CN103333254A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）重组蛋白疫苗i1c的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法。I₁C蛋白为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB和ClfA两个抗原分子的活性功能片段重组融合、大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、盐析、GST亲和层析、PP酶切、Adhere层析、凝胶过滤层析等技术，获得高纯度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白I₁C。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组蛋白疫苗I1C的纯化方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法。

背景技术

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈,全身感染死亡率高达20％，已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。新近研究证明，在MRSA所有致病作用因子中，金黄色葡萄球菌铁元素决定因子B蛋白（Factor B of surface Iron from Staphylococcusaureus,IsdB）不仅是MRSA一个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中起重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具，以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行Ⅱ期临床试验。金黄色葡萄球菌表面凝聚因子蛋白（Clumping factor A,ClfA）ClfA是MRSA非常重要的外膜蛋白，在MRSA感染的第一步粘附定植中起重要作用，针对ClfA单克隆抗体用于被动免疫接种的疫苗已完成Ⅱ期临床试验。

IsdB和ClfA都是MRSA的固有蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。我们已经构建了既能很好去除MRSA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程蛋白I₁C。目前尚未见针对（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白I₁C疫苗纯化方法的报道。

发明内容

本发明的目的：是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

本发明的技术方案是：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法，包括以下步骤：

（1）收集制备的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁C（参见201310021212.3的发明专利申请）；

（2）高压破菌：将收集的可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁C的大肠杆菌菌体以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

（3）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

（4）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、0.5M NaCl、2mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲液缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；

（5）GST亲和纯化：GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A(10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、10%甘油、5mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5)缓冲液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；

（6）Adhere层析纯化：步骤（5）收集的样品，使用A缓冲液平衡层析系统及Adhere层析柱，A缓冲液加1M NaCl，pH7.0-7.5的缓冲液线性梯度洗脱；

（7）凝胶过滤层析纯化：将步骤（6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤层析柱纯化，采用A缓冲液平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

步骤2）所述的高压匀浆破菌采用生产或中试纯化的60-80MPa，高速离心获取破菌上清。

步骤3）中加入硫酸铵分步沉淀再复溶。

步骤5）所述的GST亲和层析使用的填料为GST-Sepharose4B或GST-Sepharose6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose。

步骤5）所述的Prescission Protease酶带有GST标签。

步骤6）所述的Adhere层析柱的填料为Capto^TM Adhere。

步骤7）所述的凝胶过滤层析柱为Superdex75或Superdex200或SuperdexHR10/300。

发明效果

采用本发明所述的纯化方法，从表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98%，回收率大于50%的I₁C，整个纯化过程无需额外再置换缓冲液。经鉴定本发明人构建获得的I₁C分子质量约为46kD。

本发明所述的纯化方法主要有硫酸铵分步沉淀、GST纯化、Adhere层析、凝胶过滤层析，通过处理不同批次的I₁C作12%SDS-PAGE，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为46kD。HPLC C3柱分析呈现单一的峰，纯度在99%以上，等电点在pH4.6左右。不同I₁C肽指纹图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10Sec内波动，说明肽图谱重现性好。纯化后的I₁C与氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现I₁C加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组（PBS组）（P<0.01），证明使用本发明人纯化方法获得的I₁C可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用MRSA国际标准株MRSA252（购自ATCC）感染，发现I₁C加免疫佐剂组感染率为（20）%，阴性对照组（PBS组）感染率为（95）%，计算得出I₁C抗MRSA感染的保护率为（78.9）%。

本发明所述纯化方法工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

附图说明

图1为硫酸铵沉淀SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：全菌；泳道2：破菌上清；泳道3：破菌沉淀；泳道4：30%硫酸铵沉淀后复溶样本；泳道5：40%硫酸铵沉淀后复溶样本；泳道6：30%硫酸铵沉淀后上清；泳道7：40%硫酸铵沉淀后上清；

图2为GST亲和PP酶酶切后SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：PP酶酶切后第一次洗脱样本；泳道2：PP酶酶切后第二次洗脱样本；

图3为Capto Adhere层析图；

图4为Capto Adhere层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：peak1样品；泳道2：peak2样品；泳道3：peak3样品；

图5为Superdex200凝胶过滤层析图；

图6为Superdex200凝胶过滤层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：peak1样品。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作详细描述：

实施例1高压破菌、离心

将本申请人构建的表达可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁C的大肠杆菌工程菌（参见201310021212.3的发明专利申请，该抗原I₁C的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示）通过高密度发酵，目标蛋白表达率为13%，离心收集菌体备用。

