CN105062933A

CN105062933A - 一种罗伊氏乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105062933A
Application number: CN201510579432.7A
Authority: CN
Inventors: 姜波; 姜瑾; 刘英华; 刘金华; 郝应海
Original assignee: BEIJING BOJINYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING BOJINYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明是关于一种罗伊氏乳杆菌及其应用。所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus？reuteri)是一种罗伊氏乳杆菌LZ262，保藏号为：CGMCCNo.11240保藏日期为2015年08月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。罗伊氏乳杆菌LZ262来源于健康猪肠道中，可以在人体及动物体内定植，对胃酸和胆盐有较强的耐受性；同时该菌对大肠杆菌有较好的抑制作用，通过改良发酵配方有较高的发酵密度，喷雾干燥后有较高的存活率；该菌株与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，可用于食品及动物饲料添加剂，也可以广泛应用于其他食品及生物制品。

Description

一种罗伊氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，特别是涉及一种罗伊氏乳杆菌及其应用。

背景技术

罗伊氏乳杆菌，也称路氏乳杆菌，与人类、动物的生活关系密切，是一种常见于人、猪、家禽及其他动物肠道中的乳酸菌,能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，例如拥有维持肠道内菌群的平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等多种功能，目前研究报道较多的应用领域包括食品、饲料、医疗保健、化妆品、美容、水产养殖、工农业生产、生物防腐剂、益生菌制剂等等。

罗伊氏乳杆菌的多种生理功能，可作为宿主氮的来源。但当菌体耐酸，耐胆盐能力不足时进不到肠道，就会失去它的作用。

因此，要发挥这些益生作用，须首先能耐受人体胃肠的消化过程，能抵御胃液和胆汁对其的杀灭作用。Berrada等报导食物在胃中排空的时间是90min，胃内PH值为3.0，最低可达1.3，人体小肠胆汁液浓度在0.03％--0.3％之间。

本发明针对人体及动物肠胃的生理条件从健康猪肠道中选育一株可以耐受人体及动物胃酸和胆盐浓度的罗伊氏乳杆菌，从而可以在人体及动物体内定植，发挥益生作用。同时该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可起到调节肠道微生物菌群的功能。

根据目前的相关报导，要得到能够耐人体及动物胆盐的罗伊氏乳杆菌的方法有三种：一是从自然界中筛选，二是从传统发酵食品中筛选，三是对现有菌种进行驯化。本发明针对人体及动物肠胃的生理条件进行筛选，培育一株可以耐受人体及动物体胃酸和胆盐浓度的罗伊氏乳杆菌，从而有可能在人体及动物体内定植，发挥其益生作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于健康猪肠道的罗伊氏乳杆菌，使得该罗伊氏乳杆菌对酸、胆盐、有较好的耐受性，对大肠杆菌有较强的抑制效果，从而更加适于实用。

本发明的另一目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌的应用，该罗伊氏乳杆菌应用广泛。

本发明的目的及解决其技术问题是通过采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种罗伊氏乳杆菌，也称路氏乳杆菌，它是罗伊氏乳杆菌LZ262，保藏号为CGMCCNo.11240,保藏日期为2015年08月14日。保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

本发明的第一方面，所述的罗伊氏乳杆菌发酵培养基有较高的活菌量。

本发明的第二方面，所述的罗伊氏乳杆菌对酸、胆盐有较好的耐受性，可以在人体及动物体内定植。

本发明的第三方面，所述的罗伊氏乳杆菌在喷雾干燥后有较高的存活，具有一定的耐温性，可以在颗粒饲料生产中直接参与造粒。

本发明的第四方面，所述的罗伊氏乳杆菌对大肠杆菌有较强的抑制作用。

本发明的第五方面，所述的罗伊氏乳杆菌对指定乳酸菌有良好的复配性。所述的罗伊氏乳杆菌LZ262与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophius)；德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)；干酪乳杆菌亚种(Lactobacilluscaseisubsp.Casei)；嗜热链球菌(Streptococcusthermophius)；乳酸链球菌(Streptococcuslactis)；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)；动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

本发明的第六方面，所述的罗伊氏乳杆菌有较强的产蛋白酶能力。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种罗伊氏乳杆菌的应用，其中所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂、抑菌液、食品、保健品和水产养殖。

