CN103497926B - 表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因工程技术领域。本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株；本发明还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出人类p53蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。

Description

表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。

背景技术

癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展,肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展,这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前,很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。

人类p53基因是功能最强大的一种抑癌基因，p53蛋白对细胞周期和凋亡起关键性作用，尤其是对受辐射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，起更大的杀伤作用。人类p53基因也是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。人类p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。突变型p53基因具有促进细胞增殖的活性，导致细胞异常增殖，参与肿瘤形成。正常的人类p53基因功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系。人类p53蛋白被认为是细胞应激的关键性调控分子之一，能整合各种不同的细胞危急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号作出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应。有研究认为正常人类p53蛋白在体内扮演“分子警察”的角色，监视细胞基因组的完整性。因此，维持和修复人类p53基因功能在预防和治疗人类肿瘤疾病中有着重要意义。

BCG（BacillusCalmette-Guérin）作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。

人类p53蛋白是基因组的守卫，当DNA损伤发生时，p53蛋白会阻止细胞增殖直到损伤被修复后。人类癌细胞中的p53蛋白发生突变，失去了保护作用。因此，如果能够使用BCG作为疫苗载体构建表达分泌人类p53蛋白的活菌疫苗，将其接种机体后使之持续表达分泌人类p53蛋白，维持和恢复p53蛋白的功能，将有望达到高效预防和治疗人类肿瘤疾病的发生的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗，特别是提供一种具有表达分泌与人类肿瘤疾病密切相关的人类p53蛋白的重组BCG活菌疫苗。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。

进一步地，所述人类p53优选基因序列具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述人类p53优选基因序列的上游连接有核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的BCG分泌信号肽基因序列，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

进一步地，所述重组BCG活菌菌株是将具有核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株。

本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列以及BCG基因组对密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的人类p53优选基因序列；

（2）将具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的BCG分泌信号肽基因序列连接到上述人工合成的人类p53优选基因的上游，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；

（3）利用限制性内切酶和链接酶将上述人工合成的上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，并转化到大肠杆菌E.coliTOP10中，获得正确的重组转化子；

（4）将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定及测序鉴定阳性转化子；

（5）将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Westernblot鉴定表达的人类p53蛋白情况。

进一步地，上述构建方法中所使用的BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为pMN234穿梭表达载体。

本发明还提供了一种活菌疫苗，其特征在于：所述活菌疫苗中含有上述重组BCG活菌菌株。

本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用，其应用方法是将该重组BCG活菌菌株辅以药学上可接受的佐剂制备成疫苗，该疫苗可单独使用也可联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使用时经皮内注射，注射量以BCG活菌个数计为10⁶CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。

有益效果：

本发明对人类p53基因序列进行改造，并成功导入BCG活菌菌株中得到了能够在BCG细胞中表达分泌出人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株。利用该重组BCG活菌菌株制备而成的活菌疫苗，经Westernblot检测结果显示，该活菌疫苗可以胞外表达人类p53蛋白，并能被人类p53蛋白抗体识别。将其接种人体后，可以在体内持续表达分泌人类p53蛋白，使得人体内的p53蛋白得到补充，从而起到对癌症的预防和治疗作用。本发明提供的重组BCG活菌疫苗可作为新型的人类癌症疾病预防性疫苗应用于对癌症疾病的预防。

附图说明

图1是重组人类p53优选基因和BCG分泌信号肽基因穿梭表达载体pMN-p53的物理图谱；

图2是本发明重组BCG胞外表达人类p53蛋白的Westernblot鉴定图；

图3是本发明活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠模型细胞数变化结果；

图4是本发明活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠模型荷瘤重量分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

以下实施例中所用原料来源

菌株与载体：大肠杆菌菌株E.coliTOP10由本实验室保存，耻垢分支杆菌、BCG、由深圳市疾病预防控制中心惠赠。pMN234载体由北京蛋白质组学研究中心惠赠。

酶与试剂盒：限制性内切酶购自Fermentas公司，连接酶为NEB公司产品，Taq酶购自北京全式金生物科技有限公司。基因组提取试剂盒为OMEGA品牌产品。

生化试剂：DNA序列、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。人类p53蛋白单克隆抗体为Santas公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

