CN114099657B - 一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于减毒活疫苗技术领域，具体涉及一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用。该疫苗为将溶藻弧菌置于高浓度Mg2+环境中培养制得，无需再进一步进行灭活操作，直接对鱼类、虾类、蟹类进行免疫后，通过促进TCA循环，提高机体内的免疫基因的表达，进一步提高机体的免疫反应，抵抗溶藻弧菌对机体的侵害，显著提高生物的生存率；并且，本发明方法条件、制备步骤简单，非常适用于大规模产业化生产。

Description

一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于减毒活疫苗技术领域。更具体地，涉及一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为兼性厌氧菌，对营养要求不高，嗜盐，在17～35℃的适宜温度即可以生长繁殖，广泛分布于海水及河口中，数量居海水中各种弧菌之首。溶藻弧菌对海水鱼、虾及蟹类类的致病过程包括粘附、侵染、定居和繁殖，在海水鱼生长过程中进行侵染，对机体造成细胞、组织损伤，其代谢产物可以破坏机体局部或全身的正常代谢或机能，导致疾病的产生，一直被认为是许多海水鱼、虾及蟹类的重要致病菌，已经严重影响了水产养殖业的发展。
为了减少溶藻弧菌造成的病害，传统防治溶藻弧菌感染的方法主要有抗生素治疗、减毒或灭活疫苗、基因工程疫苗等。如中国专利申请CN103463645A公开了一种鱼类溶藻弧菌抗独特性抗体基因工程疫苗，该疫苗通过基因工程克隆出抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性；但是该方法需要采用基因工程的复杂方法，并且耗时耗力，成本较高。中国专利申请CN102296044A公开了一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，可以将其作为疫苗用于防治养殖鱼类中的溶藻弧菌病中；但是该方法采用的是较为特殊的野生低毒性溶藻弧菌，是偶然在自然环境中获取的，可遇不可求，较难实现大规模产业化生产，不利于实际情况对溶藻弧菌病害的防控与治疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有基因工程技术复杂、耗时耗力且成本高；野生减毒突变株数量稀少且无法大规模生产和产业化应用的缺陷和不足，提供一种溶藻弧菌减毒活疫苗。
本发明的目的是提供所述溶藻弧菌减毒活疫苗的制备方法。
本发明另一目的是提供所述溶藻弧菌减毒活疫苗的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种溶藻弧菌减毒活疫苗的制备方法，将溶藻弧菌置于Mg2+浓度为100～400mM的环境中进行培养。
优选地，将溶藻弧菌置于Mg2+浓度为200～400mM的环境中进行培养。更优选地，将溶藻弧菌置于Mg2+浓度为200mM的环境中进行培养，在较低的Mg2+浓度条件下即可培养得到溶藻弧菌减毒活疫苗。
进一步地，所述Mg2+来自可溶性镁盐，所述可溶性镁盐为MgCl2或MgSO4。
优选地，具体的培养方法为：将溶藻弧菌ATCC33787单克隆接种于Yeast培养基中，并置于30℃摇床中200rpm震荡培养16小时，1:50转接于含有100～400mM MgCl2的Yeast培养基中，培养至OD600＝0.6，收集菌体待用。
另外的，本发明还提供了一种溶藻弧菌减毒活疫苗，由所述制备方法制备得到。
进一步地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的使用剂量为2～6×105CFU。
优选地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的剂量为2～4×105CFU。
另外的，本发明还提供了所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备防治溶藻弧菌病害制剂中的应用。
进一步地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备防治鱼类、虾类、蟹类溶藻弧菌病害制剂中的应用。其中的鱼类、虾类、蟹类均为海洋生物。