前述的罗伊氏乳杆菌的应用，其中所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂时是将所述罗伊氏乳杆菌LZ262和其它益生菌组配，其中所述罗伊氏乳杆菌LZ262与其它益生菌之间的比例为：罗伊氏乳杆菌LZ262:嗜酸乳酸杆菌:干酪乳杆菌：植物乳杆菌＝(1～2):(3～5):(2～3)：(1～2)。

前述的罗伊氏乳杆菌的应用，其中所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂进行育肥猪饲喂，结果是有效地促进育肥猪的的生长，降低仔猪的腹泻率，抑制有害菌群和刺激肠道免疫反应方面发挥重要作用，降低猪的死亡率。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明从健康原料中分离得到，经鉴定为罗伊氏乳杆菌；以上发明的得到的罗伊氏乳杆菌对人体和动物体肠胃环境有很好的耐受性，并且可以产蛋白酶帮助消化，有较强的耐温性，与乳酸菌有较好的协同生长作用，扩大了该菌的应用范围，发酵有较高的活菌量，减少了发酵成本。

此外，所述罗伊氏乳杆菌对大肠杆菌有较好的抑制作用，通过改良发酵配方有较高的发酵密度，喷雾干燥后有较高的存活率。

附图说明

图1是本发明罗伊氏乳杆菌LZ262的光学显微镜图。

具体实施方式

实例为：这种罗伊氏乳杆菌，它是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LZ262，保藏号为CGMCCNo.11240，保藏日期为2015年08月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

罗伊氏乳杆菌LZ262的分离及鉴定方法如下：

1、分离方法

称取样品(健康猪肠道)5g至45ml无菌缓冲盐溶液中(加适量玻璃珠)作为母液，震荡10min充分混匀，以无菌缓冲盐溶液做梯度稀释，选择三到五个合适的梯度，吸取0.1ml于MRS培养基中进行涂布分离，每个稀释梯度做两个重复。培养皿放入37℃培养箱中培养48～72小时后挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在MRS培养基中进行再此分离、纯化，直到菌落完全纯化。

形态学鉴定：革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢

生理生化鉴定：接触酶，氧化酶，碳水化合物产酸

分子生物学鉴定:16SrRNA序列分析

2.实验结果

2.1生理生化特性及形态特征

表1LZ262的生理生化特性

2.216SrRNA序列测定结果

ATACATGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGT

根据上述16SrRNA序列测定结果(序列表)，鉴定LZ262为罗伊氏乳杆菌。

3.鉴定结果

结合以上鉴定结果，本发明的LZ262为罗伊氏乳杆菌。

罗伊氏乳杆菌LZ262培养基的优化及其培养方法

1材料与方法

1.1试验菌种

罗伊氏乳杆菌LZ262,分离于健康猪肠道。

1.2材料与设备

胰蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

大豆蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

牛肉膏：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

猪肝浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

安琪蛋白胨FP101：安琪酵母股份有限公司生化试剂

安琪酵母浸粉FM902:安琪酵母股份有限公司生化试剂

牛肉蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂生化试剂

酪蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

K₂HPO₄：北京化工厂分析纯

KH₂PO₄：北京化工厂分析纯

乳糖：北京奥博星生物技术有限责任公司分析纯

半乳糖：国药集团化学试剂有限公司生化试剂

淀粉：天津市大茂化学试剂厂分析纯

蔗糖：北京化工厂分析纯

麦芽糖：北京奥博星生物技术有限责任公司生化试剂

葡萄糖：福晨分析纯

硫酸锰：广东汕头市西陇化工厂分析纯

硫酸镁：国药集团化学试剂有限公司分析纯

乙酸钠：西陇化工股份有限公司

吐温80：天津市福晨化学试剂厂

柠檬酸二胺：西陇化工股份有限公司分析纯

柠檬酸三胺：西陇化工股份有限公司分析纯

752型分光光度计：上海光谱仪器有限公司

立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司LSB50L-I

超净工作台:吴江市蓝林空气净化设备有限公司100级

分析天平:赛多利斯科学仪器有限公司BSA124S-Cw

微生物发酵罐：上海广世生物工程设备有限公司GS-8000-10L

台式高速冷冻离心机：湘智离心机仪器有限公司型号090613

小型喷雾干燥仪：SY_6000

1.3培养基及培养条件

活化和计数培养采用MRS培养基,蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH₂PO₄2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween801mL、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·4H2O0.25g,用蒸馏水定容至1L,调pH6.2～6.4,121℃灭菌15min。

