CN108342340B - 一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用，属于微生物领域。所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017811。所述方法包括：1)在酵素源材料中经过分离和纯化后得到多个乳酸菌，所述酵素源材料由新谷酵素株式会社生产；2)筛选步骤1)所得的所述乳酸菌，得到所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。该产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于食品领域，同时，该产细菌素的凝结芽孢杆菌能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在酸性及中性条件下均具有良好的抑菌效果，同时，具有良好的热稳定性。

Description

一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中由核糖体合成的。细菌素是由基因编码的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质。细菌素具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点，使其作为绿色生物防腐剂在农产品和其它食品的保藏和农作物安全生产中倍受关注。考虑到细菌素产生菌的产量及细菌素的安全性，到目前为止，只有乳酸菌产生的细菌素可作为绿色防腐剂应用于食品行业。
乳酸菌在其代谢过程中能够产生乳酸、乙酸等有机酸，这些化学物质能抑制其它微生物的生长，很多乳酸菌还能产生蛋白质或肽类抑菌物质细菌素。和目前市场上广泛使用的食品级防腐剂(例如：苯甲酸和山梨酸)相比，乳酸菌产生的细菌素具有易分解、无残留、无抗性、无毒副作用等优点。目前已经发现的乳酸链球菌素(Nisin)被批准应用于食品中，并实现了工业化生产。由于乳酸链球菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性条件下抑菌性差，热稳定性差，这限制了乳酸链球菌素在食品防腐保鲜中的应用。
发明内容
为了解决现有技术中的乳酸链球菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性及碱性条件下抑菌性差、稳定性差的问题，本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017811。
具体地，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌的16SrDNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌的制备方法，所述制备方法包括：
1)将酵素源材料经过分离和纯化后得到多个乳酸菌，所述酵素源材料由新谷酵素株式会社生产；
2)筛选步骤1)所得的所述乳酸菌，得到所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。
具体地，所述分离和纯化的方法包括：
将所述酵素源材料与无菌水按照1:100的质量比进行混合，得到混合液；
将所述混合液进行梯度稀释，得到浓度不同的稀释液；
将所述浓度不同的稀释液分别在第一乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个待纯化的乳酸菌；
将所述多个待纯化的乳酸菌在第二乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个纯化的乳酸菌。
进一步地，所述稀释液的浓度分别为：10-4mg/L、10-5mg/L、10-6mg/L和10-7mg/L。
进一步地，将带有所述稀释液的所述第一乳酸细菌固体培养基于30～40℃培养20～24h。优选地，37℃培养24h。
进一步地，将带有所述多个待纯化的乳酸菌的第二乳酸细菌固体培养基于30～40℃培养20～24h。优选地，37℃培养24h。
进一步地，所述筛选的方法包括：将所述多个纯化的乳酸菌接种于乳酸细菌液体培养基中于30～40℃无氧条件下静置培养12～18h；得到发酵液；优选地，37℃培养18h。
在4℃下，将所述发酵液离心后，得到上清液；
将所述上清液通过牛津杯法筛选出所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。
更进一步地，所述发酵液于10000r/min下离心20min后，得到所述上清液。
再一方面，本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌的应用，所述应用包括：将所述产细菌素的凝结芽孢杆菌作为食品防腐剂应用于食品行业。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，该产细菌素的凝结芽孢杆菌由酵素源材料经过分离纯化和筛选后得到，该酵素源材料为食品，这使得该产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于食品领域，同时，该产细菌素的凝结芽孢杆菌能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中对常见的几种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果十分明显，对沙门氏菌也有一定程度抑制作用，这说明凝结芽孢杆菌的抑菌产物具有广谱抗菌作用，同时，具有良好的热稳定性，在酸性及中性条件下均具有良好的抑菌效果。
该产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学，该凝结芽孢杆菌分类命名分别为：Bacillus coagulansTK1，保藏编号为CCTCC NO:M 2017811。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以金黄色葡萄球菌作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1；
图2是本发明实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以大肠杆菌K99作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌TK1，右侧的牛津杯中为乳酸菌L32；
图3是本发明实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以沙门氏菌作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1；
图4是本发明实施例提供产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的16SrDNA片段的电泳图；
图5是本发明实施例提供的产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的生长曲线图；
图6是本发明实施例提供的酸抑制作用的排除试验结果图，图中1为乳酸，2为乙酸，3为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1；
图7为过氧化氢排除试验结果图，图中左侧为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的发酵液，右侧为经过氧化氢酶处理的产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的发酵液；
图8是本发明实施例提供的蛋白酶消化试验结果图，图中4含有胃蛋白酶，5含有胰蛋白酶，6含有蛋白酶K；
图9是本发明实施例提供的热稳定性试验结果图，图中左侧为经100℃加热10分钟处理后的凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液，右侧为未经处理的凝结芽孢杆菌的发酵上清液；
图10是本发明实施例提供的乳酸链球菌素和产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的抑菌圈试验结果图，图中左侧为乳酸链球菌素的抑菌圈，右侧为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的抑菌圈；
图11是本发明实施例提供的凝结芽孢杆菌TK1，图中左侧为凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液，右侧为将pH值调节至7后的凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供的试剂均购于武汉勤洁生物有限公司。
本发明实施例提供了一种制备产细菌素的凝结芽孢杆菌的方法，该方法包括：
1)将酵素源材料经过分离和纯化后得到2种乳酸菌，分别命名为TK1和L32，酵素源材料由新谷酵素株式会社生产，且酵素源材料的生产批号为：4560264290396；
具体地，分离和纯化的方法包括：
在无菌条件下，将酵素源材料剪成小块后装入试管中，向试管中加入适量无菌水，其中，酵素源材料与无菌水按照1:100的质量比进行混合，待其充分溶解后得到混合液；
吸取0.1mL混合液进行梯度稀释，得到终浓度分别为：10-4mg/L、10-5mg/L、10-6mg/L和10-7mg/L的稀释液。
取上述四种浓度不同的稀释液各0.2mL分别均匀涂布在四个第一乳酸细菌固体培养基的表面，并于30～40℃培养20～24h，具体可以为37℃培养24h，得到待纯化的乳酸菌；
将待纯化的乳酸菌分别涂布在第二乳酸细菌固体培养基上于30～40℃培养20～24h，具体可以为37℃培养24h，该步骤可重复多次直至得到纯化完全的乳酸菌，最终得到2个纯化的乳酸菌TK1和乳酸菌L32。
在本实施例中，第一乳酸细菌固体培养基和第二乳酸细菌固体培养基可以为相同的乳酸细菌固体培养基，具体地，每升乳酸细菌固体培养基中包括：10g蛋白胨、5g牛肉浸粉、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸三铵、5g醋酸钠、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂和1g吐温。
2)筛选步骤1)所得的乳酸菌，得到产细菌素的凝结芽孢杆菌。
具体地，在纯化的乳酸菌TK1和纯化的乳酸菌L32中筛选出抑菌效果最好的一株，作为本发明实施例提供的产细菌素的凝结芽孢杆菌，具体操作如下。
将乳酸菌TK1和乳酸菌L32分别接种于乳酸细菌液体培养基中于30～40℃无氧条件下静置培养12～18h，具体可以为37℃培养18h；得到发酵液；其中，每升乳酸细菌液体培养基中包括：10g蛋白胨、8g牛肉粉、4g酵母粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸氢二铵、5g乙酸钠、0.2g硫酸镁、0.04g硫酸锰和1g吐温80。
在4℃下，将发酵液于10000r/min下离心20min后，得到上清液；
将上清液通过牛津杯法筛选出抑菌效果最好的菌株作为产细菌素的凝结芽孢杆菌。