培养基：大肠杆菌培养基为LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0；M7H9+ADC液体培养基：称取4.79Middlebrook7H9Broth，溶于900ml去离子水中，加入0.2%的甘油和0.05%的Tween-80，121℃高压灭菌30min，待冷却至45℃加入100mLADCEnrichment，4℃保存；M7H10+OADC固体培养基：称取19gMiddlebrookM7H10Agar，溶于900ml去离子水中，加入0.4%甘油和0.1%的Tween-80，混匀，121℃高压灭菌30min，待冷却至50-55℃，加入100mLOADCEnrichment，倒置平板。

实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人类p53基因改造及上游添加BCG分泌信号肽序列

根据人类p53基因序列(GenBank登陆号：NM_001126112)和BCG基因组密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的人类p53优选基因序列。人类p53优选基因序列如SEQIDNO:2所示序列。

通过查阅相关文献，获得BCG基因组所携带120bp长度的α分泌信号肽基因序列，如SEQIDNO:3所示核苷酸序列。根据穿梭表达载体pMN234的酶切位点要求，将α分泌信号肽基因序列拼接到人类p53优选基因上游，α分泌信号肽基因序列上游添加BamHI和XbaI酶切位点，人类p53优选基因下游添加HindIII酶切位点。由生工生物工程（上海）股份有限公司人工合成α-p53基因序列。最终合成的α-p53基因序列具有如SEQIDNO:4的核苷酸序列。人工合成的α-p53基因的克隆质粒为pUC-57。

实施例2

BCG穿梭表达载体的构建

1.pMN-p53穿梭表达载体构建

质粒pMN234是大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，同样含有HSP60启动子（北京蛋白质组学研究中心惠赠）。目的基因可以插入到pMN234载体的BamHI和HindIII酶切位点之间表达目标蛋白。实施例1中已经获得了上游含有α分泌信号肽人类p53优选基因亚克隆重组质粒pUC-α-p53两端含有BamHI和HindIII酶切位点）。

（1）提取pMN234空质粒以及克隆质粒pUC-α-P53

质粒DNA的快速小量提取：接种分别含有pMN234空质粒以及克隆质粒pUC-α-P53大肠杆菌菌株于30ml含卡那霉素抗性和氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、200rpm摇动培养过夜。按照质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.3.0)说明书提取质粒DNA。

1）将30mL过夜培养的菌液各取3ml、13000rpm离心2min收集菌体于1.5ml的EP管中；

2）菌体沉淀悬浮于250μl溶液I中，混匀；

3）加入250μl溶液II，轻柔地颠倒混匀10次左右，裂解时间不宜超过5min；

4）加入350μl预冷的溶液III，轻柔地颠倒混匀10次左右；

5）13000rpm离心10min，将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，离心上清液转移至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。

6）将500μl的BufferWA加入SpinColumn中，12000rpm离心30sec，弃滤液。

7）将700μl的BufferWB加入SpinColumn中，12000rpm离心30sec，弃滤液。重复一次。

8）重新将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000rpm离心2min，除尽残留洗液。

9）将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入40μl加热至60℃的灭菌蒸馏水，室温静置2分钟。

10）12000rpm离心2min洗脱DNA。

（2）双酶切

pUC-α-p53信号肽质粒和pMN234质粒同时用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下：

37℃反应40min，70℃灭活10min。按照上面酶切体系，pUC-α-p53信号肽质粒和pMN234质粒各反应6管，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收α-p53目的基因和pMN234载体基因。

（4）酶切回收产物连接反应

α-p53基因和pMN234载体连接反应体系如下，在PCR管中加入：

混匀后，4℃连接过夜。

（5）.转化

将连接产物转化感受态大肠杆菌E.ColiTop10，Top10感受态细胞的制备及转化方法参考《分子克隆》。

（6）阳性转化子鉴定

菌落PCR鉴定同前，菌落PCR鉴定为阳性转化子的菌株送深圳华大基因科技有限公司进行测序测定，测序结果基因序列正确的转化子命名为pMN-p53，储存阳性转化子。

实施例3

BCG穿梭表达载体的遗传转化

BCG在M7H9+ADC培养基中培养至对数生长期，在冰上预冷之后，6000rpm离心5min收集BCG菌体细胞，用10%预冷的经过灭菌处理的甘油清洗菌体三遍，最后用10%甘油悬浮，制备成BCG电击转化感受态细胞。

提取pMN-p53穿梭表达分泌载体质粒（方法同前），调整浓度都为10μg/ml。取100μl的BCG感受态细胞，加入到0.2cm规格的电击转化杯中，加入5μl浓度为10μg/ml的穿梭表达分泌载体质粒pMN-p53，轻轻混匀后冰上放置10min。使用电转仪（eppendorf）进行电转化。设置参数电压为2.5KV，时间为5ms，电击两次。然后迅速加入无抗生素的M7H9+ADC培养基培养20h，离心收集BCG菌体细胞，涂于kan抗性平板上，大约3-4周长出转化子。

实施例4

重组BCG的筛选与鉴定

pMN234载体均具有卡那霉素抗性。因此，经过卡那霉素抗性平板初步筛选获得的转化子，经菌落PCR初步鉴定后，可接种到含有卡那霉素抗性的培养基中扩大培养，培养周期大概四周左右。选用OMEGA革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒（具体操作参考试剂盒说明书），提取转化到BCG中的pMN-p53载体质粒进行双酶切鉴定，最终测序鉴定。

实施例5

重组人类p53蛋白的表达和鉴定

重组BCG-pMN53阳性菌株经M7H9+ADC培养基扩大培养后，6000rmp离心10min收集培养基上清液，经滤膜为10KDa大小的超滤管浓缩200倍后，获得重组胞外表达蛋白样品。

1.胞外上清浓缩样品进行SDS-PAGE电泳分析（SDS-PAGE电泳方法参照分子克隆）。

（1）制胶

a.将玻璃板、隔条及梳子洗净晾干后组成严密的灌胶板；

b.制凝胶液：按照《分子克隆》的方法分别配制5％浓缩胶和10％分离胶；

表1配制凝胶液

Table1preparationofgel

c.配制好的分离胶液注入两层玻璃板中，避免气泡产生，室温静置30min，然后灌入浓缩胶，插入梳子，室温静置60min。

（2）上样：将准备好的蛋白样品和蛋白maker按照每个孔5μl的量上样。

（3）电泳：将上样好的蛋白胶置于蛋白电泳缓冲液中电泳，以80V跑浓缩胶、110V跑分离胶。

（4）染色和脱色：电泳结束后，取下胶板，小心切去积层胶，并将分离胶放入考马斯亮蓝G-250染色液中染色2h，然后取出，放到脱色液中脱色过夜。

SDS-PAGE蛋白电泳结果，在实验预期相应的位置出现了条带。

2.蛋白样品进行Westernblot实验验证（Wenternblot实验方法参照abcam公司）。

1）SDS-PAGE聚丙烯酰胺蛋白电泳部分，方法同前。

2）电泳结束后，取下胶板，切去积层胶，并将分离胶切去一角(左上角)，以便转移后的定位，将胶浸于湿法转移缓冲液中15min。

3）剪一张与蛋白胶大小略小的PVDF膜，切去一角作为标记，将其浸于100％甲醇中15sec，然后转入去离子水中2min，然后在湿转移缓冲液中平衡5min。

4）剪10张与胶大小一致的滤纸，于转移缓冲液中平衡15min。

5）组装湿转移系统：先将Western湿转膜仪的阳极板放在水平桌面上，放上一层海绵，再将5张滤纸放在海绵上，注意不要让滤纸中含有气泡。在滤纸中央放上PVDF膜，将聚丙烯酰胺凝胶置膜上，胶上再放5张滤纸，滤纸上再放上一层海绵，整个过程必须注意赶尽气泡。

6）放好阴极板，正确连接电极的连线，接通电源，以2mA/cm²恒流转移1h。

7）电转结束后，取下PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜。

8）取2ml封闭液于杂交瓶中，加入一抗(鼠抗IgG单克隆抗体，1:1000)，放入杂交箱34℃，杂交2h。

9）杂交结束后，取出PVDF膜，用TBST清洗三次，15min/次。

10）取2mlTBST于杂交瓶中，加入羊抗鼠二抗(AP标记，稀释比例1:1500)，常温杂交1h。

11）重复9步骤操作。

12）加入BCIP/NBT显色液显色，用去离子水终止显色反应。

Westernblot结果显示，重组人类p53蛋白BCG活菌疫苗可以胞外表达人类p53蛋白，并能被人类p53蛋白抗体识别（图2）。表明重组人类p53蛋白BCG活菌构建成功。

以下是本发明提供的活菌疫苗的药效学实验

1.实验材料准备

1）LLC-mCherry-A549细胞：来源于ATCC细胞库，采用Clontech公司技术，基于PiggyBac转座子表达系统，通过慢病毒包装建立的双标记（mCherry，红色荧光蛋白；luc，荧光素酶）人肺癌细胞。

2）实验小鼠：6-8周龄SPF级的BALB/c小鼠和SCID小鼠购自广东省医学实验动物中心。

3）细胞培养基及细胞培养耗材：1640培养基、胰酶购自Hyclone公司；冻存管、25cm²和75cm²细胞培养瓶购自Comning公司；小牛血清、双抗（青霉素/链霉素）购自Gibco公司；DMSO购自Sigma公司。

4）其他化学试剂：气体麻醉剂（异氟烷）购自上海雅培制药有限公司；

2.实验仪器

实验中使用到的主要仪器及厂家详见表2。

表2实验用的主要仪器及厂家说明

Table2Primaryinstrumentandmanufacturer

3.实验方法

培养BCG、BCG-pMN-p53菌株至OD600≈1.2(约2×108CFU/m1)；7000rpm离心15min收集菌体；无菌PBS洗涤3次菌体，7000rpm离心10min收集菌体。

1）细菌计数

使用MolecularProbe公司的死活菌染色试剂盒进行菌体计数，该试剂盒中的荧光染料可以对活菌染色，在荧光显微镜下可以发出绿色荧光，方便计数，能准确的计数出活细菌数。稀释调整菌液浓度为1mlPBS中的活菌数目为107个。

2）动物分组

6-8周龄雌性BALB/c小鼠21只，18～22g/只。随机分成3组，每组7只。第一组为PBS对照组；第二组为BCG对照组；第三组为BCG-pMN-p53疫苗实验组。

3）接种剂量

每鼠皮下注射0.2ml菌液，即106CFU/鼠。

4）接种方案

第0，2，4周共接种3次。

5.小鼠血清特异性IgG抗体测定

重组耻垢分支杆菌接种小鼠5周后，对接种PBS、BCG和BCG-pMN-p53的实验组BALB/c小鼠进行眼球取血，离心分离血清。10％SDS-PAGE凝胶电泳分离p53原核表达纯化蛋白，以接种疫苗小鼠的血清为一抗，AP标记的羊抗小鼠IgG为二抗进行免疫印迹分析。

Westernblot的结果显示，PBS、BCG实验组结果为阴性，而BCG-pMN-p53实验组结果为阳性，说明p53蛋白rBCG活菌疫苗可以在BALB/c小鼠体内表达人类p53蛋白，产生的抗体可以识别人类p53蛋白。表明人类p53蛋白rBCG活菌疫苗可以在小鼠体内表达人类p53蛋白。

6.重组疫苗预防A549癌细胞动物学实验

1）重组疫苗准备

培养BCG、BCG-pMN-p53菌株至OD600≈1.2(约2×108CFU/m1)；7000rpm离心15min收集菌体；无菌PBS洗涤3次菌体，7000rpm离心10min收集菌体。细菌计数方法同前。

2）动物分组

6-8周龄雌性SCID小鼠33只，18～22g/只。随机分成3组，每组11只。第一组为PBS对照组；第二组为BCG对照组；第三组为BCG-pMN-p53疫苗实验组。

