CN102181457B - 密码子优化的艰难梭菌外毒素b氨基端基因序列及其核酸疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列及其核酸疫苗。该密码子优化基因序列兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好，所涉及的艰难梭菌疫苗由密码子优化的外毒素B氨基端基因序列和真核表达载体pJW4303组成。经密码子优化后的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列，不但可以用于构建核酸疫苗，在免疫哺乳动物后有效地刺激了宿主的免疫系统，产生了特异的体液免疫反应，而且体内、体外模型显示这些特异性抗体具有良好的保护效应；而且也适用于在大肠杆菌中对其进行蛋白的原核表达，为以后该蛋白的大量获取奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列及其核酸疫苗。
背景技术
艰难梭菌是一种有芽胞的、专性厌氧的革兰氏染色阳性梭状杆菌，其主要的毒力因子为外毒素A和外毒素B。自2000年以来，艰难梭菌相关性腹泻已经成为医学界一个亟需解决的难题。一方面，艰难梭菌感染发病率、重症率、死亡率越来越高，耐药率也逐年上升。首先，艰难梭菌广泛存在于医院环境中，而且其能够耐受多种院内常用消毒剂的芽胞这一特殊生存状态的存在加剧了它在医院内的播散，艰难梭菌已经成为院内感染性腹泻的最主要的病原体之一。其次，甲硝唑、万古霉素，作为治疗艰难梭菌感染的两种主要的药物，它们的耐药性也在不断地累积、传播，疗效日趋降低，而且对于复发病例的治疗，这两种药物呈现出无能状态。另外一方面，艰难梭菌感染形势异常严峻但其预防、诊断、治疗却面临着重重困难。第一，目前尚无针对艰难梭菌的商品化的疫苗；第二，现有的基于外毒素A和B的ELISA检测试剂盒价格昂贵且存在着一定的假阳性和假阴性率，难以对艰难梭菌进行临床常规检测并且也难以进行大规模的流行病学调查和长期的监测；第三，虽然新近已有针对外毒素A和外毒素B羧基端的治疗性单克隆抗体问世，但仍处在早期临床试验阶段，所呈现的治疗效果也有一定的局限性。所以，急需开发以艰难梭菌外毒素B为基础的安全、有效、方便、廉价的艰难梭菌疫苗来保护高危人群；同时，争取在疫苗的基础上开发相应的单克隆抗体，为灵敏度高、特异性好、高效、经济的诊断试剂及安全、有效、廉价的治疗性抗体打下扎实基础。
艰难梭菌外毒素B是一种强烈的细胞毒素。传统观点认为外毒素A是艰难梭菌致病所必需的而外毒素B则可有可无，但最近的一些研究结果却提示外毒素A阴性、外毒素B阳性的菌株与外毒素A和B均阳性的菌株一样也能致病，且有研究发现外毒素B可以不依赖于外毒素A而独立致病，尤其值得注意的是：外毒素A阴性、外毒素B阳性菌株的分离率有增高的趋势但迄今为止尚未发现外毒素A阳性、外毒素B阴性的菌株。基于此，疫苗的开发必须包括外毒素B、诊断的时候必须强调外毒素B、治疗的时候必须同时针对外毒素B。外毒素B氨基端的546个氨基酸构成了其毒性区域，即外毒素B的毒性作用依赖于这一区域所具有的酶活性，通过一系列信号转导最终导致细胞凋亡。而且有研究发现，即使将外毒素B羧基端的受体结合域去除，外毒素B的毒性作用不会完全消失，只是降为原来的1/10左右。所以，艰难梭菌外毒素B氨基端是疫苗研究和抗体开发的理想结构域。目前针对这一区域具有体内中和效应的抗体还尚未见报到。
核酸疫苗(nucleic vaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)，其本质是含有抗原基因的真核表达载体被导入动物机体后为动物细胞所摄取并表达相应的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白产生免疫反应。它以其独特的优点吸引着人们：1)DNA免疫能够模拟自然感染状态，在动物体内合成具有相应空间构象的蛋白，通过MHC I类和II类分子直接递呈，能够激发机体产生既针对线性表位又针对构象表位的抗体，还能够诱导产生特异性的细胞免疫反应，这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的；2)免疫原的单一性和可塑性。相对于重组的病毒活载体疫苗会表达除了目的蛋白外的其他很多蛋白，核酸疫苗的载体本身没有抗原性而且在真核细胞内只表达相应的目的抗原。同时，正是其以DNA为免疫原，所以可在DNA水平对密码子进行优化、修饰，可以进行不同基因的融合表达，构建更高效的疫苗；3)核酸疫苗易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，适合于大规模生产。
但是，用来构建外毒素B核酸疫苗的目的基因是来自于艰难梭菌这一原核生物的，而疫苗的研究和应用对象主要为真核生物，如小鼠、猕猴、人类等高级哺乳动物。由于原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致用来构建核酸疫苗的外源基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，因此就不能有效地刺激宿主的免疫系统产生较好的免疫保护作用。这是目前核酸疫苗免疫原性较低的主要原因。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列。
本发明的另一目的是提供一种由上述基因构建的艰难梭菌外毒素核酸疫苗。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列，序列为SEQ ID NO.1。
一种艰难梭菌外毒素B核酸疫苗，该疫苗由权利要求1所述的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列与真核表达载体组成。
