CN1136280A - 抗艾滋病分泌型重组bcg疫苗 - Google Patents

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Abstract

一种含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。构成本发明的BCG分泌融合蛋白质，所述融合蛋白质是在由来自抗酸菌的α抗原的分子表面插入外来抗原肽得到的。由于该融合蛋白质具有极大地增加了的抗原性及免疫原性，因此在给动物接种时可被能有效地识别该抗原的B细胞识别，有效地诱导产生抗该抗原的抗体。当给动物接种该BCG本身时，随着它在动物体内的继续增殖，继续分泌所述融合蛋白质，因此成为非常有用的疫苗。

Description

抗艾滋病分泌型重组BCG疫苗
技术领域
本发明涉及含有分泌  融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌(Mycobacterium bovis BCG：以下简称“BCG”)的疫苗，所述融合蛋白质是由外来抗原肽插入含有信号肽的载体蛋白质分子表面得到的。作为具体实施例，可以举出作为载体的含有信号肽的分泌蛋白质是来自抗酸菌的α抗原、外来抗原肽是艾滋病毒表面抗原的抗原肽的疫苗，此疫苗可用于艾滋病的治疗和预防。
背景技术
自1988年建立BCG的转化体系开始，已尝试用重组DNA技术改良BCG，并将其用作抗各种病原体的疫苗[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，6987(1988)]。
BCG是牛型结核菌的弱毒株，是用于人体的唯一被认可的活菌苗。其特征有：毒性弱、安全，具有较高的佐剂活性，效果持续，廉价，耐热性好，可经口服用。因此人们期望：如果改良BCG使之表达抗原，即抗各种病原性细菌和病毒的抗原，这将是极有效疫苗的研制中的先锋。
其后建立了分泌和表达目的外来抗原的BCG体系[Infect.Immun.，58，4049(1990)]，并期待将其用于疫苗。实际上，已开发了能够表达和分泌通过将来自堪萨斯氏分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)的α抗原作为载体与艾滋病毒HIV-1的gag p17的抗原部位(9个氨基酸)融合得到的融合蛋白质的抗酸菌[Infect.Immun.，58，4049(1990)]。另外，据称为HIV-1的感染防御抗原之一的表面抗原中存在的第三可变区域(以下简称为V3区域或V3抗原决定基)中的15个氨基酸残基构成的肽的表达和分泌也获得成功[Vaccine 12，153(1994)]。该V3区域的15个氨基酸残基构成的肽含有杀伤T细胞抗原决定基和B细胞抗原决定基两者。它们均以来自抗酸菌的α抗原作载体，在α抗原的C末端附近的位置融合外来抗原肽。也就是说，抗酸菌分泌融合蛋白质。
然而，即使给小鼠接种能分泌V3区域的15个氨基酸残基构成的肽和来自抗酸菌的α抗原的融合蛋白质的BCG，虽然显著诱导了杀伤T细胞，但抗体产生的水平不如期待的那样高。
除BCG外，最近在利用病毒载体的疫苗的开发研究方面取得了进展。例如将以流感病毒的表面蛋白质血细胞凝集素[J.Virol.67，6659(1993)]和脊髓灰质炎病毒的表面蛋白质VP-1[J.Virol.66，3161(1992)]为代表的载体蛋白分别与V3抗原决定基融合产生融合蛋白质，利用重组DNA改良这些病毒使得能够表达融合蛋白质。用如此得到的嵌合体病毒免疫动物的例子已有报道。已知用这些嵌合体病毒免疫的动物可有效地产生抗V3抗原决定基的抗体。
来自上述病毒的载体蛋白的高级结构已被阐明。在上述融合蛋白质中，外来抗原肽插入存在于载体蛋白的分子表面且易成为B细胞抗原决定基的环部位插入的。发明的公开
本发明的目的是开发含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG的疫苗，所述融合蛋白质是将外来抗原插入含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面得到的。本发明的进一步的目的是使BCG可用作疫苗。具体地说，是将含有信号肽的载体分泌蛋白质与外来抗原肽融合得到融合蛋白质，以此制备能表达并分泌融合蛋白质的BCG疫苗，并且修饰该融合蛋白质使之可作为抗原决定基被杀伤T细胞识别，作为抗原决定基被B细胞识别，因此它可以有效地诱导杀伤T细胞，显著提高抗体产生的水平。
当给小鼠接种能分泌由V3区域中15个氨基酸残基组成的肽和来自抗酸菌的α抗原的融合蛋白质的BCG菌时，虽然可显著诱导杀伤T细胞，但不象所想的那样显著提高产生抗体的水平。
另外，目前已明确V3区域抗体用于黑猩猩后可抵御HIV-1的感染[Nature 345，622(1990)]。因此目前研究艾滋病疫苗的主攻方向是开发作为疫苗有效成分的能够诱导产生抗V3区域的抗体的蛋白质。具体地说，可使用含有V3区域的表面抗原gp120作为疫苗，所述抗原是通过基因重组的方法改变动物细胞及昆虫细胞产生的。可是该疫苗的效果并不理想。
在任何情况下抗原都可以显著诱导产生V3区域的抗体，这个抗体能抑制艾滋病毒的增殖，而且有预防感染的作用，但至今为止，效果还不很明显。因此，若制造能够显著地诱导产生具有抑制艾滋病毒的增殖、并且能预防感染活性的抗体的抗原并以此作为疫苗使用，这种疫苗将会成为极有希望的疫苗。
本发明人考虑到，即使在来自抗酸菌的α抗原的C末端的位置融合由V3区域的15个氨基酸残基组成的肽，V3抗原决定基也很难呈现出在艾滋病毒表面抗原中其本来的构象，因此，该抗原决定基很难被B细胞识别。鉴于此，本发明人考虑制备能分泌融合蛋白质的BCG并以此作为疫苗。所述融合蛋白质是通过在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。
因此，来自抗酸菌的及高级结构已知的载体蛋白是必要的，但是，对以本发明中使用的α抗原为代表的来自抗酸菌的蛋白质的高级结构未作过解析。
本发明人已明确，当以来自抗酸菌的α抗原作为载体表达并分泌外来抗原肽时，使其在来自抗酸菌的α抗原的何种位置融合，从而可以达到最高的抗原性，并成功地开发了能显著诱导产生抗所述外来抗原的抗体的疫苗，以此完成了本发明。更详细地说，通过对位于来自抗酸菌的α抗原的氨基酸序列预测为亲水性的区域中的成为α抗原自身的B细胞抗原决定基的区域进行预测和确定，在其附近插入外来抗原肽，可以成功地使BCG分泌具有高抗原性的融合蛋白质，因而成功地开发了能够诱导产生具有防治该病原体感染的抗体的疫苗。
也就是说，本发明提供了含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。
作为含有信号肽的载体分泌蛋白质，可举出来自抗酸菌的α抗原。本发明优选的疫苗是含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在该α抗原的第184位的Ser残基和第185位的Asp残基之间插入外来抗原肽得到的。
作为外来抗原肽，可以举出艾滋病毒表面抗原的抗原肽，特别是艾滋病毒的第三可变区域的抗原肽。
本发明最理想的疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是由Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile GlyPro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列号：1)19个氨基酸残基构成的第三可变区域的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。
本发明其他理想的疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是由Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu GluLeu Asp Lys Trp Ala(序列号：13)13个氨基酸构成的来自gp41的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。
本发明的其他理想疫苗是含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是以下的由19或18个氨基酸残基构成的第三可变区域的抗原肽，特别是用于治疗及预防艾滋病的疫苗。Asn Thr Arg Lys Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe TyrAla Thr Gly Asp(序列号：14)(亚型A：西、中非)Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe TyrThr Thr Gly Glu(序列号：15)(亚型B：南北美洲、欧洲、亚洲)Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe TyrAla Thr Gly Glu(序列号：16)(亚型C：南、中非)Asn Thr Arg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu TyrThr Thr Arg(序列号：17)(亚型D：中非)Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe TyrArg Thr Gly Asp(序列号：18)(亚型E：泰国、中非)
附图的简要说明
图1是为了确定α抗原自身的B细胞抗原决定基而进行的Western blotting解析图。左边的图(例1、2、3)是使用抗来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原的多克隆抗体的结果。右边的图(例4、5、6)是使用抗来自BCG的α抗原的多克隆抗体的结果。