优选地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备防治鱼类溶藻弧菌病害制剂中的应用。
更进一步地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗通过促进TCA循环来提高免疫水平，进而防治鱼类溶藻弧菌病害。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种溶藻弧菌减毒活疫苗，该疫苗为将溶藻弧菌置于高浓度Mg2+环境中培养制得，无需再进一步进行灭活操作，直接对鱼类、虾类、蟹类进行免疫后，通过促进TCA循环，提高机体内的免疫基因的表达，进一步提高机体的免疫反应，抵抗溶藻弧菌对机体的侵害，显著提高生物的生存率；并且，本发明方法条件、制备步骤简单，非常适用于大规模产业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中溶藻弧菌ATCC33787在含有不同浓度MgCl2的培养基中的生长曲线。
图2为本发明实施例1中不同MgCl2浓度培养的溶藻弧菌感染的斑马鱼存活率统计图。
图3为本发明实施例1中200mM MgCl2培养的溶藻弧菌不同菌数感染后斑马鱼的存活率统计图。
图4为本发明实施例1中200mM MgCl2培养的溶藻弧菌免疫后斑马鱼的存活率统计图。
图5为本发明实施例2中TCA循环对疫苗效力和感染后存活的影响数据图；其中，图5A为TCA循环和丙酮酸代谢关键酶活性测定结果图，图5B为抑制剂丙二酸钠阻断TCA循环后斑马鱼的存活率统计图。
图6为本发明实施例3中减毒活疫苗增强斑马鱼先天性免疫反应的数据图；其中，图6A为荧光定量PCR(qRT-PCR)检测斑马鱼接种疫苗后免疫基因的转录水平统计图，图6B为qRT-PCR检测斑马鱼存活组和死亡组免疫基因的转录水平统计图，图6C为qRT-PCR检测斑马鱼注射富马酸免疫基因的转录水平统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
Yeast培养基：称取5g酵母粉、30g NaCl，加900mL去离子水溶解，用5M NaOH调pH为7.0，定容至1L，121℃高压灭菌20min；
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 MgCl2对溶藻弧菌表型的影响
1、溶藻弧菌ATCC33787在含有不同浓度MgCl2的培养基中的生长情况测定
将Yeast培养基培养的溶藻弧菌ATCC33787过夜饱和菌(30℃摇床中200rpm震荡培养16h)1:50转接于含有0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200mM MgCl2的Yeast培养基中，在不同时间梯度下，每隔2h测定OD600nm，连续记录比较不同MgCl2浓度下与不含MgCl2条件下的OD600nm，并标记显著性。
结果如图1所示，在不同MgCl2浓度条件下，溶藻弧菌生长速度不同，尤其是在前四个小时；统计数据可见，生长速率按从快到慢的浓度依次为12.5mM≥50mM>3.125mM>0.78mM>0mM>200mM MgCl2组。
2、不同MgCl2浓度培养的溶藻弧菌感染斑马鱼存活率
将培养在浓度梯度MgCl2培养基中的溶藻弧菌培养至对数生长期后，8000rpm离心3分钟收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次，以去除残留培养基，并用生理盐水将细菌浓度调至OD600＝0.2；将OD600＝0.2菌液采用尾部肌肉注射攻毒斑马鱼，剂量为5μL/条，观察并记录鱼死亡情况。结果参见图2。
由图可见，随着MgCl2浓度(0、0.78、3.125、12.5、25、50、200mM MgCl2)的升高，培养在不同浓度MgCl2培养基的溶藻弧菌ATCC33787对斑马鱼的毒力逐渐降低，MgCl2为200mM培养的溶藻弧菌感染的斑马鱼存活率与对照组相近。
3、在200mM MgCl2中培养的不同数量溶藻弧菌的斑马鱼存活率
用200mM MgCl2条件培养的不同数量溶藻弧菌(2×105、4×105、6×105、8×105、10×105、12×105CFU)感染斑马鱼后，斑马鱼的存活率参见图3。
由图可见，斑马鱼的存活率随溶藻弧菌菌数的减少而升高。其中，当感染剂量为2×105CFU细菌时，斑马鱼存活率为100％。
4、高镁浓度培养的溶藻弧菌免疫后斑马鱼生存率