所述的真核表达载体为pJW4303。
一种核酸疫苗组合物，该组合物包括权利要求3所述的艰难梭菌外毒素B核酸疫苗pJW4303-TcdB-N以及艰难梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C。
所述的艰难梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C是将经密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列插入真核表达载体pJW4303的Pst I和BamH I酶切位点之间所得。
所述的经密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列为SEQ ID NO.4。
艰难梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C的构建方法详见中国发明专利申请201010130904.8“密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗”。
本发明提供的密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因片段及其核酸疫苗的构建步骤如下：
(1)密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因片段的设计和合成
首先选取艰难梭菌外毒素B基因氨基端1638bp，然后运用软件MacVector 7.2分析其基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好、与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点。对于哺乳动物和大肠杆菌使用偏好相同的密码子，用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代艰难梭菌外毒素B基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端序列，并经过基因公司化学合成得到了密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列。密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)保持一致。例如：艰难梭菌外毒素B基因中编码异亮氨酸Ile的三联体密码子主要是ATT，而在人类、小鼠等高级哺乳动物基因组中主要是ATC，在大肠杆菌中也主要是ATC，在密码子优化时会选用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子ATC。优化后的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列为SEQ ID NO.1，优化前的序列为SEQ ID NO.2。
(2)对基因公司提供的含有目标序列的重组载体pMK-RQ-TcdB-N进行Pst I和BamH I双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKa Ra Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0，大连宝生物公司)回收纯化约1638bp的目的片段，该片段为在密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列(TcdB-N)两端分别连接有Pst I和BamH I酶切位点的基因序列，以便于核酸疫苗的构建。
(3)将步骤(2)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-TcdB-N。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒即为本发明所述的艰难梭菌外毒素核酸疫苗。
本发明的有益效果：
与野生型基因相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子和大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的艰难梭菌外毒素B氨基端氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的蛋白表达。
由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的艰难梭菌外毒素B氨基端基因在异源宿主体内难以有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物和大肠杆菌中的表达效率，往往需要对其核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列的优化尚没有统一的标准或原则。因此针对相同的氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标多肽的表达，相应地表达效率也可能存在差异。根据我们优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了艰难梭菌外毒素B氨基端蛋白表达水平。并且将该优化后的基因用于构建核酸疫苗，在免疫哺乳动物后有效地刺激了宿主的免疫系统，产生了较好的体液免疫反应，并在体内、体外的模型中显示出了良好的保护能力。
