CN105820987A - 一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及养殖业技术领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂。该地衣芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.12334。本发明提供的保藏编号为CGMCC No.12334的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)菌株是从健康藏香猪的肠道中分离得到，具有耐酸、耐碱、耐盐、抗逆性强、能够抑制有害菌的生长繁殖的优点。本发明的菌株及微生态制剂可用于仔猪、公猪、母猪、育肥猪的养殖，抑制养殖环境中有害微生物，能够改善猪肠道微生态结构，提高免疫力。

Description

一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂
技术领域
本发明涉及养殖业技术领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂。
背景技术
猪肉是当今世界消费量最大的肉类产品。商品猪的品种较多，其中藏香猪是我国唯一的高原、高寒放牧猪种，具备耐粗饲，抗病力强，抵御恶劣自然气候能力强等特性，此外，藏香猪具有皮薄、肉香味美、营养丰富等特点。成华猪是四川特有的猪种，主要有具有早熟易肥、屠宰率较高和肉质细嫩的特点。雅南猪是四川省地方优良品种，具有奶头数多、繁殖力较高、育肥猪积脂能力强、配合力好等优点。以上猪种在四川乃至全国有着重要的经济商品价值。
猪的生长性能和肉质性状都是十分重要的经济指标，生长性能主要反映猪对饲料养分的利用能力，而胴体性状和肉质性状主要体现养分在猪体内的分配方式。现有的商品猪养殖主要只考虑到商品猪养殖数量提高、猪只重量快速增长，不重视商品猪肉质的质量、安全、健康以及粪便的有效安全处理。在饲养过程中，会大量使用抗生素，以用于疾病的治疗和促进商品猪体重快速增加。而抗生素的使用不仅会导致畜禽免疫力降低、产生耐药性，同时抗生素在商品猪体内残留又会直接危害食品安全，威胁人类的健康，同时商品猪的排泄物中残留的抗生素又会造成环境污染。
微生态制剂是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂。当猪肠道菌群遭到破坏，致病菌就会大量繁殖。微生态制剂可以平衡肠道的菌群，增加益生菌的数量，能促进正常微生物群的生长繁殖，而抑制了致病菌的生长繁殖，从而调节肠道微生态平衡，改善猪的消化道环境。在能够较好地抑制病原微生物的同时，又能够对肠道疾病有较好地预防作用。同时，猪胃肠道的许多微生物可产生多种消化酶，可将饲料中的大分子有机物降解为小分子，有利于猪肠道对营养物质的吸收。肠道中益生菌产生的有机酸可以促进肠道对营养物质的吸收，提高饲料养分消化吸收率，从而提高了商品猪对饲料的利用率，提高猪的生产性能。目前，已有防治仔猪腹泻的微生态制剂，但针对育肥猪的微生态制剂较少。因此，需要提供一种能够改善肉质、促进生长的育肥猪微生态制剂具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂。本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)菌株是从健康藏香猪的肠道中分离得到，具有耐酸、耐碱、耐盐、抗逆性强、能够抑制有害菌的生长繁殖的优点。本发明的菌株及微生态制剂可用于仔猪、公猪、母猪、育肥猪的养殖，能够改善猪肠道微生态结构，提高猪的饲料利用率，促进生长，提高免疫力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌菌株，其保藏编号为CGMCCNo.12334。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株的制备方法为：将藏香猪粪便稀释，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，获得单一菌落，纯化获得保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株。
在本发明提供的实施例中，牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL；其pH为7.0～7.2，121℃灭菌20min。
在本发明提供的实施例中，培养采用的温度为37℃，时间为18h。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株的制备方法具体为：称取藏香猪粪便，溶于无菌水中，80℃水浴15～20min后，将悬浮液制成10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的溶液；取4个适当稀释梯度(10-3～10-6)的悬液涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个稀释度至少3个平板，37℃培养18h，获得单一菌落，将单一菌落划线分离到纯菌落为止。
