CN115029259A - 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115029259A
CN115029259A CN202210529044.8A CN202210529044A CN115029259A CN 115029259 A CN115029259 A CN 115029259A CN 202210529044 A CN202210529044 A CN 202210529044A CN 115029259 A CN115029259 A CN 115029259A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soybean meal
strain
bacillus
degrading
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210529044.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115029259B (zh
Inventor
康耀卫
黄燕菲
刘冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd
Original Assignee
Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd filed Critical Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd
Priority to CN202210529044.8A priority Critical patent/CN115029259B/zh
Publication of CN115029259A publication Critical patent/CN115029259A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115029259B publication Critical patent/CN115029259B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A23K10/37—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from waste material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F17/00—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation
    • C05F17/20—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation using specific microorganisms or substances, e.g. enzymes, for activating or stimulating the treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Abstract

本发明提供了一种株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用，属于微生物及其应用技术领域。所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.24364。本发明的暹罗芽孢杆菌可将豆粕降解转化成为具有促进植物健康生长功能的小分子肽或氨基酸，可同时实现促进植物生长、防治植物病害以及提高植物抗冻能力。同时该菌株兼具较好的耐盐、耐碱性、耐酸性，是一株综合性能优异的菌株，具备良好的生产应用前景。

Description

一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术
生物刺激素是一类能够促进植物生长发育、缓解非生物胁迫及提高作物品质的功能性物质(氨基酸、肽或腐植酸等)或/和微生物及其次生代谢产物的一类物质(白由路，2017)。生物刺激素对植物的作用主要表现为以下几点：一是可促进植物生长和发育，改善品质；二是有助于改善植物营养效率，即促进植物对养分的吸收，同时减少养分的流失(沈欣等，2017；王京等，2018)；三是作为土壤改良剂可改善土壤结构与功能，从而促进植物的生长发育(赵明等，2012；康平，2014)。生物刺激素目前已广泛应用于农业生产，并逐渐成为化肥和农药提质增效和肥料配施减量的一大利器。
作为生物刺激素的一种，氨基酸早在20世纪初就走进了研究者的视野。最早开始植物氨基酸营养的研究是在1908年，Lutz成功的完成了氨基酸吸收的无菌试验，这是世界上第一次对有机态营养吸收的研究。氨基酸可提供有机氮源，许多研究已证明氨基酸能够被植物直接吸收，促进植物生长发育和改善品质，提高产量(黄继川等，2018)。土壤中氨基酸是主要的有机氮化合物，占土壤全氮的15％～60％，是植物有机氮源的主要部分(王莹等，2008)。此外，氨基酸作为优质氮源，对土壤微生物活性有激发作用，可明显缓解土壤连作障碍。黄继川等(2018)通过土壤淋施的方式施用氨基酸肥料，结果表明，花椰菜株高、茎粗、开展度、产量等均较对照处理有不同程度的提高。温逸俊等(2017)研究表明，施用含氨基酸水溶肥料对柑橘果实大小和可溶性固形物含量都有一定程度的影响，能促进果实发育，提高果实品质。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的物质，是生物刺激素的功能性物质之一。肽的分子量一般在1000道尔顿～6500道尔顿之间。在植物上，小分子肽是重要的胞间信号感应分子，主要参与调节植物的生长发育过程和应答生物和非生物胁迫的应激反应。
氨基酸肥料是一种生物刺激素类产品(Colla G等，2016)，主要成分大部分是动物蛋白通过化学工艺或者植物蛋白酶解而来的，包含氨基酸、肽类、糖类等的混合物(Schaafsma G，2009；邵光文等，2015)，因其氨基酸含量较高而称为氨基酸肥料，其品质好坏主要取决于蛋白质来源和生产工艺。大量研究结果表明，通过植物蛋白酶解得到的氨基酸种类更贴近植物的氨基酸谱，更容易被植物吸收利用，且具有更高的活性，使用起来也更加安全。也有研究结果表明，氨基酸肥料可以帮助植物渡过应激反应(比如炎热、过冷、干旱等恶劣天气)，在植物生长的关键阶段给予营养支持，是传统施肥的理想补充。氨基酸液肥具有农家肥、化肥、植物生长调理剂和植物营养促生剂的所有性质，是可以取代部分化肥的有机肥料(单程楠，2018)，对于减少化肥施用有着十分重要的意义。氨基酸肥料在改善土壤性状、促进作物生长、增强作物光合作用、提高作物的产量和品质以及增强植物的抗逆性和抗病虫害能力等方面具重要的作用。
豆粕是各类油粕中用途最广的一种，是一种具有高蛋白质、制作牧畜与家禽饲料的主要原料，其粗蛋白含量高达30％-50％，并且还含有其他丰富的营养物质，如脂肪、碳水化合物多种矿物质、维生素及动物体内必需的氨基酸。同时豆粕中含有大量碳水化合物、胰蛋白酶抑制因子、大豆寡糖、抗原蛋白、植酸、凝集素和大豆皂甙等抗营养因子(针对动物和人类)，且由于豆粕中营养元素以有机大分子形式存在，特别是氮元素以大分子蛋白质的形式存在，直接施用在土壤中需要经过一个较长期的过程大分子蛋白质才能被土壤中的微生物降解为可被植物吸收利用的小分子，所以其中抗营养因子阻碍动物消化吸收和作为肥料发挥较慢的问题成为了阻碍豆粕应用的关键因素。目前通常采用物理、化学和生物学等方法进行钝化处理以去除豆粕中的抗营养因子从而提高豆粕的营养价值。然而，物理方法主要是加热法、膨化法、浸泡法等，但是豆粕中的其他大分子如低聚糖、大豆球蛋白、植酸等对热不敏感，用此方法并不能较大程度的去除豆粕中的抗营养因子。化学方法的主要是向豆粕中加入化学试剂，通过某种化学反应来改变抗营养因子的分子结构，使其活性降低或失活。虽然化学方法相较于物理方法有更好的钝化或消除豆粕中的抗营养因子的效果，但产品中会有大量化学物质残留，会对环境和动物造成伤害。生物学方法是通过添加适宜酶制剂或用微生物发酵处理以分解大豆中的抗营养因子。生物学方具有高效、环境友好、适口性良好以及能够提高豆粕中营养物质等优点，因此是目前钝化或消除豆粕中的抗营养因子最常用的方法，常用的生物学方法包括育种法、酶解法和微生物发酵法。
