CN101696395B - 防除连作烟草黑胫病的拮抗菌及其微生物有机肥料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于防除烟草黑胫病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对烟草黑胫病病原细菌有显著拮抗作用的一种拮抗菌(多粘类芽孢杆菌C-5)，利用该拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中分别含有1×10⁸个/g以上的C-5、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量为30～35％。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群。在还没有形成连作障碍的土壤上长期施用本微生物有机肥料能在很大程度上防止连作烟草黑胫病的发生。

Description

防除连作烟草黑胫病的拮抗菌及其微生物有机肥料

一、技术领域

本发明涉及能防除连作烟草黑胫病的拮抗菌及用其制成的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服和消除连作烟草黑胫病问题。

二、背景技术

烟草是我国主要的经济作物，其质量的优劣关系着国计民生。烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var.nicotianae)发现于印尼的爪哇，是烟草生产上一类重要的真菌病害。由于其无性繁殖体(孢子囊)形成速度快、数量大，侵染后潜育期短、发病快，在植株生长季节可以进行多次侵染，环境条件适宜时，短时内可大面积蔓延，造成毁灭性病害。烟草黑胫病菌可以在烟草的任何生育阶段侵染危害，主要侵染烟草的根和茎基部，在其上形成黑色凹陷的病斑，故称“黑胫病”。症状因烟株生长阶段和气候条件的不同而有较大差异。幼苗首先在近土表的茎基部出现暗褐色至黑色的病斑或底叶受到侵染，再沿叶柄扩展到茎上，常引起“猝倒”症状。但与由Pythium sp.引起的猝倒病不同的是，在苗床期，烟草黑胫病的病苗部分或全部根系受侵染腐烂变黑，而烟草猝倒病在发病前、中期根系较少受到侵染。当气温较低时，幼苗虽可以受到黑胫病菌侵染，但往往不表现症状，这些受侵染而尚未表现症状的烟苗烟草移栽到大田，不仅成活率很低，同时也是大田初侵染菌源之一。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥，再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。

三、发明内容

1.技术问题

本发明的目的在于研制一种能防除烟草黑胫病的拮抗微生物有机肥料，防治效率达到80％以上，使大量的连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

2.技术方案

用于防除连作烟草黑胫病的拮抗菌C-5菌株，属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，于2009年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3303，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢椭圆形，兼性厌氧生长，V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等产酸产气，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，最适生长温度30℃，最适pH为7.0；

用上述的菌株C-5制成的防除连作烟草黑胫病微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中分别含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌C-5、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

上述防除连作烟草黑胫病微生物有机肥料的生产方法，包括：

1)将菌株C-5接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，通气量为每分钟体积比为0.5，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵培养液含菌量≥5×10⁹个/ml；

所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加蔗糖20g，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

2)将C-5发酵培养液按50L/吨的量分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，分别获得猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌C-5固体菌剂；所用腐熟后的猪粪堆肥为发芽指数98％以上，有机质含量≥35％，有机氮含量为1.2-2％，含水量25-30％。

3)再将堆肥的固体菌剂按体积比50-70％与菜粕微生物酶解混合物的固体菌剂按体积比30-50％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为防除连作烟草黑胫病的微生物有机肥料。

所述微生物有机肥料可专用于防除连作烟草黑胫病。

3.有益效果

本发明研制了一种能防除烟草黑胫病的拮抗微生物有机肥料，利用猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)该肥料产品中含有一种抑制烟草黑胫病病原细菌生长的专一性高效菌株(多粘类芽孢杆菌)，其抑制效果显著。试验结果表明，在连作烟草黑胫病的土壤上施用本产品后，烟草黑胫病的生物防治率达80％以上，连续三年施用本肥料的土壤，黑胫病的生物防治率更高。

2)该肥料为生物有机肥，含有丰富的有机质(含量30-35％)，有机氮含量为4％，而且大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总氮含量为4％，而且生物有效性特别高，可为拮抗菌C-5提供生长繁殖条件，使C-5在土壤中存活下来并形成优势群，发挥防病作用。

3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于烟草的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治黑胫病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。

四、附图说明

图1：拮抗菌C-5的抑菌圈

图2：温室盆栽试验防治效果

CK₁：健康水稻土；CK₂：烟草连作土；OF：CK₂+氨基酸有机肥；ANT：CK₂+C-5液体发酵液；MOF：CK₂+C-5微生物有机肥。

五、具体实施方式

(一)菌株的分离和鉴定

采集已经发生连作障碍并出现严重黑胫病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用选择性培养基分离病原菌——烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)。然后以黑胫病病原菌为指示菌，从来自于连作烟草黑胫病发病田块中的健康烟草植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终复筛出高效拮抗菌株C-5，鉴定到属种，菌种于30％甘油中-70℃保存。拮抗菌C-5的抑菌圈直径为28mm(图1)。

菌株C-5属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢椭圆形，兼性厌氧生长，V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等产酸产气，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，最适生长温度30℃，最适pH为7.0。

(二)菌剂生产

1)将菌株C-5接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，通气量为每分钟体积比为0.5，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；

