CN107988135B

CN107988135B - 镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用

Info

Publication number: CN107988135B
Application number: CN201711333700.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 曹青青; 李敏佳
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN107988135A

Abstract

本发明公开一种镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用，属于蛭弧菌技术领域。本发明利用促蛭弧菌蛭质体形成因子—镁离子，促进了蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE‑1高密度蛭质体的形成，通过本研究发现，镁离子对蛭弧菌蛭质体的形成均有明显的促进作用，蛭质体的裂解性能并未下降，高密度蛭质体组同对照组相比保质期得到了明显延长；本发明提供的高密度蛭质体既能抑制可引发人感染和食物中毒的弧菌，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，同时对其他食源性致病菌也具有很好的抑菌作用，具有广裂解谱性质，且其裂解作用同蛭弧菌BDE‑1混合体相比不变；本发明促蛭质体培养方法简单易行，可进行推广使用。

Description

镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用

技术领域

本发明属于蛭弧菌技术领域，特别涉及一种镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。

背景技术

弧菌(Vibrio)是海洋环境中最为常见的细菌类群之一，广泛存在于海水、海底沉积物及鱼、虾、贝、蟹、海参、海带等等海产品中。《伯杰氏细菌学手册》第8版记载了35种弧菌，它们中相当一部分是水产养殖生物的重要致病菌。在水产业界，由副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等各种弧菌引发的养殖生物的疾病统称为弧菌病(vibriosis)，它每年给水产业界造成巨大的经济损失。与此同时，部分弧菌也是人类的致病菌。它们不仅能引起人类肠胃炎，还能引起肠道外感染。在食品中，弧菌(Vibrio)、沙门氏菌(Salmonella)、致病性大肠埃希菌(pathogenicEscherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等一起，成为细菌性食物中毒的主要病源菌。到目前为止，已知的如霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、河流弧菌(V.fluvialis)等能引起人的肠胃炎，而创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)等引起伤口感染和败血症等肠道外感染。近年来，由致病性弧菌所引起的肠道疾病、传染病和食物中毒发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，超过沙门氏菌食物中毒，跃居细菌性食物中毒事件的首位，成为影响食品安全的重要因素，引起广泛的关注。

防治细菌性疾病最常用的方法是使用抗生素，但长期使用抗生素会导致细菌产生耐药性。因此，抗生素的有效替代品的研究显得尤为迫切。蛭弧菌类群(Bdellovibrio-and-like organisms)是一类较新的成员。它是一类寄生性革兰氏阴性菌。与其它有益菌通过或位点竞争或分泌胞外产物以抑制有害菌不同，蛭弧菌是通过寄生、进而裂解其它细菌的作用而达到控制有害菌的目的。众多研究表明，蛭弧菌具有裂解水产动物养殖中常见致病菌如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)等的能力，通过抑制这些有害菌群的滋生和转移，能够保持甚至增加水产动物肠道中本就对致病弧菌有抑制作用的益生菌如乳酸菌和双歧杆菌等的数量，激发水产动物肠道免疫系统运作，增强机体免疫力、抗病力和抗应激能力，从而改善水产动物肠道菌群结构、提高其存活率。

到目前为止，研究表明蛭弧菌广泛存在于各种自然环境中，如土壤、植物根际、各种水体(海、咸、淡、污水、封闭式的循环养殖体系中，等等)，也存在于鳗鲡(Eel)、异育银鲫(Carassius auratusgibelio)、鲟(Sturgeon)、奶牛、马、猪、鸭以及人等等的肠道和蓝蟹(Blue crab)的鳃中，为它们各自微生物群落的固有一员，但不具侵染植物、鱼类、以及人等哺乳动物细胞的能力，也即对它们无害。