微生物发酵法是利用发酵时微生物产生的酶来分解豆粕中的抗营养因子，降低其抗原性并累计有益的代谢产物，具有可加工处理，条件工艺设备要求简单的特点。豆粕经微生物菌株发酵水解后很容易被吸收利用，同时经水解会产生具有独特生理活性功能的活性肽、氨基酸分子等，具有防止动物病害病以及促进植物生长的作用。在动物饲料应用上，微生物发酵豆粕可抑制有害菌的生长繁殖，保持肠道内微生态环境处于平衡状态，提高饲料利用率；在农业生产方面，微生物发酵豆粕含有小肽、氨基酸等具有特殊的营养物质，能为作物生长提供必须的氮、磷、钾等大量营养元素，提高土壤有机质含量，改善土壤理化性质，增加土壤微生物活性。
氨基酸按照提取方法可以分为生物酶解氨基酸和酸碱水解氨基酸、化学合成氨基酸等。生物酶解是水解蛋白质最温和的方法，是取得高活性左旋游离氨基酸的更好办法，生物酶切断肽链会释放出大量的左旋氨基酸，在反应中，氨基酸不经过任何改变就被释放出来，维持其原来的螺旋状态，可以被植物直接吸收并参与到代谢过程中，这种方法保持了18种左旋氨基酸的完整性及生物活性。生物酶解中常用的是微生物降解法，利用微生物产生的大量胞外酶(包括有多种不同的蛋白质水解酶)把不同的蛋白质水解成为氨基酸、小肽和多肽；此外，还可产生包括多种有机酸以及其他具有生物刺激作用的植物生长因子。但是，由于不同微生物菌株产生胞外蛋白水解酶的种类和数量都是不同的，所以在完成蛋白底物水解后，水解产物的组成会因为使用的微生物菌株不同导致完成水解的产物体系中分子组成差异巨大，这些差异主要反映在肽分子大小不同，氨基酸的组成比例不同，生物大分子组成不同，因此会进一步反映在这些终端产物对植物生长促进功能的差异化。为此，针对特定的蛋白质底物筛选出可以将该底物转化为特定组分小肽、氨基酸和其它具有生物活性功能的生物大分子是具有巨大的应用价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用。本发明的菌株可将豆粕降解成5KD左右的小分子肽、氨基酸，可促进植物生长同时兼具提高作物抗冻能力，同时该菌株还兼具较好的耐盐、耐碱性、耐酸性及对植物病原菌抑菌谱较广的特点，可广泛用于农业生产或畜禽养殖中。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌，所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24364。
本发明对所采集到的17个不同省市的50个土壤样品，采用富集-高通量法筛选具有强降解豆粕同时兼具强降解蛋白质能力的多功能微生物。从约大于200株可降解豆粕能力的微生物中筛出62株具有较强的、高效快速降解豆粕的微生物。进一步分析菌株降解蛋白质的能力，从而得到43株同时兼具很强降解蛋白质能力的目标微生物，其中，7株微生物菌株在液体发酵豆粕条件下能较强的提高发酵液中水溶性蛋白质含量，与对照相比水溶性蛋白质含量均可提高100％以上。在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，只有菌株KY889可将豆粕降解成主要集中在4.6KD左右的小分子肽或氨基酸。
对菌株KY889进行16s rDNA序列(SEQ ID No.1)的测定结果表明，该菌株1438个碱基序列与菌株Bacillus siamensis具有99.51％的高度同源，确定KY889为Bacillussiamensis。
在另一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含前述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889和/或其发酵物。所述微生物菌剂可以为固体菌剂或液体菌剂。固体菌剂中可以包含常见的固体载体，包括例如但不限于黏土、滑石、高岭土、蒙脱石、沸石、硅石中的一种或多种；液体菌剂中可以包含常见的液体载体，包括例如但不限于植物油、矿物油、水中的一种。
在另一个方面，本发明提供了所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889或所述的微生物菌剂在以下至少一种中的应用：
(a)降解豆粕并生产出5KD以下的多肽和氨基酸混合物；(b)降解蛋白质；(c)促进植物生长或提高植物抗冻能力；(d)防控植物病害。
本发明暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889具有降解豆粕的能力，能够在含有1wt％的豆粕为氮源的培养基中生长，水解利用豆粕作为营养来源。在筛选出的大量具有降解豆粕能力的微生物菌株中，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889降解豆粕的能力较强，并且更加高效快速。
本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889能够在解蛋白固体培养基上进行生长，产生蛋白水解圈。因此，其同时具有较强的豆粕降解能力和较强的蛋白质降解能力。
利用BCA法测定菌株在液体发酵中是否具有预期降解豆粕的能力的实验表明，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY88菌液与豆粕进行液体发酵后可以显著低提高豆粕发酵液中水溶性蛋白质含量，与等体积水的对照相比可提高408％以上。利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进行进一步筛选实验，结果表明，可暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY88将豆粕降解为5KDa左右(主要为4.6KDa)小分子肽或氨基酸。
在一个实施方案中，所述应用的(a)降解豆粕或生产多肽中，所述降解豆粕包括将所述豆粕降解为多肽和/或氨基酸。具体地，所述多肽为氨基酸数目小于50个的小分子肽。在一个具体的方案中，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889降解豆粕的产物为分子量4.6-15KDa之间的多肽，其中绝大部分主要集中在4.6KDa左右。因此，本发明提供了降解豆粕生产氨基酸、多肽和/或可溶性蛋白方面的应用。
在一个实施方案中，所述应用的(d)中，所述植物病害包括以下的至少一种：番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、水稻纹枯病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2和小麦根腐病。本发明的暹罗芽孢杆菌KY88对植物病原菌抑菌谱较广，对引起上述植物病害的病原菌均具有较强的拮抗作用。
在一个方面，本发明还提供了一种发酵豆粕的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889发酵含豆粕的底物。
