CN108208316A - 含有暹罗芽孢杆菌的饲料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种含有暹罗芽孢杆菌的饲料。所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。本发明所提供的饲料中含有暹罗芽孢杆菌JAASHD，其具有广谱抗菌作用，对多种致病菌(主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)具有较好的抑制作用。此外，该暹罗芽孢杆菌JAASHD具有很高的分泌α‑淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶能力，可作为饲料发酵剂和添加剂应用于畜禽饲料中，能有效提高养殖动物的生产性能，应用前景广阔。

Description

含有暹罗芽孢杆菌的饲料

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种含有暹罗芽孢杆菌的饲料。

背景技术

随着人们对动物营养学技术的不断认识，微生物发酵技术越来越多地被应用到养殖行业中。发酵饲料可以充分利用杂粮、杂粕和农副产品下脚料、食品工业下脚料来生产饲料，是饲料原料的充分补充。同时，发酵饲料具有价格低、适口性好、营养物质利用率高等优点，成为养殖户的新选择。随着发酵技术路线的不断优化、发酵设备的不断完善，发酵饲料的品质也将逐步提升，这也将更好地为养殖业的健康和可持续发展提供更加有力的保障。

饲用微生物又称益生功能菌、活菌制剂。是近年来出现的一类新型饲料添加剂。它是指由许多有益微生物及其代谢产物和生长促进物质组成的，可直接饲喂动物的活菌制剂。具有调节动物胃肠道微生物态平衡、维持胃肠道的正常功能、提高宿主的健康水平、从而实现其防病、治病、促进生长等功能。由于它是有益活菌制剂，又具有无毒、无副作用、无污染、无残留、不产生抗药性等抗生素所不具备的优点，所以倍受关注。在饲料行业和畜牧业用有益微生物替代抗生素作为兽药和饲料添加剂，现已得到广泛的重视和应用，并显示出其光辉的前景。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有广谱抗致病菌的暹罗芽孢杆菌及其在畜禽养殖中发酵饲料和微生态试剂的应用，所述暹罗芽孢杆菌JAASHD筛选自健康仔猪的新鲜粪样，具有抑制致病菌能力，并具有很强的产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，可作为发酵饲料发酵剂和微生态制剂应用于畜禽养殖中，以弥补现有技术的不足。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种含有暹罗芽孢杆菌的饲料；

所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。

含有暹罗芽孢杆菌的饲料不仅能够提升饲料的营养价值，还能提高动物对疾病的抗性。

该菌种拉丁学名为Bacillus siamensis，中文学名为暹罗芽孢杆菌，菌株名为JAASHD，从吉林省水稻主产区健康仔猪的新鲜粪样中分离获得。

上述的经过分离纯化的暹罗芽孢杆菌，采用LB培养基，恒温37℃培养时间24小时，镜检菌体呈杆状，直径大约为0.5-0.6μm×1.3-2.9μm；平板生长出菌落呈奶白色，圆形，微凸，湿润光滑，边缘整齐。

另外，对于该菌株，经过纯化后测序，其16S rDNA序列如SEQ IDNO:1所示。

优选的，如上所述的饲料，所述饲料为发酵饲料。

所述暹罗芽孢杆菌能够生成α-淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶等产物，能够有效促进饲料的发酵，并改善饲料的营养成分。

优选的，如上所述的饲料，所述饲料为畜禽饲料。

优选的，如上所述的饲料，所述饲料中含有1w/w％～5w/w％的液体菌剂，所述液体菌剂中含有10^8～10cfu/mL的所述暹罗芽孢杆菌。

优选的，如上所述的饲料，所述液体菌剂的制备方法包括以下步骤：

将所述暹罗芽孢杆菌的菌种接种于液体培养基中进行培养并收集菌液。

优选的，如上所述的饲料，所述液体培养基包括LB培养基和/或营养肉汤培养基。

优选的，如上所述的饲料，所述饲料中含有0.1w/w％～1.0w/w％的固体菌剂，所述固体菌剂中含有100～1000亿/g的所述暹罗芽孢杆菌。

优选的，如上所述的饲料，所述固体菌剂的制备方法包括：

将所述暹罗芽孢杆菌的菌种接种于液体培养基中进行培养并收集菌液；

离心所述菌液收集菌体；

将所述菌体与保护剂混合后真空冷冻干燥。

优选的，如上所述的饲料，所述保护剂的种类包括低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸类、维生素类、蛋白质、多肽类、多糖或单糖类、酵母膏、脱脂奶中的一种或多种。

