WO2024055616A1 - 一株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102，其于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62531。该芽孢杆菌对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，可有效促进动物生长性能，提升养殖动物的抗病力，可作为动物益生菌的优良候选菌株。该菌株及其发酵产物可应用于制备饲料添加剂、饲料或药物。
Description
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株芽孢杆菌及其应用。
随着国家实施饲料禁抗、养殖限抗。研发一种无污染、无残留、绿色、环保型的新型饲料添加剂取代抗生素的应用已经成为必然趋势。芽孢杆菌在农业方面有着广泛的应用，很多生物农药是用芽孢杆菌制成的；有些菌株可用于养殖业上，作为饲料添加剂应用，提高畜禽产品的品质，降低饲养成本，抗病免疫能力。另一方面，传统饲用或人用抗生素耐药性形势严峻，迫使人们加快寻求抗生素替代品的步伐，无可否认某些天然活性物质如抗菌肽具有潜在的可能性，特别是来源于芽孢杆菌的抗菌肽，因其广谱抗菌能力以及较为高效的活性而备受关注。
芽孢杆菌(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌由于产生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射等所造成的伤害，维持自身能力不受影响。芽孢杆菌种类繁多、数量庞大，是自然界中广泛存在的非致病性细菌，对人畜无害，自然环境友好。鉴于芽孢杆菌的生物学特性，芽孢杆菌具有良好的开发应用空间，特别是在使用活菌制剂及其产物应用中表现出强大的生命力。
发明内容
本发明的发明人意外地从乌龟养殖池池底泥中分离筛选出一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102，其可分泌脂肽类抗生素、聚酮类化合物和抗菌蛋白，对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，可有效提升养殖动物的抗病力，可有效促进动物生长性能，可作为动物益生菌的优良候选菌株，在畜禽、水产等动物养殖生产中具有较高的应用价值。
基于上述发现，本发明提供了一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102，其于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62531，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明还提供了上述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在制备饲料添加剂、饲料或药物中的应用。具体的，该饲料添加剂、饲料或药物对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆
菌具有明显的抑菌性，可调节养殖动物肠道内微生物菌落平衡。
此外，该饲料添加剂、饲料或药物可促进动物肠道对于营养物质的吸收利用，提升其生长性能。优选的，该动物为猪，进一步优选的为仔猪，更进一步优选为断奶仔猪。
本发明还提供了上述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在制备用于防治动物腹泻的饲料添加剂、饲料或药物中的应用，其可减少动物腹泻的发生。优选的，该动物为猪，进一步优选的为仔猪，更进一步优选为断奶仔猪。
本发明还提供了上述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的发酵产物。
本发明还提供了上述的发酵产物在饲料添加剂、饲料或药物中的应用。具体的，该饲料添加剂、饲料或药物对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌具有明显的抑菌性，可调节养殖动物肠道内微生物菌落平衡。
此外，该饲料添加剂、饲料或药物可促进动物肠道对于营养物质的吸收利用，提升其生长性能。优选的，该动物为猪，进一步优选的为仔猪，更进一步优选为断奶仔猪。
本发明还提供了一种饲料添加剂、饲料或药物的制备方法，其将上述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行培养的步骤或采用上述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行发酵的步骤。
本发明还提供了一种饲料添加剂、饲料或药物，其采用上述的制备方法制备而得。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102可分泌脂肽类抗生素、聚酮类化合物和抗菌蛋白，对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌具有明显的抑菌性，在畜禽、水产等动物养殖生产中具有较高的应用价值。