在一个实施方案中，所述方法还包括与将所述暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)KY889与酶制剂协同发酵；优选地，所述酶制剂为蛋白酶。
由于本发明暹罗芽孢杆菌KY889能够以豆粕为原料，将豆粕水解成小分子肽或氨基酸，因此，利用本发明的菌株或其衍生产品可以或得包含更多小分子肽、氨基酸以及菌株生长产生的生物刺激素的发酵液产品，发酵更加彻底高效。
此外，可利用菌酶协同发酵的方法，将本发明KY889菌株与酶制剂复配优化，将豆粕尽可能水解成肽、氨基酸，与KY889本身所产生的细菌生物刺激素组合形成“生物刺激素-氨基酸肥料”产品。
在一个方面，本发明还提供了一种豆粕发酵液，所述发酵液由前述发酵方法获得。含有本发明菌株的豆粕发酵液可达到进植物生长、提高作物营养、防治病害的目的。
在一个方面，本发明还提供了所述的豆粕发酵液在促进植物生长、提高植物抗冻能力或制备饲料或肥料中的应用。
除含有本发明KY889菌株的菌悬液本身对植物具有的促生长、防治植物病害作用之外，当将本发明的KY889菌株的菌悬液与豆粕发酵液一起浇灌植物时，可明显促进植物的生长发育。
在一个实施方案中，所述植物包括玉米和小白菜。
在一个具体的实施方案中，本发明的KY889菌株的菌悬液或者其与豆粕发酵液的组合可以促进作物玉米的生长发育，例如提高玉米植株干重、平均叶绿素含量和平均氮素含量，增加玉米叶片宽度等。
在一个具体的实施方案中，本发明的KY889菌株的菌悬液或者其与豆粕发酵液的组合可以促进作物小白菜的生长发育，使得小白菜长势更好且叶面更加翠绿，几乎没有出现叶片变黄冻伤的现象。而本发明的KY889菌株的菌悬液与酶制剂协同发酵豆粕产生的发酵液，其对植物生长发育的促进作用，以及提高植物的抗冻能力方面的效果更优。由于酶制剂本身不含有或不产生能促进植物生长的物质，仅靠水解豆粕产生的小分子物质对植物虽有一定促进作用，说明本发明的菌株通过降解豆粕产生小肽、氨基酸以及自身产生细菌特有的生物刺激素2个方面综合发挥作用。
鉴于本发明菌株对豆粕发酵的特殊效果，因此，利用该菌株发酵获得豆粕发酵液不仅可以制备为作物肥料促进农作物吸收养分，提高作物的产量和品质，同时也适用于制备发酵饲料，促进动物对于豆粕中营养元素吸收利用，提供饲料利用率，可用于禽畜养殖方面。
有益效果
本发明提供了一种新的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)菌株，该菌株能够可将豆粕水解，主要产物为小分子肽和氨基酸；同时该菌株也兼具强降解蛋白质能力；
本发明的菌株还具由该属菌株所具有的高效广谱抗菌活性和耐酸、耐碱以及耐盐的抗逆性，是一株综合性能突出的多功能菌株；
本发明的菌株KY889与商业菌株枯草芽孢菌株92068相比，KY889对豆粕的水解能力更强，其水解豆粕的产物均集中在4.6KDa左右；与商业菌株92068处理的豆粕发酵液相比，KY889处理的豆粕发酵液具有更强的促进植物生长的能力；利用本发明菌株发酵豆粕的发酵液中水溶性蛋白含量高，且发酵液对植物的促生作用以及提高植物抗冻能力的性能更优。与商业酶制剂处理的豆粕发酵液相比，菌株KY889结合酶制剂处理的豆粕发酵液能表现出更强的促进作物生长的能力。
生物样品保藏信息：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889，该菌株已于2022年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.24364；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2022年01月21日检测为存活菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的豆粕培养基筛选阳性菌株示意图(其中，圆圈内为阳性菌株)；
图2为蛋白/豆粕培养基菌株水解情况对比示意图(其中，A和B为豆粕培养基，C和D为蛋白培养基)；
图3为不同方法、不同菌株豆粕发酵液的SDS-PAGE结果(其中，泳道1和10为氨基酸产品，泳道2-6分别0.1M NaOH，水，酶制剂1，酶制剂2，酶制剂3处理的豆粕发酵液样品；泳道7-9，11-18为菌株92068、KY347、KY423，KY426、K231、KY889、KY61、KY991、KY637、KY897、K749处理的豆粕发酵液样品)；
图4为菌株KY889在显微镜下观察结果；
图5为不同豆粕发酵液浇灌玉米植株的生物学结果；
图6为不同处理豆粕发酵液对小白菜的生物学测定结果；
图7为不同处理豆粕发酵液对小白菜、玉米的生物学测定结果；
图8为菌株KY889抗植物病原菌试验结果(依次为番茄早疫病、梨黑斑病、苹果落叶斑点病、水稻纹枯病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、小麦根腐病、青枯病和白枯病)；
图9为菌株KY889抗逆性测定结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.利用高通量法筛选具有降解豆粕能力的微生物菌株
1.1土样的采集
选择具有代表性的样品，样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，每个点采集15-20g的样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物或其他)，保藏于-80℃冰箱。
1.2利用富集法筛选具有降解豆粕能力的微生物菌株
第一步富集：
取0.5g土样于50mL纯净水中摇匀，取其中500μL混合液于含1％的100目豆粕的液体培养基中(豆粕10g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，水1L，121℃灭菌20min)，在30℃下200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。
第二步富集：取上一步富集的菌液500μL于含1％的100目豆粕的液体培养基中，在30℃下，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。
第三步富集：取第二步富集的菌液500μL于含1％的100目豆粕的液体培养基，30℃，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。
1.3涂布法筛选具有降解豆粕的功能微生物菌株
取步骤1.2中最后一次富集的菌液各100μL涂布于含1％的100目豆粕选择性培养基(豆粕10g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)，观察记录1％100目豆粕选择性培养基菌株生长及水解豆粕情况。
从上述培养基中挑取具有豆粕水解功能的菌株于R2A培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，丙酮酸钠0.3g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)上划线培养纯化。
1.4重复验证
为了确保菌株降解豆粕能力，将所得可降解豆粕的目标菌株，再次针刺于豆粕选择固体培养基，30℃培养，验证所挑取的菌落是否具有降解豆粕功能，排除假阳性菌落。
1.5结果
通过上述方法对所采集到的17个不同省市的50个土样、50个豆粕样品进行富集-高通量法筛选，筛选得到200多株具有降解豆粕能力的微生物菌株，其中62株具有较强的、高效快速降解豆粕的微生物(水解透明圈较大)。图1为豆粕培养基筛选阳性菌株示意图(其中，圆圈内为阳性菌株)。
