CN105176874B - 凝结芽孢杆菌fm603及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)新菌株FM603，其保藏号为CGMCC NO.10221。该菌株能够产生细菌素类抗菌物质，对革兰氏阳性病原菌如单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和坚强梭菌等具有抗菌活性。该细菌素分子量4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala‑Gly‑His‑Dhb‑Phe‑Val‑Dhb‑Gly‑Pro，在热、酸、胃蛋白酶或胰蛋白酶的处理下较为稳定，易被链霉蛋白酶降解失活。本发明还提供了一种FM603的发酵物，可作为微生物饲料添加剂。动物试验结果表明，该发酵物能够提高蛋鸡的产蛋率、降低料蛋比，改善蛋品质；提高仔猪采食量和日增重，降低料肉比；提高肉鸡日增重和血清溶菌酶含量，降低料肉比和死亡率。

Description

凝结芽孢杆菌FM603及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其培养和应用技术，具体涉及一种产生细菌素的新的凝结芽孢杆菌菌株，以及该菌株在饲料添加剂领域的应用。

背景技术

抗生素是微生物产生的次级代谢产物，对其它微生物具有抗菌活性。20世纪40年代，科学家们发现饲喂动物低剂量的抗生素可以改善动物的生产性能，提高经济效益。在之后的几十年内，抗生素广泛的应用于畜牧养殖行业，添加于饲料中用作生长促进剂，或者在养殖现场用作治疗药剂。抗生素的使用显著的提高了动物的生长效率和饲料转化率，对畜牧行业的发展起到了重要的作用。但是抗生素的使用也带来了诸多问题，比如耐药细菌的传播、二次感染及动物产品中的药物残留等。耐药菌的出现严重的威胁到人类健康，以抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌为例，感染该抗药菌株的死亡率是普通菌株的三倍，而且治疗费用和住院时间也增加很多。在美国和英国，约有40-60％的金黄色葡萄球菌具有甲氧苯青霉素抗性，在中国，约60-70％的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素不敏感。大量使用抗生素，并违反停药期规定则容易导致动物产品中的药物残留超标，这样的动物产品很难进入国际市场，也会对人的健康存在潜在威胁。近些年来我国食品安全事故时有报道，2013年初的速生鸡事件和禽流感的爆发给家禽养殖行业带来了巨大损失，消费者们对畜牧养殖行业的关注也日渐增多，如何保证动物的高生产性能，同时生产出安全的肉、蛋、奶产品，关系到畜牧养殖行业的持续稳定发展。欧盟于2006年全面禁止抗生素作为生长促进剂添加在饲料中，韩国也于2011年禁用了抗生素类生长促进剂。中国如今也面临着是否禁止饲料中添加抗生素的问题，这也促使饲料和养殖企业，以及农牧院校的研究人员积极致力于生物制剂的开发和使用，以减少或者替代抗生素的应用。

芽孢杆菌是革兰氏阳性、产芽孢的一类杆菌，广泛的存在于自然界中。芽孢杆菌在一定条件下可以转化为芽孢形式，芽孢对外界不良环境如高温、高压、紫外线等有极强的抵抗力。芽孢杆菌在工业上用作淀粉酶和蛋白酶的生产菌种，也长期的用于发酵类食品的制作。芽孢杆菌有益于食物的消化和肠道健康，能够促进动物的生产性能，因此也用作食品补充剂和动物益生菌。大量的研究数据表明，芽孢杆菌能够提高动物的生产性能，减少病原菌感染几率，提高动物机体免疫，降低养殖环境的氨气浓度，是抗生素类生长促进剂的良好替代品。芽孢杆菌通过刺激动物肠绒毛发育，提高非特异性免疫，产生抗菌活性物质发挥作用。细菌素是芽孢杆菌产生的抗菌活性物质之一，是微生物通过核糖体合成的多肽类抗菌物质，对很多病原菌包括耐药菌具有良好的抗菌活性。芽孢杆菌能够产生细菌素类抗菌物质，如subtilin、sublancin、subtilosin、lichenin等。细菌素是益生菌的重要功能性物质，考克大学的研究人员发现，产细菌素的乳酸菌可以有效的减少单核增生李斯特菌对小鼠的感染，但是在单核增生李斯特菌获得该细菌素的免疫基因后，乳酸菌失去对小鼠的保护功能。有研究表明，细菌素可以降低动物肠道中的葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酸酶活性，促进肉鸡增重，提高生产性能，机理与抗生素相似。因此，相比起普通芽孢杆菌，产细菌素的芽孢杆菌对动物的生产性能具有更为良好的促进作用，在实际生产中具有更大的应用潜力。

