CN104611296A

CN104611296A - 一株分泌抗重组日本血吸虫烯醇化酶特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104611296A
Application number: CN201510032026.9A
Authority: CN
Inventors: 余传信; 高玒; 宋丽君; 沈双; 殷旭仁; 王玠; 柯雪丹
Original assignee: Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Current assignee: Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2015-05-13

Abstract

一株分泌抗重组日本血吸虫烯醇化酶特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法与应用，属于基因工程、单抗制备及免疫诊断技术领域。本发明提供了一株能分泌抗重组日本血吸虫烯醇化酶（Sj Enolase蛋白）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 9910。所述杂交瘤细胞JYG-1能分泌抗重组日本血吸虫Sj Enolase特异性单克隆抗体JYGENmb-1。所述的单克隆抗体JYGENmb-1能与日本血吸虫的Sj Enolase蛋白特异性结合，提供一种检测Sj Enolase蛋白夹心酶联免疫吸附方法，可应用于建立检测日本血吸虫感染人与动物血液及排泄分泌物中Sj Enolase蛋白的各种免疫学方法。

Description

一株分泌抗重组日本血吸虫烯醇化酶特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明提供一株分泌抗重组日本血吸虫烯醇化酶（Sj Enolase蛋白）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞、一种抗Sj Enolase特异性单克隆抗体及其制备方法；提供一种以抗重组Sj Enolase特异性单克隆抗体为捕获抗体，以抗Sj Enolase特异性多克隆抗体为检测抗体的夹心法检测Sj Enolase蛋白的酶联免疫学方法。属于基因工程、单抗制备及免疫诊断技术领域。

背景技术

血吸虫病是严重威胁热带与亚热带地区人类健康的重要寄生虫病，在中国目前已被列入政府重点控制的第二大重要的公共卫生问题。经过半个多世纪的艰苦努力，我国的血吸虫病流行已得到有效的控制，流行区人群的血吸虫感染率低于1%，基本达到人群传播阻断的目标。但是，血吸虫病是一个人兽共患病，自然界存在大量的保虫宿主（如：猪、牛、羊、犬、鼠等多种易感宿主），血吸虫的中间宿主钉螺广泛分布，难以彻底消灭。因此，引起血吸虫病暴发流行的因素仍然存在，难以在短时间内消灭血吸虫病的流行。虽然我国的血吸虫感染率已经降低至极低的水平，但是，我国仍有454个县有血吸虫病流行。由于人群感染率处于极低状态，过去那种大规模的普查普治的运动式防治工作模式，已经不适用于当今防治工作的需要，会造成大量的人力、物力及财力的浪费，大规模的药物灭螺还会造成严重的环境污染及生态破坏。因此，准确地发现散在分布的现症感染血吸虫病人或动物，及时治愈患者，消灭传染源，对阻断血吸虫感染的传播，防止疫情暴发具有重要的意义。因此，需要建立高度敏感、特异的血吸虫现症感染实验室检测方法，以满足目前低度感染流行状态的血吸虫病防治工作的需要。血吸虫现症感染检测方法包括：

病原学检测

日本血吸虫病原学检测方法包括显微镜检法，从患者粪便检查是否存在虫卵，或采用毛蚴孵化法观察是否能在患者粪便中孵化出血吸虫的毛蚴，这是血吸虫现症感染确诊的金标准方法。但是，这种方法影响因素很多，在低度感染状态下极易漏检，敏感性低，依从性差，不易被病人及检测人员所接受。而且，虫卵出现在患者粪便中需要在血吸虫感染后3周以后，检测虫卵没有早期诊断价值。病原学检测方法不能满足当前血吸虫低感染度流行状态的需要。

核酸检测

发现来源于血吸虫细胞的核酸成分（包括DNA、RNA），是宿主体内存在现症感染的客观指征。采用核酸扩增的方法(如PCR法、LAMP法)，或免疫学方法检测患者血清、排泄分泌物（粪便、尿液）中的血吸虫特异性DNA片段，具有对血吸虫现症感染进行确诊的价值。但是，核酸检测方法普遍存在对操作人员技术要求高、需要复杂的仪器设备、检测成本高、检测时程长、难以批量检测等的问题，不适宜在血吸虫病流行区现场大规模应用。