由于不同微生物菌株产生胞外蛋白水解酶的种类和数量不同，会导致完成水解的产物体系中分子组成差异巨大，而这些差异主要反映在肽分子大小、氨基酸的组成比例以及生物大分子组成的不同，从而对植物生长促进作用产生差异化影响。因此，从这62株具有强豆粕降解能力的微生物菌株中筛选具有更强的蛋白质水解功能的菌株，然后利用BCA法测定具有强豆粕水解能力的同时兼具强蛋白质水解能力的目标菌株在液体发酵中降解豆粕的能力，进一步利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)法筛选出可以把豆粕蛋白降解成5KDa左右小分子物质的目标微生物菌株。
实施例2.筛选可以把豆粕降解成5KDa左右的小分子肽、氨基酸的目标微生物菌株
2.1筛选具有更强的蛋白质水解功能的菌株
2.1.1筛选具有更强的蛋白质水解功能的菌株
将筛选到的62株可降解豆粕的微生物菌株在R2A培养基上培养生长2天，针刺于解蛋白质固体培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，丙酮酸钠0.3g，脱脂奶粉5g，琼脂粉15g，水1000mL，121℃灭菌20min)和含1％的100目豆粕选择性培养基(豆粕15g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)中，室温下培养，待水解圈出现后测量不同菌株的蛋白/豆粕水解圈的直径，单位mm。设置商业菌株92068为对照(菌株92068是市场上常用的枯草芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)。
解蛋白/豆粕能力＝解蛋白圈直径的毫米数+X；
(注：X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为：0、1、2。数字2代表水解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明。)。
2.1.2微生物菌株蛋白质水解功能测定结果
将筛选的到的62株微生物菌株分别针刺于解蛋白质/豆粕固体培养基，结果发现62株微生物菌株中有43株同时兼具相对较强的降解蛋白质和较强豆粕降解能力的微生物菌株。
从表1和图2可以看出，部分微生物菌株同时具有强豆粕降解能力和强蛋白质降解能力如菌株KY423、KY426、KY749、KY889、KY991等；但也可反映出，微生物菌株降解豆粕能力与其降解蛋白质的能力不一定成正相关。降解豆粕能力较弱的，其降解蛋白质能力也可以很强，如菌株92068、菌株KY48、KY231；相反降解豆粕较强的菌株，其降解蛋白质的能力可以很弱，如菌株KY397、KY631、KY637。
因此需利用BCA法测定这43株微生物菌株在液体发酵中是否具有预期降解豆粕的能力，接着进一步利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)法筛选出可以把豆粕蛋白降解成5KDa左右小分子物质的目标微生物菌株。
表1.部分菌株对蛋白质和豆粕的水解能力的结果
Figure BDA0003645445930000081
Figure BDA0003645445930000091
2.2利用BCA法测定微生物菌株在液体发酵条件下降解豆粕的能力
2.2.1液体发酵
将筛选得到的43株菌株，分别接种到100mL豆粕液体培养基(豆粕1g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，硫酸镁0.05g，水1000mL，121℃灭菌20min)，30℃，200rpm下摇瓶培养过夜，然后各取10mL菌液加入已装有1g豆粕的50mL离心管中进行液体发酵(发酵温度30℃，发酵时间24小时)，设置等体积水以及等体积商业菌株92068菌液处理的豆粕液体发酵液为对照，发酵完成后取上清用BCA进行测定，测定其上清液中可溶性蛋白的含量。
2.2.2 BCA法测定可溶性蛋白的含量
取各个稀释度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各0.1mL，加入到标记好的试管中；在每个试管中加入2.0mL工作液，充分混合；
将试管密封，37℃，孵育30min，后将试管冷却至室温；
将分光光度计设定在562nm，以水为对照调零，在10分钟内依次检测样品的吸光值；
将各个标准品和待测样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值；
将BSA标准品在562nm处经过空白校正的吸光值对其浓度(ug/ml)作图，绘制标准曲线，使用该标准曲线来确定每个待测样品的蛋白质浓度。
2.2.3结果
将筛选得到的菌株的菌液与豆粕进行液体发酵后离心取上清用BCA进行测定，测定其上清液中可溶性蛋白的含量结果如下表2。
表2.部分菌株与豆粕发酵后BCA测定可溶性蛋白结果
Figure BDA0003645445930000092
Figure BDA0003645445930000101
由表2可以看出，在液体发酵条件下，与对照(水处理豆粕发酵液)相比，筛选得到的菌株的豆粕发酵液中水溶蛋白的含量均有不同程度的提高，且不同菌株对豆粕的水解能力有一定差别菌株，有7株菌株(KY61、KY231、KY423、KY426、KY889(V-11)、KY749、KY991)在液体发酵豆粕条件下较强地提高发酵液中水溶性蛋白质含量，与对照相比均可提高100％以上，其中菌株KY889、KY749、KY426能在液体发酵豆粕条件下较强地提高发酵液中水溶性蛋白质含量，与对照相比均可提高250％以上。利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对此10株菌株进行进一步筛选，筛选可将豆粕降解到5KDa左右小分子肽、氨基酸的目标菌株。
2.3利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进一步筛选可将豆粕降解到5KDa左右小分子肽、氨基酸的目标菌株
2.3.1利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定目标菌株降解豆粕的能力
SDS-PAGE：分离胶16.5％；浓缩胶5％。
分离胶16.5％(10mL)的组成：蒸馏水1.8mL；30％胶贮液(Acry)，5.5mL；pH8.8Tris-Hcl缓冲液2.5mL；10％SDS，0.1mL；10％AP，0.1mL；TEMED，4μL；甘油1.0mL。
浓缩胶5％的组成：蒸馏水3.4mL；30％胶贮液(Acry)，0.83mL；pH6.8 Tris-Hcl缓冲液0.63mL；10％SDS，0.05mL；10％AP，0.05mL；TEMED，2μL。
聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)步骤：
1.用加样枪将上述配制的分离胶溶液注入准备好的制胶玻板中，至2/3处停止，立即在胶上方用蒸馏水或无水乙醇封闭。室温放置约60min，见清晰界线。倒去蒸馏水或无水乙醇，用滤纸吸干残留液体。按上述配制浓缩胶，注入玻板间，立即加入梳子，固定约40min。
根据BCA所测得蛋白浓度，每个孔上样量为40μg，计算蛋白样品体积，与5×上样缓冲液混合，混匀，100℃煮沸变性5min。
浓缩胶凝固后，组装好电泳装置，加入SDS电泳缓冲液，拔下梳子，上样(以ThermoSpectraTM多色低分子量蛋白分子量标准为Marker)，设置国外进口氨基酸肥料产品(意大利启腾公司-丽维双保氨基酸有机水溶肥料)以及用碱、3种不同酶制剂(康生元粗提蛋白酶1、2、3)、92068发酵处理的豆粕发酵液为对照，进行电泳。电泳条件是：浓缩胶80V恒压、分离胶120V恒压。当溴酚蓝大约跑至胶底部，即停止电泳。
2.3.2结果
对跑完电泳的凝胶用染色液进行染色后，用脱色液进行脱色至条带清晰可见，放置于电泳成像仪中进行成像，结果见图3。
