CN102898511A

CN102898511A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原i12c制备中的纯化方法

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Publication number: CN102898511A
Application number: CN201210401223XA
Authority: CN
Inventors: 顾江; 邹全明; 曾浩; 董衍东; 樊绍文; 卢陆
Original assignee: CHONGQING YUANLUN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: CN102898511B

Abstract

本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法，其包含步骤：收集制备的所述抗原；高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切、缓冲液置换、Resource Q层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C抗原进行纯化。本发明提供的纯化方法简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明纯化的抗原可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，采用本发明方法纯化的抗原I₁₂C，其纯度≥99%。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I12C制备中的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法。

背景技术

由战创伤及感染引起的全身性炎症反应综合征和脓毒症/脓毒症休克是导致战创伤病人死亡的主要原因之一，其病死率高达50-80％，至今尚无有效防治药物，其中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA)是最常见的感染源之一。随着抗生素长期广泛地使用，金黃色葡萄球菌耐药性问题日益突出，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)就是其中典型代表，因其传播途径广泛，易致暴发流行，又由于其致病性强，多重耐药而成为临床上治疗的难点。自1961年英国首先报道以来，以惊人的速度在世界范围内蔓延。MRSA目前已成为全球ICU病房、烧伤、大型手术等感染率最高的医院內感染病原菌。

来自2011年“MRSA院内感染诊治策略新进展”会议最新的资料显示，我国内地医院MRSA院内感染发生率约为8%，每例院内感染患者平均住院时间延长14天，花费增加6542元，全国每年因医院感染MRSA造成的直接损失超过150亿元。临床上抗MRSA感染治疗面临的挑战不断增加，已很难有效地控制MRSA感染、迅速降低感染患者死亡率。为此，研发确实有效的疫苗，对控制MRSA引起的暴发感染流行，为提高人民健康水平、减轻群众经济负担，都具有显著的理论指导和现实意义。

由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA、IsdB、肠毒素、TSST-1、α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。

发明内容

本发明的目的，是提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组亚单位基因工程疫苗I₁₂C的中试纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高。采用本发明方法纯化的抗原I₁₂C，其纯度≥99%，完成整个纯化过程后无需额外再置换缓冲液，经鉴定本发明人构建获得的I₁₂C分子量约为46kD。

本发明采用了以下步骤：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI2制备中的纯化方法，该抗原I₁₂C的氨基酸序列如(Seq 2)所示，其纯化方法包括以下步骤：

A）收集自构建表达抗原HI₂的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，Resource层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C进行纯化，获得了高纯度的I₁₂C。

所述步骤B具体如下：

1）高压破菌：将高密度发酵的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁₂C的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；

3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80 pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：

5）缓冲液置换：使用缓冲液A（10-20mM PB，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）平衡层析系统及Desalting层析柱，将步骤4）获取的样品通过Desalting层析柱；

6）Resource层析纯化：步骤5）收集的样品，使用缓冲液A平衡层析系统及Resource层析柱，采用换缓冲液B（10-20mM PB，1M Nacl，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）梯度洗脱；

7）凝胶过滤层析纯化：将步骤6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用缓冲液C（10-20mM PBS,pH7.0-7.5）平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

步骤1）所采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，破菌率大于96%，离心获取破菌上清。

步骤2）硫酸铵分步沉淀

步骤3）目的蛋白沉淀复溶；

步骤4）所述的GST亲和纯化，所使用的填料为GST-Sepharose 4B或GST-Sepharose 6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose HP。步骤4）所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除PP酶。