免疫学检测

免疫学检测方法包括循环抗体的检测与循环抗原的检测两种。循环抗体检测方法是检测血吸虫感染宿主后，其抗原分子刺激宿主免疫系统产生的抗血吸虫抗原的特异性抗体分子。由于一般抗体存在宿主体内的时间很长，只能表明宿主体内曾经发生过血吸虫感染，但不能作为现症感染的指征，可用于血吸虫感染者的筛查。随着血吸虫感染免疫研究工作的进展，人们发现血吸虫的一些抗原分子在宿主体内可以诱导短寿抗体反应，参与短寿抗体反应的抗原特异性抗体随着虫体（或抗原）的存在而产生，经过治疗后，随着虫体的消失而消失，检测这种参与短寿抗体反应的抗原特异性抗体具有对血吸虫现症感染进行确诊与疗效考核价值。但是，该方法仍在研究之中，尚没有成熟试剂盒形成。循环抗原是来自于血吸虫虫体本身的蛋白成分，存在于患者的血液、尿液或唾液中。只有患者体内存活虫体，其体液才可能存在血吸虫的循环抗原分子，是血吸虫现症感染的客观指征，检测患者体液中的循环抗原具有对血吸虫现症感染进行确诊与疗效考核的价值。长期以来，血吸虫病循环抗原检测方法的研究始终是人们研究的热点课题，已经建立了多种不同的循环抗原的检测方法。这些方法用于诊断血吸虫病的特异性好，但缺点是检测靶标不明确，敏感性普遍不足。

因此，选择血吸虫排泄分泌抗原成分中含量丰度高的靶分子作为要检测靶标，并构建合适的检测方法，是提高血吸虫病循环抗原检测方法敏感性的关键。

发明内容

本发明目的是提供一株分泌抗日本血吸虫烯醇化酶（Sj Enolase）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，一种抗日本血吸虫烯醇化酶（Sj Enolase）特异性单克隆抗体，和一种检测Sj Enolase蛋白夹心酶联免疫吸附方法，以实现提高对血吸虫现症感染进行确诊效果的目的。

本发明的技术方案：为达到上述目的，本发明选择血吸虫成虫呕吐排泄物中蛋白含量最高的烯醇化酶（Sj Enolase）作为循环抗原检测的靶标分子。

一株分泌抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.9910。

一种抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1，由保藏编号CGMCC NO.9910的杂交瘤细胞JYG-1分泌产生。

一种检测Sj Enolase蛋白的双抗体夹心酶联免疫学方法，以抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体JYGENmb-1为捕获抗体，检测血吸虫感染人或动物血清、体液或排泄分泌物中的Sj Enolase蛋白。

产生所述单克隆抗体JYGENmb-1的重组Sj Enolase蛋白的表达，先将编码Sj Enolase蛋白分子的核苷酸片段SEQ ID NO:1插入到一种表达载体pET28a(+)中，构建重组表达载体Sj Enolase/pET28a，再将此重组表达载体Sj Enolase/pET28a转化到一种宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）中，在18℃培养条件下，经IPTG诱导表达出一种末端带有6个组氨酸的可溶性重组Sj Enolase蛋白粗制品；

采用镍螯合亲和层胶与含重组Sj Enolase蛋白的表达产物混合，使重组Sj Enolase蛋白结合到镍螯合亲和层析胶上，洗去未结合的杂蛋白，再用咪唑从镍螯合亲和层析胶上洗脱重组Sj Enolase蛋白，通过透析去除咪唑，即可获得纯化的重组Sj Enolase蛋白。

所述的重组Sj Enolase蛋白的表达，编码重组Sj Enolase蛋白分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:1保持有至少90%的同源性。

所述的重组Sj Enolase蛋白的表达，重组Sj Enolase蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2保持有至少90%的同源性。

所述的分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1的制备方法，将纯化的重组Sj Enolase蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾脏细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞融合，经过营养互补筛选，获得能分泌抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1。

所述的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1的制备方法，将分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1在体外进行培养；或将分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1接种到BALB/c小鼠腹腔，收集细胞培养上清液或小鼠腹水；采用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析法对培养上清液或小鼠腹水的单克隆抗体JYGENmb-1进行纯化，制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1。

所述的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的应用，在于基于抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体可以与Sj Enolase特异结合的原理，建立一系列通过抗原抗体反应检测或分离各种样本中含有的Sj Enolase蛋白的免疫学方法。这里所述的样本包括但不仅限于血吸虫本身的组织、感染血吸虫的宿主的组织、血液、体液或排泄分泌物。所述的免疫学方法，包括但不局限于酶联免疫吸附分析法、化学发光法、时间分辩荧光法、放射免疫法、免疫印渍法、磁珠吸附法、亲和层析法等。

所述的重组Sj Enolase蛋白的制备方法，包括转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。

本发明为了获得纯化的重组Sj Enolase蛋白，采用定向克隆与融合表达的策略，使表达出来的重组Sj Enolase蛋白未端带有6个组氨酸残基，可以通过镍亲和层析方法纯化制备。

本发明优选的表达质粒是pET28a(+)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的重组Sj Enolase蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。