从图3中可以看出，在同等上样量的条件下，泳道1和10为氨基酸有机水溶肥料产品的跑胶结果，由于氨基酸分子量为128Da，因此在胶上没有条带显示，此为正常现象。泳道2为0.1M NaOH处理的豆粕发酵液样品跑胶结果，与泳道3空白对照水处理的豆粕发酵液样品相比，在同等上样量的条件下，0.1M NaOH对豆粕的降解是具有一定作用的，跑胶结果显示其降解豆粕能力较强，所得的产物大部分已降解成氨基酸分子，只有少量降解不彻底，在凝胶上反映为在40KDa以上及10-25KDa左右仍有条带。泳道4-6为三种不同酶制剂的跑胶结果，可以看出在同等上样量的条件下，不同酶对豆粕的降解能力有明显差别，酶制剂1和酶制剂2可明显将豆粕水解成4.6KDa以下的小分子，而酶制剂3对豆粕的降解能力较差，其降解豆粕的产物主要集中在15-25KDa左右。泳道7-9，泳道11-18为不同菌株处理的豆粕发酵液的跑胶结果，可以看出在同等上样量的条件下，不同菌株对豆粕的降解能力有一定的差别，与泳道3(水)、泳道4-5(酶制剂1，2)、泳道2(0.1M NaOH)的跑胶结果相比，泳道7-9，泳道11-12，泳道14-15所对应的微生物菌株对豆粕的降解能力相对较弱，体现在凝胶上对应的泳道在每个区间均有深浅不一的条带，而泳道13所对应的菌株处理的豆粕发液结果表明与泳道7-9，泳道11-12，泳道14-15所对应的微生物菌株相比，该菌株(KY889)对豆粕的降解能力更强，在凝胶上显示为其水解豆粕的产物分子量均集中在4.6-15KDa左右，且主要集中在4.6KDa左右，同时比酶制剂3(泳道6)对豆粕的降解能力强，因此本研究以该菌株为研究对象开展后续试验。
实施例3.目标菌株KY889的16sDNA测序及菌株生理形态分析
3.1菌株KY889的16S DNA测序
3.1.1 CTAB法提取细菌DNA
1、接种一单菌落于5mL R2A中，30℃培养过夜；
2、取1mL种子培养液接入100mLR2A液体中，37℃、220r/min培养16小时；
3、5000r/min离心10分钟，弃去上清。
4、加入10mL TE离心洗涤后，用10mL TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；
5、取3.5mL菌悬液，加入184μL 10％SDS，混匀，加入37μL10 mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；
6、加入740μL 5mol/L NaCl，再加入512μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；
7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；
10、用1mL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。
3.1.2扩增与测序
采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(SEQ ID No.2)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')(SEQ ID No.3)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序。
3.2菌株KY889的16S rDNA测序结果
序列1(SEQ ID No.1)：
GGGATGCCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGG。
根据获得KY889的16S rDNA序列(序列1)在GenBank搜索同源序列并进行同源序列分析对比，同时与国际细菌学委员会认可的16sRNA数据库(chun’s lab)进行序列比对并结合文献分析，来确定目标微生物的分类地位(Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Kwon,S.,Lim,J.,Kim,Y.,Seo,H.and Chun,J.(2017).Introducing EzBioCloud:A taxonomically uniteddatabase of 16S rRNA and whole genome assemblies.Int J Syst EvolMicrobiol.67:1613-1617)。结果表明，该菌株的1438碱基序列与菌株Bacillus siamensis具有99.51的高度同源，确定KY889为Bacillus siamensis。
3.3 KY889(Bacillus siamensis)菌株形态观察
将筛选的菌株接种到R2A平板上，室温下培养24h，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征等。
3.3.1菌株形态观察结果
经观察，菌株KY889在R2A培养基上培养生长2d，显微镜下观察KY889菌株呈杆状，菌落在培养基上呈圆形，菌落白色，边缘较整齐，较大，不透明，粘稠，经显微镜测定其直径约2-4μm左右。图4为KY889显微镜下观察结果。
实施例4.菌株KY889豆粕发酵液的生物学测定
为了验证菌株KY889水解发酵豆粕液体的能力，拟采用以一株广泛应用的商业菌株92068(菌株92068是市场上常用的枯草芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)为对照，比较它们对玉米、小白菜的生长是否具有促进作用。
同时，进一步利用菌酶协同的方法，将KY889菌株与酶制剂复配作优化，将豆粕尽可能水解成肽、氨基酸，与KY889本身所产生的细菌生物刺激素组合形成“生物刺激素-氨基酸肥料”产品。
4.1菌株KY889豆粕发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定
取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子播种于装有蛭石的盆栽中，观察盆中蛭石的湿润情况，适时浇灌(一般间隔2天浇灌一次)，直至玉米萌发；
对照菌株：选取商业菌株92068、菌株DSM7(市场上常用的解淀粉芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)以及与另外一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY897做对照菌株；
将OD600＝0.05的92068、DSM7、KY897、KY889菌株接种到含100mL豆粕液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养48小时；
将上述菌悬液分别等体积加入含100g豆粕的烧杯中混匀，室温静置发酵24小时；
将商业菌株92068菌悬液、DSM7菌悬液、KY897菌悬液、KY889菌悬液、商业菌株92068-豆粕发酵液、DSM7-豆粕发酵液、KY897-豆粕发酵液、KY889-豆粕发酵液经稀释相同倍数后适时等量浇灌于玉米盆栽，设置水为空白对照，水-豆粕发酵液为阴性对照；每天观察记录玉米生长情况，定时补浇。
待玉米植株生长，每隔2天用叶绿素测定仪测定并记录不同组别玉米植株叶面的叶绿素含量和氮素含量；
玉米生长30天后，将不同组别的玉米茎叶部剪下，放入已烘干的培养皿，置于烘箱进行烘干(105℃杀青，85℃烘干至恒重)，记录不同组别玉米植株干重。
4.1.1菌株KY889豆粕发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定结果