如上暹罗芽孢杆菌作为饲料发酵剂的应用；

所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的饲料中含有暹罗芽孢杆菌JAASHD，其具有广谱抗菌作用，对多种致病菌(主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)具有较好的抑制作用。此外，该暹罗芽孢杆菌JAASHD具有很高的分泌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶能力，可作为饲料发酵剂和添加剂应用于畜禽饲料中，能有效提高养殖动物的生产性能，应用前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为暹罗芽孢杆菌JAASHD系统发育树。

本申请提供的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，菌株名为JAASHD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2016年8月24日，保藏编号CGMCC NO.12903。经保藏中心于2016年8月24日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1暹罗芽孢杆菌分离筛选及鉴定

1、菌株初筛

采集吉林省各地健康仔猪新鲜粪样10份，分别称取10g样品，加入90mL无菌生理盐水，制备成样品悬液，经80℃水浴处理后，涂布于LB营养平板上，恒温37℃培养48小时，获得122株芽孢杆菌。

2、产酶芽孢杆菌筛选

1)α-淀粉酶检测：

淀粉培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂粉20g。

将分离得到的菌株点种到培养基上，37℃培养16～48小时后，在菌株生长良好的培养基表面滴加一定量碘液，使其均匀布满整个培养基平板，如果生长出的菌落周边出现无色透明圈，说明培养基中淀粉已被水解。

2)蛋白酶检测：

牛奶培养基：脱脂牛奶50ml、蒸馏水50ml、琼脂粉1.5g。

将分离的到的菌株点种到牛奶培养基，37℃培养16-48小时，如果生长出的菌落周边有透明圈产生，说明培养基中酪蛋白已经被水解。

3)纤维素酶检测：

纤维素培养基：营养琼脂+0.5％CMC(羧甲基纤维素钠)。

将分离得到的菌株点种到纤维素培养基，37℃培养16-48小时，用0.1％刚果红溶液使其均匀布满整个培养基平板，染色30分钟，再滴加一定量1moL/L氯化钠，布满培养基平板表面，脱色20分钟左右，如果生长出的菌落周边出现透明水解圈，说明培养基中CMC已经被水解。

经过产酶实验，筛选得到8株淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶产量均较高的菌株，对菌株进一步鉴定分析。

3、抑制致病菌芽孢杆菌初步筛选

将分离得到的菌株，恒温37℃培养16-48小时后，8000r/min离心10min，取上清液，将直径0.8cm无菌滤纸片浸泡于分离得到的上清液中15min，取大肠杆菌(Escherichiacoli)CMCC44825 50μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，静置20min，放上准备好的滤纸片，恒温37℃培养16小时，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示抑菌活性。以上致病菌购于广东微生物种质资源库。

经过抑菌实验，筛选得到1株对大肠杆菌抑制能力较高的菌株，对该菌株进一步鉴定分析。

4、芽孢杆菌分类学鉴定

按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述菌种分类鉴定的方法，对菌株JAASHD进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

菌体的形态和生理生化特性：

采用LB培养基，恒温37℃培养时间24小时，镜检菌体呈杆状，直径大概为0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生长出菌落呈奶白色，圆形，微凸，边缘整齐。

生理生化特征：结果如表1、2所示。

表1暹罗芽孢杆菌JAASHD生理生化试验

备注：-表示阴性反应；+表示阳性反应，+-表示弱阳性反应。

表2暹罗芽孢杆菌JAASHD糖发酵试验

备注：-表示阴性反应；+表示阳性反应，+-表示弱阳性反应。

5、分子生物学特性

提取JAASHD的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，将扩增产物回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。测得的序列如SEQ ID NO:1所示。