以MRS培养基为基础,按照试验设计添加不同生长因子,接种量2％-5％接入150mL液体培养基中,37℃静置培养24h，测其生长曲线。

1.4方法

1.4.1不同碳源、氮源、磷源的选择

在MRS液体培养基的基础上,分别添加2％(w/v)乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、淀粉、麦芽糖作为不同碳源；分别加入2.5％(w/v)胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、安琪蛋白胨FP101、安琪酵母浸粉FM902、猪肝浸粉、牛肝浸粉、牛肉蛋白胨作为的不同氮源，其他组分均相同。在培养基中接入活化后的罗伊氏乳杆菌,在37℃的条件下培养24h,稀释10倍后,在600nm波长下测定菌液OD值,以MRS培养基为对照,比较不同的碳源、氮源对罗伊氏乳杆菌生长的影响。

1.4.2培养基的优化

采用正交试验设计优化碳源、氮源的用量由于,因素水平如表1所示。其中A因素为麦芽糖,B因素为安琪酵母粉FM902,C因素为安琪蛋白胨PF101,D因素为澳博星猪肝浸粉，测定菌液OD值。

表1正交试验因素水平

1.4.3OD值测定

用722型分光光度计,将菌液稀释10倍后,以相同条件下的未接菌的培养基做参比,在600nm波长下测定菌液吸光度。

1.4.4菌落计数

以MRS固体培养基为计数培养基,采取适当的稀释倍数,倾注于平板上,37℃培养48h后计数。

2结果与分析

2.1碳源对罗伊氏乳杆菌生长的影响

经过对比四种不同碳源乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、淀粉对罗伊氏乳杆菌生长的影响，发现麦芽糖的效果较为显著。

2.2氮源对罗伊氏乳杆菌生长的影响

以MRS培养基为对照,对比四种单一氮源胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏,牛肉膏、牛肉蛋白胨、猪肝浸粉、牛肝浸粉、酪蛋白胨，对罗伊氏乳杆菌的生长影响。由实验结果可以看出,罗伊氏乳杆菌的生长在以猪肝浸粉为单一氮源时,OD值略高于对照,明显高于罗伊氏乳杆菌在其它单一氮源中的生长；罗伊氏乳杆菌在以胰蛋白胨为氮源时生长效果较差,单独添加时不利于罗伊氏乳杆菌的生长,不能很好的促进菌种生长。

2.3罗伊氏乳杆菌培养基的优化

根据单因素试验的结果,设计正交试验,因素A、B、C、D分别为麦芽糖、安琪酵母粉、安琪蛋白胨、猪肝浸粉,以吸光值(OD600nm)为评价指标,测定结果和相应的极差分析见表2。

表2正交试验因素水平

由表2可以看出，影响因素大小排列为A>D>C>B，即麦芽糖>猪肝浸粉>安琪蛋白胨>安琪酵母粉；麦芽糖影响因素水平最高含量2.5％时吸光值(OD600nm)最高，猪肝浸粉的含量越多越好，综合考虑定在2％较为适宜，安琪蛋白胨含量在0.7-0.8％之间，安琪酵母粉影响因素最低，定在0.3-0.5％之间。

3检验：检测活菌量

编号	活菌量cfu/ml
		MRS	9.2*10⁸
A1B3C2D3	7.6*10⁹

4小结

采用正交试验优化后罗伊氏乳杆菌LZ262培养基，活菌量检验为7.6*10⁹cfu/ml，高于MRS的9.2*10⁸cfu/ml。

5罗伊氏乳杆菌LZ262培养方法

5.1试验菌种

罗伊氏乳杆菌LZ262

5.2材料与设备

同上

5.3培养基及培养条件

活化和计数培养采用MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH₂PO₄2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween801mL、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·4H₂O0.25g,用蒸馏水定容至1L,调pH6.2～6.4,121℃灭菌15min。