玉米生长30天后，对不同组别玉米进行叶绿素含量及氮含量测定，同时拍照记录不同组别玉米植株间的区别，完成后对玉米茎叶部进行烘干处理，因每个盆栽玉米发芽数量不一，为保证整体平均性，每组选取6棵长势均匀玉米植株进行烘干称重，结果如下：
表3.不同组别的玉米烘干后干重
Figure BDA0003645445930000141
表4.不同组别的玉米叶面叶绿素含量及氮素含量结果
Figure BDA0003645445930000142
从表3可见：①用不同菌株处理与水处理的豆粕发酵液浇灌的玉米干重比单纯浇水和菌液的玉米干重高；②KY889菌液浇灌的玉米干重明显大于商业菌株92068、DSM7及同为暹罗芽孢杆菌KY897菌液所浇灌的玉米干重；③KY889菌株的豆粕发酵液浇灌的玉米干重比水、水+豆粕处理提高88.1％和72.5％，且明显高于商业菌株92068、DSM7以及同为暹罗芽孢杆菌KY897处理的豆粕发酵液所浇灌的玉米干重。
由表4可得：①浇灌KY889菌悬液的玉米的平均叶绿素含量和平均氮素含量高于浇灌水、商业菌株92068、DSM7及同为暹罗芽孢杆菌的KY897菌悬液所浇灌的玉米；②浇灌水处理的豆粕发酵液、商业菌株92068、DSM7、KY897及KY889处理的豆粕发酵液的玉米其平均叶绿素含量和平均氮素含量明显高于单纯浇灌水和菌悬液的玉米，含量最高的均为KY889处理的豆粕发酵液所浇灌的玉米植株。
从图5中A-E可以看出，浇灌水处理的豆粕发酵液、商业菌株92068、DSM7、KY897及KY889处理的豆粕发酵液的玉米明显比单纯浇灌水和菌悬液的玉米长势更好；从图5中F可见，在不同菌株菌液浇灌的玉米中，浇灌KY889菌液的玉米长势相对较好；从图5中G-H可以看出，浇灌KY889处理的豆粕发酵液的玉米长得比水及水处理的豆粕发酵液高大，且植株整体叶片较为翠绿；从俯视图可见，浇灌KY889处理的豆粕发酵液的玉米叶片的宽度会明显大于浇灌水及水处理的豆粕发酵液的玉米植株；从图5中I-M可以看出，浇灌KY889处理的豆粕发酵液的玉米与商业菌株92068、DSM7处理以及同为暹罗芽孢杆菌的菌株KY897处理的豆粕发酵液浇灌的玉米植株高度差别不大，但浇灌KY889处理的豆粕发酵液的玉米植株整体叶片更为翠绿且舒展度较大，而且从俯视图可见，浇灌KY889处理的豆粕发酵液的玉米叶片的宽度明显大于商业菌株92068、DSM7处理的豆粕发酵液浇灌的玉米植株以及同为暹罗芽孢杆菌的菌株KY897处理的豆粕发酵液浇灌的玉米植株。
综上可得，豆粕经微生物菌株处理后能提供植物生长所需的营养成分，且不同菌株处理的豆粕发酵液对植物的生长促进作用有一定的差异；与商业菌株92068、DSM7以及同为暹罗芽孢杆菌的菌株KY897相比，不管是玉米植株干重、平均叶绿素含量、平均氮素含量还是玉米叶片宽度，经菌株KY889本身和菌株KY889处理的豆粕发酵液浇灌的玉米生长情况都要更好，表明KY889对植物的生长促进作用更强，同时也说明菌株KY889在其生长繁殖过程中能产生促进植物生长的物质，用其发酵的豆粕发酵液能将此作用放大，实现“1+1>2”的效果。
4.2菌株KY889豆粕发酵液对小白菜植株生长作用的生物学测定
取大小均匀的小白菜种子播种于装有蛭石的盆栽中，观察盆中蛭石的湿润情况，适时浇灌(一般间隔2天浇灌一次)，直至小白菜萌发；
将OD600＝0.05的92068、KY889菌株接种到含100mL豆粕液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养48小时；
将上述菌悬液分别等体积加入含100克豆粕的烧杯中混匀，室温静置发酵24小时；
将商业菌株92068菌悬液、KY889菌悬液、商业菌株92068-豆粕发酵液、KY889-豆粕发酵液经稀释相同倍数后适时等量浇灌于小白菜盆栽，设置水为空白对照，水-豆粕发酵液为阴性对照；每天观察记录小白菜生长情况，定时补浇。
4.2.1菌株KY889豆粕发酵液对小白菜植株生长作用的生物学测定结果
由图6可见，浇灌KY889菌悬液的小白菜与浇灌水、92068菌悬液的小白菜差别不大；浇灌水处理的豆粕发酵液、商业菌株92068处理的豆粕发酵液、KY889处理的豆粕发酵液的小白菜明显比单纯浇灌菌悬液的长势更好，其中促进小白菜生长效果最明显的为KY889处理的豆粕发酵液；可见，豆粕经菌处理后能提供植物(小白菜)生长所需的营养成分，且不同菌株处理的发酵液对植物的生长促进作用有一定的差异，菌株KY889处理的豆粕发酵液作用更强。
由于小白菜种植时间为12月-1月，从图6可见，浇灌水处理的豆粕发酵液、商业菌株92068处理的豆粕发酵液的小白菜部分叶片出现了叶片变黄的冻伤现象，而菌株KY889处理的豆粕发酵液浇灌的小白菜几乎没有出现叶片变黄冻伤的现象，其叶片甚至比另外两组叶面更加翠绿(由于小白菜叶片细小容易产生损伤，故在实验中没有用叶绿素测定仪及进行检测)，说明菌株KY889处理的豆粕发酵液产生的物质相对于另外两组来说更能促进植物生长，且能增加植物的抗冻能力。
4.3菌酶协同发酵豆粕生物学测定
取适量的玉米、小白菜播种于装有蛭石的盆栽中，观察盆中蛭石的湿润情况，适时浇灌(一般间隔2天浇灌一次)，直至玉米、小白菜萌发；
将OD600＝0.05的KY889菌株接种到含100mL豆粕液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养48小时；
将上述菌悬液分别等体积加入含100克豆粕的烧杯中混匀，其中一个加入适量康生元粗提蛋白酶2(蓝沛豆粕发酵液)，经摇匀后室温静置发酵24小时；
将KY889-酶制剂2-豆粕发酵液经稀释后适时等量浇灌小白菜及玉米，设置水-豆粕发酵液为对照1，酶制剂-豆粕发酵液为对照2；
每天观察记录玉米、小白菜的生长情况，定时补浇；
玉米生长30天后，将不同组别的玉米清洗干净后放入烘箱进行烘干(105℃杀青，85℃烘干至恒重)，记录不同组别玉米植株干重。
4.3.1菌酶协同发酵豆粕的生物学测定结果
从表5和图7结果可以看出，与浇灌对照水处理和酶制剂处理的豆粕发酵液相比，浇灌KY889+酶制剂处理的豆粕发酵液的玉米整体长势较好，且从表5干重可以看出，浇灌KY889+酶制剂处理的豆粕发酵液的玉米每棵的平均干重比浇灌水处理的玉米提高了64％，且与浇灌酶制剂处理的玉米相比提高了41.38％，说明虽然从SDS-PAGE跑胶结果显示酶制剂2对豆粕的降解更强，但由于酶制剂2本身不含有或不产生能促进植物生长的物质，仅靠水解豆粕产生的小分子物质对植物虽有一定促进作用，但其促进效果不如菌株KY889+酶制剂2处理豆粕发酵液，因为该豆粕发酵液中不仅含有豆粕水解后产生的小分子肽、氨基酸，而且还含有菌株KY889生长产生细菌特有的生物刺激素，能很大程度提高促进植物生长的作用。
同时，在小白菜上，浇灌水、水处理的豆粕发酵液、酶制剂2处理的豆粕发酵液的小白菜部分叶片出现了叶片变黄的冻伤现象，而菌株KY889+酶制剂2处理的豆粕发酵液浇灌的小白菜几乎没有出现叶片变黄冻伤的现象，叶面较大且更加翠绿，说明该发酵液产生的物质相对于另外3组来说更能促进植物生长，且菌株KY889菌液能产生增加植物的抗冻能力的作用因子。
表5.不同组别的玉米烘干后干重(每个盆栽种子发芽率不同，为不可控因素，取平均值做对比)
Figure BDA0003645445930000171
实施例5.KY889菌株多功能试验测定
由于菌株KY889结合酶制剂处理的豆粕发酵液产品含有微生物菌株KY889，而据报道此微生物菌株具有高效广谱抗菌活性和植物促生能力，因此本试验的目的是测定该菌株具体的抗植物病原真菌和细菌作用以及测定该菌株的其他功能，以确保后续该豆粕发酵液产品对真菌的抗性，提高产品效果。
5.1菌株与植物病原真菌和细菌的拮抗试验
植物病原真菌拮抗实验：将菌株KY889与实验室现有植物病原真菌接种到PDA培养基上进行平板对峙试验，根据不同病原真菌适宜的温度分别培养，观察试验结果，测定菌株对病原真菌抗性。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。
