CN109311946A - 稳定化的融合前rsv f蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了稳定的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白、包含所述蛋白的免疫原性组合物以及其用于预防和/或治疗RSV感染的用途。
Description
本发明涉及医学领域。本发明特别涉及重组的融合前RSV F蛋白、涉及编码这些RSV F蛋白的核酸分子、以及其例如在疫苗中的用途。
背景技术
在20世纪50年代发现呼吸道合胞病毒(RSV)后，该病毒很快成为人类中与下呼吸道感染和上呼吸道感染相关的公认的病原体。据估计，全世界每年有6400万RSV感染，导致16万人死亡(世界卫生组织急性呼吸道感染(WHO Acute Respiratory Infections)2009年9月更新)。最严重的疾病尤其发生在早产儿、老年人和免疫受损的个体中。在2岁以下的儿童中，RSV是最常见的呼吸道病原体，占因呼吸道感染而住院的约50％，并且住院高峰发生在2-4月龄。据报道，几乎所有儿童到2岁时都被RSV感染过。终身重复感染归因于无效的自然免疫力。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性A型流感感染引起的那些相似。
RSV是一种属于肺病毒亚科的副粘病毒。它的基因组编码各种蛋白质，包括称为RSV糖蛋白(G)和RSV融合蛋白(F)的膜蛋白，它们是用于中和抗体的主要抗原靶标。对抗F1蛋白的融合介导部分的抗体可以预防细胞中的病毒吸收，并且因此具有中和作用。
RSV F通过从不稳定的融合前构象融合到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒和宿主细胞膜融合。已经确定了RSV F(McLellan JS.等人Science[科学]342,592-598(2013)；McLellan JS,等人Nat Struct Mol Biol[自然结构与分子生物学]17,248-250(2010)；McLellan JS.等人,Science[科学]340,1113-1117(2013)；Swanson KA等人Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica[美国国家学院院刊]108,9619-9624(2011))，和来自相关的副粘病毒的融合蛋白的两种构象结构，提供了对这种复杂的融合机器的机制的深刻理解。与其他I类型融合蛋白一样，无活性前体(RSV F0)需要在细胞内成熟过程中通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。RSV F含有两个弗林蛋白酶位点，这导致三个蛋白：F2、p27和F1，其中后者在其N-末端含有疏水性融合肽(FP)。为了从融合前构象重折叠成融合后构象，在残基137和216之间的包括FP和七肽重复区A(HRA)的重折叠区域1(RR1)必须从螺旋、环和链的组装转化成长的连续螺旋。然后，位于RR1的N-末端片段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接下来，在融合前F刺突中形成C-末端茎并包括七肽重复区B(HRB)的重叠区域2(RR2)重新定位到RSV F的头部的另一侧并且将HRA卷曲螺旋三聚体与HRB结构域结合以形成六螺旋束。RR1卷曲螺旋的形成和RR2的重新定位以完成六螺旋束是在重折叠过程中发生的最显著的结构变化。
当前不存在对抗RSV感染的疫苗，但是由于疾病负担高，其是被希望的。RSV融合糖蛋白(RSV F)是一种引人注目的疫苗抗原，它是中和人类血清中抗体的主要靶标。人类血清中的大多数中和抗体是对抗融合前构象，但是由于它的不稳定性，融合前构象具有在溶液中和病毒粒子表面上过早重折叠成融合后构象的倾向。如上所述，晶体结构揭示了融合前状态和融合后状态之间的大的构象变化。重排的程度表明，只有一部分针对RSV-F融合后构象的抗体能够与病毒表面上的融合前刺突的天然构象发生交叉反应。因此，产生对抗RSV的疫苗的努力集中于开发含有RSV F蛋白的融合前形式的疫苗(参见例如WO 20101149745、WO2010/1149743、WO 2009/1079796、WO 2012/158613)。然而，这些努力尚未产生可用于人类测试的候选物稳定的融合前RSV F蛋白。
因此，仍然需要有效的对抗RSV的疫苗，特别是包含处于融合前构象的RSVF蛋白的疫苗。本发明的目的是提供此类稳定的融合前RSV F蛋白，以安全和有效的方式用于接种对抗RSV的疫苗。
发明内容