例1、4是大肠杆菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289)的菌体提取物的电泳图，所述菌株携带表达β-半乳糖苷酶的质粒pUR 289。例2、5是大肠杆菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289+α-Leu 38-Ala57)的菌体提取物的电泳图，所述菌株携带表达β-半乳糖苷酶和具有α抗原的第38位的Leu残基至第57位的Ala残基的序列的肽融合而成的蛋白质的质粒pUR 289+α-Leu 38-Ala 57。
例3、6是大肠杆菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289+α-Ser184-Asn 203)的菌体提出物的电泳图，所述菌株携带表达β-半乳糖苷酶和具有α抗原的第184位的Ser残基至第203位的Asn残基的序列的肽融合而成的蛋白质的质粒pUR 289+α-Ser 184-Asn 203。
箭头表示分子量约为12万的β-半乳糖苷酶融合蛋白质的位置。
图2是表示分泌和表达α抗原和HIV-1V3抗原决定基的融合蛋白质的载体的构建的策略图。斜线的区域表示含有来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原(图中用α-K表示)的DNA片段，白色区域表示含有抗酸菌质粒的复制开始区域的DNA片段，深色点的区域表示HTLVIIIB株的V3抗原决定基的15个氨基酸的合成基因，浅色点的区域表示HIV日本株V3抗原决定基的19个氨基酸的合成基因。Amp、Km、Cm则分别表示氨比西林、卡那霉素和氯霉素的耐性基因。pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)、pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)分别表示来自HTLVIIIB株的V 3抗原决定基基因导入PstI和XhoI位点的质粒，pIJK-V3(HIV日本株-XhoI)表示HIV日本株共有序列的V3抗原决定基导入XhoI位点的质粒。
图3表示对携带重组分泌载体的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)及BCG的培养上清液中的蛋白质的western blotting解析结果。
例1是携带pIJK-1的耻垢分枝杆菌的对照培养上清液的电泳结果。
例2是携带pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自HTLVIIIB株的15个氨基酸构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合而成的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
例3是携带pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自HTLVIIIB株的15个氨基酸构成的肽在α抗原的第280位的Gln残基的位置融合而成的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
例4与例1相同。
例5是携带pIJK-V3(日本株-XhoI)的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自日本株的19个氨基酸构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合而成的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
例6是携带pIJK-1的牛分枝杆菌BCG的对照培养上清液的电泳结果。
例7是携带pIJK-V3(日本株-XhoI)的牛分枝杆菌BCG的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自日本株的19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合而成的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
为标记例1、2、3，使用了能识别HIV-1 HTLVIIIB株的V3抗原决定基的中和单克隆抗体gp120N。
为了标记例4、5、6，使用了能识别HIV-1日本株的共有序列的V3抗原决定基的中和单克隆抗体μ5.5。
在分子量约32000的位置可以确认融合蛋白质的带。
图4表示小鼠中CTL诱导的结果。横轴表示效应细胞与靶细胞的比率，纵轴表示受到特异性溶胞的靶细胞的比率。BCG-α是仅表达α抗原的BCG的免疫结果，BCG-V3是表达V3抗原决定基的BCG的免疫结果。H2d/BCG-V3表示使用P815细胞作为靶细胞的结果，H2k/BCG-V3表示使用SW147细胞作为靶细胞的结果。
图5表示豚鼠中产生的抗体的临床分离病毒的中和测定的结果。A表示从2个日本人的HIV载体分离的用于测定的病毒的V3区域的氨基酸序列。框围起来的阴影部分表示中和抗原决定基的区域。B是用抑制率表示的体外中和测定的结果。GP-1及GP-2分别表示使用各有20只豚鼠的第一组、第二组的血清免疫球蛋白的结果，黑条、带斜线条及带点线条分别表示以50、10、1μg/ml的浓度将免疫球蛋白加入测定体系的结果。纵轴表示以不加抗体时的培养上清液中的p24抗原量为对照加入抗体时的p24抗原的减少率(感染抑制率)。
图6表示用ELISA法测定的泰国A和B型V3肽的交叉反应性的结果。黑点是使用BCG-V3免疫的豚鼠血清的情况，白点是使用没有进行BCG免疫的正常豚鼠的血清的情况。纵轴表示ELISA的发色剂对硝基苯酚在414nm处的吸光强度。
图7表示2只BCG-V3免疫猕猴的抗V3抗体随时间的变化情况，白点表示#2797猴，黑点表示#2799猴，纵轴是用与V3肽的结合滴定度表示的。10*8表示108。
图8表示使用BCG-V3免疫4周后的猕猴血清抗体进行的HIV-1MN株中和测定结果。#2796、#2797表示接种30mg BCG-V3的猴，#2798、#2799表示接种5mg BCG-V3的猴，黑条、带深点条、带浅点条分别表示在测定体系中加入浓度为10、3、1μg/ml的免疫球蛋白时的情况。μ5.5是作为正极对照物的中和单克隆抗体。纵轴同图5一样，表示HIV-1p24抗原产生的抑制率。
图9表示具有日本株型V3序列的HIV-1-SIV嵌合体病毒NM-3rNJ1的构建的概略图。白条表示SIVmac(猕猴属的猴产生的SIV)产生的DNA，黑条表示HIV-1(HTLVIIIB)产生的DNA，带浅色点条表示含有日本型V3区域的DNA。
图10是以病毒免疫攻击后第4周的病毒负荷表示的嵌合体病毒感染防御试验的结果。横轴表示与M8166细胞共培养所用的猴末梢血单核细胞的数目，纵轴用p27抗原浓度表示共培养一周后的培养上清液中的嵌合体病毒量。白色方块表示没有进行BCG免疫的正常猴，黑点、白点分别表示使用#2797、#2799的末梢血单核细胞的情况。
图11表示gp41中和抗原决定基(6个氨基酸及13个氨基酸)由BCG分泌表达的结果。例1、2、3分别是对BCG-α、BCG-gp41-X6、BCG-gp41-X13的培养上清液的蛋白质进行15％SDS-PAGE分离后的western blotting分析结果。为了标记，使用识别HIV-1gp41的中和单克隆抗体2F5。
实施此发明的最佳方式
下面，详细说明本发明。
构成本发明的含有信号肽的载体分泌蛋白质是由BCG分泌的蛋白质。
作为具体实施例，可以举出来自抗酸菌的α抗原。特别理想的是在后面实施例中所用的来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原，这种α抗原是广泛地存在于其他抗酸菌种中的交叉反应性蛋白质。到此为止，有五种α抗原的一次结构已明确，它们来自BCG[J.Bacteriol.170，3847(1988)]、堪萨斯氏分枝杆菌[Infect.Immun.58，550(1990)]、鸟分枝杆菌(M.avium)[Infect.Immun.61，1173(1993)]、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)[Biochem.Biophys.Res.Commun.196，1466(1993)]、以及麻风分枝杆菌(M.leprae)[Mol.Microbiol.6，153(1992)]。在氨基酸序列的水平下它们具有80％程度的高同源性。并且比较其hydropathyprofile(亲水性·疏水性图)，由于非常相似，在分子表面的亲水性区域的位置可以在各种的α抗原间存在。因此，来自各种抗酸菌种的α抗原都可以用作载体。
确定含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面的位点在该蛋白质的氨基酸序列中的哪个位点的方法是以明确了的该蛋白质的高级结构为基础进行的。但是，要对蛋白质的高级结构完全了解，则是非常困难的。因此，实际上首先用Hopp和Woods的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，3824(1981)]确定该蛋白质的亲水性区域。由于大多亲水性的氨基酸残基都集中在蛋白质的分子表面，因此，可推断亲水性区域即实际的分子表面区域。其次，考察这个区域是否实际上与可识别分泌蛋白质本身的抗体起反应，若反应，则可证明此区域就是分子表面区域。因此，即可设计融合蛋白质，使得在该区域插入外来抗原肽。为了确定亲水性区域与实际的分子表面的区域是否一致，可使用下述方法：在实际制备这样设计的融合蛋白质并考察其抗原性的同时，用分泌表达该蛋白质的BCG对动物进行免疫，确认插入的外来抗原肽是否作为抗原决定基被杀伤T细胞识别以及是否作为抗原决定基被B细胞识别，从而有效诱导杀伤T细胞并显著提高抗体产生的水平。