植物病原细菌拮抗实验：将植物病原细菌接种到R2A液体培养基中，30℃培养24h，测定OD600，后按终浓度OD600＝0.05稀释于R2A固体培养基中，倒平皿，将菌株KY889接种在该培养皿上，测定菌株对病原细菌的抗性。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。
Figure BDA0003645445930000172
Figure BDA0003645445930000181
5.1.1菌株抗植物病原菌试验结果
结果测定(图8)表明，与对照菌株92068相比，菌株KY889对番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、水稻纹枯病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、小麦根腐病具有更强或者相似的拮抗作用，且具有拮抗植物病原细菌青枯病和白枯病的作用。
5.2菌株抗逆性测定
将菌株KY889分别接种到条件为10％KNO3、20％KNO3、pH4.6、pH12的R2A培养基上，观察菌株是否生长，以及生长是否受抑制和生长速度的快慢。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。
5.2.1菌株KY889抗逆性测定结果
结果测定(图9)表明，与对照菌株92068相比，菌株KY889具有相似的耐盐性和耐碱性；但菌株KY889比菌株92068更强的耐酸性。
结论：本发明通过采用高通量法筛选方法从广东省云浮市罗定市采集的土壤中分离到了一株具有可将豆粕降解成5KD左右的小分子肽、氨基酸，可促进植物生长同时兼具提高作物抗冻能力的暹罗芽孢杆菌KY889，经过对该菌株的16sDNA的序列测定分析，该菌株1438个碱基序列与菌株Bacillus siamensis具有99.51％的高度同源，确定KY889为Bacillus siamensis。本发明发现KY889与商业菌株枯草芽孢菌株92068相比，KY889对豆粕的水解能力更强，其水解豆粕的产物均集中在4.6KDa左右；与商业菌株92068处理的豆粕发酵液相比，KY889处理的豆粕发酵液具有更强的促进植物生长的能力；而与商业酶制剂处理的豆粕发酵液相比，菌株KY889结合酶制剂处理的豆粕发酵液能表现出更强的促进作物生长的能力；同时研究还发现菌株KY889还兼具较好的耐盐、耐碱性、耐酸性及对植物病原菌抑菌谱较广的特点。由此可见，KY889是一株可将豆粕降解成小分子肽、氨基酸，可促进植物生长并提高作物抗冻能力同时兼具防治植物病害、可耐盐和耐酸碱的功能性微生物菌株。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 蓝沛生物科技（广东）有限公司
<120> 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
<130> PA22012515
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）KY889的16s rDNA序列
<400> 1
gggatgccta tactgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120
gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct 180
accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240
cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360
acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420
tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600
ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840
cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960
catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200
acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260
ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320
gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380
agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg ccgaaggg 1438
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24364。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889和/或其发酵物。
3.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889或权利要求2所述的微生物菌剂在以下至少一种中的应用：
(a)降解豆粕并生产出5KD以下的多肽和氨基酸混合物；
(b)降解蛋白质；
(c)促进植物生长或提高植物抗冻能力；
(d)防控植物病害。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其中(a)中，所述降解豆粕包括将所述豆粕降解为5KD以下的多肽和氨基酸。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其中(d)中，所述植物病害包括以下的至少一种：番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、水稻纹枯病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2和小麦根腐病。
6.一种发酵豆粕的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889发酵含豆粕的底物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括与将所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY889与酶制剂协同发酵。
8.一种豆粕发酵液，其特征在于，所述发酵液由权利要求6或权利要求7所述的方法获得。
9.权利要求7所述的豆粕发酵液在促进植物生长、提高植物抗冻能力或制备饲料或肥料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米和小白菜。
CN202210529044.8A 2022-05-16 2022-05-16 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用 Active CN115029259B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210529044.8A CN115029259B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210529044.8A CN115029259B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115029259A true CN115029259A (zh) 2022-09-09