菌体200-500g以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液，按重量：体积比1：10比例混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全（破菌率大于96%）。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

实施例2硫酸铵分步沉淀、复溶：

4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入A缓冲液（10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、0.5M NaCl、2mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5），搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；复溶后的样品电泳结果如图1所示，经硫酸铵分步沉淀复溶后I₁C蛋白纯度达到50%左右。

实施例3GST亲和纯化：

选择GST亲和层析填料进行初步纯化，GST亲和填料为GST-Sepharose4B、GST-Sepharose6B、GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP之一，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。

Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶，获取I₁C目的蛋白，电泳结果如图2所示。经过GST初纯，目的蛋白的纯度进一步提高，达到85%左右，仍有待进一步的纯化，除去痕量杂质。

实施例4Adhere层析纯化：

收集实施例3的样品，使用A缓冲液平衡层析系统及Adhere层析柱，A缓冲液、1M NaCl，pH7.0-7.5缓冲液线性梯度洗脱；层析图如图3所示，电泳结果如图4所示，在NaCl浓度为0.1M左右出现的峰主要为目的蛋白，纯度达到95%以上，收集此峰的样品保存在4℃备用。

实施例5凝胶过滤层析纯化：

将实施例4纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex200层析柱纯化，采用A缓冲液平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，置换缓冲液，层析图如图5所示，电泳结果如图6所示，即纯化的抗原在170-200mL左右范围出现的峰为目的蛋白，纯度达到97%以上。由此，收集此峰的样品得到最终的目的蛋白，即纯化的抗原。

纯化后的抗原，做以下实验：

实施例6：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100μL涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（10⁹CFU/ml），相关系数为0.9999。

实施例7：脓毒血症动物模型的构建

SPF级BALB/C4～6周龄雌性小鼠120只，分成阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组，购于北京华阜康公司。

1.将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6～8周龄、体重为18～20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；

2.感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5～1mL，取20μL血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培LB养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。

结果显示于表1：

表1MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h内死亡率为小鼠死亡率为90%,120h内死亡率为小鼠死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%,7天（d）内死亡率为小鼠死亡率为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为1.0～1.25×10⁹CFU。

3.MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为MRSA单个亚单位疫苗和MRSA多亚单位融合疫苗的成功研制及MRSA感染的发病机制的研究奠定了基础。

实施例8：免疫动物及抗体的检测

1.SPF级BALB/C4～6周龄雌性小鼠80只，分成阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组，购于北京华阜康公司。

1）首次免疫，用PBS稀释I₁C蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃，调节I₁C蛋白抗原终浓度至0.4mg/mL；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

2.第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2_a体液应答水平。

1）制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween20，再用PH计将pH调至7.4；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween20，再用PH计将pH调至7.4；

⑤显色液（TMB），为天根公司产品；

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测I₁C重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①用包被液将纯化后的IsdB2重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

③封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，吸干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

⑧加入底物显色液（TMB）100μL/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品／A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：检测I₁C蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:256000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，免疫后第7天的抗体阳性率达到95%；说明I₁C多亚单位重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例9：通过免疫小鼠确定I₁C重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例8的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2

表2显示：为动物免疫试验结果，表中结果显示阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为45.0%、15.0%和5.0%，I₁C融合蛋白加Al(OH)₃佐剂组的免疫保护性为80.0%。

Claims (7)

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）收集制备的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁C；

（2）高压破菌：将收集的可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁C的大肠杆菌菌体以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

（3）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

（4）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、0.5M NaCl、2mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；

（5）GST亲和纯化：GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A(10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、10%甘油、5mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5)缓冲液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；

（6）Adhere层析纯化：步骤（5）收集的样品，使用A缓冲液平衡层析系统及Adhere层析柱，A缓冲液加1M NaCl，pH7.0-7.5缓冲液线性梯度洗脱；

（7）凝胶过滤层析纯化：将步骤（6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤层析柱纯化，采用A缓冲液平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤2）所述的高压匀浆破菌采用生产或中试纯化的60-80MPa，高速离心获取破菌上清。

3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤3）中加入硫酸铵分步沉淀再复溶。

4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤5）所述的GST亲和层析使用的填料为GST-Sepharose4B或GST-Sepharose6B或GST-SepharoseFastFlow或GST-Sepharose。

5.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤5）所述的PrescissionProtease酶带有GST标签。

6.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤6）所述的Adhere层析柱的填料为Capto^TM Adhere。

7.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤7）所述的凝胶过滤层析柱为Superdex75或Superdex200或Superdex HR10/300。

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