发明人将经过密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因直接克隆入真核表达载体，构建了艰难梭菌外毒素核酸疫苗pJW4303-TcdB-N，该疫苗能够在真核细胞293T细胞中有效表达，免疫动物能刺激产生特异性抗体，并且体内、体外模型显示这些特异性抗体具有良好的保护效应。
本发明疫苗组合物在充分发挥艰难梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C作用的前提下，克服了两种核酸疫苗单用时对动物保护作用均不强的缺陷，显著提高了疫苗的保护作用。
附图说明
图1野生型和密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列的密码子偏好性比较结果；
A为野生型和密码子优化型艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列在哺乳动物细胞表达偏好的比较(指数＞1为哺乳动物细胞所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。
左图为野生型艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列，右图为密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列。
B为野生型和密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列在大肠杆菌表达偏好的比较(指数＞1为大肠杆菌所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列，右图为密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列。
图2质粒pJW4303-TcdB-N的酶切电泳图谱；
M，marker；1、3、5、7、9泳道分别为第一、二、三、四、五号克隆未经酶切的电泳图；2、4、6、8、10泳道分别为第一、二、三、四、五号克隆经Pst I和BamH I双酶切的电泳图。
图3转染pJW4303-TcdB-N的293T细胞目的蛋白表达的Western blot分析结果；
1：pJW4303-TcdB-N转染裂解液；2：pJW4303-TcdB-N转染上清；3：pJW4303转染裂解液；4：pJW4303转染上清。抗原为pJW4303空载体、pJW4303-TcdB-N转染293T细胞的培养上清或者裂解液，所用抗血清为免疫兔血清，稀释度为1∶500。
图4pJW4303、pJW4303-TcdB-N免疫BALB/c小鼠后IgG抗体应答时间曲线；
A为pJW4303免疫BALB/c小鼠后的IgG抗体应答时间曲线，共7只小鼠(M1-M7)；
B为pJW4303-TcdB-N免疫BALB/c小鼠后的IgG抗体应答时间曲线，共6只小鼠(M8-M13)。
图5pJW4303-TcdB-N免疫新西兰白兔后的Western blot分析结果；
1：pJW4303-TcdB-N转染裂解液；2：pJW4303-TcdB-N转染上清；3：pJW4303转染裂解液；4：pJW4303转染上清。抗原为pJW4303空载体、pJW4303-TcdB-N转染293T细胞的培养上清或者裂解液，所用一抗为免疫兔血清，稀释度为1∶500。
图6pJW4303、pJW4303-TcdB-N免疫新西兰白兔后特异性IgG抗体最高滴度
pJW4303表示空载体免疫新西兰白兔后的特异性IgG抗体最高滴度，共5只新西兰白兔；
pJW4303-TcdB-N表示pJW4303-TcdB-N DNA疫苗免疫新西兰白兔后的特异性IgG抗体最高滴度，共4只新西兰白兔。
图7pJW4303-TcdB-N免疫兔血清在Vero细胞系上的毒素中和试验；
A图：细胞形态图，其中1，细胞孔内未加4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(正常细胞对照)；2，细胞孔内只加入4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(毒素对照)；3，细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物与1∶200稀释的pJW4303-TcdB-N免疫兔血清预混物；4，细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI10463培养液超滤物与1∶100稀释的pJW4303免疫兔血清预混物。
B图：pJW4303-TcdB-N免疫兔血清的中和抗体滴度。
图8pJW4303-TcdB-N免疫兔血清在CHO细胞系上的毒素中和试验；
A图：细胞形态图，其中1，细胞孔内未加4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(正常细胞对照)；2，细胞孔内只加入4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(毒素对照)；3，细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物与1∶200稀释的pJW4303-TcdB-N免疫兔血清预混物；4，细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI10463培养液超滤物与1∶100稀释的pJW4303免疫兔血清预混物。
B图：pJW4303-TcdB-N免疫兔血清的中和抗体滴度。
图9pJW4303-TcdB-N免疫兔血清在BALB/c小鼠上的被动保护试验；