发明内容

本发明目的在于提供一株产生细菌素的凝结芽孢杆菌新菌株。

本发明所提供的凝结芽孢杆菌，是凝结芽孢杆菌FM603，该菌株已于2014年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏号为CGMCC NO.10221。

本发明菌株FM603在常温和常规培养基上生长良好，菌落在胰蛋白胨琼脂上呈白色，不规则，表面粗糙。革兰氏染色阳性，产芽孢。将该菌的16S rRNA序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库BLAST比对，与凝结芽孢杆菌的同源性为99％，经API 50CHB试剂盒(bioMerieux,France)鉴定该菌与凝结芽孢杆菌的相似度为99.7％，因此判定该菌为凝结芽孢杆菌，命名FM603。

FM603可采用常规培养基在普通条件下培养，但是在改良胰蛋白胨培养基中能获得更高生物量，改良胰蛋白胨培养基组成为：质量体积百分比，胰蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，硫酸铵0.05％，氯化钠0.1％、磷酸二氢钠0.05％、蒸馏水1000mL，pH 7.0，培养条件为30℃，150rpm培养20h。

凝结芽孢杆菌FM603发酵培养产生细菌素，对革兰氏阳性细菌具有良好的抗菌作用。该细菌素分子量为4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro。该细菌素可改变革兰氏阳性菌细胞膜通透性，导致细胞内钾离子外流。

本发明还提供一种发酵生产上述细菌素的方法，包括如下步骤：

1)发酵上清液制备：将凝结芽孢杆菌FM603接种于10mL液体LB培养基培养过夜，将1mL培养液接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，200rpm，30℃培养20h，10000rpm离心除去菌体，得到发酵上清液；

2)细菌素粗提液制备：将离子柱用50mM、pH 6.5的磷酸盐缓冲液平衡，发酵上清液以50mL/min的流速通过离子柱，将通过离子柱的上清液弃去，用磷酸盐缓冲液冲洗离子柱后，以含1M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)洗脱离子柱，流速为10mL/min，收集洗脱液100mL，将洗脱液通过C18固相萃取柱，用100％的乙腈洗脱固相萃取柱并收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥后，溶解在50mM、pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，过滤后得到类细菌素粗提液；

3)细菌素的纯化：类细菌素粗提液用高效液相色谱纯化，使用C18反相柱(250mm×10mm,5μ粒径)，流动相分别为A：100％乙腈，B：水，上样量为100μL，洗脱时间为40分钟，流速为1mL/min，收集每分钟洗脱的溶液，重复多次上样纯化后将相同时间点的洗脱液合并，冷冻干燥后溶于50mM磷酸盐缓冲液，并检测洗脱液的抗菌活性，以Listeria innocua为指示菌，获得纯化的细菌素。

与已报道的芽孢杆菌细菌素相比，FM603生产的细菌素在生物学特性及抗菌活性方面存在较大区别。

FM603产生的细菌素对热、酸稳定，在60-70℃水浴10分钟保持90％以上活性，在80-100℃水浴10分钟保持80％活性；在pH 2-8范围内处理2h活性损失小于10％，在pH9-10范围内处理2h活性存留60％。该细菌素在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶处理1h后活性存留率大于90％，链霉蛋白酶处理1h后剩余20％活性(详细见表2)。

该细菌素对革兰氏阳性致病菌如金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和耐药菌如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性(抑菌圈直径>20mm)，对厌氧产芽孢梭菌如产气荚膜梭菌和坚强梭菌具有较强的抗菌活性(抑菌圈直径17-18mm)，对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌，革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳杆菌以及酵母菌无抗菌活性，对霉菌如黄曲霉菌具有一定抗菌活性(详细见表3)。