作为含信号肽的载体分泌蛋白质，在使用来自抗酸菌的α抗原时，该α抗原的第184位的Ser残基和第185位的Asp残基附近的区域是分子表面的区域。因此，可以在第184位的Ser残基和第185位的Asp残基之间插入外来抗原肽。
构成本发明的外来抗原肽即是在用其对动物进行免疫时，作为抗原决定基被杀伤T细胞识别，或作为抗原决定基被B细胞识别，从而有效地诱导杀伤T细胞或显著提高产生抗体的水平。本发明的目的之一是提供用于治疗、预防细菌性或病毒性疾病的疫苗，因此，理想的外来抗原肽是构成导致该疾病的细菌或病毒的蛋白质的一部分。作为具体实例，可举出构成艾滋病毒的蛋白质，特别优选的是艾滋病毒表面抗原的抗原肽。更具体地说，由Asn Thr Arg Lys Ser Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列号：1)19个氨基酸残基构成的第三可变区域(V3抗原决定基)的抗原肽是最理想的。
艾滋病毒表面抗原gp120是从N末端开始按C1、V1、V2、C2、V3、C3、V4、C4、V5、C5的顺序构成的，氨基酸序列相对稳定的恒定区和变化较多的可变区大体上交替存在，其中，夹在C2和C3恒定区间的区域叫作第三可变区，其中的抗原位点叫作V3抗原决定基。具体地说，就是夹在gp120的第303位和第338位的两个Cys残基之间的区域。这个区域据LaRosa认为[Science 249，932(1990)]是极度可变的区域，但是，它可成为强烈抑制各种各样的变异株中病毒增殖的抗体的识别部位(B细胞抗原决定基)，这个抗体还可防止黑猩猩感染艾滋病毒。另外，由于这个区域含有能被体内有HLA-A2及A3的人所识别的杀伤T细胞的抗原决定基，它是用于开发能诱导中和抗体的产生和杀伤T细胞两者的艾滋病疫苗的最理想的外来抗原肽。
V3抗原决定基的基因是根据聚合酶链反应(PCR)法[Science230，1350(1985)]利用以C2及C3区域中的碱基序列为基础合成的引物得到的。另外，还可按下述方法得到：将由PCR法得到的DNA片段克隆到适当的载体中以确定碱基序列，随后在所确定的碱基序列基础上用化学方法合成DNA。
下面说明分泌融合蛋白质的BCG的制备方法，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。使BCG表达并分泌该融合蛋白质的方法之一是用重组DNA技术制备编码该融合蛋白质的DNA，将该DNA导入BCG细胞中，使其在细胞中稳定地存在，并且表达该DNA，从而分泌融合蛋白质。
下面说明用重组DNA技术制备目的BCG的方法。在此，含有信号肽的载体分泌蛋白质是来自抗酸菌的α抗原，在该α抗原的第184位的Ser残基和第185位的Asp残基之间插入作为外来抗原肽的艾滋病毒表面抗原的抗原肽，即由Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile GlyPro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列号：1)19个氨基酸构成的第三可变区域的抗原肽，以此为例来说明。
为了使BCG表达并分泌在抗酸菌产生的α抗原的亲水性领域插入外来抗原肽得到的融合蛋白质，将编码外来抗原肽的合成DNA在位于对应于α抗原基因中的亲水区域的适当的限制性内切酶位点插入公知的α抗原分泌载体pIJK-1[Infect.Immun.58，4049(1990)]中，然后将得到的重组分泌载体导入BCG中。
例如，利用对应于α抗原的亲水性区域之一即第184位的Ser残基和第185位的Asp残基的DNA具有XhoI限制性内切酶位点这一事实，按照α抗原基因的读码框，将表面抗原即编码由19个氨基酸残基构成的V3区域肽的合成DNA导入pIJK-1的XhoI位点，从而得到重组分泌载体。
在没有利用pIJK-1的情况下，首先制备编码堪萨斯氏分枝杆菌的抗原的DNA。该DNA可含有编码信号肽的区域。该DNA的制备方法采用的是Matsuo等的文献[Infect.Immun.58，550(1990)]中所记载的方法。然后制备可在BCG的细胞内稳定存在的质粒pIS18。该质粒的制备方法采用的是Snapper等的文献[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]中所记载的方法。用适当的限制性内切酶切断这样得到的质粒，使之成为直链状，把它与DNA相连接，即可得到重组DNA。切断的位置必须位于不分开为使该质粒能在BCG细胞内稳定地存在所必需的区域的位置。另外，为了表达该DNA，希望该DNA含有控制编码堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原的DNA的表达的区域，例如启动子。所述重组DNA用作构建重组分泌载体的起始物。
将重组分泌载体或重组DNA导入BCG的方法有电极化法，该方法在Snapper等的文献[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]中有记载。
另外，可用电极化法将该重组分泌载体或重组DNA导入在BCG以外的诸如耻垢分枝杆菌等各种多样的抗酸菌中。该重组分泌载体或重组DNA也可在耻垢分枝杆菌的细胞中稳定存在，该细胞可表达并分泌融合蛋白质。
对于本发明的BCG或耻垢分枝杆菌分泌的融合蛋白质的抗原性的评价方法如下：在middlebrook 7H9培养基(Difco公司出品)或Sauton培养基[J.Bacteriol.，169，839(1987)]中培养BCG或耻垢分枝杆菌的细胞，然后用western blotting法[J.Bacteriol.170，3847(1988)]解析培养上清液中的蛋白质和可识别目的外来抗原的抗体间的反应性。作为抗体，可以使用通过用目的外来抗原肽或含该肽的抗原蛋白质与佐剂一起免疫得到的兔血清(多克隆抗体)。或者，可以使用通过下述方法得到的单克隆抗体：从通常常规方法[Eur.J.Immunol.6，511(1976)]将同样免疫后的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到的hybridoma中选择能产生与目的外来抗原肽有反应性的株，随后培养该细胞株。在抗原-抗体反应中，如果融合蛋白质与抗体的反应性高于未与目的抗原融合的原始载体蛋白质与抗体的反应性，则认为该融合蛋白质具有来自目的外来抗原肽的抗原性。
在用动物模型检定BCG的抗体产生能力的情况下，可以将目的外来抗原肽或含该肽的抗原蛋白质担载在适当的固相上，然后用酶连免疫测定法(ELISA法)或western blotting法测定其与用BCG免疫的动物的抗血清的反应。
另外，所产生的抗体对于各种病原体的有效性因各种各样的病原体的不同，确认法也不同，大致有在培养细胞体系中(体外)的增殖抑制实验和生物体内的增殖抑制试验两种。前者的具体例子是在感染艾滋病毒的人的细胞株的培养液中加入该抗体和艾滋病毒，将其培养一段时间，然后用常规法定量测定培养终了时培养上清液中的病毒粒子，从而评价抑制增殖效果的方法。后者的具体例子是利用向象重症复合免疫缺陷(SCID)的鼠一样的缺乏T细胞和B细胞的鼠中，移植感染艾滋病的人的末梢血淋巴细胞得到的动物模型，即，给SCID鼠施用所述抗体和艾滋病毒，然后评价SCID鼠血液中的病毒增殖抑制的方法。
另一方面，CTL诱导能力可用CTL测定法来确定，此法是用鼠体系的以往的常规方法51Cr释放法，用脉冲目的抗原肽的细胞作为靶细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，3105(1988)]。
表达分泌融合蛋白质的BCG可以作为疫苗使用。在BCG细胞的悬浮液中可使用生理盐水、磷酸缓冲液。对于人和动物，虽然通常采用皮下接种的方法进行给药，但根据不同情况，经口给药、静脉注射等也可以得到疫苗效果。在皮下接种时，给药量可为2×107个活菌，可从出生后3个月的新生儿开始给药，但对结核感染者或结核菌素反应阳性的人不能接种。接种后的副作用主要是局部淋巴结肿胀、局部溃疡等，重症例子极少。
构成本发明的BCG分泌融合蛋白质，所述融合蛋白质是在来自抗酸菌的α抗原的分子表面插入外来抗原肽得到的。由于外来抗原肽的缘故，该融合蛋白质的抗原性及免疫原性显著增加，因此在给动物接种的时候，能够被可有效识别该抗原的B细胞识别，从而可有效地诱导产生抗该抗原的抗体。在给动物接种BCG自体时，它在动物体内继续增殖，并且，由于继续分泌该融合蛋白质，因此，可成为非常有用的疫苗。
来自以HIV为代表的各种病原体的B细胞抗原决定基多在分子表面没有如α螺旋和β片一类的二次结构的部位。本发明所提供的分泌融合蛋白质的重组分泌载体使BCG分泌和表达来自各种病原体的B细胞抗原决定基，而B细胞抗原决定基可以保持其本来结构及高抗原性。该BCG株可成为具有高免疫原性的疫苗，可诱导产生为防御各病毒、细菌、寄生虫等的感染所必需的高效价的抗体和显著的CTL活性。
实施例
下面用实例更具体地说明本发明。实施例描述中采用以下的简写。A：腺嘌呤，C：胞嘧啶，G：鸟嘌呤，T：胸腺嘧啶，DNA：脱氧核糖核酸，Ala：丙氨酸，Arg：精氨酸，Asn：天冬酰胺，Asp：天门氨酸，Gln：谷氨酰胺，Glu：谷氨酸，Gly：甘氨酸，His：组氨酸，Ile：异亮氨酸，Leu：亮氨酸，Lys：赖氨酸，Met：蛋氨酸，Pro：脯氨酸，Ser：丝氨酸，Thr：苏氨酸，Trp：色氨酸，Tyr：酪氨酸，Val：缬氨酸，CTL：杀伤T细胞，HLISA：酶连免疫测定法，IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，HIV：人免疫缺陷病毒，TBS：Tris缓冲盐水，PBS：磷酸盐缓冲盐水，SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，MHC：主要组织适合抗原，SCID：重症复合免疫缺陷症，TCID50：50％组织培养感染量。
实施例1  α抗原的B细胞抗原决定基的确定
首先，为了找出在α抗原的亲水性区域里确实露出分子表面的部位，确定α抗原自身的B细胞抗原决定基。考察来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原的亲水性·疏水性图[Infect.Immun.58，550(1990)]，选择该α抗原中两个亲水性最高的区域，合成两种编码与该区域相当的约20个氨基酸残基构成的肽的DNA。
一个DNA编码具有从该α抗原的第38位的Leu残基到第57位的Ala残基的序列的肽，所述序列是：5′-GATCCTCGACGGTCTCCGCGCTCAAGACGACTACAACGGCTGGGACATCAACACCCCGGCC
    GAGCTGCCAGAGGCGCGAGTTCTGCTGATGTTGCCGACCCTGTAGTTGTGGGGCCGGCTAG-5′(序列号：2，序列号：3)。
另一个DNA编码具有从该α抗原的第184位的Ser残基到第203位的Asn残基的序列的肽，所述序列是：5′-GATCAGTGACCCAGCCTGGCAGCGTAACGACCCGTCGCTGCACATTCCGGAGCTGGTCGCCAAC
    TCACTGGGTCGGACCGTCGCATTGCTGGGCAGCGACGTGTAAGGAATCGACCAGCGGTTGCTAG-5′(序列号：4，序列号：5)。
使将各DNA在β-半乳糖苷酶基因的最下游(相当于产物的C末端)融合得到的DNA在大肠杆菌的细胞中表达，得到两种融合蛋白质。将两个DNA片段与用BamHI切断的pUR 289质粒[EMBO J.3，1429(1984)]连接。将得到的重组DNA导入大肠杆菌EQ 192株中。在含有50μg/ml氨必西林的L-液体培养基中于37℃下将所得各转换株振荡培养3小时，然后加入IPTG，使最终浓度为1mM，再在30℃下培养2小时。将通过离心分离得到的菌体悬浮在1/10容量的TBS缓冲液中，在200W下声处理15分钟，得到2个系列的菌体提取液。各萃取液中含有目的融合蛋白质。将10μl各萃取液分别进行7.5％SDS-PAGE电泳，将经电泳分离的蛋白质印迹到硝酸纤维滤膜上。可用western blotting法测定每种蛋白质与抗来自堪萨斯氏分枝杆菌的抗原的兔多克隆抗体及抗来自BCG的抗原的兔多克隆抗体的反应性(参照图1)。
与β-半乳糖苷酶融合的含有从第38位的Leu残基到第57位的Ala残基的序列的肽与这两种抗体都不反应(例2和5)，但与β半乳糖苷酶融合的含有从第184位的Ser残基到第203位的Asn残基的序列的肽与两种抗体都有很高的反应性(例3、6)。由此可以明确，上述两种抗酸菌共有的B细胞抗原决定基存在于从第184位的Ser残基到第203位的Asn残基的区域。可推测出这个区域露出在α抗原分子的表面。
图1中，例1、例4是大肠杆菌EQ 192株的菌体提取液的电泳结果，所述菌株携带表达β-半乳糖苷酶的质粒pUR 289。例2、例5是大肠杆菌EQ 192株的菌体提取液的电泳结果。所述菌株携带表达由β-半乳糖苷酶与具有α抗原的第38位的Leu残基至第57位的Ala残基的序列的肽融合而成的蛋白质的质粒pUR 289+α-Leu38-Ala 57。例3、6是大肠杆菌EQ 192株的菌体提取液的电泳结果，所述菌株携带表达β-半乳糖苷酶与具有α抗原的第184位的Ser残基至第203位的Asn残基的序列的肽融合而成的蛋白质的质粒pUR 289+α-Ser 184-Asn 203。例1、2、3是用抗来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原的兔多克隆抗体来进行标记的。例4、5、6是用抗来自BCG的α抗原的兔多克隆抗体来进行标记的。图中的带相当于β-半乳糖苷酶-融合蛋白质。
实施例2  含有HIV-1表面抗原V3抗原决定基的融合蛋白质分泌载体的构建
由于可以推测出α抗原的第184位的Ser残基到第203位的Asn残基的区域突出于分子表面，因此作了如下尝试：即利用对应于α抗原基因中第184位的Ser残基的位置的XhoI位点，将HIV-1表面抗原V3抗原决定基与α抗原融合，使BCG及耻垢分枝杆菌分泌融合蛋白质。以下的说明参照图2以便更容易理解。
将HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原决定基中由Arg Ile Gln ArgGly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(序列号：6)15个氨基酸残基构成的肽在上述第184位的Ser残基的位置(DNA的XhoI位点)融合得到融合蛋白质，为得到此融合蛋白质，将用XhoI完全切断含α抗原基因的质粒pKAH200得到的DNA片段分离，得到载体DNA。另一方面，也可用化学方法合成编码由15个氨基酸残基构成的肽的基因。其序列如下：5′-TCGAGTCGGATCCAGAGGGGCCCTGGTAGGGCGTTCGTCACCATCGGCAAG
    CAGCCTAGGTCTCCCCGGGACCATCCCGCAAGCAGTGGTAGCCGTTCAGCT-5′(Xho I位点)(序列号：7，序列号：8)。将该合成DNA与上述载体DNA连接，得到重组DNA，将其导入大肠杆菌HB101株中，在转化株内放大重组DNA。然后，为了将融合蛋白质基因分离成KpnI片段，将KpnI接头插入来自pUC载体的HindIII位点。用KpnI消化所得到的质粒，分离出含融合蛋白质基因的KpnI-KpnI DNA片段。将KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌-大肠杆菌往复式载体pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位点，得到重组分泌载体。将其命名为pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)。
为使BCG及耻垢分枝杆菌分泌出HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原决定基和α抗原融合而成的融合蛋白质中的对照物，制备必要的重组分泌载体。在此是将HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原决定基中的ArgIle Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(序列号：6)15个氨基酸构成的肽在对应于α抗原C末端附近的第280位的Gln残基的位置的PstI位点融合，将由此得到的融合蛋白质作为对照物。分离将用PstI完全切断含α抗原基因的质粒pKAH200得到的DNA片段，得到载体DNA。另一方面，可用化学方法合成编码15个氨基酸的基因。其序列如下：5′-CGGATCCAGAGGGGCCCTGGTAGGGCGTTCGTCACCATCGGCAAGTAGCTGCAACGTGCCTAGGTCTCCCCGGGACCATCCCGCAAGCAGTGGTAGCCGTTCATCG-5′(PstI位点)(序列号：9，序列号：10)。将该合成的DNA与上述载体DNA连接，得到重组DNA，将其导入大肠杆菌HB101株中，在转化株内放大重组DNA。然后，为了将融合蛋白质基因分离成KpnI片段，将KpnI接头插入来自pUC载体的HindIII位点。用KpnI消化得到的质粒，分离出含融合蛋白质基因的KpnI-KpnI DNA片段。将KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌大肠杆菌pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位点，得到重组分泌载体。将其命名为pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)。
实施例3  由耻垢分枝杆菌表达并分泌HIV-1V3抗原决定基
          -α抗原融合蛋白质
按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]将实施例2中构建的重组分泌载体pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)和pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)分别导入耻垢分枝杆菌ATCC 607株中。将所得转化株分别在70ml含30μg/ml卡那霉素的Sauton培养基[J.Bacteriol.169，839(1987)]中于37℃下静置培养2周。通过离心分离和用微孔滤膜过滤除菌，得到培养上清液。向0.5ml各培养上清液中加入等量的10％三氯乙酸水溶液，在0℃下保温30分钟后，离心分离，使蛋白质沉淀。将各沉淀悬浮在20μl SDS-PAGE用样品缓冲液(含60mM Tris，2％SDS，5％巯基乙醇，10％甘油，0.1％溴酚蓝)中，然后在95℃加热5分钟使其溶解，得到电泳用样品。将各样品用15％ SDS-PAGE电泳分离。电泳后，按常规方法将蛋白质印迹到硝酸纤维素滤膜上，并用western blotting法解析。结果如图3所示。与由来自HTLVIIIB株的15个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第280位的Gln残基的位置融合得到的融合蛋白质(例3)相比，由来自HTLVIIIB株的15个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质(例2)与抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体gp120的反应性高50-100倍。也就是说，通过以露出α抗原的分子表面的方式表达V3抗原决定基，可以极大地提高V3抗原决定基的抗原性。