具体地，该表达质粒含有能控制外来基因蛋白表达的适当启动子，这些启动子包括但是不局限于tac启动子, 优选的启动子为T7。

本发明提供重组Sj Enolase蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。

首先克隆获得编码Sj Enolase蛋白的核苷酸序列。编码Sj Enolase蛋白的核苷酸序列与序列SEQ ID NO：1保持有至少90%的同源性。

具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码Sj Enolase蛋白的核苷酸片段，并使Sj Enolase基因片段的5′端带有BamH1的酶切位点，3′端带有Sal1的酶切位点。将Sj Enolase基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒Sj Enolase/pGEM-T进行DNA序列分析，确定其基因序列的正确性。

然后将Sj Enolase基因片段通过BamH1，Sal1酶切位点插入到表达质粒pET28a(+)中构建重组表达质粒Sj Enolase/pET28a。将该重组表达质粒Sj Enolase/pET28a转化到大肠杆菌DH5α中，再涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，琼脂粉1.2%，卡那霉素50μg/mL）表面，37℃生长过夜，筛选含有重组质粒的转化子。

本发明表达重组Sj Enolase蛋白的重组质粒Sj Enolase/pET28a可在多种大肠杆菌中表达目的蛋白，其优选的菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供一种工程菌大规模表达Sj Enolase蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒Sj Enolase/pET28a的单个菌落接种到选择性培养基LB（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，卡那霉素50μg/mL)中，37℃振摇过夜。第二天按1︰10稀释接种到新鲜的LB培养基中，18 ℃振摇培养8h (OD₆₀₀≈0.4)，加入1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，表达Sj Enolase蛋白。

重组Sj Enolas蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：SDS-page，Western blotting等。

本发明也提供一种重组Sj Enolase蛋白的分离纯化方法。

具体地，将含有重组Sj Enolase蛋白的表达产物与镍螯合亲和层析胶混合，使镍螯合亲和层析胶捕获表达产物中的重组Sj Enolase蛋白，再用一定浓度的咪唑溶液洗脱结合在胶上的重组Sj Enolase蛋白。重组Sj Enolase蛋白的纯度可以达95%以上。

本发明提供一种制备抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的方法。

具体地，以纯化的重组Sj Enolase蛋白与福氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，连续加强免疫2次后，通过酶联免疫吸咐法测定小鼠血清中是否有抗重组Sj Enolase蛋白特异性抗体产生。然后取免疫小鼠的脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行杂交融合，融合细胞在HAT培养基中培养，通过一系列的筛选，获得能产生抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1。将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤制备含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体JYGENmb-1。

本发明还提供一种抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体JYGENmb-1与抗原结合特异性的鉴定方法。

具体地，将重组Sj Enolase蛋白，健康人血清，血吸虫成虫抗原，排泄分泌抗原，可溶性虫卵抗原，肝吸虫抗原，大肠杆菌抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用电转移方法将蛋白条带转移到硝酸纤维素（NC）膜上，将含有各抗原蛋白条带的NC膜与抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体JYGENmb-1反应，加入酶标记抗鼠IgG二抗后，用底物3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，观察单克隆抗体与各抗原的反应情况，以判断此单克隆抗体JYGENmb-1的特异性。

本发明提供一种兔抗重组Sj Enolase蛋白多克隆抗体IgG的制备和纯化方法。具体地，以纯化重组Sj Enolase蛋白经皮内免疫家兔，2次加强免疫后，采集兔血液，分离血清。采用金黄色葡萄球A蛋白琼脂糖胶亲和层析法从免疫血清中制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白多克隆抗体IgG。

本发明提供一种利用抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体JYGENmb-1检测血吸虫感染者血液中循环抗原Sj Enolase蛋白的方法。检测方法分直接法和间接法两类，包括但不局限于：斑点法、酶联免疫吸附法、免疫印渍法（Immunoblot）, 免疫层析法，免疫渗滤法，放射免疫法，时间分辩荧光法（TRFIA）, 免疫磁珠吸附法，等等。

本发明提供一种检测日本血吸虫Sj Enolase分子的双抗体夹心间接酶联免疫吸附分析法。

具体地，以抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体JYGENmb-1为捕获抗体包被酶标板，与待检者血清进行反应，再与兔抗Sj Enolase蛋白多克隆抗体反应，再加辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG，经底物TMB显色，以判定被检测血清样本中是否含有Sj Enolase蛋白分子。

本发明的有益效果：日本血吸虫Sj Enolase蛋白分子是血吸虫生命过程中的一个重要的糖代谢功能分子，是血吸虫排泄分泌物中的一个高丰度抗原。采用本发明制备的抗重组Sj Enolase特异性单克隆抗体JYGENmb-1检测血吸虫感染患者体内血吸虫特异性的Sj Enolase蛋白分子对血吸虫现症感染具有确诊价值，本发明的单克隆抗体JYGENmb-1并且可以用于血吸虫能量代谢中的糖代谢功能研究及Sj Enolase其它生理功能的研究。本发明制备的抗重组Sj Enolase蛋白分子特异性单克隆抗体JYGENmb-1可以用于建立各种检测Sj Enolase蛋白的免疫学方法。以抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体JYGENmb-1建立的检测循环抗原Sj Enolase蛋白的双抗体夹心间接酶联免疫吸附法可以进一步提高检测血吸虫循环抗原Sj Enolase蛋白的准确性和阳性率，敏感性达到70pg，适合于对低度感染者进行诊断与流行病学调查。本发明具有良好的应用前景，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