本发明纯化的细菌素经SDS-PAGE电泳分析，凝胶4500Da处有一条蛋白条带，将凝胶切下来进行抗菌活性检测，结果表明，该蛋白对李斯特菌有明显的抗菌活性。FM603细菌素经基质辅助激光解吸飞行时间质谱和串联质谱分析，分子量为4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro。该细菌素能改变革兰氏阳性菌细胞膜膜电位和通透性，导致细胞内钾离子外流，从而杀灭细菌。

本发明还提供一种微生物饲料添加剂，是用凝结芽孢杆菌FM603发酵生产，其生产方法如下：将FM603划线于LB琼脂板，30℃过夜培养，挑取单菌落接种于10ml LB培养基，150rpm，30℃过夜培养作为1级种子液，将1级种子液按1％接种量接种于1000ml改良胰蛋白胨培养基，150rpm，30℃过夜培养得到2级种子液，将2级种子液按10％接种量接种于100L改良胰蛋白胨培养基，150rpm，30℃发酵24h得到发酵液，将发酵液与灭菌后的棕榈仁粕按照1:1比例混合均匀后30℃发酵36h，烘干至含水量10％以内，碎粉至过40目筛网即得。

有益效果：

动物试验结果表明，日粮中添加500-1000g/T由上述方法生产的微生物饲料添加剂，能够显著提高蛋鸡产蛋率和蛋品质、降低料蛋比；提高仔猪日增重和日均采食量、降低料肉比；提高肉鸡日增重，降低料肉比和死淘率。

本发明提供的菌株凝结芽孢杆菌FM603可作为饲料添加剂应用于饲料和养殖业，减少或替代抗生素的使用，促进动物生产性能，提高养殖效益。

附图说明

图1：FM603细菌素的分子量；

图2：FM603细菌素的作用模式；

图3：FM603细菌素对膜电位的作用；

图4：FM603细菌素对细胞内钾离子的影响；

图5：FM603生长曲线及细菌素产生规律；

图6：FM603发酵过程中产生细菌素和蛋白酶；其中，图6(A)：用EDTA螯合金属离子后，蛋白酶活性受到抑制，细菌素活性高；图6(B)：无蛋白酶存在时，细菌素不被降解；

图7：FM603芽孢萌发时间。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100ml中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。

实施例1：凝结芽孢杆菌FM603细菌素的抗菌活性分析

将FM603划线于LB琼脂板，30℃过夜培养后挑取单菌落接种于10mL LB培养基，150rpm，30℃培养24h，按0.2％接种量接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，150rpm，30℃培养24h，10000rpm离心15min得到发酵上清液。将L.innocua、L.monocytogenes、S.aureus、B.cereus、M.luteus分别在LB琼脂板上划线37℃培养过夜，挑取单菌落接种于LB培养基，37℃过夜培养，吸取10ul培养液接种于10mL LB软琼脂(含0.75％琼脂的LB培养基)，混匀后平铺于LB琼脂板，冷却后放置灭菌的牛津杯，加入100μl FM603发酵上清液或二倍梯度稀释后的发酵上清液，30℃培养过夜，观察抑菌圈，计算细菌素效价。细菌素的效价采用倍比稀释法测定，以AU/mL表示，具体如下：将发酵上清液或细菌素粗提液用无菌生理盐水进行二倍梯度稀释，各个稀释梯度取样100μl加入到牛津杯中检测抗菌活性，出现抑菌圈的最高稀释倍数定义为一个活性单位，其倒数乘以稀释倍数即为原液的抗菌活性效价(AU/mL)。结果如表1所示，发酵液对L.innocua、L.monocytogenes和M.luteus的活性效价为2560AU/mL，对S.aureus的活性效价为1280AU/mL，对B.cereus的活性效价为5120AU/mL。

表1：细菌素抗菌活性效价

实施例2：FM603细菌素的制备

1.发酵培养

将凝结芽孢杆菌FM603在LB平板上划线培养，挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基过夜培养，将10mL过夜培养种子液接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，其成分为：质量体积百分比，胰蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，硫酸铵0.05％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钠0.05％，蒸馏水1000mL，pH 7.0，培养条件为30℃，150rpm培养20小时。