BALB/c小鼠腹腔注射攻毒内容物，“None”为艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200 100μl；“TcdB-N”为艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200100μl+pJW4303-TcdB-N免疫后兔血清11μl；“TcdA-C”为艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200 100μl+pJW4303-TcdA-C免疫后兔血清11μl；“TcdB-N+TcdA-C”为艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200 100μl+pJW4303-TcdA-C免疫后兔血清11μl+pJW4303-TcdB-N免疫后兔血清11μl；“Pre-bleed”为艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200 100μl+pJW4303-TcdA-C免疫前兔血清5.5μl+pJW4303-TcdB-N免疫前兔血清5.5μl。
注：pJW4303-TcdA-C为由艰难梭菌外毒素A羧基端经密码子优化后的基因序列与真核表达载体pJW4303构建而成的艰难梭菌外毒素核酸疫苗，其制备方法见中国专利申请201010130904.8。
具体实施方式
实施例1密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列的设计与合成
首先用软件MacVector 7.2分析编码艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列SEQ ID NO.2，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物、大肠杆菌密码子使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子替代，设计出密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列SEQ ID NO.1。上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与其原有的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)一致。将设计好的序列交美国GENEART公司合成，装入载体pMK-RQ，构建成重组质粒pMK-RQ-TcdB-N。经测序证实合成的序列正确。
上述密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列与野生型比较密码子偏好性发生了改变。从图1中由软件MacVector 7.2模拟出的结果可以看出，与野生型基因(未经密码子优化)相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子和大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的蛋白表达。
实施例2真核表达载体pJW4303-TcdB-N的构建
1)TcdB-N片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：分别用Pst I和BamH I双酶切质粒pJW4303和pMK-RQ-TcdB-N(由美国GENEART公司合成)。酶切反应体系为：10×BufferTangoTM 4μl，质粒(pJW4303、pMK-RQ-TcdB-N)10μl，Pst I 1.5μl，BamH I 1.5μl，补水至40μl，37℃，2h。
2)酶切产物纯化：上述酶切产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外检测仪下，按照凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0，大连宝生物公司)说明书，切下含目的片段的凝胶，分析天平称胶块的质量，按1mg＝1μl计算胶块的体积。加入4倍体积的DR-I Buffer，置于75℃水浴中加热融化胶块，间断振荡混合，直至胶块完全融化，加入DR-I Buffer 1/2体积的DR-II Buffer，充分混匀溶液。将离心吸附柱安置在收集管上，转移混合溶液至吸附柱中，12000rpm，离心1min。弃上清液，加入500μl Rinse A液，12000rpm，离心30s。弃上清液，加入700μl Rinse B液，12000rpm，离心30s，重复洗涤一次。将吸附柱安置在新的Ep管上，在吸附柱的膜中央滴加25μl灭菌蒸馏水，静置60s。12000rpm，离心1min，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液的浓度，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20℃冰箱中备用。
3)连接反应：用T4DNA连接酶将TcdB-N目的片段与质粒pJW4303线性大片段连接，得到pJW4303-TcdB-N重组表达质粒，即为本发明所提供的艰难梭菌外毒素B氨基端的核酸疫苗。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，线性化的pJW4303 1μl，纯化的TcdB-N目的片段7μl，T4DNALigase 1μl，混匀，15℃放置16h。连接物转化HB101感受态细胞。
实施例3重组质粒pJW4303-TcdB-N的鉴定