本发明提供了稳定的、重组的、融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白(即稳定化处于融合前构象的重组RSV F蛋白)及其片段。RSV F蛋白、或其片段包含至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位。在某些实施例中，融合前RSV F蛋白是可溶性蛋白。在某些实施例中，RSV F蛋白是三聚体。在某些实施例中，RSV F蛋白是三聚体RSV F蛋白的多聚体。本发明还提供了编码融合前RSV F蛋白或其片段的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体。
本发明还涉及组合物，优选地免疫原性组合物，这些组合物包含RSV F蛋白、核酸分子和/或载体，并且涉及其在诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答中的用途，特别是其作为疫苗的用途。本发明还涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者有效量的融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，诱导免疫应答的特征在于对抗RSV的中和抗体和/或对抗RSV的保护性免疫。在具体的方面中，本发明涉及一种用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)F抗体的方法，该方法包括给予受试者有效量的包含融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体的免疫原性组合物。
附图说明
图1：具有突变N67I、S215P、T357K、N371Y和D486N的蛋白F的纯化。来自离子交换柱的洗脱液的Superdex200凝胶过滤色谱图。箭头指示收集峰。
图2：A)在还原(R)和非还原(NR)下，含有来自SEC色谱图的峰的F N67I、S215P、T357K、N371Y、D486N蛋白样品的SDS-PAGE分析。将凝胶用考马斯亮蓝染色。
图3：纯化的RSV F蛋白F N67I、S215P、T357K、N371Y、D486N的蛋白质浓度通过用CR9501和CR9503单克隆抗体的Q Octet测定来测量。CR9501仅与处于融合前构象的RSV F结合。CR9503与处于融合前构象和融合后构象两者的RSV F结合。绘制为平均值±SE。
图4：RSV F蛋白F N67I、S215P、T357K、N371Y、D486N的温度稳定性。用SyproOrange荧光染料通过差式扫描荧光测定法(DSF)测量解链温度(Tm℃)。T357K和N371Y取代的引入使PRPM的Tm增加了3.5度到68.5度。
具体实施方式
呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F)参与了病毒膜与感染所需的宿主细胞膜的融合。将RSV F mRNA翻译成被称为F0的574个氨基酸前体蛋白，该前体蛋白在N-末端含有信号肽序列(例如，SEQ ID NO:13的氨基酸残基1-26)，该信号肽序列在内质网中被信号肽酶去除。F0在两个位点(在氨基酸残基109/110和136/137之间)处被细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶，或弗林蛋白酶样)切割，去除短的糖基化间插序列(也称为p27区域)，包含氨基酸残基110至136，并产生被称为F1和F2的两个结构域或亚基。F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有疏水性融合肽，并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区域(氨基酸残基551-574)。F2结构域(氨基酸残基27-109)通过两个二硫桥键共价连接至F1。F1-F2异二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。
目前还没有可供使用的对抗RSV感染的疫苗。一种产生疫苗的潜在方法是基于纯化的RSV F蛋白的亚基疫苗。然而，对于这种方法希望的是纯化的RSV F蛋白处于与RSV F蛋白的融合前状态的构象相似的构象，该构象随时间的推移是稳定的，并且可以足够的量产生。此外，对于可溶性的基于亚基的疫苗，RSV F蛋白需要通过缺失跨膜(TM)和胞质区域来截短以产生可溶性的分泌的F蛋白(sF)。因为该TM区域负责膜的锚定和稳定，所以无锚定的可溶性F蛋白比全长蛋白明显地更不稳定，并且将容易地重折叠成融合后的末端状态。为了获得呈稳定的融合前构象的显示高表达水平和高稳定性的可溶性F蛋白，因此需要将该融合前构象进行稳定化。还因为全长(膜结合的)RSV F蛋白是亚稳态的，因此对于全长RSV F蛋白(例如对于任何减活或基于载体的疫苗方法)来说，融合前构象的稳定也是希望的。
