CN104531568A - 抗河豚毒素单链抗体及其制备方法 - Google Patents

抗河豚毒素单链抗体及其制备方法 Download PDF

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刘智禹
姜琳琳
吴靖娜
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Abstract

抗河豚毒素单链抗体及其制备方法，涉及抗河豚毒素抗体。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，保藏编号为CCTCC NO：M2014597。克隆抗河豚毒素单链抗体基因，导入载体，构建重组载体，再导入宿主细菌，构建表达抗河豚毒素单链抗体的重组工程菌；将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得。利用抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，通过RT-PCR技术，获得该抗体的重、轻链可变区序列，组装成抗河豚毒素单链抗体基因，并构建重组表达载体pET-22(b+)-scFv，进行抗河豚毒素单链抗体的表达、纯化与鉴定。

Description

抗河豚毒素单链抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗河豚毒素抗体，特别是涉及抗河豚毒素单链抗体及其制备方法。
背景技术
河豚毒素是一种钠离子通道抑制剂，通过阻止钠离子向胞外运输，破坏了细胞膜两侧电位平衡，进而抑制神经和肌肉的电脉传导。河豚毒素中毒症状表现为肌肉麻痹、无法自主呼吸，甚至窒息死亡(苏捷,姜琳琳,吴靖娜,等.动物携带河豚毒素的分子机制与生态作用[J].南方水产科学,2013,9(4):99-104.)。在我国几乎每年都有河豚毒素中毒甚至死亡的事件发生，因此研究一种能快速中和人体内误食的河豚毒素的药物显得非常重要。河豚毒素抗体可以与河豚毒素进行有效中和，从而降低河豚毒素的毒性，减缓河豚毒素对机体的损伤。但是完整抗体的相对分子质量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。对抗体基因重组，表达由抗体重链V区与轻链V区间通过人工合成的连接肽连接而成的抗体称为单链抗体(SingleChain Fragment Variable，scFV)，其相对分子质量仅为完整抗体的1/6。单链抗体相对分子质量小，容易通过血管壁，容易穿透实体瘤，是导向药物首选的载体；单链抗体无可结晶区域片段(Fragment crystallizable region,Fc)，免疫原性弱，不与非靶细胞的Fc受体结合，不易引起超敏反应和排斥反应。单链抗体可通过包涵体大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，是目前研究最多的小分子抗体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10。
本发明的第二目的在于提供抗河豚毒素单链抗体及其制备方法。
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，已于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014597。
所述抗河豚毒素单链抗体的氨基酸序列为：
所述抗河豚毒素单链抗体的基因序列为：
其中第1～438位核苷酸为抗河豚毒素单链抗体的轻链可变区基因，全长为438bp；第439～483位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp；第484～858位核苷酸为为抗河豚毒素单链抗体的重链可变区基因，全长为375bp。
所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)克隆抗河豚毒素单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗河豚毒素单链抗体的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗河豚毒素单链抗体。
在步骤1)中，所述克隆抗河豚毒素单链抗体基因的模板来自抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10；
所述克隆抗河豚毒素单链抗体基因是分别克隆抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因和抗河豚毒素单链抗体轻链可变区基因，再通过连接肽Linker将两者连接；
所述克隆抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因的引物为：
5'端引物:5'-TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCWGG-3'；
3'端引物:5'-AAG CTT CTC GAG TGM RGA GAC DGT GAC CGT GG-3'。
所述克隆抗河豚毒素单链抗体轻链可变区基因的引物为：
5'端引物::5'-ATC CAT GCC ATG GAC ATT SWG MTS ACM CAG WCT CCA-3'；
3'端引物::5'-GCC GGA TCC ACC GCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCG TTT YAT YTC CAR CTT-3″。
所述克隆抗河豚毒素单链抗体表达载体引物为：
5'端引物:5'-GAA TTC GGA CAT TGA GCT GAC ACA GTC TCC-3'；
3'端引物:5'-CTC GAG TGC GGA GAC AGT GTC ATC ACA ATG-3'；
所述载体可为pET-22b(+)质粒。
在步骤2)中，所述宿主细菌可为E.coli BL21(DE3)。
在步骤3)中，所述纯化可采用亲和层析。
本发明利用抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，通过RT-PCR技术，获得了该抗体的重、轻链可变区序列，进一步组装成抗河豚毒素单链抗体基因，并构建重组表达载体pET-22(b+)-scFv，进行抗河豚毒素单链抗体的表达、纯化与鉴定。在基因工程技术的大背景下，抗河豚毒素单链抗体的获得将有助于未来该抗体的进一步开发和应用。
附图说明
图1为抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)的PCR产物电泳图。在图1中，1为轻链可变区基因(VL)，3为重链可变区基因(VH)，2为DNA分子量标记(DNA Marker)；900、700、500、300、100为DNA分子量标记的大小。
图2为抗葡聚糖单链抗体基因的PCR产物电泳图。在图2中，1为DNA分子量标记(DNAMarker)，2为抗葡聚糖单链抗体基因；1500、900、700、500、300、100为DNA分子量标记的大小。
图3为pET22ba融合蛋白诱导表达后电泳图。在图3中，Lane2～11：转化质粒、加IPTG诱导表达，随机挑取的克隆(1#，4#，5#，7#，8#，10#克隆均出现大小正确的表达条带)；Lane 1：负对照，转化质粒、未加IPTG诱导表达。
图4为纯化后的抗河豚毒素单链抗体的电泳图。在图4中，1是蛋白分子量标记(marker),14.4，18.4，25.0，35.0，45.0，66.2，116，为蛋白质分子量大小。
图5为为抗葡聚糖单链抗体鉴定图。在图5中，横坐标为稀释度，纵坐标为OD490nm。
具体实施方式
实施例1 抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)的克隆
1)所用细胞为鼠源性抗河豚毒素抗体单克隆细胞