发酵培养基：猪肝浸粉20g、安琪蛋白胨PF1017g、安琪酵母浸粉PM9023g、K₂HPO₄2g、柠檬酸钠2g、乙酸钠5g、麦芽糖25g、Tween801mL、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·4H₂O0.25g,用蒸馏水定容至1L,调pH6.5,115℃灭菌20min。

冻干保护剂配方：脱脂乳10％-20％、乳糖0.5％-1.5％、蔗糖5％-10％、谷氨酸钠0.1％-1％。

喷雾保护剂配方：脱脂乳5％-15％、蔗糖3％-10％、乳糖1％-2％、海藻糖3％-10％。

5.4方法

5.4.1培养方法

5.4.1.1甘油种子活化取甘油保藏菌种接种到MRS液态试管中，(35℃-40℃)静置培养10-15小时。

5.4.1.2种子培养按3％-6％的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有150ml4#液体培养基的250ml三角瓶中，(35℃-40℃)静置培养。

5.4.1.3发酵培养按3％-6％的接种量，接入装有培养基的10L发酵罐中，调节温度35℃-40℃、转速50-100r/min、初始PH6.0-7.0进行培养。

5.4.1.4终止发酵当菌生长15-24h后，将发酵罐降温到20℃左右，下罐。

5.4.1.5冷冻干燥4摄氏度4000-8000转离心5-10min，去上清，缓冲盐洗菌，4摄氏度4000-8000转离心，去上清，收集菌泥，与保护剂按1：(3-6)混均进行冷冻干燥。

5.4.1.6冷冻干燥方法：将菌泥与保护剂混合均匀，按一定量装入冷阱预冻至零下30-40℃，提出冷阱设定冷冻干燥参数进行干燥，参数如下：

温度参数(℃)	时间参数(小时)
		-25--35	1-4
-15--25	1-4
		-5-0	4-6
1-5	1-8
		15-25	1-4
25-35	1-4

5.4.1.7喷雾干燥：4摄氏度4000-8000转离心5-10min，去上清，缓冲盐洗菌，4摄氏度4000-8000转离心，去上清，收集菌泥，与保护剂按1：(4-9)混均进行喷雾干燥。

5.4.1.8喷雾干燥方法：菌泥与保护剂混合均匀，仪器清洗灭菌预热，进风温度设定150-170℃，出风温度为65-75℃，蠕动泵转速10-20，收集冷却产品。

5.4.2测定方法

5.4.2.1活菌计数：采用稀释倾注平板计数法测定活菌数。

5.4.2.2存活率测定：乳杆菌存活率(％)＝(喷雾干燥后的活菌数/喷雾干燥前的活菌数)×100％

5.4.2.3水分含量测定：采用烘干方法测定产品水分含量，将装有2-3g样品的干燥皿放入105℃的烘箱中加热，直至衡重，重复上述操作，直至两次连续称量质量之差不超过0.0005g(GB/T5413.8-1997)。

m1：加入样品后干燥皿的初始质量，单位是g；

m2：样品烘干后两次称重获得的最小质量，单位是g；

m3：样品质量，单位是g。

5.4.2.4存活率测定：

存活率(％)＝(喷雾或冻干后的活菌数/喷雾或冻干前的活菌数)×100％

5.4.2.5耐高温测定：取一定量喷雾粉置于烘箱中85℃干热10min，测定其活菌数。

6.结果

项目	冻干	喷雾
			活菌数	7.85×10¹¹	6.05×10¹⁰
水分	2.8％	4.1％
			存活率	95％	58％
耐高温测定	-	27.4％

罗伊氏乳杆菌耐酸耐胆盐实验

1.实验方法

1.1胆盐耐受试验

罗伊氏乳杆菌LZ262用灭菌的改良MRS培养液37℃培养15h。将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中(胆盐浓度为0.2％，0.3％，0.5％，1.0％，1.6％),同时以不含胆盐的改良MRS培养液为对照。在37℃培养0h、2h、4h、6h、24h后取样测定活菌数。

2.2酸耐受性试验

罗伊氏乳杆菌LZ262用无菌改良MRS培养液37℃培养15h，将活化的培养液以2％的接种量接入不同PH值的无菌改良MRS中(PH分别为1.3，2.0，3.0)，同时以PH6.5的培养液为对照。37℃培养，分别于0min，30min，60min，90min，120min.取样测定活菌。