步骤5）Resource层析准备。所用层析柱为HiPrep 26/10 Desalting柱；

步骤6）所述的纯化方法Resource层析的填料为Source15Q；

步骤7）所述的凝胶层析柱为Superdex75或Superdex 200或Superdex HR10/30。

所述抗原是通过以下步骤制备的：

1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码HI2蛋白活性片段的核酸序列；

2）将步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；

3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。

本发明利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。通过重组亚单位疫苗是通过重组表达能够刺激具有保护性免疫反应的抗原分子（主要是蛋白抗原），利用单个成份免疫机体，达到预防和控制疾病的目的。因为其疫苗成份清楚、质量可控、成本较低。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白(iron surface determinant B,IsdB)是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA一个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。凝集因子A(Clumping factorA,ClfA)是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重要的黏附分子之一，能够介导金黄色葡萄球菌与上皮细胞基质蛋白的粘附。此外ClfA还能够与纤维蛋白原和纤维蛋白结合，介导金黄色葡萄球菌抗吞噬效应，在金黄色葡萄球菌引起的宿主疾病中发挥重要作用。

选择的合适的抗原成分是亚单位疫苗研发的最关键的一个部分，申请人通过研究发现将IsdB的两个活性片段（451-831，Seq3）和（1042-1398，Seq5）与ClfA的活性片段（97-639，Seq 7）使用基因工程手段构建融合蛋白I₁₂C。将该蛋白免疫Balb/C小鼠后能够刺激小鼠产生高效价的抗I₁₂C抗体。I₁₂C免疫后小鼠能抵抗致死剂量的MRSA菌株的攻毒。实验表明I₁₂C是一种MRSA的新型重组亚单位疫苗。

采用的本发明所述纯化方法，从表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白I₁₂C的大肠杆菌工程菌中可以获得的纯度超过99%的I₁₂C。完成整个纯化过程后无需额外再置换缓冲液。

参见附图，硫酸铵分步沉淀、GST纯化、缓冲液置换、Resource层析、分子筛各步SDS-PAGE。

通过上述方法纯化的的I₁₂C蛋白用12% SDS-PAGE检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子量约为46kD。HPLC C8柱分析呈现单一的峰，纯度≥在99%。纯化后的I₁₂C与氢氧化铝佐剂注射免疫BalB/C小鼠，发现I₁₂C加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组（PBS组）（P<0.01），证明使用本发明人纯化方法获得的I₁₂C可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用MRSA国际标准株252（购自ATCC）感染，发现I₁₂C加免疫佐剂组感染率为15%，阴性对照组（PBS组）感染率为95%，计算得出I₁₂C抗MRSA感染的保护率为80%。

附图说明

图1基因片段的PCR扩增结果，其中

泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）；泳道1：全基因合成片段I₁₂（758bp）产物；泳道2：目的基因片段I₁₂C(IsdB_451-831 Linker IsdB_1042-1398 LinkerClfA_97-639)（1311bp）；泳道3：ClfA_97-639基因片段(543bp)PCR产物；

图2为表达载体pGEX-6p-2-I₁₂C的酶切鉴定结果：泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）；泳道1-3：重组表达质粒pGEX-6p-2-I₁₂C经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段4000bp和1311bp；

图3为硫酸铵沉淀SDS-PAGE结果图，图中，泳道1：30%硫酸铵上清；泳道2：30%硫酸铵沉淀；泳道3：40%硫酸铵沉淀上清；泳道4：40%硫酸铵沉淀1；泳道5：40%硫酸铵沉淀2；泳道6：硫酸铵沉淀处理前破菌上清；泳道7：标准蛋白；

图4为I₁₂C蛋白GST亲和层析及PP酶切SDS-PAGE结果图，图中，泳道1:GST结合流穿样品1；泳道2：GST结合流穿样品2；泳道3:GST结合PP酶切后PBS洗涤样品1；泳道4：GST结合PP酶切后PBS洗涤样品2；泳道5：GST结合PP酶切后PBS洗涤样品3；泳道6：GST结合PP酶切后PBS洗涤样品4；泳道7：GST结合前样品；泳道9：GST结合PP酶切后填料。泳道9：标准蛋白；