为了稳定处于融合前构象的、被切割成F1和F2亚基的可溶性RSV F，将基于次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化结构域融合到可溶性RSV-F C端末端的C端(McLellan等人,Nature Struct.Biol.[自然结构生物学].17:2-248-250(2010)；McLellan等人,Science[科学]340(6136):1113-7(2013))。这种次要纤维蛋白结构域或“Foldon”衍生自T4次要纤维蛋白并且早期被描述为人工天然三聚化结构域(Letarov等人,Biochemistry Moscow[莫斯科生物化学]64:817-823(1993)；S-Guthe等人,J.Mol.Biol.[分子生物学]337:905-915.(2004))。然后，三聚化结构域没有导致稳定的融合前RSV-F蛋白(Krarup等人,NatureComm.[自然通讯]6:8143,(2015))。此外，这些努力尚未产生适合在人类中进行测试的候选物。
最近，我们描述了能够稳定处于融合前构象的RSV F蛋白的若干突变的组合(WO2014/174018和WO 2014/202570)。因此，已经描述了稳定的融合前RSV F蛋白，其包含在位置67上的氨基酸残基的突变和/或在位置215上的氨基酸残基的突变，优选地在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变和/或在位置215上的氨基酸残基S到P的突变。此外，已经描述了可溶性融合前RSV F蛋白，其包含截短的F1结构域，并且包含在位置67上的氨基酸残基的突变和/或在位置215上的氨基酸残基的突变，优选地在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变和/或在位置215上的氨基酸残基S到P的突变，其中该蛋白包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域。已经描述了另外的融合前RSV F蛋白，其中这些蛋白包含至少一个另外的突变，如在位置486上的氨基酸残基D到N的突变。
根据本发明，已经发现了引入两个其他突变(即在位置357上和在位置371上(根据SEQ ID NO:13编号)的突变)也稳定了处于融合前构象的蛋白。
因此本发明提供了重组的融合前F蛋白，其包含与在位置357上的氨基酸的突变(特别是在位置357上的氨基酸T到K(T357K)的突变)和在位置371上的氨基酸的突变(特别是在位置371上的氨基酸N到Y(N371Y)的突变)组合的在位置215上的氨基酸残基的突变(特别是在位置215上的氨基酸S到P(S215P)的突变)。
因此本发明提供了独特的突变组合，以提供重组的稳定的融合前RSV F蛋白(即稳定化处于融合前构象的RSV F蛋白)或其片段。本发明的稳定的融合前RSV F蛋白或其片段处于融合前构象，即它们包含(显示)至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位。对融合前构象F蛋白具有特异性的表位是在融合后构象中不存在的表位。不希望被任何具体的理论所束缚，相信RSV F蛋白的融合前构象可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSV F蛋白上的那些相同的表位，并且因此可以提供用于引发保护性的中和抗体的优点。
在某些实施例中，本发明的融合前RSV F蛋白或其片段包含至少一个表位，该至少一个表位被融合前特异性单克隆抗体(此后称为CR9501)(该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区域、SEQ ID NO:2的重链CDR2区域、SEQ ID NO:3的重链CDR3区域和SEQ ID NO:4的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区域以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3区域)和/或融合前特异性单克隆抗体(称为CR9502)(该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:7的重链CDR1区域、SEQ ID NO:8的重链CDR2区域、SEQ ID NO:9的重链CDR3区域和SEQ ID NO:10的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:11的轻链CDR2区域以及SEQ ID NO:12的轻链CDR3区域)识别。CR9501和CR9502包含重链和轻链可变区域，并且因此分别包含抗体58C5和30D8(先前已经显示出以其融合前构象而不是融合后构象与RSV F蛋白特异性结合)的结合特异性(参见WO 2012/006596)。
在某些实施例中，重组的融合前RSV F蛋白是三聚体的。
如贯穿本申请所使用的，核苷酸序列是从5'到3'方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。