3.实验结果

3.1耐胆盐实验结果

罗伊氏乳杆菌LZ262对不同胆盐浓度的耐受性见表3，胆盐浓度小于等于0.3％时对其无抑制作用，6h内活菌数不断增加，在0.5％-1.6％的胆盐浓度中生长具有一定的耐受性。

表3罗伊氏乳杆菌LZ262对不同浓度胆盐的耐受性

	0h	2h	4h	6h	24h
						CK	6.6×10⁷	2.7×10⁸	3.38×10⁸	1.21×10⁹	6.20×10⁹
0.2％	6.14×10⁷	1.58×10⁸	1.37×10⁸	5.87×10⁸	5.76×10⁹
						0.3％	5.95×10⁷	8.30×10⁷	1.30×10⁸	6.19×10⁸	1.03×10⁹
0.5％	4.88×10⁷	8.25×10⁷	2.70×10⁸	2.73×10⁸	5.25×10⁸
						1％	4.89×10⁷	4.48×10⁷	2.77×10⁷	2.28×10⁷	1.85×10⁶

1.6％

3.48×10⁷

2.46×10⁷

1.40×10⁷

2.74×10⁶

1.05×10⁶

3.2耐酸实验结果

罗伊氏乳杆菌LZ262在不同的酸性培养液中活菌数变化见表4，在PH2.0条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性。

表4罗伊氏乳杆菌LZ262对酸的耐受性

	0min	30min	60min	90min	120min
						PH6.5	5.13×10⁷	5.18×10⁷	5.35×10⁷	6.80×10⁷	1.02×10⁸
PH 3.0	4.85×10⁷	4.80×10⁷	4.23×10⁷	4.38×10⁷	3.28×10⁷
						PH 2.0	5.05×10⁷	4.20×10⁷	3.50×10⁷	1.50×10⁷	7.82×10⁶
PH 1.3	4.52×10⁷	4.05×10⁷	2.25×10⁷	6.00×10⁶	1.00×10⁶

小结

本实验分离得到的罗伊氏乳杆菌LZ262对酸、胆盐及室温都有很好的耐受性。人的胃内PH值在2-3之间，吃酸性食物后PH值最低可达1.5。罗伊氏乳杆菌LZ262在PH＝2和PH＝1.3的酸性环境中可存活2个小时,仅下降了一个数量级；而在PH＝3的酸性条件下，2个小时后活菌数的数量级没有发生变化。而食物(尤其是流体)通过胃的时间相对较短，一般1～2h后便进入小肠。所以，罗伊氏乳杆菌LZ262的耐酸性可以保证其有相当数量的活菌通过胃到达肠道。

人体小肠的胆盐浓度在0.03-0.3％之间，本实验中胆盐浓度小于0.3％时对罗伊氏乳杆菌LZ262没有抑制作用，6h内活菌数不断增加。罗伊氏乳杆菌LZ262对胆盐有很强的耐受性，可以通过小肠到达大肠。

罗伊氏乳杆菌LZ262对大肠杆菌、乳酸菌的生物拮抗性

1.材料与方法

1.1菌种

罗伊氏乳杆菌LZ262，大肠杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，乳酸链球菌，德氏乳杆菌保加利亚种，短双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌均来自于本实验室。

1.2培养基

MRS液体和固体培养基，番茄汁固体和液体培养基，营养肉汤固体和液体培养基

1.3菌种活化

罗伊氏乳杆菌活化：将置于低温冰柜的罗伊氏乳杆菌放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下，吸取0.2ml接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养12～14h，活化2～3代。

乳酸菌的活化：同罗伊氏乳杆菌，乳酸杆菌采用MRS液体培养基活化，乳酸链球菌采用番茄汁培养基活化。

大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照2％的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃恒温培养12h，活化两代。

1.4涂布营养琼脂平皿

将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在10⁶cfu/ml。

1.5倾注法培养乳酸菌

将活化好的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用倾注法均匀的铺在MRS平板上和番茄汁固体平板上，要求涂布时的活菌量在10⁶cfu/ml。

1.6罗伊氏乳杆菌发酵液的制备

将活化好的罗伊氏乳杆菌发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为：4℃，5000-8000rpm,5-10min。