所用细胞为抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10。
杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α B10常规培养在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃，5％CO2培养。
2)引物设计
要扩增的抗体可变区基因序列，其可变区基因序列是未知的，故本发明使用的引物采用国际上推广的引物序列。
在VL引物的5'端加入酶切位点Nco Ⅰ:CATGCCATGG(含保护性碱基CATG)，在VH引物的3'端加入酶切位点Xho Ⅰ：CCGCTCGAG(含保护性碱基CCG)。将连接肽Linker(Gly4Ser)3设计在VL3'端和VH5'端，载体5'端加入酶切位点用EcoRI：GAATTC，3'端加入酶切位点XhoI：CTCGAG，加下划线表示。在轻链引物的3’端和重链引物的5’端设计有Linker(Gly4Ser)3的序列，引物中黑体表示，其中有21个核甘酸为互补序列，如图黑体部分表示。
扩增轻链可变区的引物为：
VL 5'端引物:5'-ATC CAT GCC ATG GAC ATT SWG MTS ACM CAG WCT CCA-3'；
VL 3'端引物:5'-GCC GGA TCC ACC GCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCG TTT YAT YTC CAR CTT-3'。
扩增重链可变区的引物为:
VH 5'端引物:5'-TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG SAG GTS MAR CTK SAG SAGTCW GG-3'；
VH 3'端引物:5'-AAG CTT CTC GAG TGM RGA GAC DGT GAC CGT GG-3'。
克隆抗河豚毒素单链抗体表达载体引物为：
5'端引物:5'-GAA TTC GGA CAT TGA GCT GAC ACA GTC TCC-3'；
3'端引物:5'-CTC GAG TGC GGA GAC AGT GTC ATC ACA ATG-3'。
3)VH和VL基因的克隆
取状态良好的杂交瘤细胞株B10，采用Trizol(购自Invitrogen公司)试剂，按照说明书上的方法提取总RNA，以总RNA为模板，以Oligo(dT)20(购自TOYOBO)为随机引物，逆转成cDNA。以Oligo(dT)20为随机引物进行逆转录方案如下：
RT-PCR反应体系：5×AMV缓冲液4.0μL；dNTP(10mmol/L)1.0μL；Oligo(dT)20随机引物(20μmol/L)2.0μL；RNase抑制剂0.5μL；总RNA 5.0μL；AMV逆转录酶1.0μL；DEPC水6.5μL；总体积20μL。
RT-PCR反应条件：50℃，60min；75℃，15min。反应产物保存-20℃备用。
以RT-PCR扩增的cDNA为模板，扩增重链和轻链可变区基因。
PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液2.5μL；dNTP(10mmol/L)0.5μL；5'端引物(20μmol/L)1.0μL；3'端(20μmol/L)1.0μL；cDNA 1.0μL；Taq聚合酶0.5μL；双蒸水18.5μL；总体积25.0μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察分析结果(参见图1)，并用胶纯化回收试剂盒(OMEGA)回收VH和VL基因产物。
实施例2 抗河豚毒素单链抗体基因的克隆及其表达载体的构建
以回收的VH和VL基因产物混合液为模板，通过VH5'和VL3'引物扩增加入连接肽Linker片段的抗河豚毒素单链抗体基因(VL-Linker-VH)，再通过表达载体引物扩增抗河豚毒素单链抗体基因(参见图2)，其插入表达载体序列为：
其中第1～438位核苷酸为抗河豚毒素单链抗体的轻链可变区基因，全长为438bp；第439～483位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp；第484～858位核苷酸为为抗河豚毒素单链抗体的重链可变区基因，全长为375bp。
PCR应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL；dNTP(10mmol/L)0.5μL；VH5'引物(20μmol/L)1.0μL；VL3'引物(20μmol/L)1.0μL；VH和VL基因产物各1μL；Taq聚合酶0.5μL；双蒸水18.5μL；总体积25.0μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30个循环，72℃延伸10min。
把上述引物改为表达载体引物，就可以进行对序列进行亚克隆，获得插入表达载体序列。
抗河豚毒素单链抗体基因产物及pET-22b(+)质粒(购自Novagen公司)分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I(NEB)进行酶切，胶回收酶切后的产物。在T4 DNA连接酶的催化下，将抗河豚毒素单链抗体基因克隆至质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pET-22b(+)-scFv，转化E.coli BL21(DE3)，筛选阳性克隆并送上海英俊生物技术有限公司测序。
实施例3 抗河豚毒素单链抗体基因的原核表达和纯化
挑选测序正确的含有pET-22b(+)-scFv重组质粒的E.coli BL21(DE3)单菌落，37℃振荡培养过夜，按1∶100稀释到LB培养液中，振荡培养至OD600值约0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导表达4h，收集菌体进行SDS-PAGE电泳，经过染色、脱色，发现E.coliBL21(DE3)的表达产物在28kD处有明显的条带，与预期的目的蛋白带大小一致，表明抗河豚毒素单链抗体基因获得了表达(参见图3)。抗河豚毒素单链抗体的氨基酸序列为：
SDS-PAGE电泳表明，抗河豚毒素单链抗体基因的原核表达产物绝大部分出现在超声沉淀中，说明融合蛋白主要以包涵体的形式存在(参见图4)。包涵体经处理后，过Ni2+亲和柱，用洗脱液洗下亲和蛋白，胶上几乎只出现1条蛋白质条带(参见图4)，说明经亲和层析纯化到较高纯度含6×His的融合蛋白。经凝胶成像(Quantity One-4.6)分析显示其纯度达到90％。采用逐步透析法对纯化的蛋白进行复性，复性蛋白回收率为45％，通过紫外分光光度计扫描，根据蛋白质浓度＝1.45OD280-0.74OD260公式，测得纯化样品浓度为0.1mg/mL。
实施例3 抗河豚毒素单链抗体的鉴定
采用ELISA法测定抗河豚毒素scFv抗体片段的生物学活性。将河豚毒素与鸡卵血清白蛋白交联物用碳酸盐缓冲液稀释至5ug/mL，包被于96孔板，100μL/孔，4℃过夜。用1％的明胶封闭2h，用PBST洗96孔板5次，每孔加入倍比稀释的蛋白100μL。同时以pET-22b(+)空载体诱导表达产物为阴性对照，37℃放置1h，用PBST洗涤液洗5次后，加入鼠抗6×His抗体，37℃放置1h，用PBST洗涤液洗3次，再加羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃放置45min，再用PBST洗5次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min，加终止液(2M H2SO4溶液)终止反应，酶标仪490nm读取结果(参见图5)。
重组表达的单链抗体在1∶1稀释时OD490为2.092，在1∶256稀释时为0.245，随着抗体浓度的下降，OD490值逐渐降低，表明单链抗体能与包被在板上的河豚毒素进行特异性结合。