如上所述，本发明还涵盖融合前RSV F蛋白的片段。该片段可以来自氨基末端(例如，通过切割信号序列)和羧基末端缺失(例如，通过缺失跨膜区域和/或胞质尾区)之一或两者。可以选择片段以包含F蛋白的免疫活性片段，即在受试者中引起免疫应答的部分。这可以使用计算机、体外和/或体内方法(这些对技术人员来说都是常规的)容易地确定。
在某些实施例中，根据本发明的编码的蛋白或其片段包含信号序列，也称为前导序列或信号肽，其对应于SEQ ID NO:13的氨基酸1-26。信号序列典型地是短(例如5-30个氨基酸长)的氨基酸序列，这些氨基酸序列存在于大多数新合成的蛋白的N-末端，这些新合成的蛋白指向分泌途径，并且典型地被信号肽酶切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。
在某些实施例中，根据本发明的蛋白或其片段不包含信号序列。
在某些实施例中，融合前RSV F蛋白(的片段)是可溶性的。在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSV F蛋白或其片段包含截短的F1结构域，并且包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域。根据本发明，显示了通过将异源三聚化结构域连接到截短的F1结构域的C-末端氨基酸残基，与该(这些)稳定突变组合，提供了显示出高表达并且结合至融合前特异性抗体的可溶性RSV F蛋白，指示这些蛋白处于融合前构象。此外，将RSV F蛋白稳定化处于融合前构象，即，即使加工这些蛋白后，它们仍旧结合至融合前特异性抗体CR9501和/或CR9502，指示保留了该融合前特异性表位。
在某些实施例中，RSV F蛋白是三聚体RSV F蛋白的多聚体。因此，在一些实施例中，RSV F蛋白可以包含用于三聚体的更高级组装的组装结构域。
已知RSV作为具有两个抗原性亚型A和B的单个血清型存在。这两种类型的成熟加工的F蛋白的氨基酸序列大约93％是相同的。如贯穿本申请所使用的，氨基酸位置是参照亚型A的RSV F蛋白序列(SEQ ID NO:13)给出的。如在本发明中所使用的，因此用语“在RSV F蛋白的位置“x”处的氨基酸”意指与SEQ ID NO:13的RSV F蛋白中的位置“x”处的氨基酸对应的氨基酸。注意，在本申请中所使用的编号系统中，1是指一个未成熟F0蛋白的N-末端氨基酸(SEQ ID NO:13)。当使用另一种RSV病毒株时，F蛋白的氨基酸位置将通过在必要时插入空位使其他RSV病毒株的序列与SEQ ID NO:13的F蛋白比对，参考SEQ ID NO:13的F蛋白的编号来编号。可以使用本领域熟知的方法进行序列比对，例如，通过CLUSTALW、Bioedit或CLC Workbench。
在某些实施例中，RSV病毒株是SEQ ID NO:20的RSV病毒株。
在某些实施例中，RSV病毒株是RSV B病毒株。在某些实施例中，RSV病毒株是SEQID NO:15的RSV B病毒株。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(像例如D-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的D-对映异构体))或非天然存在于蛋白质中的任何变体(像例如正亮氨酸)。标准氨基酸基于它们的特性可以被分成若干组。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些特性对蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用是重要的。一些氨基酸具有特殊的特性，如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥键)；脯氨酸，其诱导蛋白质骨架转动；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔韧性。表1显示了标准氨基酸的缩写和特性。
本领域技术人员将理解可以通过常规的分子生物学程序对蛋白质进行突变。如与不包含该(这些)突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的突变优选地导致融合前RSV F蛋白的表达水平增加和/或稳定化增加。
在某些实施例中，融合前RSV F蛋白或其片段包含选自下组的至少一个另外的突变，该组由以下组成：
(a)在位置67上的氨基酸残基的突变；和
(b)在位置486上的氨基酸残基的突变。
在某些实施例中，该至少一个另外的突变选自下组，该组由以下组成：
(a)在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变；和
(b)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变。
在某些实施例中，融合前RSV F蛋白或其片段包含至少四个突变(与例如包含SEQID NO:13的氨基酸序列的野生型RV F蛋白相比)。在某些实施例中，这些蛋白或其片段包含至少五个突变。