蛭弧菌的生活史包括两个阶段(phases)：带鞭毛营运动但不增殖的游泳体阶段(free swimming phase)和在宿主细胞内行生长繁殖的蛭质体阶段(Bdelloplast phase)。完成一个生命周期仅需4个小时。在游泳体阶段，蛭弧菌需消耗巨大能量和氧营运动生活，以便遇获宿主。如在一段时间内未遇宿主，则能量和/或氧耗尽而死去。此阶段一般不超过数小时。换句话说，游泳体蛭弧菌极易死亡，极难存活。在蛭质体阶段，蛭弧菌已进入到宿主胞质空间(periplasmic space)，在宿主细胞壁保护下，脱去了鞭毛，通过分解宿主细胞营养自身，成长杆状。之后，通过多分裂(multiple fission)，分成多个小段，每小段长出鞭毛，即成子一代游泳体。

已有研究表明，蛭弧菌的蛭质体阶段，其生长(变长的过程)可被随时打断。待环境条件合适后，蛭质体再行分裂、分化成多个游泳体。因此，相比脆弱且高耗氧的游泳体，低耗氧的蛭质体耐受恶劣环境能力强。同时，研究也表明，镁离子等对于海洋蛭弧菌生长繁殖及其蛭质体形成和维持具有重要作用。

虽然蛭弧菌正在被越来越广泛地使用，但“水产养殖用蛭弧菌类生物制剂的检测”研究揭示，目前市面上的产品几乎不存在有活性的蛭弧菌，或数量极少。我们研究同样表明，目前蛭弧菌存在着存活率极低、保质期极短问题，影响了产品的市场开拓。

由此可见，解决当前蛭弧菌产品所存在的活菌存活率低、保质期短的问题，具有重要的经济价值。而解决该问题的关键就在于在蛭弧菌的高浓度发酵过程中转变游泳体为蛭质体，同时延缓蛭质体发育，再将处于蛭质体阶段的高浓度蛭弧菌进行冷冻干燥或直接保藏，由此来延长蛭弧菌的保质期，维持蛭弧菌产品在投入使用前蛭弧菌的存活率，并进行蛭弧菌产品应用的市场开拓，以望于蛭弧菌在水产养殖业防治细菌性疾病方面做出突出的贡献。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的主要目的在于提供一种镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用，尤其是镁离子在延长海洋蛭弧菌蛭质体的保质期中的应用。

优选的，所述的镁离子的使用终浓度为2～20mmol/L；更优选为2～10mmol/L，最优选为2mmol/L。

一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，通过以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于20～35℃、150～300r/min培养36～48h，再次添加宿主菌，并加入镁离子，继续培养20～28h，培养液经4℃、6000～8000r/min离心10～15min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀使用质量体积比(g/mL)10～30‰(优选为20‰)盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度至10¹⁰PFU/mL，即是海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。

优选的，所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1。

所述的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1，是来源于海南某水产养殖的海水中，经人工富集培养、分离纯化得到，是一株以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为寄生宿主的蛭弧菌。

所述的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年11月27日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60292。

所述的蛭弧菌BDE-1的培养温度优选为20～35℃(最优选为30℃)，PH优选为6.0～7.0(最优选为7.0)，盐度优选为10～30‰(最优选为20‰)；

培养所述的蛭弧菌BDE-1的培养基优选为DNB培养基；

所述的蛭弧菌BDE-1，具有如下形态特征和生理生化特性：

a、所筛选的蛭弧菌BDE-1革兰氏染色为阴性，杆状，无芽孢，端生单根鞭毛；

b、噬菌斑的形态特征为：所述的蛭弧菌BDE-1在DNB固体双层平板培养基30℃培养4天后，噬菌斑呈圆形，透明，凹陷，湿润，边缘整齐状，直径1～3mm。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用促蛭弧菌蛭质体形成因子——镁离子，促进了蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1高密度蛭质体的形成，通过本研究发现，镁离子对蛭弧菌蛭质体的形成均有明显的促进作用，蛭质体的裂解性能并未下降；本发明促蛭质体培养方法简单易行，可进行推广使用。

