 g/L，淀粉2.0-5.0 g/L，葡萄糖 3.0-5.0 g/L，蛋白胨1.0-3.0 g/L，豆饼粉8.0-10.0 g/L，蔗糖2.0-3.0 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0 g/L，碳酸钙3.0-5.0 g/L，七水硫酸镁0.8-1.0 g/L，硫酸锰0.1-0.5 g/L，消泡剂1.5-3.0 g/L，pH 8.0-8.5。
7. 根据权利要求3或4所述的微生物腐熟菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3) 中发酵培养前10 小时转速为100 转/ 分钟，通气量为100 升/ 分钟；10-16 小时转速为120 转/ 分钟，通气量为150 升/ 分钟；16 小时后至发酵结束，转速为150 转/ 分钟，通气量200 升/ 分钟，四菌株发酵时间为18-24 小时。
8. 根据权利要求1-2所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂在农牧业废弃物和浒苔中的应用。
9. 根据权利要求8 所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂在农牧业废弃物和浒苔中的应用，其特征在于：所述绿藻糖基微胶囊生物菌剂对农牧业废弃物和浒苔进行有氧发酵腐熟。
10. 根据权利要求1-2所述的绿藻糖基微胶囊生物菌剂在多种农用系列产品中的应用。
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