3.1pJW4303-TcdB-N转化大肠杆菌HB101感受态细胞(美国标准生物品收藏中心，美国)
1)将10μl连接物加入到装有100μl HB101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，冰浴30min。
2)将Ep管置于42℃水浴中90s。
3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0.5mL，37℃，80rpm，振摇45min。
4)将菌液涂布在含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB平板上，37℃，培养过夜。
3.2筛选阳性克隆
随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含0.1g/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37℃，200rpm振摇，培养过夜。
3.3小量提取重组质粒pJW4303-TcdB-N(质粒小量提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.2.0，TaKaRa公司)
1)将3.2中摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4℃。
2)离心管中菌液，常温下12000rpm离心2min，弃上清。
3)加入250μl Solution I充分悬浮细菌沉淀。
4)加入250μl Solution II，温和颠倒5-6次，形成透明溶液。
5)加入400μl 4℃预冷的Solution III，温和颠倒5-6次，然后室温静置2min。
6)室温12000rpm，离心10min。
7)Spin Column安置于Collection Tube上，将6)中上清液加入到Spin Column中，12000rpm离心1min，弃上清。
8)将500μl Rinse A加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃上清。
9)将700μl Rinse B加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃上清。
10)重复步骤9。
11)将Spin Column安置在1.5ml Ep上，在膜中央滴加60μl的灭菌蒸馏水，室温静置1min
12)12000rpm离心1min，洗脱液即为含有质粒的溶液。
3.4酶切鉴定质粒pJW4303-TcdB-N
质粒pJW4303-TcdB-N用Pst I和BamH I双酶切。双酶切反应体系(10μl)：10×BufferTangoTM 1μl，质粒(0.22mg/mL)2μl，Pst I 0.25μl，BamH I 0.25μl，补水至10μl。37℃孵育2h。加入1μl 10×Loading buffer终止酶切反应。10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图2。图2显示5个克隆均构建正确。将酶切鉴定正确的细菌送上海英骏公司测序，测序正确细菌划三次平板，任选其中两个单克隆细菌保存。
实施例4质粒pJW4303-TcdB-N的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，Qiagen公司)
1)吸取鉴定正确的细菌保存液5μl接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。
2)按1∶500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200rpm，过夜生长。
3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4℃，6000g离心15min，弃上清，收集细菌。
4)加入50ml缓冲液P1，反复振摇，使细菌全部重悬于溶液中。
5)加入50ml缓冲液P2，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。
6)加入50ml缓冲液P3，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。
7)4℃，21000g，离心30min，
8)将上清转移至另一离心瓶，4℃，21000g，离心15min。
9)在吸附柱中加入QBT缓冲液35ml平衡吸附柱。
10)将步骤8中得到的上清加到吸附柱内，滤过，弃滤液。
11)加入洗涤缓冲液QC 200ml，过柱，弃滤液。
12)加入洗脱缓冲液QF 35ml，过柱，收集滤液。
13)向收集液体中加入24.5ml异丙醇，4℃，16000g，离心30min，弃上清。
14)加7ml 70％乙醇，常温16000g离心10min，弃上清。
15)将有沉淀的离心管于超净台自然晾干，然后用1ml生理盐水溶解质粒团块。
16)紫外分光光度法测定抽提所得溶液中的质粒浓度及260/280比值。
实施例5细胞转染