将测序结果与Gen-Bank序列同源性比较，然后用软件MEGA5.0构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，菌株JAASHD与Bacillusssiamensis strain PD-A10(GenBank登录号NR_117274.1)同源性为99％，并处于系统发育树同一分支。

基于菌体形态特征、生长条件、生理生化、16S rDNA鉴定结果特征，将菌株JAASHD鉴定为Bacilluss siamensis。建议的分类命名为暹罗芽孢杆菌；该菌株已于2016年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12903。

实施例2暹罗芽孢杆菌JAASHD产酶实验及其抑制致病菌实验

1、α-淀粉酶检测：

淀粉培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂粉20g。

将分离得到的菌株点种到培养基上，37℃培养16-48小时后，在菌株生长良好的培养基表面滴加一定量碘液，使其均匀布满整个培养基平板，如果生长出的菌落周边出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。

2、蛋白酶检测：

牛奶培养基：脱脂牛奶50ml、蒸馏水50ml、琼脂粉1.5g。

将分离的到的菌株点种到牛奶培养基，37℃培养16-48小时，如果生长出的菌落周边有透明圈产生，说明培养基中酪蛋白已经被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。

3、纤维素酶检测：

纤维素培养基：营养琼脂+0.5％CMC：

将分离得到的菌株点种到纤维素培养基，37℃培养16-48小时，用0.1％刚果红溶液使其均匀布满整个培养基平板，染色30分钟，再滴加一定量1moL/L氯化钠，布满培养基平板表面，脱色20分钟左右，如果生长出的菌落周边出现透明水解圈，说明培养基中CMC已经被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。

暹罗芽孢杆菌JAASHD的产酶情况如表3所示：

表3暹罗芽孢杆菌JAASHD的产酶试验

由表中可以看出，暹罗芽孢杆菌具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶能力，三种酶的透明圈直径与菌落直径比均在5.1左右，因此本发明筛选的暹罗芽孢杆菌在发酵饲料及其动物微生态制剂的应用上有很大的潜力。

4、抑制致病菌能力检测：

将分离得到的菌株，37℃，150-200rpm培养16-48小时后，8000r/min离心10min，取上清液，将0.8cm直径,无菌滤纸片浸泡于分离得到的上清液中15min，取大肠杆菌(Escherichiacoli)CMCC44825、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC26071、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CMCC50、志贺氏菌(Shigella flexneri)CMCC51061为指示菌各取50μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，静置20min，放上准备好的滤纸片，37℃恒温培养16小时，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示抑菌活性。以上致病菌均购于广东微生物种质资源库。

暹罗芽孢杆菌JAASHD抑制致病菌能力如表4所示：

表4暹罗芽孢杆菌JAASHD抑制致病菌能力试验

试验菌株	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌	鼠伤寒沙门氏菌	志贺氏菌
					暹罗芽孢杆菌	+++	+++	++	-

备注：-表示无活性；+表示活性较弱，抑菌圈直径＜11mm；++表示活性中等，抑菌圈直径11～15mm；+++表示活性较强，抑菌圈直径＞15mm。

实施例3暹罗芽孢杆菌JAASHD发酵饲料的制备

1、种子液制备：挑一环新鲜的暹罗芽孢杆菌菌泥，接种于100mL LB培养基中(250mL三角瓶装液100mL)，恒温37℃、200r/min培养16-24h即成种子液；

2、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12％接种量接种至灭菌营养肉汤培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在10⁸-10¹⁰CFU/mL时停止发酵培养；

3、发酵饲料制备：将制备好的工作发酵液按发酵物料质量5％-12％接入，恒温37℃培养35-48小时，发酵完毕后尽快包装。

常规发酵物料配方：玉米粉62％、豆粕22％、麦麸12％、预混料4％，营养含量和发酵后营养含量见表5：

表5常规猪饲料发酵前后的营养成分变化表

常规营养成分	发酵前	发酵后	变化率％
				粗蛋白％	17.1％	18.1％	+5.84％
粗纤维％	5.1％	3.8％	-25.5％
				赖氨酸	0.71％	0.77％	+8.45％

