CN103463645A - 一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因，通过基因重组构建scFv及原核表达载体PET32a-AL，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。scFv基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)是引起牙鲆、鳗鲡等许多名贵经济鱼类致病的病菌之一，严重威胁着我国水产养殖业的发展。可给渔业和养殖业带来巨大的经济损失。传统防治溶藻弧菌感染的方法主要采用抗生素和减毒、灭活疫苗。抗生素的长期使用可使鱼类产生耐药性，而且残留的抗生素可通过食物链对人类造成危害。减毒疫苗的安全性难以掌握；而用物理、化学方法制备的灭活疫苗，抗原活性可能遭到破坏，且残存的杂质还可能引起鱼的炎症反应而死亡。
针对引起细菌性鱼病的溶藻弧菌抗独特型抗体具有良好的免疫原性和安全性，而由基因工程构建的抗独特型抗体可变区的小分子单链抗体一不但具备有分子量小，穿透力强，易于大量生产和降低成本等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗体分子小，免疫原性低，组织穿透力强，使用方便，有效，可行，可大规模生产的鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因，通过基因重组构建scFv及原核表达载体PET32a-AL，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。scFv基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其基因序列和氨基酸序列如下：
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A E V K
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A Y M Q L S S L T S D D S A V
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Y F C A R G R F P H Y Y A M D
---------------CDRH3----------
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--
375 ggcggcggctccggtggtggtggatccggtggtggtggttct gac
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---------------CDRL1----
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---------CDRL3-----------
730 accaagctggagctgaaacgt750
T K L E L K R
其中，划线部分是互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)，斜体是特征性的半胱氨酸，方框内为连接肽序列。
鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，具体的步骤如下：
1)用重组PCR的方法，将已获得的VL和VH基因以连接肽linker(Gly4Ser)3连接，设计连接肽linker的引物，斜体的为BamH I酶切位点，在反应体系中分别以回收的VL和VH基因为模板，加入LBark和VHFor、LFor和VLBack引物，参数为：94℃3min，94℃30s，52℃60s，72℃60s，30次循环，进行PCR扩增，10g/L琼脂糖凝胶电泳并回收后的PCR产物用BamH I酶切后用T4连接酶连接，连接产物与PMD18-T vector连接，转化感受态细菌E.coli.DH-5a，筛选阳性克隆提取质粒，筛选后的质粒命名为PET32a-AL，对PET32a-AL进行PCR鉴定，通用引物T7进行测序；
2)将PET32a-AL转化BL21，挑取阳性克隆IPTG诱导表达，表达产物在破壁缓冲液中冰浴1h和超声破碎菌体4次，变性液：20mmolTris-HCL，pH7.5，10mmol EDTA，10g/L TritonX-100，复性液：2.5mmolTris-HCL，pH7.5，0.01mol NaCL，10g/L甘油，0.1mol/L脲，离心收集上清液透析后纯化。
说明书附图
图1为本申请VH基因的PCR产物带图，其中1：DL-2000DNAmarker；2：VH gene。
图2为本申请VL基因的PCR产物带图，其中1：DL-2000DNAmarker；2：VL gene。
图3为本申请pET32a-AL的表达和纯化图，其中1：proteinmarker；2：uninduced totlal bactena protcins；3：pET32a(+)-vector；4：Lndusion bodies；5：supematant after dissolving indusion bodies；6：purfied samples。
图4为本申请pET32a-AL的Western blotting结果图，其中1：protein marker；2：purfied samples。
图5为本申请不同时间的免疫鼠血清效价比较图。
图6为本申请四种蛋白免疫小鼠后的抗体效价比较图。
图7为本申请单链抗体免疫原性的免疫组化分析图。其中a：serumlgG agaime vibio(x200)；b：serium lgC against scFv(x1600)。
图8为本申请基因序列和氨基酸序列图。
具体实施方式
针对引起细菌性鱼病的溶藻弧菌抗独特型抗体具有良好的免疫原性和安全性，而由基因工程构建的抗独特型抗体可变区的小分子单链抗体(scFv)不但具备抗独特型抗体的良好免疫原性和安全性，而且还具有分子量小，穿透力强，易于大量生产和降低成本等优点。为此，我们应用RT-PCR技术从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F4中，扩增该单克隆抗体的重链可变区基因(VH)和轻链可变区(VL)基因片段，进行克隆和序列测定，通过基因重组构建scFv昀表达载体pEr132a-AL，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达该抗体scFv的融合蛋白，并对表达的融合蛋白免疫Ba1b/c小鼠进行免疫原性鉴定。