(2)本发明提供的高密度蛭质体既能抑制可引发人感染和食物中毒的弧菌，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，同时对其他食源性致病菌也具有很好的抑菌作用，具有广裂解谱性质，且其裂解作用同蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)相比不变；

(3)本发明提供的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1高密度蛭质体组同对照组相比保质期得到了明显延长。

附图说明

图1是宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)100×油镜镜检图。

图2是蛭弧菌BDE-1的DNB双层固体培养基平板法分离结果图

图3是蛭弧菌BDE-1的透射电镜观察结果图。

图4是实施例2中的不同浓度镁离子对蛭弧菌BDE-1蛭质体形成量的作用图。

图5是实施例4中的不同状态下的蛭弧菌在4℃和10℃下保质期的天数比较图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及到的培养基：

DNB液体培养基的配方(g/L)：营养肉体0.8，酸水解酪蛋白0.5，酵母提取粉0.1，氯化钠20；最终pH 7.0；

DNB上层培养基配方：20‰盐度的无菌水中加入质量比为0.8％的琼脂粉，最终pH7.0；

DNB下层培养基配方：DNB液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH7.0；

营养肉汤(NB)液体培养基配方(g/L)：蛋白胨10；牛肉膏粉3；氯化钠5，最终pH7.0；

营养肉汤(NB)固体培养基配方：营养肉汤液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH 7.0；

硫酸镁母液的配方：称取12.32g七水合硫酸镁粉末溶于50mL的无菌蒸馏水中。

本实施例中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM 1.136)购买于广东省微生物研究所。

本实施例中39株指示菌中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)AS1.1865、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)AS 1.2420和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CMCC 50115购买于中国普通微生物保藏管理中心；

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)ATCC 43305、河流弧菌(Vibriofluvialis)ATCC33809、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)(tdh+)ATCC17802购于美国模式培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)；

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)1、溶藻弧菌(V.alginolyticus)2、溶藻弧菌(V.alginolyticus)3、溶藻弧菌(V.alginolyticus)4、霍乱弧菌(V.cholera)6、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)8、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)9、溶藻弧菌(V.alginolyticus)10、溶藻弧菌(V.alginolyticus)11、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)12、溶藻弧菌(V.alginolyticus)13、气味沙雷菌(Serratiaficaria)15、溶藻弧菌(V.alginolyticus)16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)17、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)18、溶藻弧菌(V.alginolyticus)19、气味沙雷菌(Serratiaficaria)20、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)21、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)22、溶藻弧菌(V.alginolyticus)23、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)24、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)25、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)26、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)27、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)28、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)29、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)30、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)31、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)33、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)34、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)35由华南理工大学轻工与食品学院提供(biological characterization of two marinebdellovibrio-and-like organisms isolated from Daya bay of Shenzhen,China andtheir application in the elimination of Vibrio parahaemolyticus in oyster[J].Li H,Liu C,Chen L et al.International Journal of FoodMicrobiology,2011,151:36–43.)；

雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)32由华南理工大学轻工与食品学院提供(The protective effect ofbdellovibrio-and-like organisms(BALO)on tilapiafish fillets against Salmonella enterica ssp.enterica serovar Typhimurium[J].Lu F,Cai J.Letters inAppliedMicrobiology,2010,51:625–631.)；

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)MVM425由华东理工大学生物反应器国家重点实验室赠送(海洋鱼类致病菌鳗弧菌MVM425毒力质粒pEIB1复制区域的最小化分析[J].吴海珍，张惠展,李刚,叶江,马悦,张元兴.食品与药品,2007,04:1-4.)