本发明还提供了一种微生态制剂，包括本发明提供的地衣芽孢杆菌菌株。
作为优选，地衣芽孢杆菌菌株在微生态制剂中的活菌数为(3～6)×109CFU/mL。
在本发明提供的实施例中，微生态制剂的制备方法为：将保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株采用营养肉汤培养基进行培养，液体发酵后冷冻干燥得到微生态制剂。
在本发明提供的实施例中，营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
本发明还提供了该地衣芽孢杆菌菌株或微生态制剂在改善猪肠道微生态结构、促进猪的生长、提高免疫力中的应用。
在本发明提供的实施例中，改善猪肠道微生态结构为：抑制有害细菌生长繁殖，提高肠道中益生菌活力。
在本发明提供的实施例中，该地衣芽孢杆菌菌株或微生态制剂可抑制大肠杆菌的生长繁殖，有利于乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌的生长繁殖。
本发明还提供了该地衣芽孢杆菌菌株或微生态制剂在制备抑菌剂中的应用。
本发明还提供了一种日粮，包括本发明分离得到的地衣芽孢杆菌菌株或制得的微生态制剂，和基础日粮。
作为优选，微生态制剂与基础日粮的重量比为1：(100～1000)。
作为优选，本发明提供的日粮用于藏香猪、成华猪、雅南猪的仔猪、公猪、母猪、育肥猪的养殖。
本发明还提供了一种抑菌剂，包括本发明分离得到的地衣芽孢杆菌菌株或制得的微生态制剂。
在本发明提供的实施例中，抑菌剂的剂型为水剂。
抑菌剂的剂型为水剂时，作为优选，微生态制剂与水的重量比为1：(10～100)。
在本发明提供的实施例中，微生态制剂与水的重量比为1：50。
在本发明中，该抑菌剂可抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长与繁殖。
作为优选，该抑菌剂的用量为0.2～0.5kg/m3。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂、日粮。该地衣芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCCNo.12334。本发明至少具有如下优势之一：
(1)本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)菌株是从健康藏香猪的肠道中分离得到，具有耐酸、耐碱、耐盐、抗逆性强、能够抑制有害菌的生长繁殖的优点。本发明的菌株及微生态制剂可用于仔猪、公猪、母猪、育肥猪的养殖，能够改善猪肠道微生态结构，提高猪的饲料利用率，促进生长，提高免疫力；
(2)本发明提供的抑菌剂可有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长与繁殖。
生物保藏说明
菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)KM01于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.12334。
附图说明
图1是依据16SrDNA序列构建的菌株KM01与相关种的系统发育树。
具体实施方式
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的地衣芽孢杆菌菌株及微生态制剂中所用原料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)的分离与鉴定
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min)。
称取10g藏香猪粪便，溶于100mL无菌水中，80℃水浴15～20min，然后用无菌水10倍梯度稀释，取103～106等4个适当稀释梯度的悬浮液涂布于平板，每个稀释度至少3个平板，37℃培养18h获得单一菌落，将单一菌落划线分离，直到获得纯菌落为止，将菌株命名为KM01。
(1)形态和生理生化鉴定
在纯菌落菌株进行革兰氏染色后，将菌株划线分离、培养，采用光学显微镜进行革兰氏染色观察和芽胞染色观察，生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》。
形态特征：菌落为白色，不透明，表面较平且干燥，边缘光滑.菌体呈直杆状，长1.5-3.0μm，宽0.6-0.8μm，革兰氏反应呈阳性。
生理生化特征：理生化鉴定结果如下表所示，根据菌株KM01的生理生化特征，参照《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定菌株为芽孢杆菌属菌株。