2.细菌素粗提物制备

将培养好的FM603发酵液10000×g离心15min取上清液备用。将离子柱用50mM，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，发酵上清液以50mL/min的流速通过离子柱，将通过离子柱的上清液弃去，用磷酸盐缓冲液冲洗离子柱后，以含1M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH6.5)洗脱离子柱，流速为10mL/min，收集洗脱液100mL，将洗脱液通过C18固相萃取柱，用100％的乙腈洗脱固相萃取柱并收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥后，溶解在50mM，pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，过滤后得到类细菌素粗提液。

3.细菌素的纯化

细菌素粗提液用高效液相色谱纯化，使用C18反相柱(250mm×10mm，5μ粒径)，流动相分别为A：100％乙腈，B：水。上样量为100μl，洗脱时间为40分钟，流速为1mL/min，收集每分钟洗脱的溶液，重复多次上样纯化后将相同时间点的洗脱液合并，冷冻干燥后溶于50mM磷酸盐缓冲液，并检测洗脱液的抗菌活性，以L.innocua为指示菌，获得纯化的细菌素。

实施例3：FM603细菌素的生物学特性

1)对温度的耐受性：将实施例2发酵上清液在60、70、80、90、100℃分别处理10min，以未经热处理的样品为对照，L.innocua为指示菌，检测热处理对细菌素活性的影响，以处理组的抑菌圈直径与对照组抑菌圈直径之比表示抗菌活性存留率，结果如表2所示，60-100℃分别处理10分钟，细菌素活性基本未受影响，活性都保持在90％以上。

2)对酶的敏感性：取实施例2发酵上清液分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，酶的终浓度为1mg/mL，胃蛋白酶处理pH为2.5，其它酶处理pH为6.5，37℃处理2h后，以L.innocua为指示菌检测抗菌活性的存留率，未处理的发酵上清液为对照，结果如表2所示，FM603对胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶不敏感，但是在链霉蛋白酶处理2h后抗菌活性存留率为20％，说明FM603是一种蛋白质，能够被链霉蛋白酶降解。

3)对酸碱的耐受性：分别取1mL实施例2的细菌素粗提液于试管中，用0.5M的盐酸或氢氧化钠调整pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10，静置2h后将pH调整为7.0，以L.innocua为指示菌，未调pH的细菌素粗提液为对照，检测抗菌活性。

表2：不同温度、酶及pH对细菌素抗菌活性的影响

由上表可以看出，凝结芽孢杆菌FM603产生的细菌素对温度具有良好的耐受性，100℃处理后仍然存留了80％的抗菌活性，该细菌素不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶降解，但是在链霉蛋白酶处理后活性降为20％，说明对链霉蛋白酶敏感，也验证了该细菌素的蛋白质属性，但是该蛋白质对胃蛋白酶和胰蛋白酶有较强的抗性，因此在动物肠道中不容易失活。该细菌素对酸具有良好的耐受性，在pH2-5范围内的处理几乎对活性没有影响，但是pH大于8后，该细菌素的活性明显受到影响，说明该细菌素适宜在偏酸性条件下应用。

实施例4：FM603细菌素的抑菌谱

通过检测对不同微生物的抗菌活性可以更好的在实践中应用细菌素，本试验中检测的指示菌包括：大肠杆菌CVCC195、CVCC249、金黄色葡萄球菌CVCC6538，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、无害李斯特菌、单核增生李斯特菌，屎肠球菌、枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、产气荚膜梭菌、坚强梭菌等，结果如表3所示：

表3：FM603细菌素的抑菌谱

凝结芽孢杆菌FM603对革兰氏阴性菌如大肠杆菌没有抗菌活性，但是对革兰氏阳性致病菌如金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌及耐甲氧西林葡萄球菌具有良好的抗菌活性，该细菌素对动物肠道分离的屎肠球菌有弱活性，对植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌没有抗菌活性。

实施例5：细菌素分子量及氨基酸序列测定

为了验证FM603细菌素的蛋白质属性，同时测定该细菌素的分子量，进行SDS-PAGE试验。SDS-PAGE分离胶浓度16％，以纯化的细菌素作为电泳样品，上样量10ul，60V电泳1h，100V电泳2h，采用低分子量蛋白标准品作为对照，电泳结束后将胶切割为两部分，包含蛋白标准品和细菌素样品的部分用考马斯亮蓝染色，另一部分只有细菌素样品，放入固定液(25％异丙醇溶液)中固定30分钟，再用蒸馏水洗60分钟。将洗过的胶放置在LB琼脂板上，铺上接种L.innocua的LB软琼脂，待软琼脂冷却后将平板放在培养箱中37℃培养16h，观察抗菌活性。经过染色后，对应标准品4500Da处，在细菌素样品的跑道上有一条蓝色条带，说明该细菌素为蛋白质，分子量约为4500Da，而胶的另一部分在相同的位置有明显的抑菌圈，证实该条带为细菌素。