293T细胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及10％胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以5.0×106个细胞(6mL)接种于10cm培养皿中，待生长至80％融合时，依据PEI转染法进行细胞转染。取PEI 75μl，pJW4303-TcdB-N 15μg，加含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基至825μl，充分混匀，室温孵育15min，然后将上述混合液加到培养皿中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染293T细胞作为阴性对照。8h后更换不含血清含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM培养液。继续培养48h后收获培养上清及细胞裂解液，进行Western blot分析。分析结果如图3所示。图3中显示pJW4303-TcdB-N转染293T细胞后可在上清及细胞裂解液中检出特异性蛋白的表达，其表观分子量约为63.4kDa。阴性对照空载体pJW4303转染293T细胞的上清及裂解液没有检出特异性蛋白的存在。Western blot分析表明，pJW4303-TcdB-N核酸疫苗可以在293T细胞内表达相应的蛋白并分泌出来。说明经密码子优化后的核酸疫苗能在宿主细胞中表达蛋白。
其中，转染细胞收获步骤为：吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心10min，吸取上清-20℃冻存。用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl PH7.6，150mM NaCl，1％Triton，临用前加入2％100mM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育15min，12000rpm，4℃，离心60min，收集上清液，-20℃冻存。
实施例6密码子优化pJW4303-TcdB-N核酸疫苗免疫原性的研究
在核酸疫苗构建和表达成功后，对实验动物进行免疫，通过ELISA和Western blot方法检测密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端核酸疫苗的免疫原性和诱导产生的抗体的特异性。
6.1pJW4303-TcdB-N免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔，实验设计如下：
表1pJW4303-TcdB-N免疫BALB/c小鼠
| 组别 | 数量(只) | 核酸疫苗 | 剂量 |
| A | 7 | 空载体pJW4303 | 100μg |
| B | 6 | pJW4303-TcdB-N | 100μg |
如表1，用空载体pJW4303和pJW4303-TcdB-N各免疫一组BALB/c小鼠。肌肉注射100μg相应质粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(针头插入深度至少2mm，电转染参数：电压50V，脉冲次数正反各3次，波宽30ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行DNA免疫，于每次免疫前、第6周、末次免疫后两周采血。
表2pJW4303-TcdB-N免疫新西兰白兔
| 组别 | 数量(只) | 核酸疫苗 | 剂量 |
| A | 5 | 空载体pJW4303 | 200μg |
| B | 4 | pJW4303-TcdB-N | 200μg |
如表2，用空载体pJW4303和pJW4303-TcdB-N各免疫一组新西兰白兔。肌肉注射200μg相应质粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(针头插入深度至少2mm，电转染参数：电压100V，脉冲次数正反各6次，波宽60ms，频率60Hz)，以兔子腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行DNA免疫，于每次免疫前、第6周、末次免疫后两周采血。
6.2ELISA检测血清中TcdB-N特异性IgG
用ELISA方法检测血清中特异的IgG抗体反应，评价pJW4303-TcdB-N核酸疫苗在BALB/c小鼠、新西兰白兔模型中诱导产生体液免疫的能力。
1)pJW4303-TcdB-N转染产物作为抗原包被ELISA板(使用PBS pH7.2-7.4作为包被液，转染上清1∶5稀释，转染裂解1∶10稀释)，每孔100μl，4℃，过夜。
2)弃包被液，用1XPBST洗板5次(PBST构成为10mMPBS和0.05％Tween-20)。
3)5％脱脂奶粉(PBS，0.05％Tween-20，5％脱脂奶粉)37℃，封闭1h，每孔200μl。
4)弃封闭液，用1XPBST洗板5次。
5)一抗为待检测血清，稀释度为1∶200。每孔加入100μl，37℃，孵育1h(一抗稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。
6)弃一抗，用1XPBST洗板5次。
7)二抗为HRP标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，稀释度为1∶5000，每孔加入100μl，37℃，孵育1h(二抗稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。
8)弃二抗，用1XPBST洗板5次。
9)TMB显色(TMB溶液配方：TMB片剂1片，0.1M磷酸枸橼酸缓冲液(pH值为5.0)5ml，双蒸水5ml，30％双氧水2μl)，每孔加入100μl，室温，3.5min，每孔加入50μl 1M的H2SO4终止显色。
10)酶标仪测定并记录各孔A450值，计算复孔平均值，以免疫前血清OD值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0.05也去除。