1.7罗伊氏乳杆菌发酵液抑菌效果观察

牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板、MRS固体平板和番茄汁固体平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。

1.8实验结果

结果表明，大部分乳杆菌对大肠杆菌都有抑制作用，且本发明所述的罗伊氏乳杆菌抑菌效果尤为明显，具体结果见表5。

实验表明，本发明所属的罗伊氏乳杆菌和大部分乳酸菌都能协同生长，这扩大了罗伊氏乳杆菌的应用范围，具体结果见表6。

表5乳酸菌与大肠杆菌的拮抗试验

菌种名称	抑菌圈直径(mm)
		LZ262罗伊氏乳杆菌	23
YDB14短双歧杆菌	16
		YDB109青春双歧杆菌	16
YDB114青春双歧杆菌	13
		YDB120两歧双歧杆菌	14
YDL197干酪乳杆菌	10
		YDL200嗜酸乳杆菌	13
YDL124嗜酸乳杆菌	7
		YDL165嗜酸乳杆菌	16
BJYL132植物乳杆菌乳杆菌	25
		YDL192嗜酸乳杆菌	15

表6罗伊氏乳杆菌与乳酸菌的复配性(拮抗试验)

菌种名称	试验结果	菌种名称	试验结果
				YDL200嗜酸乳杆菌	－	YDL18干酪乳杆菌	－
YDL124嗜酸乳杆菌	－	YDL126干酪乳杆菌	－
				YDL163嗜酸乳杆菌	－	YDS151嗜热链球菌	－
YDL192嗜酸乳杆菌	－	BJYL132植物乳杆菌	－
				YDL137嗜酸乳杆菌	－	YDS194嗜热链球菌	－
YDL184保加利亚乳杆菌德氏乳亚种	－	YDS011乳酸乳球菌乳酸亚种	－
				YDL162保加利亚乳杆菌德氏乳亚种	－	YDS125乳酸链球菌	－
YDL197干酪乳杆菌	－	B174动物双歧杆菌乳亚种	-
				YDL108干酪乳杆菌	－	YDS170嗜热链球菌	－

罗伊氏乳杆菌LZ262用于制备饲料添加剂的方法如下：

本发明的罗伊氏乳杆菌LZ262益生作用明显，可以和其他益生菌组配，用于动物饲料中。试验表明，复合益生菌制剂能有效免受大肠杆菌的攻毒，提高对大肠杆菌的抵抗力。各益生菌之间的比例为：罗伊氏乳杆菌LZ262:嗜酸乳酸杆菌:干酪乳杆菌：植物乳杆菌＝(1～2):(3～5):(2～3):(1～2)。

罗伊氏乳杆菌LZ262较强的产蛋白酶能力

1、实验材料和仪器

酪氨酸、碳酸钠、福林试剂、酪蛋白、三氯乙酸、水浴锅、分光光度仪、离心机。

2、实验方法

(1)酪氨酸标准曲线的制定

配制不同浓度的酪氨酸标准溶液(0,20,40,60,80,100μg·ml-1)，分别取不同浓度的酪氨酸标准溶液1.00mL，各加0.4mol·ml-1的碳酸钠溶液5.00mL、福林稀释液1.00mL,置于40℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计分别测定其吸光度OD660(以不含酪氨酸的管为空白)。

不同浓度的酪氨酸标准溶液与OD660的变化关系

酪氨酸浓度(μg·ml-1)	10	20	30	40	50	60	80
								OD660	0.101	0.21	0.308	0.409	0.513	0.625	0.81

以OD值为横坐标，以酪氨酸的浓度为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程：y＝98.22x-0.3288(R2＝0.9994)

(2)测发酵液蛋白酶活力

①把菌株在超净工作台中，按2％-3％的接种量分别接种在50ML的4#培养基中，于37℃培养箱培养。

②发酵液3500r/min离心20min，取上清液即为粗酶液。

③先将2％酪蛋白放入40℃恒温水浴中，预热2min。取1.0ml粗酶液预热2min，加预热后的酪蛋白1.0ml，摇匀，并在40℃下精确保温10min。

④再加0.4mol/L三氯乙酸2.0ml，摇匀后继续水浴放置20min以沉淀残留蛋白，3500r/min离心10min，取上清液1.0ml，

⑤于40℃下加0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml和1.0ml福林酚试剂，保温20min。