为了获得该细菌素的精确分子量，纯化的细菌素样品经基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析，测得分子量为4276.45Da，如图1所示。样品经Edman降解无法获得氨基酸序列信息，说明N末端有修饰基团，经串联质谱分析获得了该细菌素的部分序列：Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro，Dhb为二脱氢丁氨酸，是苏氨酸经过修饰后形成的，说明该细菌素可能为一种羊毛硫细菌素。

实施例6：FM603细菌素作用模式研究

在两个灭菌管中分别加入LB培养基9mL，接种100μl过夜培养的L.innocua，其中一管加入细菌素粗提液1mL，另一管加入无菌蒸馏水1mL，将它们放置在37℃培养，每隔2h取出1mL样品，检测L.innocua的活菌数。结果表明(参考图2所示)，随着培养时间的增加，对照组的活菌含量增长迅速，但是细菌素组的活菌数逐渐变少，说明L.innocua在细菌素的作用下失去活性，FM603细菌素的作用模式为杀菌。

细菌素对膜电位的作用：将L.innocua过夜培养后按1％接种量接种于LB培养基，37℃，200rpm培养5h。离心收集菌体，用含5mM HEPES和葡萄糖溶液洗两次后悬浮于5mM葡萄糖缓冲液中，加入荧光探针DiSC3至0.5μm浓度，室温下静置15min。取90μl加入到NBS微孔板，再加入10μl FM603细菌素，用荧光光度计检测荧光变化。结果如图3所示，FM603细菌素从细胞膜上释放出荧光探针，说明该细菌素能够改变细胞膜极性。

细菌素对细胞内钾离子影响：将L.innocua过夜培养后按1％接种量接种于LB培养基，37℃，200rpm培养5h。离心收集菌体，用含5mM HEPES和葡萄糖溶液洗两次后悬浮于5mM葡萄糖缓冲液中，在细胞悬液中加入PBFI(Potassium sensitive probe)至2μm，取90μl加入到NBS微孔板，加入10μl FM603细菌素，通过荧光光度计检测荧光变化。结果如图4所示，FM603提高了细胞膜的通透性，导致细胞内的钾离子外流。

实施例7：凝结芽孢杆菌FM603的生长曲线

将FM603在LB平板上划线培养，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基，于37℃培养过夜，取1mL培养液接种于500mL液体LB培养基，37℃，200rpm培养48h，每隔4h取样检测发酵液OD值及抗菌活性，以L.innocua作为指示菌。结果表明(参考图5所示)，FM603在接种后4h进入对数生长期，20h进入平台期，而细菌素活性在8h被检测到，

实施例8：蛋白酶活性检测

将FM603接种于10mL液体LB培养基，37℃培养48h，8000×g离心20分钟后取上清液，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，取200μl滤液加入放置在酪蛋白平板(25g/L脱脂奶粉，15g/L琼脂，1000mL蒸馏水)的牛津杯内，37℃培养48h，检测透明圈的出现。结果表明，在牛津杯的周围出现约25mm直径的透明圈，说明FM603可以产生蛋白酶。

FM603的上清液抗菌活性在培养后期有下降的趋势，可能是因为菌株本身产生了某些蛋白酶对细菌素有降解的作用，为了验证这一假设，将菌株分别接种于3个500mL三角瓶，每个三角瓶有200mL LB液体培养基，将接种后的三角瓶在30℃培养18h后加入蛋白酶抑制剂EDTA(0.1mM)或者PMSF(0.1mM)，不加EDTA和PMSF的三角瓶作为对照。培养到48h后，分别检测三个三角瓶中发酵液检测抗菌活性。同时，取未加入蛋白酶抑制剂的18h发酵液样品，过滤后分成三份，分别加入EDTA或者PMSF(10mM)，并于37℃培养48h后检测抗菌活性，未加入蛋白酶抑制剂的滤液作为对照。