所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

2)将C-5拮抗菌液按50L/吨的接种量分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解混合物进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度30-50℃，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，分别获得猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物的C-5拮抗菌固体菌剂。所用腐熟后的猪粪堆肥为发芽指数98％以上，有机质含量≥35％，有机氮含量为1.2-2％，含水量25-30％。

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品，江苏新天地氨基酸肥料有限公司生产)，将嗜麦芽寡养单胞菌(Steno trophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物(含氨基酸的混合材料)。

3)再将堆肥的固体菌剂按体积比70％与菜粕微生物酶解混合物的固体菌剂按体积比30％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得防除连作烟草黑胫病的微生物有机肥(含菌株C-5)。

用上述拮抗菌所生产的微生物有机肥(防除连作烟草黑胫病的微生物有机肥)，该肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌C-5、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

(三)温室盆栽试验

供试土壤为烟草连作土，黑胫病发病严重。烟草种子采用烟草黑胫病敏感型的“云烟87”。处理如下：

CK₁：健康水稻土；CK₂：烟草连作土；OF：CK₂+氨基酸有机肥(菜粕酶解物，江苏新天地氨基酸肥料有限公司，发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)；ANT：CK₂+C-5液体发酵液；MOF：CK₂+C-5微生物有机肥。

每处理6个重复，10kg病土/盆。ANT处理使用C-5液体发酵液接种拮抗菌，使拮抗菌在土壤中的浓度达到10⁸cfu/g干土。MOF处理每盆施25g微生物有机肥，其他处理用化肥补齐肥料差异。烟苗移苗后10天开始记录发病情况，30天后，CK₂发病率达66.7％，而接种拮抗菌液或微生物有机肥都能降低黑胫病的发病率，其中使用C-5生产的微生物有机肥表现出最好的防治效果(表1，图2)，发病率为16.7％，防病率可达到80％。

结果表明，拮抗菌的施入，不单可以起到防治烟草黑胫病，促进烟草根际微生物群落显著增加(表2)，而且加入微生物肥料的烟草不仅提高了烟草的抗病性，还有利于增加烟草的产量(表3)。

表1：不同盆栽处理发病率和防病率

处理	发病率(％)	防病率(％)
			CK1	-	-
CK2	66.7	-
			OF	33.3	31.6
ANT	50.0	42.0
			MOF	16.7	80.0

注：防病率＝100×(对照感病指数-处理感病指数)/对照感病指数

烟草病情分级行业标准：0级：全株无病。1级：茎部病斑步超过茎围的二分之一，或半数以下叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。2级：茎部病斑超过茎围的二分之一，或半数以上叶片凋萎。3级：茎部病斑环绕茎围，或三分之二以上凋萎。4级：病株全部叶片凋萎或枯死。

表2：不同盆栽处理根表微生物的含量差异

处理/数量(cfu/g ±)	细菌	放线菌	真菌
				CK1	1.7×10<sup>7</sup>	7.6×10<sup>5</sup>	1.9×10<sup>4</sup>

处理/数量(cfu/g ±)	细菌	放线菌	真菌
				CK2	9.6×10<sup>8</sup>	1.6×10<sup>5</sup>	5.3×10<sup>4</sup>
OF	7.2×10<sup>8</sup>	1.8×10<sup>6</sup>	9.3×10<sup>3</sup>
				ANT	3.4×10<sup>9</sup>	7.0×10<sup>5</sup>	2.6×10<sup>4</sup>
MOF	2.3×10<sup>9</sup>	1.9×10<sup>6</sup>	3.3×10<sup>4</sup>

表3：不同盆栽处理鲜重、干重和株高的差异

处理/生物量	地上部鲜重(g)	地上部干重(g)	株高(cm)
				CK1	106.07	11.16	40.38
CK2	80.89	9.75	37.65
				OF	102.94	11.33	44.92
ANT	113.87	13.46	50.67
				MOF	149.41	16.02	54.22

本发明专利从微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著消除连作烟草黑胫病发生的微生物有机肥料产品。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源给连作障碍土壤有益微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速恢复和建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了烟草作物的立苗率和抗逆能力。

Claims (6)

1.用于防除连作烟草黑胫病的拮抗菌，该菌株C-5属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，于2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3303，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢椭圆形，兼性厌氧生长，V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等产酸产气，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，最适生长温度30℃，最适pH为7.0。

2.用权利要求1所述拮抗菌所生产的防除连作烟草黑胫病微生物有机肥料。

3.根据权利要求2所述的防除连作烟草黑胫病微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌C-5、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

4.权利要求2或3所述防除连作烟草黑胫病微生物有机肥料的生产方法，包括：

1)将权利要求1所述的菌株C-5接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.8-7.2，培养温度28-35℃，通气量为每分钟体积比为0.5，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵培养液含菌量≥5×10⁹个/ml；所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：

用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min；

2)将C-5发酵液按50L/吨的量分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，分别获得猪粪堆肥、菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌C-5固体菌剂；

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为，将ZL200610086126.0中公开的保藏号为CGMCC NO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Steno trophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物；

3)再将猪粪堆肥的固体菌剂按体积比50-70％与菜粕微生物酶解混合物的固体菌剂按体积比30-50％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为防除连作烟草黑胫病的微生物有机肥料。

5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤2)所用腐熟后的猪粪堆肥为发芽指数98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

6.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防除连作烟草黑胫病中的应用。

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