图5为I_I2C蛋白脱盐层析图；

图6为I_I2C蛋白ResourceQ层析图；

图7为I₁₂C蛋白Superder200层析图；

图8为ResourceQ及Superdex200层析纯化效果图，图中，泳道1：标准蛋白；泳道2：Superdex200层析后样品；泳道3：ResourceQ层析后样品；泳道4：GST亲和PP酶切后样品；

图9为I₁₂C HPLC检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细描述：

本实施例所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；

2.试剂

1)胰蛋白胨、酵母提取物	英国Oxoid公司
		2)EB	美国Sigma公司

BamH I、Not I

实施例1：表达I₁₂C工程菌的构建

抗原I₁₂C的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

1.-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒（上海生工）抽提MRSA基因组。

2.采用PCR方法自合成模板I₁₂扩增I₁₂-Linker-基因片段，扩增步骤如下：

1）设计PCR引物P1、P2，分别为SEQ ID NO：9-10，其中，P1（5’-GCGGATCCATGGGCAGCGCACCAAACTCTCG-3’）及P2（5’-GCTTCTTTACTGCTGCTGCCACCGCCACCGGCATTGGCTTTAGTAAA-3’）。

2）用合成模板I₁₂ PCR扩增I₁₂-Linker基因片段(Seq 3，Accession：CAG40104,上海生工公司合成)。

3）PCR体系：

模板(50ng/μl)	2.5μl
		P1(50μM)	1μl
P2(50μM)	1μl
		Taq酶	2.5μl
dNTP	2μl
		Buffer	15μl
灭菌双蒸水	26μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性20s，68℃退火40s，72℃延伸2.5min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。

4）使用凝胶回收试剂盒回收I₁₂-Linker-PCR产物。

3.采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增-Linker-ClfA_97–639基因片段(Seq 5，Accession：CAG39851,上海生工公司合成)，扩增步骤如下：

1）设计PCR并合成引物P3、P4，分别为SEQ ID NO：11-12，其中，P3(5’-GCCAATGCCGGTGGCGGTGGCAGCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCA-3’)及P4(5’-ATGCGGCCGCTTATCACTCGAGCATACGAGGCGCAC-3’)，上海生工生物公司合成

2）以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增ClfA_97-639基因片段。

3）PCR体系：

模板(100ng/μl)	2.5μl
		P3(50μM)	1μl
P4(50μM)	1μl
		Taq酶	2.5μl
dNTP	2μl
		Buffer	15μl
灭菌双蒸水	26μl
		总体积	50μl

4）使用凝胶回收试剂盒回收-Linker-ClfA_97-639PCR产物。

4.采用重叠延生PCR方法，以I₁₂-Linker-及-Linker-ClfA_97-639为模板，重叠延生PCR方法扩增出I₁₂C基因片段。

1）PCR体系：

模板1 I₁₂-Linker-（50ng/μl）	1μl
		模板2)-Linker-Clf_A97-639（50ng/μl）	1μl
P1(50μM)	1μl
		P4(50μM)	1μl
Taq酶	2.5μl
		dNTP	2μl
Buffer	15μl
		灭菌双蒸水	26μl
总体积	50μl

2)PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性20s，65℃退火40s，72℃延伸1min40s，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增I₁₂C结果示于图1中。

3)使用凝胶回收试剂盒回收I₁₂C基因PCR产物。

5.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和I₁₂C PCR产物酶切反应体系：

BamH I	3μl
		Not I	3μl
10×K Buffer	3μl
		0.1%BSA	6μl
Product	45μl
		总体积	60μl

37℃酶切4h。

2）使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3）连接和转化

通过紫外分光光度计测定I₁₂C酶切回收产物核酸浓度：34ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2~10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

T4 DNA Ligase	0.5μl
		T4 DNA Ligase Buffer	1μl
I₁₂C酶切回收产物	8.2μl
		PGEX-6P-2酶切回收产物	0.3μl
总体积	10μl

