KR101658761B1 - 내염성 및 단백질 분해 활성을 갖는 균주 및 이의 용도 - Google Patents

내염성 및 단백질 분해 활성을 갖는 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고염에서 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 균주 또는 이의 배양물은 식품첨가제, 사료첨가제, 특히 고염 젓갈 발효제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

내염성 및 단백질 분해 활성을 갖는 균주 및 이의 용도{Microorganism with salt tolerance and protease activity, and uses thereof}
본 발명은 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 NaCl 5% 이상의 고염에서도 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
미생물이, 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정을 발효(fermentation)라고 한다. 발효는 인간의 음식 조리 방법으로 널리 활용되는 기술이며, 인간이 먹는 음식의 3분의 1은 발효식품이다. 미생물의 종류, 식품의 재료에 따라 발효식품의 종류는 다양하며, 복잡한 반응의 결과로 원료에 함유되어 있지 않던 성분들이 생겨나면서 영양가, 기호성 및 저장성 등이 향상된다. 알콜발효, 젖산발효, 초산발효, 아미노산발효 등 발효균의 종류와 발효조건에 따라 생성물이 달라지므로 식품에 다양하게 이용되고 있다. 주류, 식초, 치즈·요구르트·버터와 같은 유제품, 콩발효식품, 채소 절임류 등이 대표적인 발효식품에 해당되며 발효차, 발효두부, 발효조미료, 발효빵 등 식품의 가공과정에 응용되기도 한다. 한국의 주요 발효식품으로는 전통장류인 간장·된장·고추장·청국장 등과 채소류 발효식품인 김치·절임류, 수산물 발효식품인 젓갈·식해 그리고 주류와 식초 등이 주종을 이루고 있다.
한편, 발효식품의 맛과 발효속도를 조절하기 위하여 인위적으로 발효제를 사용하여 발효식품을 제조하기도 한다. 선행문헌 1은 '병원성 세균의 생육을 억제하는 김치에서 분리한 신규류코노스톡 메센트로이드 및 이의 용도'에 관한 것으로서, 김치로부터 분리한 류코노스톡 메센트로이드(Leuconostoc mesenteroide)를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나 류코노스톡 메센트로이드는 NaCl 15% 이상의 고염에서는 생존이 어려워 고염 발효 식품에 사용하기에는 한계가 있다. 따라서 고염에서도 단백질 분해 활성이 우수한 균주의 개발이 필요한 실정이다.
선행문헌 1: 한국 공개특허공보 제10-2009-0040026호
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 고염에서도 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스(Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus) 또는 이의 배양물을 제공한다. 상기 균주는 NaCl 5% 이상의 고염에서도 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수하여 고염 식품의 발효제로서 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스(Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제, 젓갈 발효제 및 사료첨가제와 이들을 포함하는 발효식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스(Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus) 또는 이의 배양물을 스타터로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 발효식품에는 고염 발효식품으로서 김치, 젓갈 및 식해 등일 수 있다.
예로서, 젓갈에는 가자미젓, 강달이젓, 고노리젓, 고등어젓, 갈치젓, 까나리젓, 꽁치젓, 능성어젓, 눈치젓, 대구젓, 도루묵젓, 도미젓, 돌치젓, 동태젓, 등피리젓, 디포리젓, 매가리젓, 멸치젓, 모챙이젓, 민어젓, 반지젓, 뱅어젓, 밴댕이젓, 송애젓, 뱀장어젓, 웅어젓, 자리젓, 전어젓, 정어리젓, 준치젓, 황숭어젓, 갈게젓, 겟가제젓, 게장, 게젓, 고개미젓, 곤쟁이젓, 꽃게젓, 농발게젓, 능갱이젓, 대하젓, 돌게젓, 바다게젓, 박하지젓, 방게젓, 백하젓, 벌떡게젓, 부새우젓, 새우젓, 새우맛젓, 새우액젓, 새하젓, 썰게젓, 오젓, 육젓, 자젓, 중하젓, 참게젓, 청게젓, 털게젓, 토하젓, 피앵이젓, 화란게젓,　황발이젓, 꼴뚜기젓, 굴젓, 낙지젓, 대합젓, 동죽젓, 맛젓, 모시조개젓, 바지락젓, 백합젓, 소라젓, 오분자기젓, 오징어젓, 어리굴젓, 조개젓, 한치젓, 갈치속젓, 게웃젓, 고등어내장젓, 대구아가미젓, 민어아가미젓, 명태아가미젓, 뱀장어 창젓, 전어밤젓, 조기속젓, 조기아가미젓, 창란젓, 해삼창자젓, 게알젓, 고등어알젓, 대구알젓, 대구이리젓, 명란젓, 복어알젓, 새우알젓, 성게알젓, 숭어알젓, 연어알젓, 장대알젓, 조기알젓 및 화란젓 등일 수 있다.