BALB/c小鼠血清TcdB-N特异性IgG抗体应答时间曲线如图4所示。在pJW4303-TcdB-NDNA疫苗免疫后，所有(6只小鼠)免疫血清中均可检测到TcdB-N特异性IgG，且随着免疫次数的增加，免疫应答强度提高。和预期的一样，所有7只pJW4303空载体免疫BALB/c小鼠的血清未检测到TcdB-N特异的抗体应答。
新西兰白兔血清TcdB-N特异性IgG抗体最高滴度如图6所示。图中显示第四次免疫后2周的兔血清中，TcdB-N免疫组有较高滴度的特异性抗体，而pJW4303空载体免疫组则未检测到抗体应答，两组相比具有统计学差异(p＜0.05)。
6.3Western blot检测血清中TcdB-N特异性IgG
1)pJW4303-TcdB-N转染293T细胞裂解及上清、pJW4303转染293T细胞裂解及上清各20μl，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸10min。
2)制备15％的分离胶(7.5ml 30％丙烯酰胺溶液，3.7ml 1MTris/Cl pH8.8，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，灌胶，液面顶端加水，室温下聚合20～30min。
3)倒弃水，再制备5％的积层胶(960μl 30％丙烯酰胺溶液，740μl 1MTris/Cl PH6.8，60μl10％SDS，60μl 10％过硫酸氨，5μl TEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。
4)将上述处理好的样品加入胶孔中进行电泳，先20mA，1h，然后40mA，2h。
5)100V，1h，将胶上的蛋白转到PVDF膜上。
6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，37℃，1h。
7)用1xPBST洗膜两次。
8)将膜浸在1∶500稀释的兔血清(一抗)中，4℃，过夜。
9)弃掉血清，用1xPBST洗膜6次，每次间隔10min。
10)弃掉洗液，加入1∶5000稀释HPR标记的羊抗兔IgG(二抗)，37℃，1h。
11)弃掉二抗，用1xPBST洗膜6次，每次间隔10min。
12)发光剂加到膜上，暗室显影。
结果见图5：可以在pJW4303-TcdB-N DNA疫苗免疫新西兰白兔后获得的血清中检出特异性抗体，其表观分子量约为63.4kDa，而且这些抗体与pJW4303转染的上清、裂解均无反应。
实施例7细胞毒性试验
7.1从培养上清部分纯化毒素
1)将艰难梭菌VPI 10463(美国标准生物品收藏中心，
编号：43255TM，下同)接种于bioMérieux公司的BacT/
SN 259790培养瓶中(胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，40m1)，37℃，过夜培养。
2)取1)中菌液1ml接种于BacT/
SN 259790培养瓶，37℃，72h。
3)收获菌液，4℃，6000g，离心15min。
4)取上清，0.45um滤器过滤。
5)以Amicon Mltra-15 Centrifugal Filter Unit with Mltracel-100membrane对上述过滤液进行超滤浓缩，离心条件为：4℃，5000g，30min。浓缩液置于-70℃保存。
7.2细胞毒性试验
1)Vero、CHO细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，中国)用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10％热灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内培养至对数生长期。
2)用2.5g/L胰酶消化后，以1×104/孔接种于96孔培养板，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内培养24h。
3)弃去培养基，加入200μl 37℃预热的PBS洗涤一遍。
4)以含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10％热灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基连续2倍稀释7.1中所获艰难梭菌培养液超滤浓缩物，每个浓度稀释液按照100μl/孔、3个复孔的规律加入到96孔细胞培养皿中；对照孔加不含毒素的培养基。37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内培养24h。
5)24h后在Nikon ECLIPSE TE2000-S显微镜下观察细胞形态。将导致孔内细胞全部圆缩化的毒素最低剂量定义为1CTU(cytotoxic unit)。
7.3毒素中和试验
1)准备Vero、CHO细胞，步骤同7.2的1)、2)、3)。
2)1∶100为起始稀释度，以含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10％热灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基连续两倍稀释pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清，每个稀释度的血清100μl与含4CTU毒素量的体积为100μl的艰难梭菌培养液超滤浓缩物稀释液混合，37℃孵育1h。
3)将上述混合物加3个复孔内，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内培养24h。