混匀，16℃连接1.5h。

4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入“此实施例步骤4中3）”步所得的DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取150μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5）pGEX-6p-2/I₁₂C阳性重组质粒的筛选、鉴定

（1）阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

（2）质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

（3）质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

BamHI	0.5μl
		Not I	0.5μl
10×K Buffer	0.5μl

0.1%BSA	1μl
		重组质粒	8μl
总体积	12.5μl

37℃酶切2h；

（4）1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道4样品为构建成功的pGEX-6p-2/I₁₂C重组质粒；

5）pGEX-6p-2/I₁₂C重组质粒转化进入工程菌BL21中。

从-80℃冰箱取3管大肠杆菌工程菌BL21感受态细胞，加入pGEX-6P-2/I₁₂C质粒，冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。

以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取150μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。挑取阳性克隆，-70℃、20%甘油保存备用。

实施例2：表达I₁₂C工程菌的高密度发酵。

1）发酵用MRSA疫苗工程菌的复苏、活化与鉴定

（1）MRSA疫苗工程菌菌种的复苏

取-70℃、20%甘油保存的菌种100μl，接种于含A+LB固体培养基的平板中，37℃，过夜。待长出菌落后，放4℃保存。

（2）种子菌的活化

挑取形态大小均一的单菌落接种于含5ml A+LB培养基的药瓶中，37℃、200r/min培养5－7h，OD600达0.6-0.8，成为活化菌，4℃保存。

（3）种子菌的检定

取活化菌分别做形态学检测、革兰氏染色检测、抗生素抗性检测、生化反应检测，进行菌种检定。

2）种子菌的制备

菌种检定完全合格后，进行种子菌的制备。取活化菌接种于摇瓶用TB培养基中，37℃、200rpm/min，过夜，待OD600达2－3时种子菌制备完成。15L发酵罐准备1L种子菌。

3）发酵前的准备

（1）配制发酵用TB培养基及补料：15L发酵罐准备9L培养基、300ml补料。

（2）罐外高压灭菌酸、碱、补料瓶，漏斗及硫酸镁、补料。罐内高压TB培养基。

（3）校准PH、PO2电极：高压前用标准缓冲液校准PH电极7.0和4.0；高压中温度升至121℃后，校准PO2电极0%，发酵前各个参数设置完后，PO2值稳定时校100%。

（4）高压完后，温度降至37℃时，加入氨苄青霉素至100μg/ml。

4）发酵

（1）初始参数设置：

温度（℃）	转速(rpm)	pH	空气(L/min)
				37	500	7.40	14－28

（2）加入硫酸镁、种子菌开始发酵。随着菌体密度的增大、耗氧的升高，转速改为与溶氧控制关联，即以PO2控制器为主控制器，搅拌控制器为伺服控制器（转速范围300－800RPM）。PO2始终控制在45%左右。

（3）当转速达800 RPM后，改为纯氧与溶氧控制关联，即纯氧控制器为伺服控制器，PO2始终控制在45%左右。

（4）监视PH、PO2值，当两值都快速上升时，甘油消耗完，调节温度：25℃，加入0.2mM IPTG，开启补料，诱导开始。

（5）诱导时间为5h，期间通过调节补料速度，使菌达到一个生长表达平衡。

5）收集菌体

6000g离心20min，称重后分装，-70℃冻存备用。

实施例3：表达I₁₂C工程菌的高压破菌、离心

将本申请人构建的表达可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁₂C的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，目标蛋白表达率为13%，离心收集菌体备用。

菌体200-500g以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液，按重量：体积比1：10比例混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000离心15-30min，收集上清备用。

实施例4：重组I₁₂C的硫酸铵分步沉淀、复溶：

4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)0.5% Tween80缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；

实施例5：重组I₁₂C的GST亲和纯化：

选择GST亲和层析填料进行初步纯化，GST亲和填料为GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP之一，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。

Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：

实施例6：重组I₁₂C的的Desalting层析纯化

将HIPREP 26/10 Desalting column(柱体积24ml)连接到AKTA explorer-10层析系统，对目标蛋白进行纯化。使用A液(20mmol/L Tris，25mM NaCl,5%glycerol,pH8.0)平衡柱子及上样，收集目的蛋白洗脱峰。

实施例7：重组I₁₂C的ResourceQ层析纯化

将阴离子交换柱Resource Q及连接到AKTA explorer-10层析系统，对I₁₂C进行纯化。使用A液(10mmol/L Tris，25mol/L NaCl，5% glycerol，pH 8.0)平衡柱子及上样，B液(10mmol/L Tris，1mol/L NaCl，5% glycerol，pH 8.0)洗脱，设定洗脱洗脱梯度为120min B%从0到100%，收集洗脱下来的目的蛋白。

实施例8：

重组I₁₂C的凝胶过滤层析纯化：实施例7纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用PBS(10-20mM，pH7-7.5)平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，置换缓冲液，分离纯化目标蛋白。

实施例9：I₁₂C的HPLC检测

将C18柱连接到Agilent-1100高效液相分析系统，对I₁₂C进行检测。使用0.1%TFA水平衡柱子，上样10ul样品，0.1%TFA乙腈洗脱，设定柱温30℃，流速0.25ml/min。洗脱洗脱梯度为30min B%从0到100%，记录层析曲线并通过曲线测算出I₁₂C的纯度。

实施例10：免疫动物及抗体的检测

1.免疫动物

1）首次免疫，用PBS稀释I₁₂C蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃，调节I₁₂C蛋白抗原终浓度至0.4mg/mL；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100uL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

2．第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后血清总IgG水平。

1）制备液体

（1）包被液的配制：称取NaHCO₃ 1.6g，Na₂CO₃ 2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

（2）封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

（3）抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

（4）洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

（5）显色液（TMB），为天根公司产品；

（6）终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测I₁₂C重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

（1）用包被液将纯化后的IsdB2重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

（2）包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200uL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

（3）封闭：酶标板加封闭液100uL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

（4）将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

（5）取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100uL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

（6）将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

（7）加入稀释抗体工作液，100uL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

（8）加入底物显色液（TMB）100uL/孔，室温避光反应5min；

（9）加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：检测I₁₂C蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:256000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，免疫后第7天的抗体阳性率达到95%；说明本发明构建的I₁₂C多亚单位重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例11：通过免疫小鼠确定I₁₂C重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率和保护率。保护率计算公式为存活率=（实验组存活数-对照组存活数）/实验组数×100%结果示于表2。

表2

表2显示：为动物免疫试验结果，表中结果显示阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为45.0%、15.0%和5.0%，I₁₂C融合蛋白加Al(OH)₃佐剂组的免疫保护性为85.0%。

Claims

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法，其特征在于，该抗原I₁₂C的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其纯化方法包括以下步骤：

A）收集自构建表达抗原I₁₂C的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切、缓冲液置换、Resource层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C进行纯化，获得了高纯度的I₁₂C。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤B具体如下：

1）高压破菌：将高密度发酵的抗原I₁₂C的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤1）所采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，破菌率大于96%，离心获取破菌上清。

4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤2）硫酸铵分步沉淀。

5.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤3）目的蛋白沉淀复溶。

6.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤4）所述的GST亲和纯化，所使用的填料为GST-Sepharose 4B或GST-Sepharose 6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose HP。步骤4）所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除PP酶。

7.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤5）Resource层析准备。所用层析柱为HiPrep 26/10 Desalting柱。

8.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤6）所述的纯化方法Resource层析的填料为Source15Q。

9.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤7）所述的凝胶层析柱为Superdex75或Superdex 200或Superdex HR 10/30。

10.根据权利要求1至9任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的：

3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。