图1是本发明实施例1中芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在琼脂平板上培养后菌落形态图；
图2是本发明实施例1中芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在琼脂平板上培养后染色图。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
实施例1菌株筛选
1、试验材料
(1)指示菌：大肠杆菌(K12D31)：金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)来自中国微生物菌
种保藏管理中心。
(2)培养基：LB琼脂、LB肉汤、营养琼脂，购自广东环凯微生物科技有限公司。
(3)细菌生化反应试剂：购自广东环凯微生物科技有限公司。
(4)药敏试纸片：购自广东环凯微生物科技有限公司。
(5)试验动物：BALB/c小白鼠，购自广东省实验动物中心。
2、菌株的筛选、分离
取乌龟池底泥约1g于1.5ml离心管，4500rpm离心5min，上清移到另一离心管中，95℃水浴加热5min，每样品取200μL涂布LB琼脂平板，37℃培养24h。
挑取芽孢杆菌疑似菌落于LB琼脂平板上划线，37℃静置培养24h，挑取典型菌落镜检。挑取典型菌落于LB琼脂平板上划线，37℃静置培养24h，选取代表株于LB肉汤培养基中，于37℃、200r/min条件下培养24h，菌液进行16S rDNA克隆测序，鉴定，获得芽孢杆菌X102菌株。
3、菌株的抑菌试验
将筛选获得的芽孢杆菌X102菌株应用营养琼脂平板分离培养，挑取典型菌落，接种于LB肉汤培养基，37℃，振摇(120转/分钟)培养24h，取出菌液，置4℃，备用，并进行抑菌实验。具体如下：
(1)指示菌培养：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于LB肉汤培养基，37℃，振摇(120转/分钟)培养16～24h，细菌浓度约为OD 1.0(600nm)左右，取出，置4℃，备用。
(2)菌液上清液的制备：取菌液1mL加入离心管，10000rmp离心10min,取上清液，置4℃，备用。
(3)菌液滤过液制备：取上清液1mL，以0.45μml滤器过滤，收集过滤液，置4℃，备用。
(4)抑菌试验
取熔化后冷却至50～56℃LB琼脂，取指示菌液，加每平皿约20μL，充分混匀，浇注平板，风干表面凝集水，备用。
菌液的抑菌试验采用滤纸片法：用直径6mm，121℃，20min，干燥滤纸片，按预设位置贴附，取被测菌液(约10μL)，滴加于贴附指示菌平皿表面滤纸片上，并用强力霉素药敏片(金黄色葡萄球菌指示菌平板)和新霉素药敏片作对照(大肠杆菌指示菌平板)，每株菌株试验样品做2个平皿重复，置37℃，18～24h后取出，用游标卡尺计量抑菌圈直径(mm)，记录结果。上清液和滤过液抑菌试验，在同一指示菌平皿进行，采用琼脂扩散法：按预设位置，以直径6mm
打孔器打孔，挑出孔内琼脂，取被测菌液(约60μL)，滴加于孔内，以加满不溢为度，其他与滤纸片法相同。具体实验结果如表1所示。
表1芽孢杆菌X102抑菌试验结果表
综合样品的抑菌强度依次是：芽孢杆菌X102菌液、上清液和菌液滤液。实验结果表明芽孢杆菌X102菌株对革兰阳性金黄色葡萄球菌的抑菌性较强；相对于大肠杆菌，芽孢杆菌X102对革兰阳性金黄色葡萄球菌抑菌性强度更为明显。从抑菌强度分析表明：芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102是一株特性优良的益生菌候选菌株。
最终筛选出的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在营养琼脂平板划线分离培养(37℃，24h)，其菌落特征为：菌落黄白色，圆形，较少划开单菌落，直径4～6mm，粘稠，隆起，菌落表面形成白色皱褶，自中心呈同心圆放射排列，周边形成透明粘液带(参图1)。
4、形态、生化鉴定
最终筛选出的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在普通琼脂平板培养(37℃，24h)，涂片，革兰氏染色，镜检。结果表明，其为革兰氏染色阳性，较细长，蓝紫色大杆菌(参图2)。
按广东环凯微生物科技有限公司相关的细菌生化鉴定管使用说明书，将芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102接种各细菌生化鉴定反应管，37℃，24h培养，判定结果见表2。
表2芽孢杆菌X102生化反应鉴定结果表
备注：“+”为阳性反应，“-”为阴性范围，“w”为弱阳性反应
备注：“+”为阳性反应，“-”为阴性范围，“w”为弱阳性反应
5、基因测序
芽孢杆菌新种X102进行16S rDNA克隆测序(广州艾基因生物技术有限公司)。通过对16S rDNA基因片段测序，其基因序列如下所示：
进一步的，将测序结果与基因BANK数据库进行序列同源性比较，X102菌株与Bacillus sp.210 63遗传距离相同，确认芽孢杆菌菌株X102(Bacillus sp.X102)为芽孢杆菌新种菌株。