表1菌株主要生理生化特征
指标 结果 指标 结果3 -->
硝酸盐还原 + 明胶试验 +
甲基红试验 + 淀粉水解 +
柠檬酸盐 + 卵磷脂试验 -
V-P试验 + 过氧化氢酶 +
亚硝酸盐 + 葡萄糖 发酵型
吲哚试验 + 石蕊牛乳试验 产酸凝固
注：+表示阳性，-表示阴性。
(2)16SrDNA序列鉴定
提取菌株基因组总DNA，采用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增后的序列回收进行测序，测序完成后，将所测得的序列与GenBank中的16SrDNA序列进行Blast相似性分析比较，以16SrDNA基因序列同源性>99％为鉴定标准。
16SrDNA基因序列分析结果：所测得的序列与GenBank中的16SrDNA序列进行Blast相似性分析比较，菌株KM01与地衣芽孢杆菌的16SrDNA序列的同源性达到了99％。根据16SrDNA序列分析结果，综合考虑菌株的细胞壁革兰氏染色、菌落形态特征、生理生化特征，鉴定菌株KM01为地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)。
(3)系统发育树构建
利用MEGA5.1软件，选择芽孢杆菌属内8个种和短芽孢杆菌属2个种的16SrDNA序列进行同源性比对，绘制系统发育树，如图1所示。
实施例2分离菌株特性的测定
(1)耐酸性测定
培养基：营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃20min灭菌)。
将配制的营养肉汤培养基取100mL到三角瓶中，灭菌后，在无菌操作台上将实施例1分离得到的菌种接种于营养肉汤培养基，37℃，200r/min，摇床培养，全部形成芽孢后，待用。
准备7支无菌试管，分别加入4.5mL无菌水，编号1、2、3……6、7，取0.5mL芽孢悬浮液于1号试管，混匀，然后从1号试管取0.5mL悬浮液于2号试管，混匀，然后依次对芽孢悬浮液进行10倍梯度稀释。
准备3支无菌试管，各加入4.5mL无菌水，分别在10-5、10-6、10-7梯度试管取0.5mL芽孢悬浮液3支试管，置于37℃，200r/min摇床培养24h，然后在各试管取200μL培养液于平板，涂布计数。
制人工胃液100mL，灭菌，分别取4.5mL至3支无菌试管中，分别在10-5、10-6、10-7梯度试管取0.5mL芽孢悬浮液于3支试管，然后置于37℃，200r/min摇床培养，分别于30、180min时用以上方法测定活菌数量。设两株地衣芽孢杆菌(KM02、KM03)作为对照，测试结果如下：
表2菌株在不同培养时间下人工胃液中存活情况
实验表明KM01菌株对人工胃液耐受能力良好，高于对照组KM02、KM03菌株。
(2)耐盐性测定
在7个营养肉汤培养基中各加入一定量的猪肝胆盐溶液，使猪胆盐浓度为0.01％、0.03％、0.05％、0.10％、0.50％、1.0％和5.0％，分别取9mL胆盐培养液于7支无菌试管。
先将菌液于37℃、200r/min在营养肉汤培养基培养18h后，在7支不同猪胆盐浓度的培养液试管中各加入1mL菌株培养液，37℃静置培养12h后，采用10倍梯度稀释，取105倍稀释梯度的样液1mL进行平板涂布计数，37℃恒温培养，48h后观察记录活菌数量。设两株地衣芽孢杆菌(KM02、KM03)作为对照，测试结果如下：
表3菌株在不同猪胆盐浓度中存活情况
注：+表示菌落生长素超过30个，(+)表示菌落数在5～30之间，-表示菌落数在0-5个。
实验表明，KM01菌株对胆盐耐受能力良好，高于对照组KM02、KM03菌株。
(3)抗菌性测定
采用营养肉汤培养基培养大肠杆菌和沙门氏菌，分别取5mL菌液至200mL灭菌后冷却至40℃的营养琼脂培养基，摇匀后倒平板，凝固后放置4℃冰箱扩散24h备用。将芽孢杆菌用接种环接种于大肠杆菌平板和沙门氏菌平板上，培养24h后，观察菌种抑制圈的大小。测试结果如下：
表4菌株在不同猪胆盐浓度中存活情况
菌株 对大肠杆菌抑菌圈大小(mm) 对沙门氏菌抑菌圈大小(mm)
KM01 14.5 13.9
KM02 11.0 10.3
KM03 12.1 11.6
实验结果表明，24h后观察到所有的平板均出现抑制圈，三种菌株对大肠杆菌、沙门氏菌的生长繁殖均有抑制作用，其中，KM01菌株效果最好。
综上所述，经实验测定三种芽孢杆菌菌株均有着良好的耐酸性、耐盐性、抗菌性，能够有效地作为微生态制剂的菌种，选定其中效果最好的KM01作为本专利中的菌株。
实施例3微生态制剂的制备
(1)微生态制剂菌株的培养制备
培养基：营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min)。
本发明所选用的地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)可以在营养肉汤培养基培养，培养后采用液体发酵技术后冷冻干燥一系列处理后加工成菌粉，制剂中含水量低、活菌数高，具有耐酸性、耐盐性、抗菌性等特性。