以下结合具体实施例对本发明做进一步描述：
一、基因VH和VL的RT-PCR扩增
1、材料和方法
1.1材料分泌抗溶藻弧菌独特型mAb杂交瘤细胞株2F4为本室建立；RPMI1640为Gibco BRL公司产品；RNA抽提试剂TRIzolTMReagents购自Life technology公司；RT-PCR试剂盒为美国invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自上海华舜生物工程公司；PMD18-T vector为Takara产品。
1.2方法
1.2.1抗溶藻弧菌独特型mAbVH和VL基因的扩增收获6×107分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体杂交瘤细胞，用TRIZOL，氯仿和异丙醇抽提RNA后以无水乙醇沉淀，取10μLRNA为模板，以OligodT为随机引物，反转录合成cDNA。根据Kabat库设计PCR引物。引物的序列如下：
VH Back 为：
5′-CGGCCGAGGTGC(A)AGCTGC(A，G)A(T)GC(G)AGT
CTGG(A)GG-3′；
VH For为：5′-TCCACCTGTCGACACGGTGACTGAGGTTCC-3′；
VL Back为：5′-GACATCCAGATGACACAGAC-3′；
VLFor为：5′-ACGTTTC(TK)AG(T)C(T)TC CAG(A)
CTT G(T)G-3′。
在50μL反应体系中，加入VHBack和VHFor引物进行PCR，反应参数为：94℃5min，94℃30s，56℃60s，72℃60s，共30次循环。在50μL反应体系中，加入VL Back和VL For引物进行PCR，反应参数为：94℃5min，94℃30s，58℃60s，72℃60s，共30次循环；PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.2扩增产物的鉴定和序列测定将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物与PMD18-T载体连接，并转化感受态细菌E.coli.DH-5α，在含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。挑取单个菌落扩大培养后，小量提取质粒DNA，并以PCR法进行鉴定。采用双脱氧终止法进行序列测定，测序引物为T载体上M13-T7固有引物。
二、基因VH和VL的扩增产物鉴定和序列分析
1、RT-PCR扩增产物的鉴定
用RT-PCR扩增抗溶藻弧菌独特型mAbVH和VL基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，VH基因的PCR产物出现大小为370bp左右的带(见图1)；VL基因的PCR产物出现大小为350bp左右的带(见图2)，二者均同预期结果相吻合。
2、基因VH和VL的克隆及序列分析
2.1VH基因的克隆及序列分析将PCR产物经纯化后，克隆入T-Vector中进行引物测序，将序列输入计算机分析显示，该序列基因的长度为369bp，编码123个氨基酸，具有小鼠IgG VH基因的特征；即含有4个FR、3个CDR和两个抗体特征性的半胱氨酸。
基因VH的核苷酸序列为：
1 CG GCC GAG GTG AAG
15 CTG AAG GAG TCT GGG GCT GAG CTG GTA AGG CCT GGG ACT TCA GTG
60 AAG GTG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCC TTT ACT AAT TAC TTG
--------------CDR1------------
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基因VH的氨基酸序列为：
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S S L T S D D S A V Y F C A R G R F P H Y
---------------CDR3---
Y A M D Y W G Q G T S V T V S T G G
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2.2VL基因的克隆及序列分析将PCR产物经纯化后，克隆入T-Vector中测序，将序列输入计算机分析显示，该序列基因的长度为339bp，编码113个氨基酸，具有小鼠IgGVL基因的特征，即含有4个FR、3个CDR和两个抗体特征性的半胱氨酸。
基因VL的核苷酸序列为：
I GAC ATC CAG
10 ATG ACA CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA
55 GCC TCC ATC TCT TGC GGA TCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT
-------------------------CDR1---------
100 GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT
---------------------
145 CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC
-------------CDR2---------
190 CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC
235 AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC
280 TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG
---------------CDR3---------------
325 CTG GAG CTG AAA CGT 339
基因VL的氨基酸序列为：