生物材料样品保藏：一种分泌抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1的杂交瘤细胞JYG-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，登记入册号为CGMCC NO. 9910，保藏日期为：2014年11月13日。

附图说明

图1日本血吸虫Sj Enolase基因扩增；M、DNA分子量标志物，1、RT-PCR扩增产物。

图2 重组表达质粒构建结果；M、1kb DNA分子量标志物，1、重组表达质粒Sj Enolase/pET28a，2、表达质粒pET28a。

图3 重组质粒Sj Enolase/pET28a酶切分析结果；M、1kb DNA分子量标志物，

1、未被酶切的重组表达质粒Sj Enolase/pET28a，2、经BamH1+Sal1双酶切的Sj Enolase/pET28a质粒DNA产物。

图4 重组日本血吸虫Sj Enolase蛋白融合表达；

M、蛋白质分子量标志物，

1-4、含重组质粒Sj Enolase/pET28a转化子细菌的表达产物，

5-6、E.coli BL21对照。

图5 亲和层析纯化重组日本血吸虫Sj Enolase蛋白；M、蛋白质分子量标志物，1、纯化的重组日本血吸虫Sj Enolase蛋白。

图6抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体的特异性分析；M、蛋白分子量标志物，1、可溶性虫卵抗原，2、成虫排泄分泌抗原，3、成虫抗原，4、大肠杆菌蛋白，5、重组Sj Enolase蛋白，6、华支睾吸虫可溶性蛋白。

图7 双抗体夹心间接ELISA检测Sj Enolase蛋白灵敏度分析；ELISA:酶联免疫吸附法，灵敏度为0.7 ng/mL，检测线性范围为0.7-1000 ng/mL。

具体实施方式

下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。

实施例1：日本血吸虫Sj Enolase基因克隆：

日本血吸虫Sj Enolase基因通过RT-PCR技术，从血吸虫成虫组织的mRNA中反转录合成而来，具体制备方法如下：

1、血吸虫成虫mRNA的制备

取新鲜分离的血吸虫成虫0.5g，在液氮中冷冻后，在陶瓷研钵中粉碎，再用GE Healthcare公司的mRNA纯化试剂盒（Illustra QuickPrepTM mRNA purification kit）制备纯化mRNA，操作方法严格按试剂盒的操作说明书。用紫外分光光度计测mRNA的纯度与含量。

2、Sj Enolase基因扩增

2.1引物设计：

Sj Enolase 1: ttggatccat gaaaatggca attatagcga t，（划线处为BamH1酶切位点），

Sj Enolase 2: ttgtcgactc aaatttgagga tggcggaagt，（划线处为Sal1酶切位点），

2.2 第一链cDNA合成

采用Phusion^TM RT-PCR Kit(购自NEB北京分公司). 在一0.2mL的PCR管中，加入mRNA 2μL(约10ng)，10 mM dNTP 混合物1 μL，Oligo(dT) primer 1 μL，加无离子水至10 μL。混匀，离心收集于管底。65℃ 水浴预变性5min，置冰上冷却。加入10×反转录缓冲液2 μL，反转录酶混合物2μL，无核糖核酸酶水（无Rnase水）6μL。混匀，离心收集于管底。25℃保温10min，再在40℃保温30min以合成cDNA。80℃保温5min以中止反应。

2.3 目的基因扩增

在一个0.2mL的PCR管中，加入2×PhusionR Master Mix 25μL，第一链cDNA 3μL，引物Sj Enolase 1：0.5μL (25μM)，Sj Enolase 2：0.5μL (25μM)，加无核糖核酸酶水到终体积50μL。PCR条件：98 ℃ 30 Sec；然后98℃变性10 Sec；58℃ 30 Sec，72℃ 60 Sec，共扩增30个循环；最后，72℃保温5min。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯化的Sj Enolase基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约1311bp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化Sj Enolase基因DNA片段。如图1所示。

TA克隆与序列分析

在Sj Enolase基因DNA片段的3′端加腺嘌呤（A）尾巴将纯化的S jEnolase基因DNA片段置于PCR 反应管中，加入10× Taq DNA 聚合酶链反应缓冲液10μL，MgCl₂ 10μL（25 mmol/L），dATP 1μL(10 mmol/L)，Taq DNA 聚合酶1μL (5 U/μL)，加灭菌无离子水至100μL，在PCR 仪上72 ℃保温30 min，使Sj Enolase基因片段的3′端加上“A”尾巴。用Promega 公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A 尾后的Sj Enolase基因DNA片段。将Sj Enolase DNA片段与TA clone 载体pGEM-T(美国PROMEGA公司产品) 按照摩尔数3︰1 的比例混合，在T4 DNA 连接酶的作用下连接，反应体系如下：2× ligase buffer 5μL，pGEM-T vector 1μL (50ng), Sj Enolase DNA片段 3μL，T4 DNA ligase 1μL（1U），总体积 10μL。混匀后，短暂离心，16℃水浴连接过夜，形成重组质粒SjEnolase/pGEM-T。