4)24h后在Nikon ECLIPSE TE2000-S显微镜下观察细胞形态。将3个复孔内细胞均无圆缩化的血清最大稀释度的倒数定义为中和抗体滴度。
结果见图7、8。图7的A图显示，在4CTU的毒素剂量下，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清能够保护Vero细胞而不发生诸如圆缩化的细胞形态改变；图7的B图显示，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清在近200倍稀释时仍能够中和4CTU剂量的毒素而使Vero细胞不发生圆缩化。类似的，图8的A图显示，在4CTU的毒素剂量下，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清能够保护CHO细胞而不发生诸如圆缩化的细胞形态改变；图8的B图显示，pJW4303-TcdB-N免疫的兔血清在近150倍稀释时仍能够中和4CTU剂量的毒素而使CHO细胞不发生圆缩化。
实施例8BALB/c小鼠被动保护试验
1)取BALB/c小鼠12只，随机分为4组，按表3剂量腹腔注射艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物稀释液，组间稀释之比为10∶1，记录攻毒后14天内各组死亡率，找出0％和100％死亡率的稀释范围。
表3
| 组别 | 小鼠(只) | 稀释倍数 | 给药容量(ml/只) |
| A | 3 | 1∶10 | 0.1 |
| B | 3 | 1∶100 | 0.1 |
| C | 3 | 1∶1000 | 0.1 |
| D | 3 | 1∶10000 | 0.1 |
第14天观察终点时：A、B组小鼠全部死亡，C、D组小鼠未见死亡
2)取BALB/c小鼠25只，随机分为5组，按表4剂量腹腔注射艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物稀释液，组间稀释之比为2∶1，记录攻毒后14天内各组死亡率，找出0％和100％死亡率的稀释范围。
表4
| 组别 | 小鼠(只) | 稀释倍数 | 给药容量(ml/只) |
| A | 5 | 1∶100 | 0.1 |
| B | 5 | 1∶200 | 0.1 |
| C | 5 | 1∶400 | 0.1 |
| D | 5 | 1∶800 | 0.1 |
| E | 5 | 1∶1600 | 0.1 |
第14天观察终点时：A、B组小鼠全部死亡，余组小鼠未全部死亡。
所以，以“艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200稀释溶液0.1ml/只”为攻毒量进行BALB/c小鼠保护试验。
3)取BALB/c小鼠125只，随机分为5组，按表5腹腔注射艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物稀释溶液(所有“给药内容物”混合后均在37℃孵育1h)。每天间隔12小时观察一次，连续14天，记录小鼠的死亡情况。
艰难梭菌外毒素A核酸疫苗pJW4303-TcdA-C的构建方法详见中国发明专利申请201010130904.8“密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗”。
表5
图9为BALB/c小鼠保护试验的生存曲线。由图中可知，100μl艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物1∶200稀释液对BALB/c小鼠攻毒时，以11μl/鼠的pJW4303-TcdB-N免疫兔血清进行保护试验时没有有效的保护作用，但当它与11μl/鼠的pJW4303-TcdA-C免疫兔血清联用时可使pJW4303-TcdA-C免疫兔血清单用时的近50％的存活率骤升至100％，由此可见pJW4303-TcdB-N免疫兔血清在体内也具有一定的保护作用，并且具有与艰难梭菌外毒素A羧基端DNA疫苗(TcdA-C)免疫血清的显著的协同增强保护作用(“TcdA-C组”与“TcdB-N+TcdA-C组”的存活率具有显著差异，*P＝0.000015)。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
实施例中所涉及的试剂信息如下表：
Claims (6)
1.一种密码子优化的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列，序列为SEQ ID NO.1。
2.一种艰难梭菌外毒素B核酸疫苗，其特征在于该疫苗由权利要求1所述的艰难梭菌外毒素B氨基端基因序列与真核表达载体组成。
3.根据权利要求2所述的艰难梭菌外毒素B核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为pJW4303。
4.一种核酸疫苗组合物，其特征在于该组合物包括权利要求3所述的艰难梭菌外毒素B核酸疫苗以及艰难梭菌外毒素A核酸疫苗。
5.根据权利要求4所述的核酸疫苗组合物，其特征在于所述的艰难梭菌外毒素A核酸疫苗是将经密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列插入真核表达载体pJW4303的PstI和BamH I酶切位点之间所得。
6.根据权利要求5所述的核酸疫苗组合物，其特征在于所述的经密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列为SEQ ID NO.4。
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