CN115029259B CN115029259B (zh) 2024-04-05

Family

ID=83121682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210529044.8A Active CN115029259B (zh) 2022-05-16 2022-05-16 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115029259B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480097A (zh) * 2014-07-25 2015-04-01 青岛海大生物集团有限公司 一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用
CN108208316A (zh) * 2018-01-24 2018-06-29 吉林省农业科学院 含有暹罗芽孢杆菌的饲料
CN109439601A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法
CN109468243A (zh) * 2018-11-13 2019-03-15 河北农业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN110257293A (zh) * 2019-06-27 2019-09-20 康生元(肇庆)生物科技有限公司 解淀粉类芽孢杆菌ky15、菌剂、应用和应用其的产品
WO2020009097A1 (ja) * 2018-07-06 2020-01-09 Ｉｇａバイオリサーチ株式会社 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材
CN111690578A (zh) * 2020-07-31 2020-09-22 山东佐田氏生物科技有限公司 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用
CN113549578A (zh) * 2021-08-03 2021-10-26 华南农业大学 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480097A (zh) * 2014-07-25 2015-04-01 青岛海大生物集团有限公司 一种绿藻糖基微胶囊生物菌剂及其制备方法和应用
CN108208316A (zh) * 2018-01-24 2018-06-29 吉林省农业科学院 含有暹罗芽孢杆菌的饲料
WO2020009097A1 (ja) * 2018-07-06 2020-01-09 Ｉｇａバイオリサーチ株式会社 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材
CN109468243A (zh) * 2018-11-13 2019-03-15 河北农业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN109439601A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法
CN110257293A (zh) * 2019-06-27 2019-09-20 康生元(肇庆)生物科技有限公司 解淀粉类芽孢杆菌ky15、菌剂、应用和应用其的产品
CN111690578A (zh) * 2020-07-31 2020-09-22 山东佐田氏生物科技有限公司 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用
CN113549578A (zh) * 2021-08-03 2021-10-26 华南农业大学 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115029259B (zh) 2024-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112410244B (zh) 一种阿氏芽孢杆菌及其应用
US8252720B2 (en) Use of Gluconacetobacter with reduced use of nitrogen fertilizer to improve beet crop production
EA009126B1 (ru) Микроорганизмы для обработки почвы и способ их получения
CN111004760B (zh) 一株苏云金芽孢杆菌及其应用
CN111117924B (zh) 复合菌剂及制备方法、肥料及防治根腐病的方法
CN110358710B (zh) 一株侧孢芽孢杆菌及在制备抗病耐盐碱功能微生物制剂中的应用
CN115572702B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌、菌剂和生物制剂及其应用
CN101519644B (zh) 一株根瘤菌及其应用
CN109749953B (zh) 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用
CN105439657B (zh) 一种草莓专用抗重茬生物有机肥的制备方法
CN113736661A (zh) 耐盐性的根际促生细菌的筛选方法、菌株及其应用
CN111205998B (zh) 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841及其应用
CN110791459B (zh) 一株用于防控连作百合土传枯萎病的枯草芽孢杆菌及其应用
CN101463338A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用
CN111548948A (zh) 一种用于盐碱地玉米茎基腐病防治的微生物菌剂jf及其制备方法
CN115772482A (zh) 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用
CN110564647B (zh) 一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用
CN115058355A (zh) 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用
CN115029259B (zh) 一株能够降解豆粕的暹罗芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
CN107586748B (zh) 一种中华单孢菌及其应用
CN112920954B (zh) 微生物组合物及其用途
CN115851502B (zh) 拟蕈状芽孢杆菌、菌剂和液态生物有机肥以及它们的应用
CN112430558B (zh) 一株具有抑菌能力的丝状芽孢杆菌gbw-f006及其应用
CN113969252B (zh) 根瘤菌scauy041及其用途
CN117586931B (zh) 一种木糖氧化无色杆菌ivf-wk240及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant