CN110607314B

CN110607314B - 一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用

Info

Publication number: CN110607314B
Application number: CN201911052346.5A
Authority: CN
Inventors: 曹三杰; 全柯吉; 缪昌; 梁伟; 牟欣然; 易强; 赵勤
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110607314A

Abstract

本发明提供了一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用，属于基因工程技术领域，所述TcdB RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将所述TcdB RBD基因重组得到的重组RBD蛋白，将得到的重组RBD蛋白制备得到的特异性抗体采用酶联免疫的方法检测艰难梭菌，检测的阳性率达到100％。

Description

一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile C.diff)是一种严格厌氧生长的革兰阳性梭状芽孢杆菌，为肠道中的常在菌群，属于条件致病菌，1935年首次在婴儿肠道中发现，因分离和体外培养难度很高所以称为艰难梭菌。1978年，Bartlett J.G.等首次从肠炎及腹泻病人的粪便中分离出了艰难梭菌，并证明其与抗生素相关的肠炎有关。艰难梭菌会在机体免疫力低下，或长时间使用抗生素造成动物肠道菌群紊乱的情况下大量增殖并释放毒素，从而造成一系列以结肠感染性病变为主的疾病，称为艰难梭菌感染(Clostridium difficileInfection，CDI)。据报道，人医上15-25％的抗生素相关性腹泻和超过95％的伪膜性肠炎与艰难梭菌有关。其主要症状包括腹泻、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠症等，严重时甚至可以导致死亡。它广泛分布，在各种动物体内，土壤，水，蔬菜，肉类中均有发现，因其芽孢抵抗力强，可在外界环境存活数周至数月。21世纪初，欧洲及北美地区接连发生多次CDI的暴发流行，且其致死率逐年升高，引起了医学界的高度关注。

致病性艰难梭菌主要释放由位于19.6kb大小致病决定区域(PaLoc)的tcdA和tcdB基因编码的TcdA和TcdB两种毒素蛋白，从而引起机体的肠黏膜损伤导致肠炎和腹泻病的发生，TcdA和TcdB都属于大分子蛋白在氨基酸水平上显示出总共约63％的同源性，属于梭菌属糖基化毒素，具有糖基转移酶活性，能够能够催化底物在特定位点发生糖基化，从而改变其生物学活性。这两种毒素蛋白的表达与分泌主要受同属于PaLoc的负向调控基因tcdC、正向调控基因tcdR以及膜穿孔蛋白tcdE的共同调控。

目前关于艰难梭菌毒素蛋白候选抗原的研究主要是在TcdB碳端的受体结合区域(RBD)。TcdB位于碳端的受体结合区域都可以产生有效的针对整个毒素的中和抗体，同时没有葡萄糖基转移酶活性不会特异性的使细胞内的小GTP失活没有细胞毒性具有良好的安全性。同时相较于毒素氮端2/3序列RBD主要是由高度保守的疏水性氨基酸组成。但是利用现有的RBD基因制备重组RBD蛋白，再将重组蛋白应用到酶联免疫中检测艰难梭菌，检测结果的准确度低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种TcdB RBD基因，所述TcdB RBD基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的TcdB RBD基因重组得到的重组RBD蛋白，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述重组RBD蛋白的重组方法包括以下步骤：

1)提取艰难梭菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模版，利用艰难梭菌引物进行PCR扩增，得到TcdB RBD基因；

2)将所述步骤1)得到的TcdB RBD基因与载体pET-32a(+)进行连接，得到连接产物；

3)将所述连接产物转入大肠杆菌后进行液体培养，将得到的培养液经IPTG诱导后，得到重组RBD蛋白。

优选的，所述步骤1)艰难梭菌引物包括艰难梭菌上游引物和艰难梭菌下游引物，所述艰难梭菌上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述艰难梭菌下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述步骤1)PCR扩增使用的体系每25μl，包括：基因组DNA1μl、艰难梭菌上游引物1μl、艰难梭菌下游引物1μl、ddH2O 9.5μl和

Max DNAPolymerase12.5μl。

优选的，所述PCR扩增的程序包括：98℃5min；98℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述步骤2)连接的体系每10.3μl包括：载体pET-32a(+)3μl、TcdB RBD基因6.8μl、T4连接酶0.5μl和10×Buffer G 1μl。

优选的，所述连接的温度为14～18℃。

优选的，所述步骤3)ITPG在培养液中的浓度为0.8～1.2mM。

本发明还提供了上述技术方案所述的重组RBD蛋白在制备检测艰难梭菌的试剂中的应用。

本发明提供了一种TcdB RBD基因，所述TcdB RBD基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明将所述TcdB RBD基因重组得到的重组RBD蛋白，将得到的重组RBD蛋白制备得到的特异性抗体采用酶联免疫的方法检测艰难梭菌，检测的阳性率达到100％。

附图说明

图1为pET-32a(+)-rbd挑单鉴定结果，其中，M：DL10000，1、2：挑单鉴定结果，3：阴性；

图2为pET-32a(+)-rbd酶切鉴定，其中，M:DL10000，1-5：阳性质粒样本，6：空载对照；

图3为C1 rbd碱基及氨基酸突变位点；

图4为BL21-pET-32a(+)-rbd诱导表达鉴定，其中，M：PageRuler^TMPrestainedProtein Ladder,10to 180kDa；1：空载pET-32a(+)未诱导；2：空载pET-32a(+)诱导；3：pET-32a(+)-rbd未诱导；4：pET-32a(+)-rbd诱导；5、7：pET-32a(+)-rbd超声破碎上清；6、8：pET-32a(+)-rbd超声破碎包涵体；

图5为RBD上清梯度纯化，其中，M：PageRuler^TMPrestained Protein Ladder,10to180kDa；1：5mM咪唑洗脱峰；2：20mM咪唑洗脱峰；3：100mM洗脱峰；4：500mM洗脱峰；5：上样峰；6：未纯化RBD上清；

图6为RBD超滤浓缩纯化鉴定，其中M：VisColor Full-Range Pre-StainedProteinMarker#VC03(245-10KD)；1：超声破碎上清；2：超滤浓缩纯化后RBD重组蛋白；

图7为蛋白浓度标准曲线；

图8为HAT筛选SP2/0结果；

图9为细胞融合筛选结果；

图10为阳性杂交瘤细胞上清效价测定结果；

图11为杂交瘤细胞染色体数目测定；

图12为腹腔注射杂交瘤细胞AE2D3小鼠；

图13为腹水抗体纯化PAGE验证结果；

图14为抗体亲和力测定；

图15为抗体特异性测定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种TcdB RBD基因，所述TcdB RBD基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下所示：

cttatgtcaactagtgaagaaaataaggtgtcacaagttaaaataagattcgttaatgtttttaaagataagactttggcaaataagctatctttcaactttagtgataagcaagatgtgcctgtgagtgaaataatctcagcatttacacctccatattatgaggatggattgattggctatgatttgggtctagtttctttatataatgaaaaattttatattaataactttggaatgatggtatctggattaatatatattaatgattcattatattactttaaaccaccagtaaataatttgataactggatttgttactgtaggtgatgataagtattactttaatccaactaatggtggagctgcctcaattggagagacaataattaatgacaaaaattattatttcaaccaaagtggaatcttacaaacaggtgtatttagtacagaagatggacttaaatattttgccccagctaatacacttgatgaaaacctagaaggagaagcaattgattttactggaaaattaattattgacgaaaatatttattattttgaagataattatagaggagctgtagaatggaaagaattagatggtgaaatgtactattttagcccagaaacaggcaaagcttttaaaggtctaaatcaaataggtgatgataaatactattttaattctgatggaattatgcaaaaaggatttgttagtataaatgataagaaatattattttgatgattctggtgttatgaaagtgggttatattgaaatagatggcaagtatttctactttgctgaaaatggagaaatgcaaataggagtatttaatacatcagatggatttaaatattttgctcatcataatgaagacctaggaaatgaagaaggtgaagcaatttcatattctggtatattaaatttcaataataaaatttactattttgattattcatttacagctgtagttggatggaaagatttagaggatggttcaaagtattattttgatgaagatacagcagaagcatatgtaggtttatcattaatcaatgatggtcaatattattttaatgatgatggaattatgcaagttggatttgtcactataaataataaagttttctacttctctgattctggaattatagaatctggagtacaaaatatagatgataattatttctatatagatgagaagggtatagttcaaattggcgtatttgatacttcagatgaatataaatactttgcacctgctaatactgtaaatgataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagttggtgaagatatatattattttggagaaacctatacaattgagactggatggatatatgatatggaaaatgaaagtgataaatattatttcaatccagaaactaaaaaagcatgcaaaggtattaatttaattgatgatataaaatattattttgatgagaatggcataatgagaacgggtcttatatcatttgaaaataatgattattactttaacgagaatggtgaaatgcaatttggttatataaatatagaagataagatgttttattttggtgaagatggtgtcatgcagattggagtatttaatacgcaagatggatttaaatactttgcacatcaaaatactttggatgagaattttgagggagaatcaataaactatactggttggttagatttagatgaaaagagatattattttacagatgaatatattgcagcaactggttcagttattattgatggtgaggagtattattttgatcctgatacagctcaattagtgattagtgaa。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的TcdB RBD基因重组得到的重组RBD蛋白，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

LMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIISAFTPPYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPTNGGAASIGETIINDKNYYFNQSGILQTGVFSTEDGLKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFEDNYRGAVEWKELDGEMYYFSPETGKAFKGLNQIGDDKYYFNSDGIMQKGFVSINDKKYYFDDSGVMKVGYIEIDGKYFYFAENGEMQIGVFNTSDGFKYFAHHNEDLGNEEGEAISYSGILNFNNKIYYFDYSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYVGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINNKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDEKGIVQIGVFDTSDEYKYFAPANTVNDNIYGQAVDYSGLVRVGEDIYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDENGIMRTGLISFENNDYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTQDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE。

在本发明中，所述重组RBD蛋白的重组方法优选包括以下步骤：

本发明提取艰难梭菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模版，利用艰难梭菌引物进行PCR扩增，得到TcdB RBD基因。

本发明对提取艰难梭菌的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取方法即可。在本发明中，所述艰难梭菌优选从四川省成都市某猪场临床分离得到的ST11型艰难梭菌C1株。

在本发明中，所述艰难梭菌引物优选包括艰难梭菌上游引物和艰难梭菌下游引物，所述艰难梭菌上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

cgggatcccttatgtcaactagtgaagaaaataagg；

所述艰难梭菌下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

cgagctcttcactaatcactaattgagctgtatc。

在本发明中，所述艰难梭菌引物根据所述ST11型艰难梭菌C1株的rbd基因序列设计得到。

在本发明中，所述PCR扩增使用的体系优选每25μl，包括：基因组DNA1μl、艰难梭菌上游引物1μl、艰难梭菌下游引物1μl、ddH₂O 9.5μl和

Max DNAPolymerase12.5μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售即可。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选包括：98℃5min；98℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环；72℃延伸10min。

本发明将得到的TcdB RBD基因与载体pET-32a(+)进行连接，得到连接产物。

在本发明中，所述连接的体系优选每10.3μl包括：浓度为38ng/μl的载体pET-32a(+)3μl、浓度为27ng/μl的TcdB RBD基因6.8μl、T4连接酶0.5μl和10×Buffer G 1μl。在本发明中，所述连接的温度优选为14～18℃，更优选为16℃。在本发明中，所述连接前还优选包括：将所述载体pET-32a(+)和TcdB RBD基因经过BamH I和Sac I双酶切，将得到的酶切产物进行连接。本发明对所述利用BamH I和Sac I双酶切的酶切条件没有特殊限定，采用常规即可。

本发明将所述连接产物转入大肠杆菌后进行液体培养，将得到的培养液经IPTG诱导后，得到重组RBD蛋白。

本发明对所述连接产物转入大肠杆菌的方法没有特殊限定，采用常规转入大肠杆菌的转入方法即可。在本发明中，所述大肠杆菌优选为BL21(3)。

在本发明中，所述液体培养的条件优选包括：培养温度为37℃，培养的转速为220rpm。当所述培养液的OD₆₀₀为0.6时，培养液经IPTG诱导。在本发明中，所述培养液总IPTG的浓度优选为0.8～1.2mM，更优选为1mM。在本发明中，所述诱导的条件优选包括：所述诱导的温度为37℃，所述诱导的转速为220rpm，所述诱导的时间为4h。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料

1.1菌株，细胞及实验动物

细菌：四川省成都市崇州市某猪场临床分离ST11型艰难梭菌C1株，购买于四川农业大学动物医学院猪病研究中心；大肠杆菌BL21(DE3)由本实验室保存；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

细胞：SP2/0骨髓瘤细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司；

实验动物：6周龄BALB/c小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2质粒与载体

表达载体pET-32a(+),由本实验室保存。

1.3试剂

表1-1使用的试剂

1.4主要仪器

所用仪器见表1-2。

表1-2主要仪器

2方法

2.1抗原制备

2.1.1艰难梭菌的培养

将保存在超低温冰箱中的C1菌株取出，接种到脑心浸液琼脂平板上，放入厌氧罐，37℃厌氧培养36-48h后，挑取单个菌落于5ml脑心浸液肉汤中，厌氧孵育48h。

2.1.2细菌基因组DNA的提取

按照TIAN amp Bacteria DNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明书，抽提培养C1菌株细菌基因组DNA。

2.1.3引物设计及基因克隆

根据C1株rbd基因序列设计合成扩增引物。引物及扩增体系条件见表2-1、2-2。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2-1 rbd扩增引物序列

表2-2 rbd扩增反应体系

反应程序：98℃5min；98℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环，最后72℃延伸10min。

2.1.4重组质粒的构建

将扩增片段按照Cycle-Pure Kit说明书进行纯化，rbd片段及pET-32a(+)利用BamH I和Sac I进行双酶切。

表2-3 rbd酶切体系

纯化rbd片段	15μl
		BamHI	2μl
SacI	2μl
		10×BufferG	5μl
ddH<sub>2</sub>O	26μl
		总体系	50μl

表2-4 pET-32a(+)酶切体系

酶切条件均为37℃，30min；将酶切后产物按照Cycle-Pure Kit说明书进行纯化后用T4连接酶16℃过夜连接。

表2-5连接体系

pET-32a(+)	3μl
		rbd	6.8μl
T4连接酶	0.5μl
		10×BufferG	1μl
总体系	10μl

2.1.5重组质粒的转化

将rbd的连接产物按照博迈德DH5α大肠杆菌说明书进行操作。转化后37℃培养16h后观察结果。

2.1.6重组质粒的鉴定

随机挑选已涂布有转化后菌液的Amp+LB平板上的白色菌落，用20μl PBS缓冲液进行重悬，按照表2-2RBD扩增体系进行菌落PCR。将鉴定为阳性的菌液进行扩大培养并送上海生工生物有限公司测序。

2.1.7重组质粒的表达与鉴定

将测序鉴定阳性克隆扩大培养，按照OMEGA质粒抽提试剂盒说明书进行质粒的提取，将提取重组质粒按照如前所述方法转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑单鉴定。将阳性克隆转入200mlAmp+LB液体培养基进行扩大培养，37℃、220r/min条件下培养菌液至OD₆₀₀＝0.6左右时，加入终浓度为1mM IPTG，37℃220r/min诱导培养4h，后利用SDS-PAGE鉴定。

2.2RBD单克隆抗体的制备及鉴定

2.2.1实验小鼠免疫程序

6周龄雌性BALB/C小鼠预饲喂一周后，用纯化后的RBD重组蛋白与Gel水性佐剂1：10混合，对小鼠进行免疫，具体免疫程序如表2-6。

表2-6免疫程序

免疫次数	免疫抗原	免疫剂量	免疫途径
				0d	RBD+Gel佐剂	100μg	背部皮下多点
14d	RBD+Gel佐剂	100μg	背部皮下多点
				28d	RBD+Gel佐剂	100μg	背部皮下多点
融合前3d	RBD	100μg	背部皮下多点

三免后7d采集小鼠血清测定抗体效价，当免疫小鼠抗体效价大于2×10⁴，利用纯化蛋白进行加强免疫，3d后取效价最高小鼠脾脏细胞进行融合。

2.2.2脾细胞的制备

选取之前3免后抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，3d后提取其脾细胞用于融合：

(1)处死小鼠前提前采血收集血清用，将小鼠尸体在75％乙醇溶液中浸泡10min消毒；

(2)将小鼠置于无菌平板中，小心剪开小鼠腹部皮肤露出腹膜后，用酒精擦拭消毒，剪开腹膜钝性分离连接在脾脏上的多余组织后取出脾脏，用PBS容易冲洗3次后转入新的无菌平板中；

(3)用无菌20ml吸取10mlPBS溶液刺入脾脏反复冲洗，直至脾脏泛白后室温条件800×g，离心10min；

(4)小心吸弃上清后，加入5ml红细胞裂解液，4℃静置15min，待红细胞充分裂解后，室温条件下800xg，离心10min，；

(5)加入10ml PBS溶液重悬沉淀细胞，并进行细胞计数，调整脾细胞浓度到10⁶/ml。

2.2.3细胞融合

(1)将生长状态良好、折光性强、透亮的处于对数期的SP2/0细胞用PBS轻轻吹打重悬，利用倒置显微镜计数，调整细胞浓度至10⁶/ml；

(2)将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1比例加入同一离心管进行融合，轻轻吹打混匀后，室温条件下800×g，离心10min后小心吸弃上清，轻轻震荡离心管底让沉淀细胞从离心管壁脱落；

(3)将装有细胞的离心管放入装有37℃温水的烧杯中水浴，然后以1ml/1min的速度缓慢滴加(防止局部融合剂浓度太高损伤细胞)提前预温至37℃的PEG15001ml，同时一边滴加一边轻轻摇晃搅拌，让细胞与PEG充分结合以达到最好融合效果，滴加继续搅拌30混匀，然后放置1min；

(4)5min钟内匀速缓慢向装有融合细胞的离心管内滴加预温至37℃的DMEM完全培养基，然后再5分钟内匀速缓慢滴加10ml DEME完全培养基，最后5分钟内向离滴加15ml培养基所有操作与第(10)步一样均在装有37℃温水的烧杯中进行，并在滴加的培养基的同时轻柔晃动离心管，在全部液体滴加完后37℃静置5min，室温条件800×g离心10min，轻轻弃去上清；

(5)将沉淀细胞用提前37℃预温好的已经加入HAT阻断剂的含有有20％FBS的DMEM培养基重悬后轻轻混匀后，按SP2/0细胞10⁴个/200μL的浓度将杂交细胞悬液接种至两天制备的有饲养细胞的96孔板中，放入细胞培养箱培养；

(6)融合后四天，用预温的加入HAT的DMEM培养基进行半量换液；

(7)融合七天后，用预温的加入HT的DMEM培养基进行半量换液；

(8)及时查看融合细胞生长状态并做好记录，待到有杂交瘤细胞长到有明显细胞集落(10-14d左右)时，利用间接ELISA检测是否有能够分泌特异性抗体的细胞；

(9)后续根据各培养孔细胞生长情况，用HT或DMEN培养基进行半量换液(约3d/次)。

融合过程中的注意事项：由于细胞板培养细胞会有边孔效应，可在培养板较为边缘的孔适量多加入一些培养基；SP2/0属于半贴壁细胞，进行细胞传代是只需用移液器轻轻吹打即可脱落无需使用胰酶进行消化；融合时必须挑选处于对数生长期的SP2/0细胞这样有利于提高融合效率。

2.2.4饲养细胞的制备

(1)融合前两天取健康小鼠安乐死同时采集血清用作后续阴性对照，将小鼠尸体置于75％乙醇溶液中消毒10min；

(2)在超净台中用剪刀剪开小鼠腹部皮肤暴露腹膜后，用10ml无菌注射器将5mlPBS溶液缓慢注射进腹腔(注意不能扎破内脏组织)，用酒精棉球轻柔按摩腹部2min后，用注射器将液体吸出，再吸取5ml PBS溶液重复上述操作，室温条件下1000rmp离心10min；

(3)小心吸弃上清后用含有HAT的DMEM培养基重悬沉淀细胞，混匀后100μL/孔加入96孔细胞培养板板，放入细胞培养箱培养。

2.2.5阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆亚克隆

(1)用RBD作为正向筛选抗原，pET-32a(+)表达的GDH重组蛋白作为负向筛选抗原利用间接ELISA方法，对融合后杂交瘤细胞是否分泌针对RBD的特异性抗体进行初步筛选

(2)将筛选得到的能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞用含10％FBS的DMEM培养基重悬后计数；

(2)按照10、20、50、100个/ml等4个浓度梯度对阳性细胞进行稀释；

(3)按照100μL/孔将稀释后的杂交瘤细胞加入铺有饲养层细胞的的96孔板中，最后分别达到每个细胞培养含有1、2、5和10个细胞，放入细胞培养箱培养；

(4)亚克隆培养到4天是利用DMEM完全培养基进行换液，此后每隔24h利用显微镜观察细胞生长状态并拍照，并做好记录工作；

(5)待亚克隆细胞生长至占据显微镜视野1/2时(约7-10d)，吸取培养上清对抗体分泌情况进行检测；

(6)将检测结果阳性的，且生长状态良好的，效价高的最好只有单个细胞群落的培养孔再次利用上述方法进行亚克隆，一般克隆3-4次后，该杂交瘤细胞株即为较纯的单克隆阳性细胞，当一孔细胞经多次亚克隆后96孔板均为阳性时，即判断单克隆抗体筛选成功，转入24孔培养板继续扩大培养。

细胞亚克隆的注意事项：能够分泌抗体的杂交瘤细胞在细胞传代培养的过程中很容易出现染色体丢失和死亡的情况，所以需要及时进行亚克隆将遗传形状不稳定的细胞及时淘汰，同时将筛选出的状态好、效价高的细胞保种和扩大培养用于制备腹水。

2.2.6单克隆抗体亚类鉴定

细胞培养上清中的单克隆抗体亚类鉴定通过Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Proteintech)步骤进行：a.将细胞培养上清按照1：100比例稀释后，加入板条样品孔，50μL/孔，无需孵育；b.将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔，50μL/孔，轻轻震荡混匀室温孵育1h；c.弃掉孔内液体，用PBST洗板3次，拍干；d.加入TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min；e.加入终止液，100μL/孔，立刻读数。

2.2.7腹水的制备

选取8只6周龄的BALB/C小鼠，在制备腹水7d前用弗氏不完全佐剂致敏小鼠,将生长状态良好的细胞800rmp离心10min后，用PBS溶液将重悬并计数，每只小鼠腹腔注射10⁶个细胞。等到小鼠腹腔肿胀明显后采集腹水约(约7-15d)，2000rpm离心10min，收集上清，分装标记后-80℃保存备用。

2.2.8单抗腹水纯化

(1)腹水经2000rmp离心10min后用0.45μm滤器过滤，在不停搅拌的同时将缓慢滴加4倍体积60mM/L(pH＝4.5)的醋酸溶液；

(2)缓慢滴加饱和(NH₄)₂SO₄溶液同时不停搅拌使其终浓度为33μL/mL，室温搅拌30min后8000rpm离心10min收集上清，滤纸过滤后调节pH至7.4；

(3)边搅拌边滴加饱和(NH₄)₂SO₄溶液至终浓度达到50％，搅拌30min后，4℃静置5h。12000rpm，离心30min，弃上清；用平衡缓冲液(20mM PB+0.15M NaCl，pH7.0)重悬，装入已经预处理的透析袋中，在磁力搅拌装置中4下透析48h，12h更换一次平衡缓冲液；

(4)用10个柱体积的平衡缓冲液(20 mM PB+0.15M NaCl，pH7.0)，平衡Protein G层析柱，至流出液电导和pH不变；

(5)将透析后上清用0.45μm滤器过滤后进行上样；

(6)上样后用平衡缓冲液淋洗至基线；

(7)用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱后立即用碱性缓冲液(1M Tris/HCl，pH 9.0)中和收集到的抗体pH避免抗体失活，维持抗体的生物活性；

(8)利用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定收集到抗体的浓度。

2.2.9杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定

将阳性杂交瘤细胞株体外培养连续培养3个月后，间接ELISA方法测定细胞上清中抗体效价；并将细胞株分别冻存3、6个月后复苏，检测细胞上清抗体及小鼠腹水效价。

2.3多克隆抗体(pAb)的制备

2.3.1免疫程序

将纯化后的重组蛋白与Gel水性佐剂1：10混合后，对新西兰大白兔进行免疫具体免疫程序如表2-7，每次免疫后7d耳缘静脉采血收集血清测定抗体效价。

表2-7免疫程序

免疫时间	免疫抗原	免疫剂量	免疫方式
				0d	RBD+Gel佐剂	1mg	颈背部皮下多点注射
14d	RBD+Gel佐剂	1mg	颈背部皮下多点注射
				28d	RBD+Gel佐剂	1mg	颈背部皮下多点注射

2.3.2抗体的纯化与收集

加强免疫后2周进行心脏采血收集血清，并用2.2.6所述的方法进行抗体的纯化与收集。

3结果

3.1成功构建pET-32a(+)-rbd重组表达质粒

将PCR扩增纯化后rbd片段与pET-32a(+)载体连接转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞后，挑取单个菌落培养作为模板对rbd基因进行扩增，在1800bp处出现目的条带(图1)，将阳性菌液抽质粒进行进一步酶切鉴定可在5900bp、1800bp出现两条清晰条带(图2)。同时将质粒送公司进行测序，通过BLAST比对结果显示通过BLAST与Genebank TcdB序列进行比对发现在5341处发生碱基突变(C-T)，对应的蛋白层面也出现S1801P变异(图3)。

3.2成功表达RBD重组蛋白

将转入pET-32a(+)-RBD重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养至OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为1mM IPTG，25℃、200rmp/min培养4小时。将诱导完成菌液进行超声破碎后加入2x蛋白质电泳loading buffer煮沸10分钟后，进行SDS-PAGE在100KD左右可看到明显目的条带(图4)。

3.3成功纯化RBD重组蛋白

将诱导表达的RBD重组蛋白用Bio-ScaleTM Mini NuviaTM IMAC Ni-Charged进行亲和层析后用SDS-PAGE对不同咪唑浓度洗脱峰进行鉴定(图5)。同时利用30KD超滤管对纯化蛋白进行浓缩，和进一步纯化得到纯度较高的RBD重组蛋白(图6)。

3.4抗原浓度测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对超滤浓缩后的重组蛋白RBD(SEQ ID No.2)进行浓度的测定，根据标准品OD562测定结果可得一条标准曲线(图7)，待测蛋白RBD稀释4倍后OD562为0.25由带入公式计算可得RBD浓度为：4.52mg/mL。

3.5抗RBD受体结合区域多克隆抗体制备

重组RBD蛋白免疫家兔后，制备血清通过间接ELISA方法测定抗体效价5x10⁵以上，说明重组RBD蛋白具有较强的免疫原性。

3.6抗RBD受体结合区域单克隆抗体的制备

3.6.1小鼠免疫后抗体效价测定

三次免疫后7天，利用间接ELISA方法测定8只小鼠针对RBD抗体效价均在5x105(P/N＞2.1)以上(表3-1)，均达到进行细胞融合标准，因此挑选效价最高7号小鼠进行加强免疫，7天后进行融合。

表3-1 RBD三免血清效价测定结果

(+)：超出酶标仪测定范围

3.6.2 SP2/0细胞培养筛选

SP2/0细胞的培养条件为37℃，5％CO₂，10％胎牛血清DMEM的培养基，显微镜下观察可以清晰看到细胞呈现圆形串珠状且大小均一；向生长状态良好的处于对数生长期的细胞中加入HAT阻断剂后72h内，可以逐渐观察到细胞逐渐出现萎缩、脱落最后全部死亡(图8)，表明此批SP2/0细胞对HAT敏感未出现返祖现象，可以用于细胞融合。

3.5.3细胞融合及筛选

细胞融合后4-10天，显微镜观察2块96孔细胞培养板总计165孔出现细胞集落，融合率为85.9％，通过正向RBD重组蛋白与负向pET-32a(+)-gdh重组蛋白筛选，23孔ELISA检测结果为阳性，阳性率11.9％。

3.5.4阳性杂交瘤的筛选及亚克隆

细胞融合后，及时观察细胞状态和换液，待阳性筛选细胞长至显微镜视野大约1/2处时，按照有限稀释法的操作步骤，选取23个阳性培养孔中抗体测定吸光度最高的8个孔，按照有限稀释法进行亚克隆筛选，待到亚克隆的细胞又生长至显微镜视野约1/2时测定各细胞培养液抗体分泌情况；选取吸光度最高的且最好是单个细胞集落生长的培养孔再次进行亚克隆筛选(图9)；总共通过4轮有限稀释法的筛选得到一株能够稳定分泌抗rRBD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，将其命名为AE2D3。通过图10可以看到，利用rGDH和rRBD进行正负向筛选AE2D3可以分泌针对RBD的特异性抗体。

3.5.7融合细胞染色体鉴定

通过姬姆萨染色鉴定杂交瘤细胞染色体数目结果显示AE2D3染色体数目为109条，SP2/0骨髓瘤细胞染色体数目为68条，证明AE2D3为杂交瘤细胞图11。

3.5.5单克隆抗体亚型的测定

收集AE2D3杂交瘤细胞培养上清，利用proteintechTM MouseMonoclonalAntibody Isotyping Elisa Kit测定单克隆抗体亚型，AE2D3分泌的针对抗体重链为IgG2b型，轻链为kappa型。

3.5.6杂交瘤细胞分泌稳定性检测

AE2D3抗体分泌稳定性结果见表3-2；可以看到无论是连续传代还是长时间冻存后复苏的细胞，都能够稳定的分泌特异性抗体。

表3-2杂交瘤细胞稳定性验证结果

3.5.7 BALB/c小鼠腹水制备及纯化

弗氏不完全佐剂致敏7天后，注射AE2D3杂交瘤细胞BALB/c的小鼠与未注射杂交瘤细胞小鼠饲喂7天后，腹部明显肿大隆起图12；待到14天后收集腹水。经硫酸铵盐析粗提，Protein G亲合层析进一步纯化后的到纯度较高的IgG抗体：SDS-PAGE见过可以清楚的纯化后抗体的重链与轻链且纯度在95％以上图13。通过BCA测定纯化前后抗体浓度结果显示，未纯化腹水蛋白浓度为6.54mg/ml，Protein G亲合层析后浓度为0.743mg/ml。

3.5.8亲和纯化单克隆抗体相对亲和力测定

利用间接ELISA方法测定AE2D3杂交瘤细胞培养上清及经亲合层析纯化后腹水抗体效价结果表明，纯化后腹水抗体效价明显高于细胞培养上清。后续检测方法的建立将使用纯化后腹水作为检测抗体图14。

3.5.9单克隆抗体特异性检测

Westernblot结果表明，AE2D3能够较好的与重组RBD结合(97KD)，同时与同为pET-32a(+)载体表达的GDH不反应，说明AE2D3分泌的抗体具有较好的反应原性和特异性图15。

2.4双抗体夹心ELISA检测方法的建立

2.4.1抗体最佳稀释浓度摸索

分别将纯化针对RBD的pAb作为捕获抗体，AE2D3分泌的特异性mAb作为检测抗体，通过棋盘法对抗体最佳配对使用浓度进行摸索。最佳抗体配对浓度的确定依据P/N值。

2.4.2捕获抗体最佳孵育时间摸索

选择设置0.01/0.05/0.1mol/L碳酸盐3个抗原包被液浓度梯度及37℃2h/37℃1h+4℃过夜/4℃过夜，三个包被时间梯度进行优化，根据P/N值确定最佳捕获抗体孵育条件。

2.4.3检测抗体AE2D3最佳孵育时间摸索

加入C1株培养上清和阴性对照，按照之前摸索的捕获抗体最佳孵育条件和配对抗体最佳稀释浓度对检测用mAb进行稀释，37℃分别孵育0.5/1/1.5/2h，根据P/N确定mAb的最佳孵育时间。

2.4.4封闭液使用条件的摸索

在摸索出的抗体最佳使用条件下进行封闭液最佳使用条件的探索，封闭液分别选用1.5％/3％/5％的不同浓度的脱脂奶粉，在37℃设置0.5/1/2h 3个不同封闭时间梯度进行孵育摸索最佳封闭时间，测定在450nm处的OD值，根据P/N值确定最佳封闭条件。

2.4.5HRP-羊抗鼠二抗最佳使用条件的摸索

将酶标二抗按1:2000-1:10000的浓度梯度进行稀释，在37℃条件下分别作用0.5/1/1.5h 37℃，根据P/N值确定酶标二抗的最佳使用条件。

2.4.6TMB显色时间确定

在之前确定的孵育条件下，对TMB显色液使用时间进行优化，设置10/15/20min 3个时间梯度37℃条件下通过棋盘法进行测定，根据P/N值确定最佳显示时间。

2.4.7结果判定标准的确定

利用建立的DAS-ELISA方法检测20份阴性样品，测定OD450nm的吸光度，同时计算吸光度的平均值(X)与标准差(SD)，以X+3SD作为阳性临界值，X+2SD作为阴性临界值。

2.4.8特异性及敏感性试验

用建立好的DAS-ELISA方法，检测临床分离的艰难梭菌、重组RBD蛋白及同样用pET-32a(+)表达的GDH重组蛋白等其他无关蛋白各10份，确定DAS-ELISA方法的特异性及敏感性。

3.6双抗体夹心ELISA方法的建立

3.6.1抗体最佳使用浓度及包被条件的确定

使用制备的兔多克隆抗体作为捕获抗体，AE2D3纯化后腹水作为检测抗体，通过棋盘法确定阳性与阴性样本OD得P/N值确定最佳包被条件及两种抗体的最佳使用浓度，由此得到的兔多克隆抗体最佳稀释浓度为1：1600倍，AE2D3作为检测抗体最佳稀释浓度为1：3200倍。根据不同包被液浓度及包被条件P/N，0.05mM碳酸盐溶液，37℃1h+4℃过夜孵育为最佳包被条件，检测抗体最佳孵育条件为37℃1h。

表3-3抗体最佳配对浓度

表3-4最佳包被条件确定

3.6.2最佳封闭液及封闭条件确定

分别使用1.5％，3％，5％脱脂牛奶作为封闭液，在37℃0.5h，37℃1h及37℃2h三种不同孵育条件下，检测样品的OD450吸光度并测算P/N，确定，37℃1h为最佳封闭条件。

表3-5最佳封闭条件确定

3.6.3 HRP酶标二抗最佳使用浓度及时间确定

分别对二抗使用浓度和时间进行摸索，得到P/N值如表3-6。明确HRP酶标羊抗鼠IgG抗体最佳使用稀释浓度为5000倍，最佳作用时间为37℃1h。

表3-6二抗最佳使用条件确定

3.6.4 TMB显色时间确定

对TMB显色液使用时间进行探索，得到P/N值如表3-7。确定最佳显色液使用时间为10min。

表3-7最佳显示时间确定

综上所述，通过棋盘法摸索出的DAS-ELISA最佳检测条件结果如表3-8所示：

表3-8 DAS-ELISA最佳反应条件

3.6.5判定结果标准的确定

根据上述反应条件，检测收集的30份未感染艰难梭菌BABL/C小鼠粪便，用PBS稀释用取上清作为阳性性样品平均值X为0.098，标准差为0.021，根据X+3SD计算得到临界值为0.161，根据X+2SD计算得到阴性临界值为0.14。

3.6.6特异性评价

利用建立的双抗体夹心ELISA方法检测临床分离的ST11型艰难梭菌C1、C2株，其他基因型艰难梭菌18株，重组RBD蛋白，pET-32a(+)-gdh重组蛋白等其他无关蛋白各10份，检测结果见表3-9。非ST11型艰难梭菌培养上清，大肠杆菌表达其他无关蛋白OD450均小于0.14呈阴性结果，表明无交叉反应，而重组RBD蛋白与ST11型艰难梭菌培养上清OD450均大于0.161呈阳性，说明本方法特异性良好。

表3-9特异性检测结果

3.6.7灵敏度评价

用DAS-ELISA方法测定RBD的检测底限，如表3-10所示，当待测蛋白浓度大于8.828ng/ml时能被本检测体系测出。

表3-10 DAS-ELISA检测RBD的底限

实施例2

利用实施例1建立的双抗体夹心ELISA方法检测临床分离的ST11型艰难梭菌C1、C2株，其他基因型艰难梭菌18株，重组RBD蛋白，pET-32a(+)-gdh重组蛋白等其他无关蛋白各10份，检测结果见表3-11。非ST11型艰难梭菌培养上清，大肠杆菌表达其他无关蛋白OD450均小于0.14呈阴性结果，表明无交叉反应，而重组RBD蛋白与ST11型艰难梭菌培养上清OD450均大于0.161呈阳性，说明本方法特异性良好。