具体地，牛津杯法包括：①将已灭菌的LB(Luria-Bertani)固体培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿20mL，待其凝固。②用无菌管吸取0.2mL由指示菌制备的具有最佳指示浓度的指示菌液，其中，指示菌包括金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌K99(革兰氏阴性菌)和沙门氏菌(革兰氏阴性菌)，用无菌棉棒或L棒均匀涂布于LB固体培养基上。具体地，最佳指示浓度的确定方法为：将活化后的沙门氏菌、大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌分别接种于指示菌生长培养基上，在37℃下培养12h。将培养好的指示菌菌液分别作为原液进行梯度稀释，使其终浓度分别为原液的10-1、10-2、10-3和10-4，利用稀释平板法分别计算菌株数量。将三个菌的所有稀释液各取0.2ml分别涂布于指示菌培养基上，进行抑菌实验，根据抑菌圈直径大小、边缘整齐程度和清晰度程度，来确定最佳的指示浓度，抑菌圈具体情况见表1。③在无菌条件下，将已灭菌的牛津杯(该牛津杯的尺寸可以为：内径6mm、外径8mm、高10mm)垂直放在LB固体培养基的表面并轻轻加压。④在牛津杯中加入200μL待测样品(乳酸菌TK1的发酵液和乳酸菌L32的发酵液)，在4℃下静置4h后于37℃培养24h，所得结果分别如图1至图3所示，在图1中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1，比较两个牛津杯外抑菌圈的大小可知，乳酸菌TK1所产生的抑菌圈大于乳酸菌L32所产生的抑菌圈，由此可知，相对于乳酸菌L32，乳酸菌TK1对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用；在图2中，左侧的牛津杯中为乳酸菌TK1，右侧的牛津杯中为乳酸菌L32，比较两个牛津杯外抑菌圈的大小可知，乳酸菌TK1所产生的抑菌圈大于乳酸菌L32所产生的抑菌圈，由此可知，相对于乳酸菌L32，乳酸菌TK1对大肠杆菌K99具有良好的抑制作用；在图3中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1，比较两个牛津杯外抑菌圈的大小可知，乳酸菌TK1所产生的抑菌圈直径较大，由此可知，相对于乳酸菌L32，乳酸菌TK1对沙门氏菌具有良好的抑制作用。在实现时，可以通过游标卡尺分别测量抑菌圈的大小，最后选择抑菌效果最好(即抑菌圈最大)的乳酸菌TK1作为本发明实施例所用菌株。
表1为不同浓度的菌液对抑菌活性的影响结果
Figure BDA0001563462940000061
由表1可知，菌液浓度为2.0×106cfu/mL时，菌苔厚度适中，抑菌圈边缘清晰，易于测量，并以菌液浓度为2.0×106cfu/mL时作为最佳的指示浓度。
产细菌素的菌株的鉴定
将筛选出的乳酸菌TK1接种于5mL乳酸细菌液体培养基中，37℃静置培养24h。用细菌基因组DNA提取试剂盒参照其说明书提取该菌株的基因组DNA。
利用该菌株的16SrDNA引物(该引物包括：序列如序列表中SEQ ID NO:2所示的正向引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示的反向引物)扩增出16SrDNA片段，并进行电泳，其电泳图如图4所示，用胶回收试剂盒回收16SrDNA片段后，将回收的16SrDNA片段连接到pMD19-T载体上，并送至天一辉远科技有限公司测序，然后进行BLAST比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。根据比对结果显示，所筛选到的产细菌素的菌株为凝结芽孢杆菌TK1(Bacillus coagulans TK1)。
凝结芽孢杆菌TK1的生长曲线的构建
采用乳酸细菌肉汤培养基作为基质，使用全自动生长曲线分析仪通过测定600nm波长下OD值的变化，绘制出菌株生长曲线，具体生长曲线见图5，研究其生长规律。
凝结芽孢杆菌TK1在培养6h后左右进入对数期，菌体浓度开始随时间指数型快速生长；培养12h后左右，菌体开始进入稳定期，但稳定期维持时间不长；18h之后，由于培养基中营养成分的消耗、代谢产物的积累，菌体的死亡率慢慢大于繁殖率，菌体进入衰亡期。
抑菌物质的定性实验
A.酸抑制作用的排除
测定凝结芽孢杆菌TK1的发酵液的pH值，且测得pH值为6。向两个小烧杯中分别加入适量蒸馏水，用质量分数为36％的乳酸和质量分数为80％的乙酸分别调节蒸馏水的pH值，使两个小烧杯中的蒸馏水的pH值均达到6，备用。取200μL配置好的乳酸溶液、乙酸溶液于牛津杯中做抑菌实验。将凝结芽孢杆菌TK1置于LB液体培养基上于37℃下培养12h后，在10000r/m离心10min，取200μL上清发酵液作为对照于牛津杯中做抑菌试验。指示菌为大肠杆菌K99。抑菌试验可重复进行3次。实验结果如图6所示，由图6可知，乳酸溶液和乙酸溶液均无抑菌圈出现，这说明乳酸溶液和乙酸溶液均无抑菌性，由此可以排除发酵液中乳酸和乙酸抑制了指示菌的生长。
B.过氧化氢排除试验
将过氧化氢酶溶解于凝结芽孢肝菌TK1的上清发酵液中，使过氧化氢酶终浓度达到5μg/mL，并于30℃下温浴2h。取200μL做牛津杯抑菌试验。分别以凝结芽孢肝菌TK1的发酵培养液和未经过氧化氢酶处理的凝结芽孢肝菌TK1的发酵液作为对照。抑菌试验可重复进行3次。实验结果如图7所示。由图7可知，凝结芽孢杆菌TK1的发酵液经过氧化氢酶消化后，抑菌圈略减小，这表明发酵液中含有过氧化氢，过氧化氢的存在，可抑制细菌的生长。但是，过氧化氢酶消化后，抑菌圈没有完全消失，表明发酵液中除过氧化氢可以抑制细菌外，还有其它物质可抑制指示菌的生长。
C.蛋白酶消化试验
将蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶分别溶解在过氧化氢酶消化后的凝结芽孢杆菌TK1的上清发酵液中，使酶终浓度为5mg/L，并于30℃下温浴2h，取200μL做牛津杯抑菌试验。以蒸馏水稀释相同倍数后的上清发酵液作为对照。抑菌试验可重复进行3次。凝结芽孢杆菌TK1的发酵液经过氧化酶处理后，用胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsinase)、蛋白酶K(proteinase K)分别水解，结果见图8。由图8可见凝结芽孢杆菌TK1的发酵液经以上三种蛋白酶水解后，抑菌圈均完全消失，表明凝结芽孢杆菌TK1的发酵液中除过氧化氢外，主要的抑菌物质为蛋白类物质。
D.热稳定性试验
将凝结芽孢肝菌TK1的上清发酵液在100℃下加热10分钟，立即冰浴冷却，同时，以未加热的凝结芽孢肝菌TK1的上清发酵液作为对照，通过牛津杯扩散法检测其抑菌活性。结果如图9所示，由图9可知，经热处理后的凝结芽孢肝菌TK1的抑菌活性基本不变，表明凝结芽孢肝菌TK1具有良好的热稳定性。
将凝结芽孢杆菌TK1和乳酸链球菌素进行抑菌效果对比，具体地，将凝结芽孢杆菌TK1和乳酸链球菌素各取200μL，分别加入到牛津杯中，选取大肠杆菌K99做指示菌。结果如图10所示。由图10可见，乳酸链球菌素对革兰氏阴性菌沙门氏菌无抑菌作用，凝结芽孢杆菌TK1对革兰氏阴性菌沙门氏菌有明显的抑菌作用。
用pH计测得凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液的pH值为6.0，再用NaOH的水溶液调节凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液的pH值至7，用大肠杆菌k99作为指示菌，做抑菌试验，结果见图11，由图11可知，该凝结芽孢杆菌TK1在中性环境下具有良好的抑菌性能。
该凝结芽孢杆菌TK1来源于食品，这使其可以作为食品防腐剂应用于食品行业，同时，该凝结芽孢杆菌TK1也可以用于水产养殖、畜牧伺料和医药行业。
本发明实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，该产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1由酵素源材料经过分离纯化和筛选后得到，该酵素源材料为食品，这使得该产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于食品领域，同时，该产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中对常见的几种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果十分明显，对沙门氏菌也有一定程度抑制作用，这说明凝结芽孢杆菌的抑菌产物具有广谱抗菌作用，同时，具有良好的热稳定性，在酸性和中性环境下均具有良好的抑菌性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 凝结芽孢杆菌TK1(Bacillus coagulans TK1)
<400> 1
acaaccggcc cccacgccga gcccagcgca gacagaccag agagccgccc gccacgggcc 60
ccaaacacgc acaccgcaca caggaaccac cccccgcacc aagccccagc caagaccccc 120
ccgggagccg ggggccacac agacaagaaa ccgccgcgcc gcacgcccaa aaaccggaca 180
acgcgccacc acgaaccgcg gcgcggcacg agagccgggc cggagaaccg caagggagaa 240
cagacccacc gcccaacaac agagacgacc gaaaacccca ccacgcggcg gccggcagac 300
cgccagccga agacccacgc gcccccgagg aggggccggc cagcccaagg gccgacaccc 360
ccaggcggca gcacgggccg ggagccgacc caccaacagc aagcaccgcg ggccaccaca 420
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cccgagggca ggacccacgg accacccgcg ccaccycccg gggagcaagc ccggggaaaa 540
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<212> DNA
<213> 凝结芽孢杆菌TK1(Bacillus coagulans TK1)
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<212> DNA
<213> 凝结芽孢杆菌TK1(Bacillus coagulans TK1)
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cahagggaca acc 13

Claims (2)

1.一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)TK1，保藏编号为CCTCC NO:M 2017811。
2.一种如权利要求1所述的产细菌素的凝结芽孢杆菌的应用，其特征在于，将所述产细菌素的凝结芽孢杆菌作为食品防腐剂应用于食品行业。
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