由上表可知，发酵后常规饲料的营养价值发生显著的变化。饲料中粗纤维下降了25.5％，粗蛋白在原来基础上提高了5.84％、赖氨酸在原来基础上提高了8.45％。提高了饲料的营养价值，利于动物对饲料的消化吸收。

实施例4暹罗芽孢杆菌JAASHD菌粉的制备

1、种子液制备：挑一环新鲜的暹罗芽孢杆菌菌泥，接种于100mL LB培养基中(500mL三角瓶装液200mL)，恒温37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；

2、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12％接种量接种至灭菌营养肉汤培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在10⁸-10¹⁰CFU/mL时停止发酵培养；

3、菌粉制备：将工作发酵液离心(10000rpm，8min)收集菌体，加入适量的保护剂搅拌混匀，经过真空冷冻干燥成粉，制成含活菌量为100-1000亿/g的暹罗芽孢杆菌菌粉。

实施例5暹罗芽孢杆菌JAASHD对仔猪生产性能的影响

将60只生长良好、体重相近的仔猪随机分为2组，每组3个重复，每个重复10只，Ⅰ组为对照组，饲喂普通商品日粮，Ⅱ组为实验组，在普通商品日粮基础上添加质量百分比为0.2％的暹罗芽孢杆菌粉剂。试验期为40天，测量仔猪的平均日增重、料肉比及腹泻率。实验结果如表6所示：

表6暹罗芽孢杆菌JAASHD对仔猪生产性能的影响

组别	平均日增重(g)	料肉比F/G	腹泻率(％)
				Ⅰ	321.78±12.42	1.89±0.07	18.12±1.41
Ⅱ	341.41±13.21	1.76±0.09	2.32±1.11

由上表中试验结果可以看出，4日喂养试验肉，Ⅱ组(实验组)仔猪平均日增重比Ⅰ组(对照组)增加19.63g，仔猪料肉比降低0.13，腹泻率降低15.8％。本试验结果表明日粮中添加暹罗芽孢杆菌能显著提高仔猪养殖的生产性能，降低日常喂养成本，增加养殖户经济收益。暹罗芽孢杆菌在仔猪饲料中添加有很好的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 含有暹罗芽孢杆菌的饲料

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1508

<212> DNA

<213> Bacillus siamensis

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggagg gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtcggtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgcggc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaac cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatgc tctgccaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc ccgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgctgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaatct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggta 1508

Claims (10)

1.含有暹罗芽孢杆菌的饲料；

所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。

2.根据权利要求1所述的饲料，其特征在于，所述饲料为发酵饲料。

3.根据权利要求1或2所述的饲料，其特征在于，所述饲料为畜禽饲料。

4.根据权利要求1或2所述的饲料，其特征在于，所述饲料中含有1w/w％～5w/w％的液体菌剂，所述液体菌剂中含有10^8～10cfu/mL的所述暹罗芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的饲料，其特征在于，所述液体菌剂的制备方法包括以下步骤：

将所述暹罗芽孢杆菌的菌种接种于液体培养基中进行培养并收集菌液。

6.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，所述液体培养基包括LB培养基和/或营养肉汤培养基。

7.根据权利要求1或2所述的饲料，其特征在于，所述饲料中含有0.1w/w％～1.0w/w％的固体菌剂，所述固体菌剂中含有100～1000亿/g的所述暹罗芽孢杆菌。

8.根据权利要求7所述的饲料，其特征在于，所述固体菌剂的制备方法包括：

将所述暹罗芽孢杆菌的菌种接种于液体培养基中进行培养并收集菌液；

离心所述菌液收集菌体；

将所述菌体与保护剂混合后真空冷冻干燥。

9.根据权利要求8所述的饲料，其特征在于，所述保护剂的种类包括低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸类、维生素类、蛋白质、多肽类、多糖或单糖类、酵母膏、脱脂奶中的一种或多种。

10.暹罗芽孢杆菌作为饲料发酵剂的应用；

所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。