图3中，例1是携带只分泌α抗原的载体pIJK-1[Infect.Immun.58，4049((1990)]的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，例2是携带pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自HTLVIIIB株的15个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合而成的融合蛋白质的抗原-抗体反应。例3是携带pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自HTLVIIIB株的15个氨基酸构成的肽在α抗原的第280位的Gln残基的位置融合而成的蛋白质的抗原-抗体反应。
为了标记，使用抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体，该抗体可购自美国杜邦公司。
实施例4  含HIV-1(日本株)表面抗原V3抗原决定基的融合
         蛋白质分泌载体的构建
实施例2、3对于通过将HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原决定基中由Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile GlyLys(序列号：6)15个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质进行了试验。这里对于通过将HIV-1(日本株)V3抗原决定基中由Asn Thr Arg Lys Ser IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列号：1)19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质进行试验。
以下的说明参照图2以便于理解。
为了得到通过将HIV-1(日本株)V3抗原决定基中由Asn ThrArg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala ThrGly Ser(序列号：1)19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置(DNA中XhoI位点的位置)融合得到的融合蛋白质，分离用XhoI将含有α抗原基因的质粒pKAH200完全切断得到的DNA片段，得到载体DNA。另-方面，也可用化学方法合成编码19个氨基酸残基的肽的基因。其序列如下：5′-TCGAGTAACACGAGGAAGAGCATCCACATCGGGCCCGGGAGGGCATTCTACGCCACCGGG
    CATTGTGCTCCTTCTCGTAGGTGTAGCCCGGGCCCTCCCGTAAGATGCGGTGGCCCAGCT-5′(序列号：11，序列号：12)。将该合成DNA与上述载体DNA连接，将得到的重组DNA导入大肠杆菌HB101株中，在转化株中放大重组DNA。然后，为了将融合蛋白质基因分离成KpnI片段，将KpnI接头插入来自pUC载体的HindIII位点。用KpnI消化所得的质粒，分离出含有融合蛋白质基因的KpnI-KpnI DNA片段。将KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌-大肠杆菌往复式载体pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位点，得到重组分泌载体。将其命名为pIJK-V3(日本株-XhoI)。
实施例5  由耻垢分枝杆菌和BCG表达并分泌HIV-1V3抗原
         决定基-α抗原融合蛋白质
按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]将实施例4中构建的重组分泌载体pIJK-V3(日本株-XhoI)导入耻垢分枝杆菌ATCC600株中。将所得的转化株在70ml含30μg/ml卡那霉素的Sauton培养基[J.Bacteriol.169，839(1987)]中于37℃静置培养2周，然后通过离心分离和用微孔滤膜过滤除菌，得到培养上清液。向0.5ml培养上清液中加入等量的10％三氯乙酸水溶液，在0℃保温30分钟后，离心分离，使蛋白质沉淀。将沉淀悬浮在20μl SDS-PAGE用样品缓冲液(含60mM Tris，2％ SDS，5％2-巯基乙醇，10％甘油，0.1％溴酚蓝)中，然后在95℃加热5分钟使其溶解，得到电泳用样品。将样品用15％ SDS-PAGE电泳分离。电泳后，按常规方法将蛋白质印迹到硝酸纤维素滤膜上，并用western blotting法解析。结果如图3所示。结果表明，来自日本株的19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质也与抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体μ5.5强烈地反应(例5)。也就是说，对于日本株的情况，通过以露出α抗原的分子表面的方式表达V3抗原决定基。也可以极大地提高V3抗原决定基的抗原性。
图3中，例4是携带pIJK-1的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果。例5是携带pIJK-V3(日本株-XhoI的耻垢分枝杆菌的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自日本株的19个氨基酸构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
为了标记，使用抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体μ5.5。该抗体是用下述方法得到的：用在上述19个氨基酸残基构成的肽(序列号1)的两端加上Cys残基得到的肽的三聚体免疫小鼠，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到hybridoma，并进行培养。
从开发抗来自日本携带者的病毒中最常见的HIV-1株的疫苗的观点考虑，使BCG分泌融合蛋白质，所述融合蛋白质是将来自日本株的19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第18位的Ser残基的位置融合得到的。实验方法按采用耻垢分枝杆菌的方法进行。分泌的融合蛋白质用western blotting法解析，结果示于图3中。结果表明，即使在由BCG分泌通过将来自日本株的19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质的情况下，融合蛋白质也与抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体μ5.5强烈地反应(例7)。将所得的BCG株命名为BCG-V3并用于下面的动物实验中。牛分枝杆菌BCG-V3已保藏在通商产业省工业技术院生命科学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-4759。
图3中，例6是携带pIJK-1的牛分枝杆菌BCG的培养上清液的电泳结果。例7是携带pIJK-V3(日本株-XhoI)的牛分枝杆菌BCG的培养上清液的电泳结果，这是为了考察来自日本株的19个氨基酸残基构成的肽在α抗原的第184位的Ser残基的位置融合得到的融合蛋白质的抗原-抗体反应。
为了标记，使用抗HIV-1的V3抗原决定基的中和单克隆抗体μ5.5。
实施例6  豚鼠中抗HIV-1V3位点的抗体产生
将BCG-V3和仅表达来自堪萨斯氏分枝杆菌的α抗原的BCG-α分别在5ml Middlebrook 7H9培养基(Difco制)中于37℃振荡培养，当OD610nm达到0.6时(对数增殖期)集菌，用PBS洗涤一次，然后悬浮在10ml PBS中。用1ml BCG-V3的菌液(5mg，含约108BCG细胞)给4只豚鼠皮下接种，并用相同量的BCG-α的菌液给另外3只豚鼠皮下接种，6周后采血，用V3肽(19个氨基酸)抗原按ELISA法测定抗V3抗体效价(表1)。BCG-α免疫豚鼠阴性对照组的抗体效价低于可检出界限，而用BCG-V3免疫的4只豚鼠全部诱导产生了超过120-640倍的高效价抗体。其中2只所诱导的抗体效价水平足以防止黑猩猩感染HIV-1[Nature 345，622(1990)]。
表1是豚鼠中抗V3抗体产生的试验结果。其中，“正常”、“BCG-V3-1～4”和“BCG-α-K-1～3”分别表示什么也没接种的豚鼠、4只BCG-V3免疫的豚鼠和3只BCG-α免疫的豚鼠。
                             表1
             BCG-V3接种豚鼠血清中的抗V3抗体效价
             豚鼠                     抗V3抗体效价
             Normal                         0