同时，本实施例中39株指示菌均在专利“ZL201410752144.2、一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用”中公开。

实施例1蛭弧菌BDE-1的分离和纯化

从海南某水产养殖的海水水体区域取回样品，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为寄生宿主菌，取样品液体10mL加入无菌处理的50mL DNB液体中，200r/min30℃富集培养30h，将菌液先在6000r/min下离心10min，再将上清液在20000r/min下离心20min后，把离心管底部少量菌用无菌水悬浮，并将悬浮液稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，各稀释梯度依次倒DNB双层固体培养基平板，30℃培养3～4天，选择噬菌斑数为30～300的平板，接种针挑取大小基本一致，圆形，透明且边缘整齐的的单个噬菌斑到50mL DNB液体中继续培养，接着继续离心稀释倒DNB双层固体培养基平板，直至双层平板上的噬菌斑大小基本一致，呈圆形透明且边缘整齐，即可初步确认为蛭弧菌，并进行透射电镜观察及菌种鉴定；

将纯化得到的蛭弧菌进行鉴定，鉴定结果如下：

a、所筛选的蛭弧菌大小为1.03×0.45μm，杆状，端生鞭毛，鞭毛长度约为4.8μm；

b、噬菌斑的形态特征为：在DNB双层琼脂培养基30℃培养4天后，噬菌斑呈圆形，透明，凹陷，表面湿润，边缘整齐，直径1～3mm；

宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)100×油镜镜检图，如图1所示。

DNB双层固体培养基平板法分离结果图，如图2所示。

透射电镜观察结果图，如图3所示。

分子生物学鉴定结果：

接种平板噬菌斑摇床培养一瓶蛭弧菌菌液，先在6000r/min下离心10min，再将上清液在20000r/min下离心20min，用500μL的TE缓冲液富集沉淀，送于测序公司(上海生工生物工程有限公司)进行测序；其中，PCR扩增所用引物为：

63F：5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3'；

842R：5'-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3'，其中，简并碱基W表示A/T；

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃，变性1min；56℃，退火45s；72℃，延伸1min；35个循环；72℃，终延伸10min；本发明采用单克隆鉴定方法，经正向引物63F和反向引物842R扩增得到两条片段，DNAStar拼接两条序列，得到约800bp目的片段。

将16S rDNA基因测序结果序列通过NCBI BLAST在GenBank数据库中进行同源比对分析鉴定，RDP classifier搜索分类为蛭弧菌，进一步NCBI BLAST分析发现，该蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)和它们与最近的亲缘关系-Bdellovibrio sp.BDH12、Bdellovibrionales bacterium BDHSH06、uncultured bacterium clone Bms_CK248均有98％的相似度，因此，菌株(Bdellovibrio sp.)BDE-1鉴定为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)。

综述所述，本发明分离纯化得到的蛭弧菌命名为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年11月27日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60292。

所述的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：3所示(774bp)。

实施例2镁离子对蛭弧菌BDE-1蛭质体的促培养作用

(1)接种宿主并培养：取最新培养的宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisGIM 1.136)宿主种子液一瓶，在无菌操作台中酒精灯外焰下烧好瓶口，吸取3mL宿主菌种子液转入250mL瓶装NB液体培养基中，在31℃左右的恒温摇床中进行摇床培养约15h后，分装到4个100mL离心管中，放入冷冻离心机中在6000r/min转速、4℃下离心10min，然后弃上清液，每管加入1mL 5‰盐度的无菌蒸馏水悬浮，打散混合均匀后移入一个离心管中，盖上无菌盖子，套袋，袋子需无菌，然后放入4℃冰箱保存备用，得到宿主菌浓缩液；

(2)BDE-1种子液培养：取纯化后的BDE-1平板，挑取圆形透明噬菌斑接入50mL DNB液体培养基中，同时接入250μL的浓度为1mol/L MSG(谷氨酸钠)溶液，再加入1mL浓缩的宿主菌浓缩液，混合均匀，放置于摇床中，在30℃、200r/min条件下培养，每隔48h加宿主500μL，培养至第5天后，加入1mL宿主继续摇床30min后放入冰箱备用；

(3)镁离子组培养液接种：取步骤(2)中的BDE-1种子液，接种100μLBDE-1到将含0、2、10和20mmol/L镁离子的四瓶50mL DNB液体培养基中，同时加入1mL宿主菌浓缩液，250μLMSG液，置于30℃摇床中进行摇床培养；