⑥在660nm波长下比色，测其吸光度。(测定空白时，加酪蛋白与三氯乙酸的顺序相反)。

注：蛋白酶活力计算方法：

酶活力(U/ml)＝(OD样品测定-OD空白试验)×K×4/10×N

式中，K＝98.22；4:4毫升反应液取1mL测定(即4倍)；N:酶液稀释的倍数，本实验为5倍；10:反应10min。

酶活力单位的定义：在40℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力。

实验结果

罗伊氏乳杆菌培养18小时，蛋白酶活性达8.4602U/ml。

罗伊氏乳杆菌LZ262对哺乳仔猪的饲喂实验

1.实验材料

选择大白母猪胎次及预产日期相近的出生仔猪12窝，随机分成对照组和实验组。

2.实验地点：北京某猪场

3.实验方法

对照组:按常规方法护理及饲喂至断奶。

实验组:仔猪出生后0-7日内饲喂仔猪以罗伊式乳杆菌LZ262为主的液体饲喂剂，每天给每头仔猪饮用4ml，连服三天；7日龄-28日龄断奶，在乳猪料中加入0.2％的罗伊氏乳杆菌LZ262粉状饲喂剂。

4.检测

4.1称重：称量仔猪出生个体重和断奶个体重。

4.2耗料量：记录每天添加料量及剩余料量。

4.3健康状况：每天观察仔猪健康状况，记录仔猪死亡情况。

5.实验结果

由上表可知，实验组哺乳仔猪各生长指标均比对照组有所改善。

1)哺乳仔猪断奶菌种(个体)：对照组均重是7.75kg，实验组8.25kg。实验结果：实验组个体断奶均重较对照组提高6.45％。

2)平均日增重(个体)：对照组日增重178.7g，实验组日增重187.5g。即实验组较对照组个体平均日增重提高4.92％。

3)平均个体日耗料：对照组日耗料42.4g，实验组日耗料39.2g。即实验组个体平均日耗料较对照组降低7.55％。

4)料重比：对照组料重比是0.221，实验组料重比是0.209，即实验组料重比较对照组降低5.43％。

5)死亡率：对照组是19.68％，实验组是12.07％。即实验组死亡率较对照组降低38.67％。

综上所述，本发明从健康原料中分离得到，经鉴定为罗伊氏乳杆菌LZ262。所述的罗伊氏乳杆菌LZ262对人体和动物体肠胃环境有很好的耐受性，并且可以产蛋白酶帮助消化，与乳酸菌有较好的协同生长作用，扩大了该菌的应用范围，发酵有较高的活菌量，减少了发酵成本，并且可以显著提高哺乳仔猪生长性能。所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂、抑菌液、食品、保健品和养殖等领域。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种罗伊氏乳杆菌，也称路氏乳杆菌，其特征在于：它是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LZ262，保藏号为CGMCCNo.11240，保藏日期：2015年08月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262在优化后的培养基中有较高的活菌量。

3.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262对人及动物胃酸和胆盐有耐受性。

4.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262在喷雾干燥后有较高的存活。

5.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262对大肠杆菌有较强的抑菌性。

6.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；

嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophius)；

德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)；

干酪乳杆菌亚种(Lactobacilluscaseisubsp.Casei)；

嗜热链球菌(Streptococcusthermophius)；

乳酸链球菌(Streptococcuslactis)；

乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)；

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；

动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)。

7.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262有较强的产酶能力。

8.一种如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌的应用，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂、抑菌液、食品、保健品。

9.根据权利要求8所述的罗伊氏乳杆菌的应用，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂时是将所述罗伊氏乳杆菌LZ262和其它益生菌组配，其中所述罗伊氏乳杆菌LZ262与其它益生菌之间的比例为：罗伊氏乳杆菌LZ262:嗜酸乳酸杆菌:干酪乳杆菌：植物乳杆菌＝(1～2):(3～5):(2～3):(1～2)。

10.根据权利要求8或9所述的罗伊氏乳杆菌的应用，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LZ262用于动物饲料添加剂进行育肥猪饲喂。