用2×105CFU溶藻弧菌(在含200mM MgCl2的Yeast培养基或生理盐水中培养后)免疫斑马鱼，然后注射全致死剂量5×106CFU的溶藻弧菌(未经过高浓度镁处理)，作为免疫组；以3％NaCl溶液免疫斑马鱼，然后注射全致死剂量5×106CFU的溶藻弧菌(未经过高浓度镁处理)，作为对照组，结果如图4。
由图可见，对照组斑马鱼生存率为0％，而免疫组生存率高达75％；上述结果表明，200mM MgCl2培养的溶藻弧菌ATCC33787可作为候选的抗溶藻弧菌感染的减毒活疫苗。
实施例2 TCA循环对疫苗效力和感染后存活的影响
实验方法：将实验分成四组，分别为：对照组、存活组、死亡组和免疫组；将半数致死量的溶藻弧菌(2.5×106CFU，未经过高浓度镁处理)攻毒斑马鱼后，3天后存活下来的作为存活组，3天内死亡的作为死亡组，以生理盐水注射的斑马鱼作为对照组，以注射经200mMMgCl2培养的溶藻弧菌免疫后，再注射全致死剂量(5×106CFU)的溶藻弧菌(未经过高浓度镁处理)作为免疫组。每一组都分别取3条斑马鱼(重量约为200mg)的内脏团混合在一起，按质量与体积比1：15(mg:μL)磷酸盐缓冲液(PBS)，用匀浆机充分匀浆后，12000rpm、4℃、离心10min后，将上清移至新的EP管中；采用常规蛋白浓度定量试剂盒测定蛋白浓度，作为斑马鱼样本，后面统一取200μg进行酶活测定。
酶活测定：配制PDH和a-KGDH的反应混合液：取1mM噻唑蓝(MTT)0.3mL，H2O 0.7mL，10mM MgCl2 1mL、65mM吩嗪硫酸甲酯(PMS)1mL、2mM三苯基溴化膦(TPP)1mL、50mM丙酮酸/a-酮戊二酸1mL、500mM磷酸钾缓冲液1mL，共6mL混匀。SDH和MDH的反应混合液：1mM MTT0.3mL，H2O 0.7mL，10mM MgCl2 1mL、20mM琥珀酸/苹果酸1mL、500mM磷酸钾缓冲液1mL，65mMPMS 2mL，共6mL混匀。
取上述酶反应混合液120μL与80μL不同浓度的MTT混合，置于96孔酶标板中孵育，使MTT终浓度为25、50、75、100、125、150、175、200μM，混匀后测OD566；以MTT浓度为横坐标，OD566为纵坐标绘制标准曲线。取上述酶反应混合液120μL与60μL(PDH和a-KGDH)或者20μL(SDH和MDH)于透明96孔板中，加入斑马鱼样本，用ddH2O补足200μL，混匀后30℃避光孵育10min。然后使用酶标仪检测OD566的读值及反应时间。根据标准曲线计算出各自的酶活以及比活力(酶活/蛋白样品质量)。
结果参见图5，由图5A可见，TCA循环和丙酮酸代谢中丙酮酸脱氢酶(PDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的酶活性在免疫组和存活组中均显著升高，而在死亡组中显著下降；这个结果表明了TCA循环在防止细菌感染方面起着至关重要的作用。
当将TCA循环中关键酶之一琥珀酸脱氢酶所对应的抑制剂丙二酸钠注射斑马鱼后，观察斑马鱼感染溶藻弧菌后的生存率，结果参见图5B；随着丙二酸钠剂量的提高，斑马鱼的存活率显著降低。
上述结果表明，受到溶藻弧菌感染的斑马鱼存活需提高TCA循环，并且，TCA循环的提高是减毒活疫苗提供有效抗细菌感染能力的重要原因之一。
实施例3减毒活疫苗增强斑马鱼先天性免疫反应
按细菌培养步骤培养，将实验分为：对照组、免疫组、存活组、死亡组、外源添加浓度梯度富马酸(0、50、100μg)组。以只经生理盐水注射的斑马鱼作为对照组；以经200mMMgCl2培养的溶藻弧菌免疫后，再注射全致死剂量(5×106CFU)的溶藻弧菌作为免疫组(图6A)；将半数致死量的溶藻弧菌(2.5×106CFU)攻毒斑马鱼后，3天后存活下来的作为存活组，3天内死亡的作为死亡组，腹腔只注射生理盐水作为对照组(图6B)；另外以腹腔注射50μg和100μg富马酸溶液作为外源添加浓度梯度富马酸组(图6C)。
取出所有组斑马鱼的脾脏研磨，8000rpm离心3min收菌，用同盐度灭菌水洗菌三次，并调OD600＝1.0，取1mL菌液，8000rpm离心3min收集菌体，弃上清后直接加入1mLTrizol，盖紧管盖涡旋震荡或吹打混匀至菌体完全溶解于Trizol中，然后进行常规RNA提取和逆转录反应，最终得到cDNA。
采用qRT-PCR测量10个先天性免疫基因il1β、il4、il8、il21、tnf-α、c3b、tlr1、tlr3、nf-κb和lysozyme的表达量，具体10个先天性免疫基因和内参基因(β-actin)如表1所示。