电转化：1）取5μL 连接产物加入到50μL 感受态细胞E.coli DH5α中，小心混匀，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2）将连接产物与E.coli DH5α的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1cm 的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3）设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4）取出电击杯，加入0.5 mL 37℃预热的SOC 培养基，混匀后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37 ℃、200 rpm 振荡培养40 min。5）取200μL菌液均匀涂布于表面预先涂有40μL X-gal（40 mg/mL）的LB 平板上（含Amp 100μg/mL）。室温下放置，待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37 ℃培养箱过夜。在LB 平板上出现的白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析。

实施例2：重组Sj Enolase蛋白表达质粒的构建

本发明采用pET28a为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有质粒pET28a的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20℃保存待用。

具体如下，对表达载体质粒pET28a及重组质粒Sj Enolase/pGEM-T分别进行BamH1、 Sal1双酶切。具体条件如下。质粒（pET28a及Sj Enolase/pGEM-T）DNA 10μL，BamH1 1μL，Sal1 1μL，10×酶切缓冲液5μL；ddH₂O 33μL，总体积为50μL。37℃恒温水浴锅内保温3h，通过低琼脂糖凝胶电泳回收线性化的pET28a质粒DNA及Sj Enolase DNA片段。将回收的Sj Enolase DNA片段与表达质粒pET28a DNA片段连接，构建重组表达质粒Sj Enolase/pET28a。连接体系为10μL，双酶切的pET28a质粒与双酶切Sj Enolase DNA的摩尔比为1︰2-10，10×T4 DNA ligase 缓冲液1μL，T4 DNA ligase 1μL，加无菌水至总体积为10μL。连接反应在16℃恒温水浴内温浴16h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将转化的大肠杆菌DH5α涂布于LB固体培养基（含有卡那霉素，50μg/mL）表面，37 ℃培养箱中培养过夜。阳性克隆的鉴定是选择在含卡那霉素的LB平板上生长的单个阳性克隆，抽提质粒，并通过BamH1、 Sal1双酶切分析确定目的基因是否被插入到表达载体中（图2，3所示）。

实施例3：重组Sj Enolase蛋白表达工程菌的构建

具体方法如下。

首先挑选含有Sj Enolase/pET28a重组质粒的细菌克隆，提取质粒DNA。然后，用电转化的方法把质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。

电转化方法转化大肠杆菌具体如下。

先进行感受态细胞的准备。挑取新鲜的BL21（DE3）单菌落，接种至含有3mL LB液体培养基的试管中，37℃、200rpm培养过夜。然后取1mL的培养物接种至含有500mL新鲜LB培养基的2L三角摇瓶中，37℃、250-300rpm培养过夜，至OD_600 nm小于0.4，将细菌培养物置于冰上冷却，2500g离心20min，去上清，用500mL的冰预冷的ddH₂O将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用10mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬，调节菌液OD_600nm=10.0。以每管100μL的体积分装感受态细胞，-70℃保存备用。

电击转化，具体如下。

将重组质粒Sj Enolase/pET28a DNA溶解在5-10μL TE溶液中，与80μL的上述感受态菌体混匀，转至0.1cm狭缝的预冷电转化杯中，冰浴30min。然用1.8kv电压、25μF电容、 200Ω电阻的条件进行电击。电击完毕后，加入1mL 37℃预温的LB液体培养基悬浮，并转至无菌的玻璃试管中，37℃、250-300rpm培养40min。将菌液涂布到含有KAN的LB平板上，置于37℃培养过夜。

实施例4：重组 Sj Enolase蛋白的表达和纯化

重组Sj Enolase蛋白的表达

将表达菌株接种于50mL LB液体培养基中(KAN，50μg/mL)，37℃、200 rpm过夜培养。取10mL过夜培养菌液，按照1︰100 分别转种于1,000 mL LB肉汤培养基中(KAN，50μg/mL)中，37 ℃、200 rpm振荡培养，培养3～4 h至菌液光密度OD_600 nm约为0.5。加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，18℃下继续培养8 h。4℃、10,000 rpm 离心10 min，收集所有细菌。取少量的细菌进行SDS-PAG电泳，观察目的蛋白的表达情况。如图4所示。用100 mL PBS重悬浮细菌沉淀。 -30 ℃反复冻融2-3次，冰浴中超声破碎细菌7次（功率200W），每次20 sec，间隔20 sec。裂解液以14,000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液。