(4)接入镁离子促培养因子：在三组摇床培养的BDE-1摇床培养满4天后，将提前配置好并用0.22μm滤膜过滤除菌的镁离子母液按计算好的量分别接入到相应培养瓶，使镁离子组的终浓度分别为2、10和20mmol/L，接好促培养因子后，将培养瓶置于摇床中继续培养24h，便于蛭质体的形成；

(5)蛭质体的分离及倒双层：将所有的50mL原培养菌液利用6000r/min离心，便于蛭质体沉降，然后将上清液倒出在无菌离心管中，取1mL无菌水将蛭质体沉淀悬浮吸打均匀，并稀释为10^-1、10^-2和10^-3三个浓度梯度，然后取500μL稀释菌液进行倒DNB双层固体培养基平板，全部倒好后用防水笔做好标记并分类，待双层平板的上层琼脂凝结后，用保鲜塑料袋包裹好，置于30℃培养箱中静置培养；

(6)结果观察：每隔12h观察一次平板，看所有平板的蛭弧菌的出斑情况，待出斑后，计噬菌斑个数并计算出各相应浓度。

结果如表1及图4所示，跟对照组相比，镁离子浓度为2mmol/L组增加了2.26lg，增幅最大，10mmol/L组增加了1.12lg，20mmol/L组增加了0.97lg。可见随着镁离子添加浓度的增加，蛭弧菌原培养菌液中的蛭质体密度呈现先上升后下降趋势，当镁离子添加中浓度为2mmol/L时，对蛭质体形成的促进作用最佳。

表1不同浓度镁离子对蛭弧菌蛭质体形成的影响(浓度以对数值表示)

注：a:平均数±标准偏差，n＝3

实施例3蛭弧菌BDE-1蛭质体的宽裂解谱的应用

(1)39株指示菌的制备

39株指示菌(表2)单菌落接种营养肉汤液体培养基中，37℃，200r/min培养8h，调节其浓度至1×10⁶CFU/mL，4℃保存，备用；

表2 39株不同的实验指示菌株

(2)蛭弧菌蛭质体的制备

将实施例1中已鉴定的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1单噬菌斑接种于50mLDNB液体培养基，30℃，2000r/min，培养3天，培养其浓度至1×10⁸PFU/mL；6000r/min，4℃，10min离心蛭弧菌培养液，富集沉淀(蛭质体)为细菌裂解实验备用，4℃保存，备用(浓缩制备的混合液的蛭弧菌浓度为6.5×10¹³PFU/mL，蛭质体的蛭弧菌浓度为3.8×10¹⁰PFU/mL)；

(3)(蛭质体)裂解实验

裂解实验：取步骤(1)制备得到的指示菌和步骤(2)得到的蛭质体各500μL一同与3mL DNB上层培养基混合振荡均匀，平铺于已提前倒好的DNB下层培养基基上，待DNB上层培养基凝结后，在30℃培养3-4天，查看各平板是否能出现噬菌斑，并记录；

结果分析：

实验采用该株蛭弧菌混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)菌液作为对照，以便检验蛭质体相对于混合体的裂解能力是否会出现减弱的可能性。蛭质体裂解实验结果如表3所示，39株不同来源的致病菌作为本实验的指示菌，蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1蛭质体和混合体裂解能力仍保持一致，对39株指示菌的裂解率达100％，这就说明蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1的蛭质体仍保持着同混合体几乎相同强度的裂解能力，并未出现裂解能力减弱的情况。

因此，本发明中，蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1蛭质体裂解谱较为广泛，既能抑制可引发人肠炎的弧菌如含有tdh毒素基因的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，又可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等。