如图6A所示，当EDTA在指数后期加入到发酵液中并培养48h后，发酵液仍然保留了绝大多数活性，而未加入蛋白酶抑制剂的对照组和加入丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF组在发酵48h后抗菌活性明显降低。同时18h发酵液样品的滤液，不管有没有加入蛋白酶抑制剂，在培养48h后活性都没有大的变化(图6B)。说明在发酵后期，FM603产生了一种金属蛋白酶，能够降解其产生的细菌素，但是当加入金属螯合剂EDTA后，金属蛋白酶无法正常发挥作用，因此细菌素活性得到存留。

实施例9：FM603细菌素基因的扩增

关于凝结芽孢杆菌细菌素的报道较少，FM603产生的抗菌物质表现出了明显的蛋白质特征，为了验证该蛋白质是否与已发现的细菌素结构一致，提取基因组DNA后，采用已经报道过的几对引物进行PCR扩增，引物如下表所示。

表4：扩增选用的引物

其中Licfwd和Licrev根据lichenicidin结构基因设计，SB5和SB6、LanBfw和LanBrev、LanCfwd和LanCrev是根据细菌素修饰蛋白的保守序列设计的简并引物，osboP1和osboP2是细菌素subtilosin的扩增引物。分别采用以上引物进行PCR扩增，扩增反应结束后用琼脂糖电泳检测条带。电泳结果表明，以上引物均未产生扩增产物，说明FM603细菌素跟以上细菌素的结构不一致。

实施例10：FM603芽孢萌发时间

芽孢在适宜条件下会萌发为营养体，芽孢在动物肠道内起作用也需要萌发为营养体，因此可以通过检测芽孢的数量了解芽孢的萌发时间和规律。将FM603于LB琼脂板上划线培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基，培养48h后80℃水浴15min，将水浴后的发酵液做10倍梯度稀释后，选取合适的稀释度涂布于LB琼脂板，计算芽孢的数量。取水浴后的芽孢液1mL接种于9mL液体LB培养基，30℃培养4h，分别于2h和4h取样，检测芽孢和活菌数量。

结果如图7所示，在0h时，芽孢的数量为1.0×10⁶cfu/mL，30℃培养2h后，营养体数量为1.9×10⁶cfu/mL，而芽孢数量为0，到4h时，营养体的数量增加到6×10⁷cfu/mL，芽孢数量仍然为0。说明在合适的条件下，芽孢能够迅速萌发为营养体，时间小于2h。

实施例11：FM603的抗生素敏感性试验

将FM603划线于LB琼脂板，30℃过夜培养，挑取单菌落接种于液体LB培养基，30℃，150rpm过夜培养，将培养液稀释至10⁶cfu/mL，吸取10μm加入到10mL溶解的LB软琼脂培养基中，混匀后平铺到LB琼脂板上，冷却后将含有不同抗生素浓度的药敏片放置于琼脂板上，30℃培养过夜后观察抑菌圈。结果如下表所示，在抗生素浓度达到1000ppm时，FM603对测试的革兰氏阳性菌抗生素和广谱抗生素较为敏感，而抗生素浓度为50ppm时，该菌株仅对吉它霉素敏感。

表5：菌株FM603对不同抗生素的敏感性*

*+++抑菌圈直径>20mm，++抑菌圈直径15-20mm，+抑菌圈直径<15mm，-无抑菌圈。

实施例12：FM603发酵棕榈仁粕生产微生物饲料添加剂

将FM603划线于LB琼脂板，30℃过夜培养，挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基，150rpm，30℃过夜培养作为1级种子液，将1级种子液按1％接种量接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，150rpm，30℃过夜培养得到2级种子液，将2级种子液按10％接种量接种于100L改良胰蛋白胨培养基，150rpm，30℃发酵24h得到发酵液，将发酵液与灭菌后的棕榈仁粕按照1:1比例混合均匀后30℃发酵36h，烘干至含水量10％以内，碎粉至过40目筛网得到FM603发酵物。

取发酵物检测芽孢含量、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、游离氨基酸、还原糖，结果如表6所示，棕榈仁粕的粗蛋白含量为17.45％，粗脂肪11.8％，粗纤维12.78％，经过FM603发酵后，粗蛋白提高0.33个百分点，粗脂肪下降1.3个百分点，粗纤维提高2.34个百分点。该发酵物可作为一种含有FM603芽孢的微生物饲料添加剂使用。