按镍螯合亲和层法(镍螯合亲和层析胶购自Genescript 公司，中国)说明书准备50%的镍螯合亲和层析胶，将镍螯合亲和层析胶装柱，用10倍柱体积的平衡液（0.5M NaH₂PO₄ 19mL、0.5M Na₂HPO₄81mL、NaCl 29.3g，加无离子水定容到1L）平衡柱。将表达产物上清液上柱，控制流速1mL/min，样本上柱完毕，再用平衡液洗柱，去除未结合蛋白，再用含有咪唑的蛋白洗脱液（分别含有10mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM咪唑的平衡液）洗脱结合于柱上的重组Sj Enolase蛋白，收集合并全部洗脱液于透析袋中，SDS-page分析各浓度咪唑洗脱液纯度，选择50mM咪唑洗脱液，用PBS透析去除咪唑，获得纯化的重组Sj Enolase蛋白。采用SDS-page分析纯化Sj Enolase蛋白产物。如图5所示。

实施例5：抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体的制备

取8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠3只，首次免疫用完全福氏佐剂加纯化的重组Sj Enolase蛋白为抗原免疫，剂量为80 μg/只，其后每隔2周用相同剂量的不完全佐剂加抗原进行加强免疫，连续加强免疫3次。当小鼠血清抗体效价>1:10,000时，取免疫小鼠的脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞（骨髓瘤细胞）在50%PEG4000的作用下进行细胞融合，用HAT选择培养基对融合细胞进行筛选。采用间接ELISA法对有杂交瘤细胞生长的细胞孔上清液进行检测，对上清液能识别重组Sj Enolase蛋白，且反应较强的杂交瘤细胞采用有限稀释法进行多次克隆化，直至每个单克隆细胞孔上清液检测均为阳性，建立杂交瘤细胞株。

将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤，收集含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白单克隆抗体。

按照抗体类型及亚类鉴定试剂盒操作说明书的要求，采用间接ELISA法对单抗进行分型鉴定。结果获得一株产特异性高亲和力的单克隆抗体JYGENmb-1的杂交瘤细胞JYG-1，属IgG1亚类。亲和常数为8.8×10⁸ mol/L。

实施例6：单克隆抗体JYGENmb-1特异性分析

将重组Sj Enolase蛋白，健康人血清，血吸虫成虫抗原，可溶性虫卵抗原，肝吸虫抗原，大肠杆菌抗原进行12% SDS-PAG电泳，结束后立即用半干转印缓冲液（Tris 5.82g，glycine 2.93g，methanol 200mL，加无离子水至1L)平衡胶15 min。准备预先切割好的厚滤纸和硝酸纤维素膜（切割至与电泳凝胶大小一致），使用前放置于半干转印缓冲液中浸泡15-30 min。将转膜装置的各组件从下至上依次按阳极、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极的顺序放好，滤纸、NC膜、凝胶精确对齐，每一步都要去除气泡。在室温、恒电压20V条件下电转化30min。硝酸纤维素（NC）膜用5%脱脂牛奶PBST(PBS含0.05%Tween-20)封闭，室温 1 h或4℃过夜；将NC膜纵切成0.3cm宽的长条，编上号码，在水化盘槽内分别与单克隆抗体JYGENmb-1进行反应，室温摇床上反应1 h。用TBST洗涤NC膜条3次，每次10min，加入用PBS作1:10000稀释的HRP标记抗鼠IgG，室温反应1 h。再用TBST洗涤3次后用3,3-二氨基联苯胺钠盐（DAB）底物液(6mg DAB溶于10mL PBS中, 用前加10μL H₂O₂)显色2 min，用蒸馏水漂洗NC膜条终止反应，观察结果。结果显示单克隆抗体JYGENmb-1可与重组Sj Enolase蛋白、血吸虫可溶性虫卵抗原、及成虫抗原中的天然Sj Enolase蛋白结合，但不与大肠杆菌蛋白、华支睾吸虫可溶性蛋白反应，显示出良好的特异性。如图6所示。

实施例7 兔抗重组Sj Enolase蛋白特异性多克隆抗体的制备

取日本大白兔两只，免疫前经耳缘静脉采血，分离血清，-80℃保存。首次免疫用纯化重组Sj Enolase蛋白完全福氏佐剂经颈背部皮肤皮内多点注射免疫，重组Sj Enolase蛋白用量为每只兔子2mg；随后每隔2周加强免疫一次，加强免疫时重组Sj Enolase蛋白用量不变，但佐剂为不完全佐剂，共加强免疫2次。末次免疫后2周，经颈动脉放血，采集免疫兔血液约 100mL，分离血清。