예로서, 식해에는 가자미식해, 갈치식해, 광어식해, 노가리식해, 대구식해, 도다리식해, 도루묵식해, 멸치식해,　명태식해, 뱅어식해, 우럭식해, 전어식해, 전갱이식해, 조기식해, 쥐치식해, 홀때기식해, 횟대식해, 고동식해, 낙지식해, 대합식해, 마른 오징어식해, 문어식해, 오징어식해, 한치식해, 명태아가미식해, 명태창자식해 및 명란식해 등일 수 있다.
본 발명에 따른 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스(Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus)는 통상적인 살린비브리오 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, Marine 또는 Nutrient 또는 TSA 배지를 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 살린비브리오 속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대 25 ℃ 내지 37 ℃에서 18시간 내지 48시간동안 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는 30 ℃에서 72시간동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 또는 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명에 따른 균주 또는 이의 배양물은 고염에서도 단백질 분해 활성이 우수하여 고염 젓갈 균주의 속성발효제, 사료첨가제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 균주 또는 이의 배양물은 고염 젓갈의 속성발효를 위한 스타터로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예1에서 투명환을 형성한 콜로니들의 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예1에서 염 농도에 따라 성장한 콜로니들의 사진이다.
본 발명자들은 고염에서도 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주를 젓갈에서 찾고자 연구를 거듭하던 중, NaCl 20%에서도 내염성 및 단백질 분해 활성이 우수한 균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하에서는 본 발명을 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 권리는 하기에서 설명된 구현예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
<실시예 1>
1-1. 내염성 및 단백질 활성을 가지는 균주의 분리
시판되고 있는 젓갈 3종을 구매하여 상기 젓갈을 균주 분리 시료로 사용하였다. 상기 젓갈을 0.85% 식염수로 10배 희석하였고, 0.5 mL씩 20% NaCl과 2% 탈지유 (skim milk)를 함유한 nutrient 배지, TSA 배지, marine 배지에 플레이트에 접종한 후, 스프레더로 도말하였다. 이후, 플레이트를 30 ℃의 항온 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 20% NaCl의 고염 조건에서 생육하면서 skim milk에 대한 분해 활성을 나타내어 투명환을 형성한 각각의 콜로니를(도 1) 20% NaCl과 2% 탈지유를 함유한 nutrient 배지, TSA 배지, marine 배지에 획선 접종하여 재확인하였으며, 30 ℃의 항온 배양기에서 3일 동안 배양하여 총 13개의 콜로니를 분리하였다.
1-2. 선별된 균주의 동정
상기 1-1.에서 선별된 균주를 단일 콜로니로 분리한 후, 각각 nutrient broth, TSA broth, marine broth 배지에 배양하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini kit (QIAgen, 독일)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로즈 젤(agarose gel)을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 템플릿(template)으로 하여 518F (5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’, forward), 800R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’, reverse) 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 변성(denaturation) 95 ℃에서 1분, 어닐링(annealing) 45 ℃에서 1분 및 증폭 (extension) 72 ℃에서 1분 30초로 하여 30회 수행하였다. 얻어진 PCR 수득물은 마크로젠(서울, 한국)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16S rRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다. 그 결과, 상기 균주의 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)은 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스(Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus)의 16S rRNA의 염기서열(서열번호 2)과 99% 동일함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 상기 균주를 “살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스-위킴 23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus wikim 23)“로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 2014년 10월 7일자로 기탁하였다. (기탁번호 : KFCC11602P)
1-3. 선별된 균주의 성장 가능 염 농도 확인
선별된 살린비브리오 코스티콜라 종. 알칼리필러스-위킴 23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus wikim 23)에 대한 성장 가능 염 농도를 확인하였다. 5, 10, 15, 20 및 25% NaCl을 함유한 nutrient 배지, TSA 배지, marine 배지에 플레이트에 획선 접종하였다. 플레이트를 30 ℃의 항온 배양기에서 3일 동안 배양한 결과, 도 2와 같이 nutrient 배지, TSA 배지, marine 배지 모두에서 NaCl 5~20% 범위에서 생육이 활발하였으며 특히, 8%에서부터 활발한 생육 활성을 나타내었다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11602P 20141007
<110> Korea Food Research Institute <120> Microorganism with salt tolerance and protease activity, and uses thereof <130> 2014-wikim23 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1492 <212> DNA <213> Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus wikim 23 <400> 1 tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gagcggaaac ggcagtattg 60 aagcttcggt ggatttactg gacgtcgagc ggcggacggg tgagtaacgg ctgggaacct 120 gccctgacga gggggataac cgttggaaac gacggctaat accgcataat gtcttgattc 180 gttagagtca ggaccaaagg tggcctctac atgtaagcta tcgcgttggg atgggcccag 240 ttaggattag ctagttggta aggtaatggc ttaccaaggc aacgatcctt agctggtttg 300 agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tggggaatat tgcacaatgg gggagaccct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 420 