表3-11特异性检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种TcdB RBD基因、重组RBD蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt 60

tttaaagata agactttggc aaataagcta tctttcaact ttagtgataa gcaagatgtg 120

cctgtgagtg aaataatctc agcatttaca cctccatatt atgaggatgg attgattggc 180

tatgatttgg gtctagtttc tttatataat gaaaaatttt atattaataa ctttggaatg 240

atggtatctg gattaatata tattaatgat tcattatatt actttaaacc accagtaaat 300

aatttgataa ctggatttgt tactgtaggt gatgataagt attactttaa tccaactaat 360

ggtggagctg cctcaattgg agagacaata attaatgaca aaaattatta tttcaaccaa 420

agtggaatct tacaaacagg tgtatttagt acagaagatg gacttaaata ttttgcccca 480

gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga gaagcaattg attttactgg aaaattaatt 540

attgacgaaa atatttatta ttttgaagat aattatagag gagctgtaga atggaaagaa 600

ttagatggtg aaatgtacta ttttagccca gaaacaggca aagcttttaa aggtctaaat 660

caaataggtg atgataaata ctattttaat tctgatggaa ttatgcaaaa aggatttgtt 720

agtataaatg ataagaaata ttattttgat gattctggtg ttatgaaagt gggttatatt 780

gaaatagatg gcaagtattt ctactttgct gaaaatggag aaatgcaaat aggagtattt 840

aatacatcag atggatttaa atattttgct catcataatg aagacctagg aaatgaagaa 900

ggtgaagcaa tttcatattc tggtatatta aatttcaata ataaaattta ctattttgat 960

tattcattta cagctgtagt tggatggaaa gatttagagg atggttcaaa gtattatttt 1020

gatgaagata cagcagaagc atatgtaggt ttatcattaa tcaatgatgg tcaatattat 1080

tttaatgatg atggaattat gcaagttgga tttgtcacta taaataataa agttttctac 1140

ttctctgatt ctggaattat agaatctgga gtacaaaata tagatgataa ttatttctat 1200

atagatgaga agggtatagt tcaaattggc gtatttgata cttcagatga atataaatac 1260

tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat atttacggac aagcagttga ctatagcggt 1320

ttagttagag ttggtgaaga tatatattat tttggagaaa cctatacaat tgagactgga 1380

tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa 1440

gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat ataaaatatt attttgatga gaatggcata 1500

atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat aatgattatt actttaacga gaatggtgaa 1560

atgcaatttg gttatataaa tatagaagat aagatgtttt attttggtga agatggtgtc 1620

atgcagattg gagtatttaa tacgcaagat ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact 1680

ttggatgaga attttgaggg agaatcaata aactatactg gttggttaga tttagatgaa 1740

aagagatatt attttacaga tgaatatatt gcagcaactg gttcagttat tattgatggt 1800

gaggagtatt attttgatcc tgatacagct caattagtga ttagtgaa 1848

<210> 2

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg

1 5 10 15

Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe

20 25 30

Asn Phe Ser Asp Lys Gln Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Ser Ala

35 40 45

Phe Thr Pro Pro Tyr Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly

50 55 60

Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met

65 70 75 80

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

85 90 95

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

100 105 110

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Thr Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

115 120 125

Thr Ile Ile Asn Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Ile Leu

130 135 140

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Leu Lys Tyr Phe Ala Pro

145 150 155 160

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

165 170 175

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Glu Asp Asn Tyr

180 185 190

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met Tyr Tyr Phe

195 200 205

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

210 215 220

Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Ile Met Gln Lys Gly Phe Val

225 230 235 240

Ser Ile Asn Asp Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

245 250 255

Val Gly Tyr Ile Glu Ile Asp Gly Lys Tyr Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

260 265 270

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Ser Asp Gly Phe Lys Tyr

275 280 285

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Ala Ile

290 295 300

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

305 310 315 320

Tyr Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

325 330 335

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Val Gly Leu Ser

340 345 350

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

355 360 365

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asn Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

370 375 380

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

385 390 395 400

Ile Asp Glu Lys Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

405 410 415

Glu Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

420 425 430

Gly Gln Ala Val Asp Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Ile

435 440 445

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

450 455 460

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

465 470 475 480

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

485 490 495

Glu Asn Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asp

500 505 510

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

515 520 525

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

530 535 540

Val Phe Asn Thr Gln Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

545 550 555 560

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

565 570 575

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

580 585 590

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

595 600 605

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

610 615

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccct tatgtcaact agtgaagaaa ataagg 36

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagctcttc actaatcact aattgagctg tatc 34

Claims

1.重组TcdB RBD蛋白在制备检测ST11型艰难梭菌的试剂中的应用，其特征在于，所述重组TcdB RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述编码重组TcdB RBD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组RBD蛋白的重组方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤1)艰难梭菌引物包括艰难梭菌上游引物和艰难梭菌下游引物，所述艰难梭菌上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述艰难梭菌下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增使用的体系每25μl，包括：基因组DNA 1μl、艰难梭菌上游引物1μl、艰难梭菌下游引物1μl、ddH₂O 9.5μl和

Max DNA Polymerase 12.5μl。

5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：98℃5min；98℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤2)连接的体系每10.3μl包括：载体pET-32a(+)3μl、TcdB RBD基因6.8μl、T4连接酶0.5μl和10×Buffer G 1μl。

7.根据权利要求2或6所述的应用，其特征在于，所述连接的温度为14～18℃。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤3)ITPG在培养液中的浓度为0.8～1.2mM。