以抗重组Sj Enolase蛋白包被酶标板，采用常规ELISA法测定免疫前、免疫结束后兔血清中抗重组Sj Enolase蛋白抗体IgG的效价。结果显示免疫后兔血清抗重组Sj Enolase蛋白多克隆抗体IgG的效价达到1：200000以上。采用金黄色葡萄球A蛋白琼脂糖胶亲和层析法纯化免疫血清中抗重组Sj Enolase蛋白多克隆抗体IgG，获得了纯化的兔抗重组Sj Enolase蛋白多克隆抗体IgG。

实施例8 基于单克隆抗体JYGENmb-1检测Sj Enolase蛋白双抗体夹心间接ELISA的灵敏性分析

以单克隆抗体JYGENmb-1包被酶标板，与不同浓度的重组Sj Enolase蛋白抗原反应后，再与兔抗Sj Enolase多克隆抗体反应，用HRP标记抗兔二抗进行检测，加入底物TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）显色。方法的灵敏度为 0.7ng/mL，检测线性范围为0.7-1000 ng/mL，如图7所示。

实施例9 基于单克隆抗体JYGENmb-1检测Sj Enolase蛋白双抗体夹心间接ELISA检测血吸虫病人血清样本的效果的研究

采用实施例7建立的双抗体夹心间接ELISA对96份血吸虫病人血清、96份健康人血清进行检测，敏感性为84.35%，特异性为95.83%。见表1。

表1双抗夹心-ELISA与SEA-ELISA检测血吸虫感染患者血清结果比较

采用实施例7建立的双抗体夹心间接ELISA对30份华支睾吸虫感染者、20份卫氏并殖吸虫感染者血清进行检测，交叉反应率分别为3.33%及0%。而SEA ELISA的交叉反应率分别为16.67%及65.00%。见表2。

表2双抗夹心-ELISA与SEA-ELISA分别检测华支睾吸虫及并殖吸虫患者血清结果比较

<160> 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> 日本血吸虫Sj Enolase蛋白

<400> 1

atgaaaatgg caattatagc gattcacgcc cgtcaaatct tcgacagccg agggaatccc 60

acagttgagg ttgatctaaa aacagcaaaa ggtttgttcc gcgcagccgt tccaagtggg 120

gcttcaacag gtgttcatga ggctcttgaa ttacgtgata caaattcaaa ggcttatatg 180

tgcaaagggg ttttgacagc agttagtaat gtgaataata tcatcgctcc tgctctgctg 240

aagaaacaaa ttcctgtaac caatcaatcg gaggttgacc aatttatgat cgaactcgat 300

ggcaaagaaa acaaaggaaa tctcggagcg aatgctatat taggcgtatc tttggctgta 360

tgcaaggcgg gtgcagctga attaaattta cctctctata ggtatattgc aaagttagct 420

ggccataagg atgtcataat gccggttcct gcatttaatg tcattaatgg tggcagtcat 480

gctggcaaca agctagcgat gcaggagttt atgattttac ctactggggc tagctcattc 540

actgaggcaa tgcaaatggg ttctgaggtg taccacaatt aaaggctgtt atcaaacgt 600

gagtttggat tagatgcatg taacgttggt gacgagggtg gttttgcacc gaatatccag 660

gataatatga aaggtcttca acttcttgaa gaggctataa aaattgctgg atatactgga 720

aaagtagaga ttggtatgga ttgcgcggct tctgaatatt ataagaaggg gaagtatgat 780

ttggatttca agaatcctca atctgccgaa tctcattggc ttagtcctga tgaaatggct 840

aatgtttaca aggaaatgat tcagaagtac ccaatagtga gcattgagga cccgtttgat 900

caagatgatt gggatgcgtg gcctaaattg actgcgtcaa ctaacattca gattgtcggc 960

gacgacttaa cagtcaccaa tccgaaacgc attgaaaagg ccatcaaagt aaaagcttgc 1020

aattgccttc ttttgaaagt aaaccagata ggttcaataa ccgagtctat tgaagcttgc 1080

aaaatggcac aaaaagcagg ctggggtgtt atggtttcac atcgatcagg tgaaacggaa 1140

gataatttca tcgctgatct tgtcgttggt ctttgtactg gacagatcaa aacaggtgca 1200

ccttgtcgat ttgaacgtct tgcgaagtac aaccaactct tgcgtattga agaggaatta 1260

ggatcaacag caaagtatgc cggaaaacac ttccgccatc ctcaaatttg a 1311

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 436

<212> PRT

<213> 日本血吸虫Sj Enolase蛋白

<400> 2

Met Lys Met Ala Ile Ile Ala Ile His Ala Arg Gln Ile Phe Asp

5 10 15

Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Lys Thr Ala Lys

20 25 30

Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Val

35 40 45

His Glu Ala Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asn Ser Lys Ala Tyr Met