6、小白鼠安全性试验
选取BALB/c小白鼠，随机分成3组，每组5只。A组第一天口服菌液0.1mL/只；B组口服菌液0.2mL/只；C组口服LB肉汤培养基，作为对照组。自第二天起，每天取菌液，按A组0.1mL/只；B组0.2mL/只，均匀拌于饲料中，自由采食。试验7天，每天观察记录临床状况，称量体重，观察粪便情况，记录结果。
试验显示：试验小白鼠试验期间食欲明显提高，粪便正常。无死亡、发病。表明：口服新种芽孢杆菌X102对小白鼠无致病性，安全。鉴于喂饲试验时间较短，具体增重及相关指标与对照组差异不明显。
7、药物敏感性试验
选取具有代表性的常用药物7种：阿莫西林、阿米卡星、头孢菌素、恩诺沙星、复方新诺明、青霉素、强力霉素，对芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行药物敏感试验。药敏试纸片购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，具体试验方法按药敏试验纸片(扩散法)说明书进行。
表3芽孢杆菌X102药敏试验结果表
通过以上结果可以看出，芽孢杆菌X102株对所选择的7种常用的代表性药物也均在敏感水平以上，同样不具有耐药性或抗药性；口服新种种芽孢杆菌X102株对小白鼠无致病性，安全。新种芽孢杆菌X102菌株具有较强的抑菌性，尤其是对革兰氏阴性大肠杆菌的抑菌性更强。综上，实验室分离获得的新种芽孢杆菌X102株更具备益生素优良菌株的要求，在畜禽、水产等动物养殖生产中，可以作为益生素菌种或饲用微生物添加剂研究、开发与应用。
实施例2芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的效果验证
1、试验材料
试验用芽孢杆菌X102株制剂由佛山市南海东方澳龙制药有限公司提供，其芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102株制剂活菌数≥3.0×109cfu/g。该制剂的制备方法为：采用MRS肉汤培养基，于温度37℃、转速200r/imn、通气量1.5L/min条件下发酵48h，加入淀粉混合均匀干燥粉碎而成。
2、试验动物分组与试验设计
采用单因素完全随机设计，根据出生日期、胎次和重量相近、性别一致的原则选择90头“杜长大”断奶仔猪，随机分为3组,每个处理组3个重复组,每个重复组10头仔猪。预试期5天，正式试验期30天。预试期内所有仔猪饲喂基础日粮。正式试验期内，对照组饲喂基础日粮，试验Ⅰ组在基础日粮添加芽孢杆菌X102株制剂(500g/t日粮)，试验Ⅱ组在基础日粮添加芽孢杆菌X102株制剂(1000g/t日粮)。
3、饲养管理
进猪前先彻底消毒猪舍，并清洗料槽。仔猪采用高架网床保育，地板为塑料漏缝地板，试验期间自由采食和饮水，按照猪场日常管理制度进行生产管理，按猪场常规程序进行消毒、驱虫和免疫。定期消毒，保持环境卫生。
4、指标测定及方法
预试结束后清晨空腹称重，并做好数据记录，进入正试期，记录采食量、腹泻数、死亡数。试验结束时，按重复组空腹称重。计算各重复组试验猪的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比、腹泻率。
平均日采食量(ADFI)＝(配料总量-剩料量)/(试验天数×每组试验猪数)
平均日增重(ADG)＝(试验末体重-初始体重)/(试验天数×每组试验猪数)
料重比＝平均日采食量/平均日增重
腹泻率＝试验期腹泻仔猪头次/(每组试验猪头数×试验天数)×100％
平均日采食量(ADFI)＝(配料总量-剩料量)/(试验天数×每组试验猪数)
平均日增重(ADG)＝(试验末体重-初始体重)/(试验天数×每组试验猪数)
料重比＝平均日采食量/平均日增重
腹泻率＝试验期腹泻仔猪头次/(每组试验猪头数×试验天数)×100％
5、实验结果
5.1芽孢杆菌X102株制剂对断奶仔猪生长性能的影响
具体结果见下表所示：
注：不同组别间字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)
注：不同组别间字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)
从表中可知，试验Ⅰ组和Ⅱ组的末重、平均日增重、平均日采食量均显著高于对照组(P<0.05)。试验II组的末重、平均日增重显著高于试验I组((P<0.05))。两组之间的平均日采食量差异不显著(P>0.05)。试验Ⅱ组的料重比显著低于对照组(P<0.05)，试验Ⅰ组的料重比低于对照组之间但差异不显著(P>0.05)。结果表明，随着芽孢杆菌X102株制剂在基础日粮中添加量的增加，断奶仔猪的生长性能逐步提高，Ⅰ组和Ⅱ组之间差异显著。
需要说明的是，仔猪断奶经常会发生断奶应激，造成肠道健康问题。肠道对营养物质的消化吸收与肠道的健康状况密切相关，而动物肠道的形态、肠道内有害菌的丰度、肠道的渗透压等均会影响动物肠道的健康状况。饲料中的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102株制剂进入动物肠道后能够通过刺激上皮细胞的增殖促进绒毛生长，改善动物肠道的形态。芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102株制剂能够抑制有害微生物的生长，改善动物的肠道微生物菌群平衡，从而促进肠道对营养物质的消化吸收，改善动物生长性能。同时可能由于芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102株制剂在肠道繁殖代谢含有小分子多肽及未知生长因子等多种生物活性，可提高断奶仔猪对饲料中营养物质的利用率，从而提高断奶仔猪生长性能。