3）接种剂量

每鼠皮下注射0.2ml菌液，即106CFU/鼠。

4）接种方案

第0，1，2周共接种3次。

5）A549肺癌细胞复苏培养

a.从液氮罐内迅速取出冻存管，放入40℃水浴中，快速解冻。

b.用75%酒精彻底消毒冻存管后，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，补加10ml新鲜的1640完全培养液，低速离心(1000rpm)5分钟，弃上清再用新鲜的1640完全培养重悬细胞。

c.将重悬后的细胞液转移到25cm2的细胞培养瓶中，于CO2细胞培养箱中培养。培养条件设定为：37℃、5％的CO2浓度。培养过程需要定期更换培养液。使用台盼蓝(TrypanBlue)染色法对活细胞进行计数，调整细胞浓度为105/ml。

6）A549癌细胞攻击重组疫苗接种后的SCID小鼠

取SCID小鼠于后肢右侧腋下皮下接种A549癌细胞，每鼠0.2ml细胞悬液。使用活体成像的方法观察小鼠肿瘤模型的生长情况。

活体成像结果显示：在A549癌细胞两周后，PBS和BCG对照实验组的A549癌细胞的SCID小鼠模型成功率为100%，而BCG-pMN-p53疫苗实验组的A549癌细胞的SCID小鼠模型成功率为45%（5只），说明BCG-pMN-p53疫苗具有一定的抵制A549癌细胞的作用。

7.重组疫苗治疗A549癌细胞动物学实验

1）A549肺癌动物模型的建立

A549肺癌细胞常规复苏，培养于完全1640培养液，37℃、5％的CO2浓度的环境中。传代扩大培养，待达到所需的细胞数量后，以0.1%的胰蛋白酶消化细胞2～3min，加入完全培养基终止胰蛋白酶反应，轻柔吹打收获细胞，1000rpm离心5min后弃上清，以无菌PBS重悬。使用台盼蓝(TrypanBlue)染色法对活细胞进行计数，调整细胞浓度为107/ml。取21只SCID小鼠于后肢右侧腋下皮下接种A549肺癌细胞，每鼠0.2ml细胞悬液。使用活体成像的方法观察小鼠肿瘤模型的生长情况。

活体成像观察显示：A549肺癌细胞接种SCID小鼠皮下后，存活率为100%。

2）BCG标准株、BCG-pMN-p53疫苗菌株的制备

挑取含Kan抗性的Middlebrook7H10固体培养基上处于对数生长期的新鲜BCG标准株、BCG-pMN-p53疫苗菌落接种于Middlebrook7H9液体培养基，37℃、200rmp摇床分别培养约3～4周后，离心弃收集菌体。以无菌PBS淘洗3次，最终悬浮于1ml的PBS中。菌落计数与前文介绍的方法一致。BCG的准备方法与以上介绍的方法相同。调整至合适浓度后备用。

3）动物分组

将构建成功的A549肺癌细胞SCID小鼠模型随机分3组，共21只，每组7只。具体治疗操作为：

A组(PBS对照组)：0.2ml灭菌PBS/只，共7只（编号CA-1--CA-5）；

B组(BCG对照组)：0.2ml即2x106CFU/只，共7只（编号CB-1--CB-5）；

C组(BCG-pMN-p53实验组)：0.2ml即2x106CFU/只，共7只（编号CC-1--CC-5）；

4）疫苗治疗过程

每次注射0.2ml即2x106CFU/只重组菌，第0、1、2周接种治疗，共三次。

5）观测指标

I.通过活体成像仪定期对A549肺癌小鼠模型体内的肺癌细胞数量变化进行分析。

II.于治疗30天后，处死肿瘤模型小鼠，对各分组荷瘤大小及重量进行分析。

6）统计学处理

采用SPSS19.0统计分析软件对相关数据进行分析处理。

实验结果显示：（1）通过活体成像系统可以看出，BCG-pMN-p53实验组小鼠体内的A549癌细胞增长速度与PBS和BCG实验对照组相比，具有明显的减缓作用，说明BCG-pMN-p53疫苗能在一定程度上抑制A549癌细胞的增长，具有抑癌作用（图3）；（2）从最终的荷瘤大小可以看出，BCG-pMN-p53实验组小鼠体内的A549癌细胞荷瘤与PBS和BCG实验对照组相比，大小与重量都小且具有统计学意义（图4）。说明BCG-pMN-p53疫苗对A549癌细胞具有抵抗作用。