             BCG-V3-1                     640
             BCG-V3-2                     160
             BCG-V3-3                     120
             BCG-V3-4                     320
             BCG-α-K-1                     0
             BCG-α-K-2                     0
             BCG-α-K-3                     0皮下接种5mg的重组BCG后，用ELISA法测定6周后的抗V3抗体效价
实施例7  BCG-V3接种豚鼠血清的体外病毒中和活性的测定
使用实施例6得到的4只BCG-V3接种豚鼠的6周后的血清测定体外病毒中和活性。用植物血细胞凝集素刺激人的末梢血淋巴细胞，向1天后的blast化的细胞中加入HIV-1MN株2000 TCID50和上述豚鼠血清的免疫球蛋白部分在37℃预保温1小时得到的混合物，培养约1周，当观察到细胞变性效果时，用核蛋白p24测定ELISA试剂盒测定培养上清液中的HIV粒子。结果示于表2中。采用正常豚鼠血清的对照样末观察到明显的HIV-1中和活性，而4只BCG-V3免疫的豚鼠全部观察到显著的HIV-1中和活性，这说明实施例6中得到的抗V3抗体实际上具有抑制HIV-1增殖的活性。
表2中，与各病毒反应所用的豚鼠血清免疫球蛋白量中细胞培养上清液中的p24蛋白浓度以pg/ml单位表示，若p24蛋白浓度低于使用正常豚鼠血清的场合，则可以说血清具有HIV中和活性。
                            表2
                  BCG-V3接种豚鼠血清的病毒中和活性
Ig浓度(μg/ml)  BCG-V3-1   BCG-V3-2   BCG-V3-3   BCG-V3-4   正常   μ5.5
    0             2390       2390       2390       2390     2390    2390
    1             1308       1656       2880       1906     2250    2096
   10             1184        635       1427        804     1815       1
   50              961         19        906         47     1921       1
“正常”表示正常豚鼠血清，BCG-V3-1～BCG-V3-4表示4只BCG-V3接种豚鼠血清，μ5.5表示中和单克隆抗体。靶细胞培养上清液中的病毒核蛋白p24量用pg/ml单位表示。
实施例8  利用SCID米色小鼠的、BCG-V3接种豚鼠血清的体
         内病毒中和活性的测定
给SCID米色小鼠(缺乏T、B细胞之外的天然杀伤细胞的小鼠)腹腔内接种2×107个人末梢血淋巴细胞，2周后，同时静脉注射HIV-1 MN株的约6000TCID50和10mg实施例4中得到的BCG接种豚鼠血清的免疫球蛋白部分。84小时后脱血，收集靶细胞。将靶细胞与用植物血细胞凝集素刺激的人末梢血淋巴细胞一起培养7天，按与实施例7相同的方法测定培养上清液中的病毒量。结果示于表3中。在每一靶细胞中，当使用正常豚鼠血清时检测到约100pg/ml的p24浓度，而使用BCG-V3-2血清时p24浓度在检出界限以下，这说明其血清中的抗V3抗体即使在体内也具有HIV-1中和活性，可防止SCID小鼠中的末梢血淋巴细胞感染HIV-1。
表3示出了施用HIV-1 MN株和豚鼠血清免疫球蛋白的SCID米色小鼠的末梢血单核细胞、腹腔浸出细胞和脾细胞的培养上清液中的p24蛋白浓度(pg/ml)，“＜30”表示在检出界限以下。
                    表3
      采用SCID米色小鼠的体外病毒中和活性靶细胞                  正常豚鼠IgG          BCG-V3-2豚鼠IgG末梢血单核细胞              95                     ＜30腹腔浸出细胞                90                     ＜30脾细胞                     104                     ＜30
给腹腔接种2×107人末梢血淋巴细胞2周后的SCID米色小鼠静脉注射HIV MN株和10mg豚鼠血清IgG，收集细胞并培养，7天后的培养上清液的病毒核蛋白P24量以Pg/ml单位表示。
实施例9  小鼠中CTL的诱导
给5只Balb/C小鼠皮下接种0.1mg BCG-V3，2周后分离脾细胞，用10μg/ml V3肽(19个氨基酸)再刺激7天，得到效应细胞。用V3肽脉冲后的P815细胞(MHC class I：H2d)作为靶细胞，用Cr释放法测定效应细胞的CTL活性。5只小鼠中均观察到显著的CTL活性的诱导(图4A)。另外，当用含有MHC class I H2k分子的SW5147细胞用作靶细胞时，效应细胞不显示这一活性。因此可认为这一活性来自MHC Class I限制性CTL(图4B)。
实施例10  BCG-V3接种豚鼠血清的临床分离病毒株中和活性
          的测定
据报道，由正在作为预防艾滋病感染候补疫苗引起关注的亚单位gp120疫苗(通过基因重组动物细胞产生)诱导的中和抗体可中和诸如MN株一类的实验室株，但不能中和临床分离株[AIDS Res.HumanRetroviruses，10，631-632(1994)]。给每组20只的两组(共计40只)豚鼠皮下接种5mg BCG-V3，用与实施例7相同的体外中和测定法测定6周后的血清抗体的临床分离HIV-1株中和活性。所用的临床分离病毒HIV-A和HIV-B分别通过用植物血细胞凝集素刺激日本HIV携带者的末梢血单核细胞后与正常人的末梢血单核细胞在RPM1640培养基(GIBCO制)中共同培养得到。提取培养上清液中不含细胞的病毒RNA，用OD3引物(nt 7345-7369＝5′-AAATTCCCCTCCACAATTAAAACTG-3′)(序列号：19)和逆转录酶进行逆转录，得到DNA。用该DNA作为模板，利用夹持V3区域的两种引物EB2(在nt 6989-7009上加上BamHI识别序列得到的＝5′-GCCGGATCCTCAACTCAACTGCTGTTAAAT-3′)(序列号：20)和EC2(在nt 7314-7336上加上PstI识另序列和终止密码子得到的＝5′-GCT CTGCAGTCAAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG-3′)(序列号：21)进行PCR反应以放大DNA，然后用BamHI和PstI切断，将得到的片段克隆到pUC18载体上。用373A DNA定序仪(Applied Biosystems-Perkin ElmerCo.)确定克隆后DNA的碱基序列，从而推断V3区域的氨基酸序列。将临床分离的病毒100 TCID5O与通过用蛋白A琼脂糖(PharmaciaP-L Biochemicals)柱纯化20只免疫豚鼠的混合血清得到的免疫球蛋白部分，在37℃下培养60分钟，然后与106个用植物血细胞凝集素刺激的正常人末梢血单核细胞混合，在37℃下振荡60分钟。用PBS洗涤细胞，然后在含有重组人IL-2(40单位/ml)的PRM1640培养基中培养7天，用p24抗原ELISA试剂盒(Dinabot制)测定培养上清液中的HIV量。结果示于图5B中，其中中和活性以在体系中加入抗体时得到的p24量与不加抗体的对照样得到的p24量的比率(抑制率)表示。对于A、B两种病毒，用GP-1、GP-2两组豚鼠的血清进行同样的实验。BCG-α免疫的豚鼠和BCG-V3免疫前的豚鼠的血清免疫球蛋白几乎没有中和活性，而BCG-V3免疫组显示了非常的中和活性，其90％抑制浓度为1μg/ml左右。这两种病毒的V3区域中的中和抗原决定基(图5A的阴影部分)的氨基酸序列与引入BCG-V3的日本株与HIV MN株的共有序列完全一致。这表明，如果是至少与V3中和抗原决定基的氨基酸序列相同的病毒，则无论是从HIV载体分离得到的株，还是MN株之类的实验室再次培养得到的株，抗体实际上可同样地中和病毒。
实施例11  豚鼠中产生的抗V3抗体的交叉反应性
测定实施例10中制备的一组20只豚鼠的混合血清(BCG-V3免疫后6周)与泰国A型和B型病毒V3区域的交叉反应性。通常，从病毒的分类上看，属于clade B的北美型(MN株)和日本株与属于clade E的泰国型株无血清学上的交叉反应。通过ELISA法采用19个氨基酸组成的泰国A型V3肽(Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr IleGly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp)(序列号：18)和19个氨基酸组成的泰国B型V3肽(Asn Thr Arg Lys Ser IleHis Leu Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Thr Thr Gly Gln)(序列号：22)分别与载体蛋白质钥孔血蓝蛋白(KLH)轭合得到的抗原测定交叉反应性。结果示于图6中。
用于对照的正常豚鼠血清与泰国AV3肽或泰国BV3肽几乎没有交叉反应，而BCG-V3免疫的豚鼠血清与泰国AV3肽和泰国BV3肽都有交叉反应，这暗示了BCG-V3免疫豚鼠血清除了中和北美型、日本型病毒以外的中和泰国型病毒的活性。