5.2芽孢杆菌X102株制剂对断奶仔猪腹泻率的影响
具体结果见下表所示：
注：不同组别间字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)
注：不同组别间字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)
从表中可知，Ⅰ组和Ⅱ组的腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，Ⅰ组和Ⅱ组之间差异也显著(P<0.05)。结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102株制剂在基础日粮中添加量的增加，断奶仔猪的腹泻率显著降低(P<0.05)。
需要说明的是，仔猪腹泻具有发病率高、侵害性强的特点，是养猪业常见的疾病之一，严重影响仔猪存活率和正常生长。仔猪在断奶前后，消化系统尚未发育成熟，整体消化功能比较弱。断奶过程中饮食结构、饲养环境等急剧改变造成的应激，极易引发断奶仔猪肠道微生物菌群紊乱，导致断奶仔猪腹泻，严重时还会导致断奶仔猪死亡。芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102制剂进入动物肠道后能够抑制肠道内有害细菌的增殖，促进有益菌的生长繁殖，通过控制有益菌与有害菌的数量来调节肠道内微生物菌落平衡，保障肠道健康，从而减少腹泻的发生。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (14)
- 一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102，其于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62531，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
- 如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在制备饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在制备用于促进动物生长性能的饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102在制备用于防治动物腹泻的饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的发酵产物。
- 如权利要求5所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的发酵产物在饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 如权利要求5所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的发酵产物在用于促进动物生长性能的饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 如权利要求5所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102的发酵产物在用于防治动物腹泻的饲料添加剂、饲料或药物中的应用。
- 一种饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行培养的步骤；或采用如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行发酵的步骤。
- 一种饲料的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行培养的步骤；或采用如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行发酵的步骤。
- 一种药物的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行培养的步骤；或采用如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)X102进行发酵的步骤。
- 一种饲料添加剂，其特征在于，其采用如权利要求9所述的制备方法制备而得。
- 一种饲料，其特征在于，其采用如权利要求10所述的制备方法制备而得。
- 一种药物，其特征在于，其采用如权利要求11所述的制备方法制备而得。
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