综合以上结果推断，BCG-pMN-p53接种人体后，可以在体内表达p53蛋白，使得人体内的p53蛋白得到补充，从而起到对癌症的预防和治疗作用。

<110>深圳大学

<120>表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用

<160>4

<210>1

<211>393

<212>PRT

<213>人类p53蛋白氨基酸序列

<400>1

MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGP60

DEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAK120

SVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHE180

RCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNS240

SCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELP300

PGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPG360

GSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD*393

<210>2

<211>1182

<212>DNA

<213>人类p53优选基因核苷酸序列

<400>2

atggaggaaccccagtccgatccgtcggtggaaccgcccctgtcgcaggagaccttctcg60

gacctgtggaaactgctgcccgaaaacaacgtcctgagccccctgccgtcccaggcgatg120

gatgacctgatgctgtccccggacgacatcgagcagtggttcaccgaggacccgggtccc180

gatgaagccccgcgcatgcccgaagccgcaccgccggtggcaccggcgcccgccgcaccc240

acgcccgccgcgccggcacccgccccctcgtggccgctgagctcgtccgtcccctcccag300

aaaacctaccagggctcgtatggcttccggctgggcttcctgcacagcggcaccgcgaag360

agcgtcacctgcacctattcgcccgcgctgaacaagatgttctgccagctggccaaaacg420

tgccccgtgcagctgtgggtcgattcgacgccgccgcccggcacccgcgtccgcgcgatg480

gcgatctacaagcagagccagcacatgacggaagtggtccggcggtgcccgcaccacgag540

cgctgctccgactcggacggcctggcgcccccccagcacctgatccgggtggagggcaac600

ctgcgcgtggagtatctggacgaccgcaacaccttccgccactcggtggtcgtgccgtat660

gaaccccccgaagtgggcagcgattgcaccaccatccactacaactacatgtgcaactcc720

tcgtgcatgggcggcatgaaccggcgcccgatcctgaccatcatcacgctggaggactcc780

tccggcaacctgctgggccgcaactcgttcgaggtgcgcgtctgcgcctgcccgggccgc840

gatcggcgcacggaggaagagaacctgcggaagaagggcgagccgcaccacgaactgccc900

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aaacccctggacggcgagtacttcacgctgcagatccgcggccgggaacgcttcgaaatg1020

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ggctcccgggcgcactcgagccacctgaagtcgaagaaaggccagtcgacctcgcgccac1140

aagaaactgatgttcaagaccgaaggcccggattcggactaa1182

<210>3

<211>120

<212>DNA

<213>分泌信号肽序列

<400>3

atgacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacgccgattgatgatcggcacggca60

gcggctgtagtccttccgggcctggtggggcttgccggcggagcggcaaccgcgggcgcg120

<210>4

<211>1318

<212>DNA

<213>分泌信号肽序列+p53优选序列

<400>4

gactagtcgcggatccatgacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacgccgatt60

gatgatcggcacggcagcggctgtagtccttccgggcctggtggggcttgccggcggagc120

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gccgctgagccaggagaccttctcgggcctgtggaagctgctgcccccggaggacatcct240

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ggactcctccgggaacctcctggggcgcgactccttcgaagtccgtgtgtgtgcgtgccc960

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Claims (7)

1.一种重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株，所述人类p53优选基因序列如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于：所述人类p53优选基因序列的上游连接有核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的BCG分泌信号肽基因序列，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

3.根据权利要求2所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。

4.一种活菌疫苗，其特征在于：含有权利要求1至3任一项所述的重组BCG活菌菌株。

5.权利要求3所述的重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列以及BCG基因组对密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的人类p53优选基因序列；

（2）将如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的BCG分泌信号肽基因序列连接到上述人工合成的人类p53优选基因的上游，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；

（3）利用限制性内切酶和链接酶将上述人工合成的上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，并转化到大肠杆菌E.coliTOP10中，获得正确的重组转化子；

（4）将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定及测序鉴定阳性转化子；

（5）将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Westernblot鉴定表达的人类p53蛋白情况。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为pMN234穿梭表达载体。

7.权利要求1至3任一项所述的重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用。