实施例12  猴的中和抗体产生
给4只雄性猴(7-8岁，#2796-#2799)中的2只(#2796，#2797)皮下接种30mg BCG-V3(6×108细胞)，给另2只(#2798，#2799)皮下接种5mg BCG-V3(1×108细胞)，采用与KLH轭合的V3肽(19个氨基酸)抗原通过ELISA法测定2、4、6、8、12、27周后血清中的抗V3抗体效价。4只猴中全部诱导了抗体产生。#2797和#2799两只猴中抗体效价的变化示于图7中。2只中均观察到大于106的高效价的抗体产生，但免疫10周后，抗体效价呈逐渐减小的趋势。按与实施例10相同的体外中和测定方法测定4周后血清抗体的HIV-1MN株中和活性，结果示于图8中。任一只猴的血清抗体均具有中和活性，特别是接种5mg BCG-V3的猴(#2798，#2799)具有很强的病毒中和活性，其90％抑制浓度为约10μg/ml。
实施例13  猴中HIV-SIV嵌合体病毒(SHIV)的感染防御
据报道，将可感染猕猴的猴免疫缺陷病毒(SIV)的外壳(pg120，gp41部分)用HIV-1的外壳代替后得到的HIV-SIV嵌合体病毒(SHIV)同样可以感染猕猴。将外壳部分换成来自HIV-1(HTLVIIIB)的外壳所得的NM 3rN的分子克隆[J.Virol.65，3514(1991)]的V3区域用来自日本株的序列替换，制备嵌合体病毒NM-3rNJ1。构建的方法示于图9中。用EcoRI和HpaI由NM-3rN基因切出外壳部分，将该外壳部分亚克隆到在HincII位点插入了HpaI接头(宝酒制造)的pUC18的EcoRI-HpaI。用BglII切断所得质粒，分离出大片段，以此作为载体。如实施例10所述，将由日本HIV携带者A的血液中分离得到的病毒RNA逆转录为DNA，用PCR法放大，将其作为BamHI-PstI片段亚克隆到pUC18中，用BglII切断，得到含有V3区域的DNA片段，将其与上述载体连接，得到重组质粒。将该质粒导入大肠杆菌HB101株中并在所得转化株中放大。将用EcoRI和HpaI切断该质粒得到的小片段与用HpaI切断NM-3rN得到的大片段连接，得到含有来自日本株的HIV-1的V3区域的基因的NM-3rNJ1。用常规的磷酸钙法将NM-3rNJ1质粒转染到M8166细胞中，在RPM1640培养基中培养1周。将释放到培养上清液中的病毒(SHIV)再次转染到M8166细胞中，将培养1周后所得培养上清液中的病毒用于感染实验。对#2797和#2799两只猴，在免疫38周后，各自通过皮下接种100μg融合蛋白质进行追加免疫，所述融合蛋白质是将19个氨基酸的V3肽插入在大肠杆菌中表达并在直链淀粉树脂柱上纯化的麦芽糖结合蛋白质与α抗原的融合蛋白质中得到的，2周后确认抗V3抗体效价的升高后，静脉注射SHIV(MN)10TCID50。在病毒免疫攻击后2、4、6周采血，将分离出的末梢血单核细胞5×106个的2倍稀释素到分别与M8166细胞一起培养，1周后用SIV p27抗原测定ELISA试剂盒(Ortho公司制)测定培养上清液中的嵌合体病毒浓度。4周后的结果示于图10中。在#2797猴中，当细胞浓度为2.5×106以上时观察到嵌合体病毒感染，但与接种嵌合体病毒10TCID50的正常猕猴阴性对照组相比，所产生的病毒量显著降低。在#2799猴中，根本没有检出嵌合体病毒，这表明极好地防止了SHIV感染。
实施例14  表达HIV-1gp41中和抗原决定基的BCG株的确立
制备表达和分泌pg41中和抗原决定基[J.Virol.67，6642-6647(1993)]和α抗原的融合蛋白质的重组BCG，据报道，所述gp41中和抗原决定基可被HIV-1V3抗原决定基以外的B细胞抗原决定基中具有强病毒中和活性的抗体识别。按与实施例2和3类似的方法，用化学方法合成编码6个氨基酸(Glu Leu Asp Lys Trp Ala)(序列号：23)的gp41抗原决定基而不是V3抗原决定基及N末端延长的13个氨基酸(Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu AspLys Trp Ala)(序列号：13)的肽的基因(具有可在XhoI识别位点插入基因的附着末端)，并用于克隆。其序列如下：5′-TCGAGTGAGCTGGACAAGTGGGCT
    CACTCGACCTGTTCACCCGAAGCT-5′(序列号：24，序列号：25)(编码6个氨基酸)，5′-TCGAGTAAGAACGAGCAGGAGCTGCTGGAGCTGGACAAGTGGGCT
    CATTCTTGCTCGTCCTCGACGACCTCGACCTGTTCACCCGAAGCT-5′(序列号：26，序列号：27)(编码13个氨基酸)。按与图2所示V3抗原决定基的情况相同的方法，将这些DNA片段与用XhoI完全切断质粒pKAH200得到的载体DNA连接，得到重组DNA，将其导入大肠杆菌HB101株中，并在转化株内放大重组DNA。为了将融合蛋白质基因切成KpnI片段，将KpnI接头插入来自pUC载体的HindIII位点，用KpnI消化得到的质粒，分离出KpnI-KpnI DNA片段。将该DNA片段克隆到pIS18载体的KpnI位点，得到重组分泌载体。对于6个氨基酸的，将所述载体命名为pIJKgp41-X6，对于13个氨基酸的，将其命名为pIJKgp41-X13。
按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]将载体导入BCG东京株中。将得到的各转化株在5ml含有30μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9培养基(Difco制)中于37℃振荡培养6周。培养上清液经微孔滤膜过滤除菌后，加入等量的2倍浓度的SDS-PAGE样品缓冲液，在95℃加热5分钟，然后供给15％ SDS-PAGE电泳。分离后，按常规方法将其印迹到硝酸纤维素滤膜上，用western blotting法解析。结果示于图11中。携带pIJKgp41-X6的BCG(例2)和携带pIJKgp41-X13的BCG(例3)均与识别gp41抗原决定基的中和单克隆抗体2F5(Waldheim Pharmazeutika，奥地利)有明显的反应性，而后者的反应性略强。同样，可以将V3抗原决定基以外的中和抗原决定基插入α抗原的分子表面，由BCG分泌并表达。这些BCG株分别命名为BCG-gp41-X6(6个氨基酸)和BCG-gp41-X13(13个氨基酸)。
             序列表
序列号：1序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala          161               5                  10                  15Thr Gly Ser                                                              19序列号：2序列长度：61序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GATCCTCGAC GGTCTCCGCG CTCAAGACGA CTACAACGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC        60C                                                                        61序列号：3序列长度：61序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GATCGGCCGG GGTGTTGATG TCCCAGCCGT TGTAGTCGTC TTGAGCGCGG AGACCGTCGA        60G                                                                        61序列号：4序列长度：64序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GATCAGTGAC CCAGCCTGGC AGCGTAACGA CCCGTCGCTG CACATTCCGG AGCTGGTCGC        60CAAC                                                                     64序列号：5序列长度：64序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GATCGTTGGC GACCAGCTAA GGAATGTGCA GCGACGGGTC GTTACGCTGC CAGGCTGGGT       60CACT                                                                    64序列号：6序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1  日本株序列Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys             151               5                  10                  15序列号：7序列长度：51序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGAGTCGGA TCCAGAGGGG CCCTGGTAGG GCGTTCGTCA CCATCGGCAA G                51序列号：8序列长度：51序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGACTTGCC GATGGTGACG AACGCCCTAC CAGGGCCCCT CTGGATCCGA C             51序列号：9序列长度：53序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列CGGATCCAGA GGGGCCCTGG TAGGGCGTTC GTCACCATCG GCAAGTAGCT GCA           53序列号：10序列长度：53序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA
序列
GCTACTTGCC GATGGTGACG AACGCCCTAC CAGGGCCCCT CTGGATCCGT GCA           53序列号：11序列长度：60序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGAGTAACA CGAGGAAGAG CATCCACATC GGGCCCGGGA GGGCATTCTA CGCCACCGGG    60序列号：12序列长度：60序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGACCCGGT GGCGTAGAAT GCCCTCCCGG GCCCGATGTG GATGCTCTTC CTCGTGTTAC    60序列号：13序列长度：13序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala                 131               5                  10序列号：14序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala     161               5                  10                  15Thr Gly Asp                                                         19序列号：15序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr     161               5                  10                  15Thr Gly Glu                                                         19序列号：16序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala     161               5                  10                  15Thr Gly Glu                                                         19序列号：17序列长度：18序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr     161               5                  10                  15Thr Arg                                                             18序列号：18序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg     161               5                  10                  15Thr Gly Asp                                                         19序列号：19序列长度：25序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列AAATTCCCCT CCACAATTAA AACTG                                       25序列号：20序列长度：30序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GCCGGATCCT CAACTCAACT GCTGTTAAAT                                  30序列号：21序列长度：35序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列GCTCTGCAGT CAAATTTCTG GGTCCCCTCC TGAGG                            35序列号：22序列长度：19序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Leu Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Thr     161               5                  10                  15Thr Gly Gln                                                         19序列号：23序列长度：6序列类型：氨基酸拓扑结构：直链状序列种类：肽起源：生物名：人免疫缺陷病毒株名：HIV-1序列Glu Leu Asp Lys Trp Ala1               5序列号：24序列长度：24序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGAGTGAGC TGGACAAGTG GGCT                                        24序列号：25序列长度：24序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGAAGCCCA CTTGTCCAGC TCAC                                        24序列号：26序列长度：45序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA
序列
TCGAGTAAGA ACGAGCAGGA GCTGCTGGAG CTGGACAAGT GGGCT                 45序列号：27序列长度：45序列类型：核酸链数：1条拓扑结构：直链状序列种类：其他核酸  合成DNA序列TCGAAGCCCA CTTGTCCAGC TCCAGCAGCT CCTGCTCGTT CTTAC                 45

Claims (10)

1.含有分泌融合蛋白质的牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白质是在含有信号肽的载体分泌蛋白质的分子表面插入外来抗原肽得到的。
2.根据权利要求1所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中含有信号肽的载体分泌蛋白质是来自抗酸菌的α抗原。
3.根据权利要求2所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中含有信号肽的载体分泌蛋白质是来自抗酸菌的α抗原，，融合蛋白质是在所述α抗原的第184位的Ser残基和第185位的Asp残基之间插入外来抗原肽得到的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中外来抗原肽是艾滋病毒表面抗原的抗原肽。
5.根据权利要求4所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中外来抗原肽是艾滋病毒的第三可变区域的抗原肽。
6.根据权利要求5所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是下述由19个氨基酸残基构成的第三可变区域的抗原肽：Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro GlyArg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser。
7.根据权利要求5所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是由序列号14、15、16、17或18的氨基酸残基构成的抗原肽。
8.用于治疗、预防艾滋病的权利要求4-7中任一项所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗。
9.根据权利要求4所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗，其中艾滋病毒表面抗原的抗原肽是下述由13个氨基酸残基构成的抗原肽：Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala。
10.用于治疗、预防艾滋病的权利要求9所述的含有牛分枝杆菌BCG菌的疫苗。
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