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A S I S C G S S Q S L V H S N G N T
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Y L H W Y L Q K P G Q S P K L L I Y
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三、溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定疫原性鉴定
1、材料与方法
1.1菌株及质粒溶藻弧菌抗独特型scFv杂交瘤细胞株2F4为我室建立。大肠杆菌BL21、溶藻弧菌、克隆载体pUC19和质粒pET-32a(+)为我室保存。PMD18-T vector为Takara产品。
1.2工具酶与试剂RPMI1640为Gibco BRL公司产品。RNA抽提试剂TRIzor Reagents购自Life technology公司，RT-PCR kit为美国invitrogen公司产品。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。限制性内切酶EcoR I、BamH I和HindIII为Takara产品。HRP-羊抗小鼠IgG和HRP-羊抗兔IgG购自华美生物工程公司。IPTG、DAB和BSA购自Sigma公司。
1.3引物合成依据Huston等人设计连接肽Linke(Gly4Ser)3的引物(斜体的为BamH I酶切位点)如下：
Lback5′-TCGACAGGTGGAGGCGGCGGCGCCTCCGGTGGTGGT GGff1′CC一3。
LFor5′-Cff1′CTGGATGTCAGAACCACCACCACCGGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCC-3′，由北京三博生物有限公司合成。
1.4实验动物6～7周龄Balb/c小鼠，雌性，体质量18～20g，购自第四军医大学动物实验中心。
1.5溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体scFv基因构建及表达
1.5.1scFv基因构建及序列测定用重组PCR的方法，将已获得的VH和VL基因以Linker连接，依据Huston等人设计连接肽Linker(Gly4Ser)3的引物(斜体的为Bam HI酶切位点)：在反应体系中，分别以回收的VH和VL基因为模板，加入LBack和VHFor、LFor和VLBack引物，参数设为：94℃3min，94℃30s，52℃60s，72℃60s，30次循环，进行PCR扩增。10g/L琼脂糖凝胶电泳并回收后的PCR产物用BamH I酶切后用T4连接酶连接。连接产物与PMD18-T vector连接，转化感受态细菌E.coli DH-5a，筛选阳性克隆提取质粒行PCR鉴定。通用引物T7进行测序。
1.5.2重组子的诱导表达和纯化将scFv及载体pEI32a(+)分别用同一对酶(EcoR I相HindIII)进行酶切，连接转化E.coli DH-5a，筛选阳性克隆扩大培养后提取质粒，并以PCR和酶切鉴定。筛选后的质粒命名为pEI32a-AL。将pEI32a-AL转化BL21，挑取阳性克隆IPTG诱导表达，表达产物在破璧缓冲液中冰浴1h和超声破碎菌体4次(变性液：20mmol Tris-HCL(pH 7.5)，10mmol EDTA，10g/L TritonX-100。复性液：2.5mmol Tris-HCL(pH 7.5)，0.01mol NaCL，10g/L甘油，O.1mol/L脲)，离心收集上清液透析后纯化。
1.6溶藻弧茵抗独特型单克隆抗体scFv的免疫原性鉴定
1.6.1表达产物的SDS-PAGE和Westem blotting分析包涵体和纯化产物经透析和浓缩后用120g/L聚丙烯酰胺电泳，考马斯亮蓝染色后用激光扫描仪分析电泳条带的蛋白含量。同样的SDS-PAGE凝胶经电转移把蛋白条带转移到PVDF膜上用于Westemblotting。50g/L脱脂奶粉封闭PVDF膜，37℃1h；PBST洗涤3次，加入1∶200兔抗菌多抗，37℃1h；PBST洗涤3次，加入1∶1000HRP-羊抗免IgG，37℃1h；DAB-H2O2底物显色。
1.6.2细菌、亲本抗体、包涵体和纯化蛋白免疫Balb/c小鼠细菌、亲本抗体、包涵体和纯化蛋白分别与弗氏完全佐剂混合，以PBS免疫小鼠作为对照，取1mL腹腔注射初次免疫Balb/c小鼠，2周后取尾静脉血20止，再次腹腔注射0.5mL加强免疫，分别在4、6和8周时取尾静脉血201uL待测。
1.6.3单链抗体免疫原性的ELISA鉴定溶藻弧菌以1×106/mL包被酶标板4℃孵育过夜，弃去包被液，PBST洗5min，3次后拍干，分别取经单链抗体纯化产物免疫2、4、6、8周后的小鼠血清以1∶1000稀释加入，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育th，洗涤后OPD显色。同时设空白(用PBS代替一抗)和阴性(正常小鼠血清)对照。酶联检测仪上测的OD430nm值。
1.6.4细菌涂片免疫组织化学法鉴定将溶藻弧菌活化后离心弃上清液，加入40g/L多聚甲醛4℃过夜；离心后弃上清液，生理盐水洗涤2次后弃上清液，加入无菌生理盐水，比浊记数后即可用于涂片。细菌涂片经40g/L多聚甲醛固定30min。用甲醇双氧水室温作用30min以封闭内源性过氯化物酶。0.01mL/L PBS(pH 7.3)洗3次后0.1mmL/L正常羊血清室温孵育30min封闭非特异反应。甩去正常羊血清，滴加1∶1000稀释的小鼠免疫血清于4℃过夜。PBS洗3次后滴加1∶200的HRP-羊抗鼠1gG抗体室温孵育2h，DAB显色。采用OLYMPUS BH-2光学显微镜(OLYMPUS公司)观察结果并摄片。同时设阳性(用溶藻弧菌免疫鼠血清代替一抗)，空白(用PBS代替一抗)和阴性(正常小鼠血清)对照。
2结果
2.1溶藻弧菌抗独特型抗体scFv基因的克隆及序列测定
利用已获得特异扩增的溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体VH和VL基因(GenBank accessionNo：DQ011530和DQ011531)，用重组PCR的方法，将VH和VL基因以Linker连接，所获单链抗体基因长度为747bp，用DNA测序仪进行测序，结果VH、Linker和VL的编码区序列均正确，确定溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因改建成功。