Claims (10)

1.大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，已于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014597。
2.抗河豚毒素单链抗体，其特征在于其氨基酸序列为：
3.抗河豚毒素单链抗体，其特征在于其基因序列为：
其中第1～438位核苷酸为抗河豚毒素单链抗体的轻链可变区基因，全长为438bp；第439～483位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp；第484～858位核苷酸为为抗河豚毒素单链抗体的重链可变区基因，全长为375bp。
4.抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)克隆抗河豚毒素单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗河豚毒素单链抗体的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗河豚毒素单链抗体。
5.如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述克隆抗河豚毒素单链抗体基因的模板来自抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10。
6.如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述克隆抗河豚毒素单链抗体基因是分别克隆抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因和抗河豚毒素单链抗体轻链可变区基因，再通过连接肽Linker将两者连接。
7.如权利要求6所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因的引物为：
5'端引物:5'-TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCWGG-3'；
3'端引物:5'-AAG CTT CTC GAG TGM RGA GAC DGT GAC CGT GG-3'。
8.如权利要求6所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗河豚毒素单链抗体轻链可变区基因的引物为：
5'端引物::5'-ATC CAT GCC ATG GAC ATT SWG MTS ACM CAG WCT CCA-3'；
3'端引物::5'-GCC GGA TCC ACC GCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCG TTT YAT YTC CAR CTT-3″。
9.如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述克隆抗河豚毒素单链抗体表达载体引物为：
5'端引物:5'-GAA TTC GGA CAT TGA GCT GAC ACA GTC TCC-3'；
3'端引物:5'-CTC GAG TGC GGA GAC AGT GTC ATC ACA ATG-3'；
所述载体可为pET-22b(+)质粒。
10.如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细菌为E.coli BL21(DE3)；
在步骤3)中，所述纯化可采用亲和层析。
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