ccttcgggtt gtaaagcact ttcagcagtg aggaaggtcg tgtacttaat acgtgcacgg 480 cttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 540 gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg catgcaggcg gtttgttaag 600 tcagatgtga aagcccgggg ctcaacctcg gaaccgcatt tgaaactggc aggctagagt 660 cttgtagagg ggggtagaat ttcaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat 720 accagtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct cagatgcgaa agcgtgggta 780 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gctgtctact tggaggttga 840 ggttttagac tttggctttc ggcgctaacg cattaagtag accgcctggg gagtacggcc 900 gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960 aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagcgaagc ctttagagat 1020 agaggtgtgc cttcgggagc gctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1080 tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tccttgtttg ccagcacata 1140 atggtgggaa ctccagggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca 1200 agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcaga tacagagggc 1260 agcgagacag cgatgtttag cgaatccctt aaagtttgtc gtagtccgga ttggagtctg 1320 caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat 1380 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggctg caccagaagt 1440 agatagctta ccnttcggga gggcgtttac cacggtgtgg ttcatgactg gg 1492 <210> 2 <211> 1539 <212> DNA <213> Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus wikim 23 <400> 2 tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gagcggaaac ggcagtattg 60 aagcttcggt ggatttactg gacgtcgagc ggcggacggg tgagtaacgg ctgggaacct 120 gccctgacga gggggataac cgttggaaac gacggctaat accgcataat gtcttgattc 180 gttagagtca ggaccaaagg tggcctctac atgtaagcta tcgcgttggg atgggcccag 240 ttaggattag ctagttggta aggtaatggc ttaccaaggc aacgatcctt agctggtttg 300 agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tggggaatat tgcacaatgg gggagaccct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 420 ccttcgggtt gtaaagcact ttcagcagtg aggaaggtcg tgtacttaat acgtgcacgg 480 cttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 540 gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg catgcaggcg gtttgttaag 600 tcagatgtga aagcccgggg ctcaacctcg gaaccgcatt tgaaactggc aggctagagt 660 cttgtagagg ggggtagaat ttcaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat 720 accagtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct cagatgcgaa agcgtgggta 780 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gctgtctact tggaggttga 840 ggttttagac tttggctttc ggcgctaacg cattaagtag accgcctggg gagtacggcc 900 gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960 aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagcgaagc ctttagagat 1020 agaggcgtgc cttcgggagc gctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1080 tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tccttgtttg ccagcacrta 1140 atggtgggaa ctccagggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca 1200 agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcaga tacagagggc 1260 agcgagacag cgatgtttag cgaatccctt aaagtttgtc gtagtccgga ttggagtctg 1320 caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat 1380 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggctg caccagaagt 1440 agatagctta accttcggga gggcgtttac cacggtgtgg ttcatgactg gggtgaagtc 1500 gtaacaaggt agccctaggg gaacctgcgg ctggatcac 1539

Claims (10)

  1. NaCl 5 내지 25% (w/v)에서 내염성 및 단백질 분해 활성을 갖는, 살린비브리오 코스티콜라 아종. 알칼리필러스 WIKIM23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus, 기탁번호: KFCC11602P).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 살린비브리오 코스티콜라 아종. 알칼리필러스 WIKIM23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus, 기탁번호: KFCC11602P) 또는 이의 배양물을 포함하는, 식품첨가제.
  5. 제1항의 살린비브리오 코스티콜라 아종. 알칼리필러스 WIKIM23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus, 기탁번호: KFCC11602P) 또는 이의 배양물을 포함하는, 젓갈 발효제.
  6. 제1항의 살린비브리오 코스티콜라 아종. 알칼리필러스 WIKIM23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus, 기탁번호: KFCC11602P) 또는 이의 배양물을 포함하는, 사료첨가제.
  7. 제4항의 식품첨가제를 포함하는 발효식품.
  8. 제7항에 있어서, 상기 발효식품은 젓갈 또는 식해인 것인 발효식품.
  9. 제7항에 있어서, 상기 발효식품은 김치인 것인 발효식품.
  10. 제1항의 살린비브리오 코스티콜라 아종. 알칼리필러스 WIKIM23 (Salinivibrio costicola subsp. alcaliphilus, 기탁번호: KFCC11602P)을 스타터(starter)로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법.
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