50 55 60

Cys Lys Gly Val Leu Thr Ala Val Ser Asn Val Asn Asn Ile Ile

65 70 75

Ala Pro Ala Leu Leu Lys Lys Gln Ile Pro Val Thr Asn Gln Ser

80 85 90

Glu Val Asp Gln Phe Met Ile Glu Leu Asp Gly Lys Glu Asn Lys

95 100 105

Gly Asn Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Val

110 115 120

Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Leu Asn Leu Pro Leu Tyr Arg Tyr

125 130 135

Ile Ala Lys Leu Ala Gly His Lys Asp Val Ile Met Pro Val Pro

140 145 150

Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly Asn Lys Leu

155 160 165

Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Thr Gly Ala Ser Ser Phe

170 175 180

Thr Glu Ala Met Gln Met Gly Ser Glu Val Tyr His Asn Leu Lys

185 190 195

Ala Val Ile Lys Arg Glu Phe Gly Leu Asp Ala Cys Asn Val Gly

200 205 210

Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Gln Asp Asn Met Lys Gly

215 220 225

Leu Gln Leu Leu Glu Glu Ala Ile Lys Ile Ala Gly Tyr Thr Gly

230 235 240

Lys Val Glu Ile Gly Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Tyr Lys

245 250 255

Lys Gly Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Gln Ser Ala Glu

260 265 270

Ser His Trp Leu Ser Pro Asp Glu Met Ala Asn Val Tyr Lys Glu

275 280 285

Met Ile Gln Lys Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp

290 295 300

Gln Asp Asp Trp Asp Ala Trp Pro Lys Leu Thr Ala Ser Thr Asn

305 310 315

Ile Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg

320 325 330

Ile Glu Lys Ala Ile Lys Val Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu

335 340 345

Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Ile Thr Glu Ser Ile Glu Ala Cys

350 355 360

Lys Met Ala Gln Lys Ala Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg

365 370 375

Ser Gly Glu Thr Glu Asp Asn Phe Ile Ala Asp Leu Val Val Gly

380 385 390

Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg Phe Glu

395 400 405

Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu Leu

410 415 420

Gly Ser Thr Ala Lys Tyr Ala Gly Lys His Phe Arg His Pro Gln

425 430 435

Ile ***

436

Claims

1.一株分泌抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.9910。

2.一种抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1，由保藏编号CGMCC NO.9910的杂交瘤细胞JYG-1分泌产生。

3.一种检测Sj Enolase蛋白的双抗体夹心酶联免疫学方法，其特征在于以抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体JYGENmb-1为捕获抗体，检测血吸虫感染人或动物血清、体液或排泄分泌物中的Sj Enolase蛋白。

4.权利要求1所述重组Sj Enolase蛋白的表达方法，其特征在于将编码Sj Enolase蛋白的核苷酸片段SEQ ID NO:1插入到表达载体pET28a（+）中，构建重组表达载体Sj Enolase/pET28a；然后，将重组表达载体Sj Enolase/pET28a转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，在18℃条件经IPTG诱导表达出一种末端带有6个组氨酸残基的可溶性重组Sj Enolase蛋白粗制品；

采用镍螯合亲和层析法对含有重组Sj Enolase蛋白的粗制品进行纯化，获得纯化的重组Sj Enolase蛋白。

5.权利要求4所述的重组Sj Enolase蛋白的表达方法，其特征在于编码重组Sj Enolase蛋白的核苷酸序列，与SEQ ID NO:1保持有至少90%的同源性。

6.权利要求4所述的重组Sj Enolase蛋白的表达方法，其特征在于重组Sj Enolase蛋白的氨基酸序列，与SEQ ID NO:2保持有至少90%的同源性。

7.权利要求1所述的分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1的制备方法，其特征在于将纯化的重组Sj Enolase蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾脏细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞融合，经过营养互补筛选，获得能分泌抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1。

8.权利要求2所述的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1的制备方法，其特征在于将分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1在体外进行培养；或将分泌抗重组Sj Enolase蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞JYG-1接种到BALB/c小鼠腹腔，收集细胞培养上清液或小鼠腹水；采用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析法对培养上清液或小鼠腹水的单克隆抗体JYGENmb-1进行纯化，制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性单克隆抗体JYGENmb-1。

9.权利要求3所述检测Sj Enolase蛋白的双抗体夹心酶联免疫学方法，其特征在于以纯化的抗重组Sj Enolase蛋白的单克隆抗体JYGENmb-1为捕获抗体包被酶标板，与待检测样本结合后，再以抗重组Sj Enolase蛋白的多克隆抗体IgG为检测抗体，以辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗进行显色，形成一个检测Sj Enolase蛋白的双抗体夹心间接酶联免疫吸附方法。

10.根据权利要求9所述检测Sj Enolase蛋白的双抗体夹心酶联免疫学方法，其特征在于所述抗重组Sj Enolase蛋白的多克隆抗体的制备，用纯化的重组Sj Enolase蛋白免疫家兔，制备抗血清；采用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析法制备纯化的抗重组Sj Enolase蛋白的特异性多克隆抗体IgG。