表3蛭质体对39株不同来源致病指示菌裂解情况

注：+表示该蛭弧菌蛭质体能够裂解对应细菌

实施例4蛭弧菌BDE-1蛭质体的保质期研究

(1)蛭弧菌蛭质体的制备：见实施例3中步骤(2)；对照组不添加任何促培养因子。

(2)将该株蛭弧菌培养的对照组和高密度蛭质体组置于梯度温度下进行加速试验；

(3)定期取样，检测混合液和蛭质体的蛭弧菌的浓度；

(4)运用阿伦尼乌斯方程及步骤(3)记录的数据计算出对照组和高密度蛭质体组的保质期，通过比对保质期来确定高密度蛭质体组保质期是否更长久；

步骤(2)中在相同条件下培养两瓶混合液，具体培养方法见实施例2，其中一瓶加入最佳浓度的的蛭质体促培养因子——镁离子，培养好后，该瓶经6000r/min离心后的沉淀即为蛭质体；

步骤(2)中浓缩制备的混合液的蛭弧菌浓度为6.5×10¹³PFU/mL，蛭质体的蛭弧菌浓度为3.8×10¹⁰PFU/mL；

步骤(3)中所述的梯度温度优选为25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃；

将步骤(2)中制备好的蛭弧菌混合液3mL和蛭质体3mL分别装入4mL的无菌离心管中，密封，然后置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下进行恒温加速实验。

步骤(2)中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；

步骤(3)中所述的定期取样的检测间隔时间优选如表4所示。

表4不同的温度下取样检测间隔时间及取样次数

温度	持续时间/取样间隔时间	总共取样次数
			25℃	0～72h/12h	6
37℃	0～48h/8h	6
			45℃	0～24h/4h	6
55℃	0～8h/40min	12
			65℃	0～2h/20min	6
75℃	0～1h/10min	6
			85℃	0～30min/5min	6
95℃	0～10min/1min	10

步骤(3)中所述的对照组和高密度蛭质体组中蛭弧菌的浓度优选通过DNB双层固体培养基平板检测法进行检测；

步骤(3)中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程(Arrhenius formula)的指数定律k＝Ae^-E/RT，其对数形式为：lgk＝-E/2.303RT+lgA；

其中k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌的初始浓度为C₀，所测的蛭弧菌浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性(C_r＝C/C0)；以lgC_r对时间(t)进行回归分析，得出各温度下蛭弧菌的失活速度常数(k)，将lgk对1/T×10³进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，求出该种蛭弧菌混合液和蛭质体在不同温度(4℃和10℃)下的保质期(见表5及图5)。

表5不同温度下对照组和高密度蛭质体组的保质期

不同处理方式的蛭弧菌	4℃下保质期/d	10℃下保质期/d
			对照组	34.565	22.488
高密度蛭质体组	67.225	38.298

所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1，通过使用研究保质期的经典恒温加速试验，对蛭弧菌BDE-1的高密度蛭质体组和对照组进行保质期研究，以确定该菌株蛭质体相较于对照组而言保质期延长的有效时段，实现了通过该方法达到提高蛭弧菌BDE-1保质期的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 63F

<400> 1

caggcctaac acatgcaagt c 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 842R

<400> 2

cgwcactgaa ggggtcaa 18

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDE-1的16S rDNA的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (760)..(760)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 3

gtggcgcacg ggtgagtaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcggga 60

aaccggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 120

ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgttac attagcttgt tggtggggta acggcctacc 180

aaggctacga tgtataactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg 240

tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc 300

agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 360

ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggcatac 420

tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 480

aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaatc tcggggctca accccgaaac 540

tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 600

taaaatccct agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 660

gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720

ctaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgccccccn tccagtgacc gaaa 774

Claims

1.镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用，其特征在于，所述的镁离子的使用终浓度为2mmol/L；所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1，于2017年11月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60292。

2.一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，其特征在于通过以下方法制备得：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于20～35℃、150～300r/min培养36～48h，再次添加宿主菌，并加入镁离子，继续培养20～28h，培养液经4℃、6000～8000r/min离心10～15min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀使用质量体积比10～30‰盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度至10¹⁰PFU/mL，即是海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDE-1，于2017年11月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60292。