1 cg gccgaggtgaag
A E V K
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465 gatcaagcctccatctcttgcggatctagtcagagccttgtacac
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溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体ScFv的核苷酸及其氨基酸推导序列注：划线部分是互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)，斜体是特征性的半胱氨酸，方框内为连接肽序列。
2.2scFv基因的表达
将重组质粒pErl32a-AL转化感受态菌BL21，在0.1mmol/L的IPTG终浓度诱导下表达3h，SDS-PAGE和Westem-blotting均显示在接近相对分子质量47000处有一条特异性条带(如图3、4)。经凝胶薄层扫描，细菌表达带的蛋白量占菌体总蛋白量的24％。
2.3单链抗体免疫原性的ELISA分析
ELISA检测结果显示基因工程抗体scFv免疫Balb/c小鼠后，免疫小鼠血清与可与相应抗原(溶藻弧菌)结合并具有较高的抗原亲和力。免疫小鼠在2周时已产生抗体，在4周时抗体效价达最高(如图5)，分别用四种蛋白免疫Balb/c小鼠后的免疫血清的抗体效价比较结果显示这四种蛋白的免疫原性相似(如图6)。
2.4单链抗体免疫原性的免疫组化分析
免疫组织化学检测结显示，经溶藻弧菌(如图7a)及基因工程抗体scFv(如图7b)免疫Balb/c小鼠后的免疫血清可特异性地和相应抗原(溶藻弧菌)结合，使溶藻弧菌能显示出强阳性信号，阴性对照呈免疫反应阴性。
3、讨论
抗独特型抗体具有“内影像”的作用可以模拟抗原诱导机体产生特异性抗体或细胞免疫应答，因此可以作为疫苗使用。关于抗独特型抗体疫苗的研究已有不少文献报道。针对引起细菌性鱼病的溶藻弧菌，我们已制备了溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体。通过筛选发现细胞株2F4能诱导小鼠产生抗独特型抗体的抗体，并通过动物保护试验显示，对动物的保护率可达80％以上，说明抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体2F4模拟的是溶藻弧菌的保护性表位，可以作为疫苗使用。但细胞工程制备抗独特型抗体时，必须通过收集大量的分泌抗体的杂交瘤细胞来获取，成本较高。本研究旨在利用基因工程抗体技术，对抗独特型抗体进行改造，降低疫苗成本，提高疫苗模拟抗原的相似性和抗原的穿透性，实验证实有抗独特型抗体改造而成的scFv也能够模拟抗原，且较其Fab片段有更高的亲和性。
单链抗体是指由Linker将VH、VL连接起来，使之成为既保持抗原结合区的完整、又不发生解离的抗体分子片段，具有分子量小，穿透力强，易于大量生产等优点。为了不影响Fv的空间结构和稳定性，我们选用了(Gly4Ser)3连接肽，研究表明此连接肽不影响Fv的二级结构，已成为通用Linker，广泛应用于scFv的构建。VH、VL的排列顺序有两种，即VH-Linker-VL和VL-Linker-VH，其表达产物均能折叠成具有抗原结合活性的单链抗体，但两者的表达量和亲和力可能有所不同，本申请采用了前者。
我们应用RT-PCR技术从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株中克隆了VH基因和VL基因，对其进行广泛的同源分析及结构功能预测显示，VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均含有维持抗体可变区空间结构所必须的2个特征性的半胱氨酸，并有明确的4个框架区和3个抗原互补决定区，具有小鼠IgG可变区基因的特征。VH-Linke-VL基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征。通过上述分析显示我们所获得的碱基对序列正是本疫苗所需要克隆的基因，并且ELISA结果显示此基因工程抗体scFv与原代抗体一样，可与相应抗原结合具有较高的抗原亲和力。动物免疫试验也显示出抗独特性抗体的基因工程抗体scFv与溶藻弧菌一样具有免疫原性。实验表明细胞工程生产的抗独特型抗体和基因工程抗体scFv比细菌直接免疫更具有安全性，且scFv细胞工程生产的抗独特型抗体的生产成本较低。
Claims (3)
1.一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因，用(Gly4Ser)3组成的连接肽(linker)连接VH和VL，构建VH-linker-VL形式的单链抗体scFv基因，在大肠杆菌中表达，获得鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，其基因序列和氨基酸序列如下：
1 cg gccgaggtgaag
A E V K
15 ctgaaggagtctggggctgagctggtaaggcctgggacttcagtg
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330 tactggggtcaaggaacctcagtcaccgtgtcgtcgggtggaggc
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375 ggcggcggctccggtggtggtggatccggtggtggtggttct gac
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465 gatcaagcctccatctcttgcggatctagtcagagccttgtacac
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510 agtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggc
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555 cagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttct
Q S P K L L I Y K V S N R F S
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600 ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttc
G V P D R F S G S G S G T D F
645 acactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttat
T L K I S R V E A E D L G V Y
690 ttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctggg
F C S Q S T H V P L T F G A G
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730 accaagctggagctgaaacgt750
T K L E L K R
其中，划线部分是互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)，斜体是特征性的半胱氨酸，方框内为连接肽序列。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，构建单链抗体scFv基因引物序列为：
Lback 5′-TCGACAGGTGGAGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCC-3，
LFor 5′-CATCTGGATGTCAGAACCACCACCACCGGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCC-3`。
3.实现权利要求1所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，具体的步骤如下：
1)用重组PCR的方法，将已获得的VL和VH基因以连接肽linker(Gly4Ser)3连接，设计连接肽linker的引物，斜体的为BamHI酶切位点，在反应体系中分别以回收的VL和VH基因为模板，加入LBark和VHFor、LFor和VLBack引物，参数为：94℃3min，94℃30s，52℃60s，72℃60s，30次循环，进行PCR扩增，10g/L琼脂糖凝胶电泳并回收后的PCR产物用BamH I酶切后用T4连接酶连接，连接产物与PMD18-T vector连接，转化感受态细菌E.coli.DH-5a，筛选阳性克隆提取质粒，筛选后的质粒命名为PET32a-AL，对PET32a-AL进行PCR鉴定，通用引物T7进行测序；
2)将PET32a-AL转化BL21，挑取阳性克隆IPTG诱导表达，表达产物在破壁缓冲液中冰浴1h和超声破碎菌体4次，变性液：20mmol Tris-HCL，pH7.5，10mmol EDTA，10g/L TritonX-100，复性液：2.5mmol Tris-HCL，pH7.5，0.01mol NaCL，10g/L甘油，0.1mol/L脲，离心收集上清液透析后纯化。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104531568A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-04-22 | 福建省水产研究所 | 抗河豚毒素单链抗体及其制备方法 |
| CN108601833A (zh) * | 2016-02-01 | 2018-09-28 | 伊莱利利公司 | 甲状旁腺激素-抗rankl抗体融合化合物 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955940A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-26 | 付建芳 | 抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列 |
-
2012
- 2012-06-06 CN CN201210183806XA patent/CN103463645A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955940A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-26 | 付建芳 | 抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区的基因序列 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 付建芳 等: "抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv 的构建和表达", 《中国免疫学杂志》 * |
| 付建芳: "溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104531568A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-04-22 | 福建省水产研究所 | 抗河豚毒素单链抗体及其制备方法 |
| CN108601833A (zh) * | 2016-02-01 | 2018-09-28 | 伊莱利利公司 | 甲状旁腺激素-抗rankl抗体融合化合物 |
| CN114099657A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-03-01 | 暨南大学 | 一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用 |
| CN114099657B (zh) * | 2021-11-04 | 2022-05-17 | 暨南大学 | 一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用 |
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