(2)微生态制剂活菌总数测定
取1ml培养液样品至装有9ml浓度为0.9％的无菌生理盐水的试管中，10倍梯度逐步稀释至适当梯度，吸取200μL适当稀释梯度的菌液于平板中涂匀涂布，将涂布的平板置于37℃培养箱中培养18h，待长出清晰可见的菌落，然后选择平均菌落数在30～300之间的平板进行计数。经测定，最终细菌浓度为3×109～6×109CFU/mL。
实施例4微生态制剂应用效果的测定
(1)微生态制剂在猪用日粮中的应用
抽取50头体重在35kg左右的育肥猪，称量体重之前，空腹12h，早上8点测量体重，之后对其进行分组，每10头猪放在一个猪圈内。对于实验组，每次按猪体重5％饲喂含实施例3制备的微生态制剂的日粮，对照组饲喂不含微生态制剂日粮，其它条件相同。在一周预喂期结束后，按照之前的要求，再次进行称重。然后开始正式试验，每天饲喂情况与前期一致，同时记录各项指标。在饲喂45d后，采用之前的方法对猪的体重进行测量，记录体重数据，按照各项数据的统计情况，计算日增重、料肉比等主要指标。
实验表明，饲喂添加有微生物制剂的商品猪日增重为0.4040±0.0586kg，大于普通日粮饲喂商品猪的自增重(0.3754±0.0473kg)，同时，饲喂微生态制剂日粮的实验组未出现腹泻的情况。因此微生态制剂能够改善调节肠道微生物，能够增加猪群的肠道消化吸收能力、促进肉质的改善、促进生长，而且还能够提高免疫力，降低肠道疾病的发病率。
(2)微生态制剂在饲养环境的应用
将地衣芽孢杆菌(B.licheniformisKM01)配制成微生态制剂，再将其与水按照1:50的比例制成喷洒菌剂，可按照每立方米0.2～0.5kg的用量利用喷雾方式喷洒与饲养圈舍内外，每3天一次，同时不使用任何消毒剂。30天后，测定饲养场不同环境的大肠杆菌、沙门氏菌的数量。
实验结果表明，饲养场环境中的细菌总数在6×104个/m3的国家安全标准范围(《规模猪场环境参数及环境管理》GB/T17824.3—2008)，所以利用此方法能够有效地抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的生长繁殖，能够达到普通消毒剂的消毒效果。
(3)猪粪便中微生物数量
在上述微生态制剂在猪用日粮中应用的试验结束前1天收集新鲜粪便，用于测定猪粪中的大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌的数量，实验结果如下：
表5粪便中大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌的数量
实验表明，饲喂微生态制剂的猪粪的乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌数量多于对照组，而大肠杆菌的数量少于对照组，说明该微生态机制能够有利于肠道中有益菌生长繁殖，同时又有效地抑制肠道中部分病原菌的生长繁殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.12334。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株的制备方法为：将藏香猪粪便稀释，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，获得单一菌落，纯化获得保藏编号为CGMCCNo.12334的地衣芽孢杆菌菌株。
3.一种微生态制剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌菌株在所述微生态制剂中的活菌数为(3～6)×109CFU/mL。
5.如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株或权利要求3或4所述的微生态制剂在改善猪肠道微生态、促进猪的生长、提高免疫力中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述改善猪肠道微生物结构为：抑制有害细菌生长繁殖，提高肠道中益生菌活力。
7.如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株或权利要求3或4所述的微生态制剂在制备抑菌剂中的应用。
8.一种日粮，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株或权利要求3或4所述的微生态制剂，和基础日粮。
9.根据权利要求8所述的日粮，其特征在于，所述微生态制剂与所述日粮的重量比为1：(100～1000)。
10.一种抑菌剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株或权利要求3或4所述的微生态制剂。
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