表6：FM603发酵物与棕榈仁粕的比较

实施例13：FM603对蛋鸡生产性能的影响

为了研究FM603作为微生物饲料添加剂的效果，选取25周龄罗曼褐商品代蛋鸡960只，随机分成3个处理，每个处理8个重复，每个重复40只鸡。处理组1为空白组，饲喂基础日粮；处理组2和3为试验组，分别在基础日粮中添加500g/T和1000g/T实施例12中的FM603发酵物。试验周期为30周，试验结束后，计算平均采食量、产蛋率、料蛋比等指标，分别从各处理组随机捡蛋30枚，检测蛋壳强度、蛋壳厚度、哈夫单位、蛋黄颜色及胆固醇含量。基础日粮配方如表7所示：

表7：日粮配方及营养水平

结果如表8所示，与对照组相比，在基础日粮中添加500g/T和1000g/T FM603发酵微生物饲料添加剂成品有利于蛋鸡产蛋性能和蛋品质的提高，当添加500g/T FM603发酵微生物饲料添加剂时，显著的提高了蛋壳强度和蛋黄颜色，当添加1000g/T FM603发酵微生物饲料添加剂成品时，显著提高了产蛋率、蛋壳强度和蛋黄颜色，降低了料蛋比。

表8：FM603发酵物对蛋鸡生产性能的影响*

*同行不同字母代表差异显著。

实施例14：FM603对仔猪生产性能的影响

选取35日龄体重相近的公仔猪90头，随机分成3个处理，每个处理6个重复，每个重复5头猪。处理1为空白对照组，饲喂基础日粮，处理2和3为试验组，分别在基础日粮中添加500g/T和1000g/T实施例12中的FM603发酵物。试验期28天，自由采食和饮水，试验结束后称重，计算平均日增重、料肉比、平均日采食量。日粮组成及营养成分见表9。

表9：日粮配方及营养水平

结果如表10所示，在试验期内，添加FM603发酵物的两个试验组(处理2、3)在采食量和日增重方面显著高于空白对照组(处理1)，而料肉比则显著低于空白对照组。说明在日粮中添加FM603发酵物有利于促进动物采食，提高日增重和饲料利用率，增加养殖效益。

表10：FM603发酵物对仔猪生产性能的影响*

*同行不同字母表示差异显著。

实施例15：FM603对肉鸡生产性能的影响

选取1日龄肉仔鸡900只，随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复50只鸡，自由采食饮水，处理1为空白对照组，饲喂基础日粮，处理2和3为试验组，分别在基础日粮中添加500g/T和1000g/T实施例12中的FM603发酵物，试验期21天，第21天各处理组宰杀12只鸡，称量脾脏、法氏囊和胸腺的重量，检测血清溶菌酶浓度，记录并计算试验期肉鸡的日增重、料肉比和死亡率。日粮原料及营养组成如表11所示。

表11：日粮配方及营养水平

结果如表12所示，在日粮中添加FM603发酵物后(处理2和3)，显著的提高了肉鸡日增重，降低了料肉比，对死亡率的降低也有作用，但是与空白组(处理1)相比差异不显著。两个试验组肉鸡血清溶菌酶的含量显著的高于空白对照组，说明FM603发酵物对肉鸡的免疫力有一定的促进作用，但是空白对照组和试验组的脾脏、法氏囊和胸腺相对重量没有明显差异。

表12：FM603发酵物对肉鸡生产性能的影响*

*同行不同字母表示差异显著。

Claims (3)

1.一株产生细菌素的菌株，具体为凝结芽孢杆菌FM603，保藏编号为CGMCC NO.10221。

2.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其特征在于，发酵培养基采用改良胰蛋白胨培养基，按质量体积百分比组成为：胰蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，酵母浸粉0.5％，玉米浆干粉0.2％，硫酸铵0.05％，氯化钠0.1％、磷酸二氢钠0.05％、蒸馏水1000mL，pH 7.0，培养条件为30℃，150rpm培养20h。

3.权利要求1所述的菌株在饲料添加剂中的应用。