表1先天性免疫基因引物
Figure BDA0003338329680000061
Figure BDA0003338329680000071
qRT-PCR反应体系(10μL)：5μL
Figure BDA0003338329680000072
Premix Ex Taq II(2×)，PCR上下游引物各0.2μL，0.1μL cDNA模板，4.5μL RNase-free H2O；反应程序：95℃30sec预变性；95℃ 5sec，58℃ 30sec，75℃荧光信号检测，共40个循环。结果参见图6。
由图6A可见，与生理盐水对照组相比，免疫组的il1β、il8和lysozyme表达量显著升高，其他基因表达量基本不变。
由图6B可见，il1β、il8、il21、tnf-α、tlr1、nf-κb和lysozyme的表达量在存活组中均显著升高，而il1β、il4、il8、tlr1、tlr3和nf-κb在死亡组中表达量显著降低。
经过比较发现，免疫组和存活组中il1β、il8和lysozyme表达量均显著升高，其中il1β表达量在死亡组中显著降低。
研究表明TCA循环中的苹果酸可促进先天性免疫基因的表达，从而提高斑马鱼抗溶藻弧菌感染的能力。因此推测升高的TCA 循环与先天免疫基因的表达升高有关。为了证实此推测，将TCA循环中的重要中间产物之一富马酸进行实验，检测其是否可以促进免疫组和存活组三个共同上调基因il1β、il8和lysozyme的表达量。由图6C可见，外源富马酸以剂量依赖性方式增加il1β、il8、il21和lysozyme的表达量，且还能促进nf-κb的表达。说明了富马酸确实可以促进斑马鱼先天性免疫基因的表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种溶藻弧菌减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，将溶藻弧菌置于Mg2+浓度为200mM的环境中进行培养，其中，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌ATCC33787。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Mg2+来自可溶性镁盐，所述可溶性镁盐为MgCl2或MgSO4。
3.一种溶藻弧菌减毒活疫苗，其特征在于，由权利要求1或2所述制备方法制备得到。
4.根据权利要求3所述溶藻弧菌减毒活疫苗，其特征在于，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的剂量为2~6 × 105 CFU。
5.根据权利要求4所述溶藻弧菌减毒活疫苗，其特征在于，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的剂量为2~4 × 105 CFU 。
6.权利要求3~5任一所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备预防溶藻弧菌病害制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备预防鱼类、虾类、蟹类溶藻弧菌病害制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备预防鱼类溶藻弧菌病害制剂中的应用。
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"Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus";S. ULITZUR;《Arch. Microbiol》;19750828;第104卷(第3期);第285-288页 *
"溶藻弧菌生物被膜形成能力及特性分析";贾玲华等;《生物工程》;20150507;第36卷(第20期);第201-205页 *
"致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究";姚刚等;《水产科学》;20120514;第31卷(第2期);第73-78页 *

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