在某些实施例中，这些蛋白或其片段包含至少六个突变。
在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽因此包含选自下组的至少一个另外的突变，该组由以下组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基的突变；
(b)在位置83上的氨基酸残基的突变；
(c)在位置92上的氨基酸残基的突变；
(d)在位置184上的氨基酸残基的突变；
(e)在位置203上的氨基酸残基的突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基的突变；和
(g)在位置487上的氨基酸残基的突变。
在某些实施例中，该至少一个另外的突变选自下组，该组由以下组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基S到G的突变；
(b)在位置83上的氨基酸残基L到M的突变；
(c)在位置92上的氨基酸残基E到D的突变；
(d)在位置184上的氨基酸残基G到N的突变；
(e)在位置203上的氨基酸残基L到I的突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基V到I的突变；和
(g)在位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变。
在某些实施例中，异源三聚化结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:14)。
如上所述，在某些实施例中，本发明的蛋白或其片段包含截短的F1结构域。如在此所使用的，“截短的”F1结构域是指不是全长F1结构域的F1结构域，即其中N-末端地或C-末端地一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据本发明,至少跨膜结构域和胞质尾区已经缺失以允许表达为可溶性胞外结构域。
在某些其他实施例中，将三聚化结构域连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。在某些实施例中，三聚化结构域因此包含SEQ ID NO:14并且连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。
在某些实施例中，本发明的RSV F蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在某些实施例中，与野生型RSV F蛋白相比，本发明的融合前RSV F蛋白的表达水平是增加的。在某些实施例中，表达水平增加至少5倍，优选地多达10倍。在某些实施例中，表达水平增加超过10倍。
根据本发明的融合前RSV F蛋白是稳定的，即加工蛋白(像例如纯化、冻融循环、和/或储存等)时不易变成融合后构象。
在某些实施例中，与没有该(这些)突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的融合前RSV F蛋白在4℃储存时具有增加的稳定性。在某些实施例中，这些蛋白在4℃储存时稳定持续至少30天、优选地至少60天、优选地至少6个月、甚至更优选地至少1年。“存储时稳定”意指在蛋白呈溶液(例如，培养基)储存在4℃至少30天后，这些蛋白仍然显示对融合前特异性抗体(例如，CR9501)具有特异性的至少一个表位。在某些实施例中，在融合前RSV F蛋白在4℃储存时，这些蛋白显示该至少一个融合前特异性表位持续至少6个月、优选地持续至少1年。
在某些实施例中，与不具有所述一种或多种突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的融合前RSV F蛋白在受热时具有增加的稳定性。在某些实施例中，融合前REV F蛋白在55℃、优选地在58℃、更优选地在60℃的温度下加热稳定持续至少30分钟。“加热稳定”意指在经受增加的温度(即，55℃或更高的温度)至少30分钟之后，蛋白质仍显示至少一个融合前的特异性表位，例如，如使用如实例中(参见图4)所述的方法所确定的。
在某些实施例中，在适合的配制缓冲液中经受1至6次冻融循环后，这些蛋白质显示该至少一个融合前特异性表位。
如贯穿本申请所使用的，核苷酸序列是从5'到3'方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。
在某些实施例中，根据本发明的编码的蛋白进一步包含前导序列，也称为信号序列或信号肽，对应于SEQ ID NO:13的氨基酸1-26。它是存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白质的N-末端的短(典型地5-30个氨基酸长)肽。在某些实施例中，根据本发明的蛋白质不包含前导序列。
在某些实施例中，这些蛋白质包含HIS-标签。His-标签或多组氨酸-标签是蛋白质中的氨基酸基序，该氨基酸基序由至少五个组氨酸(H)残基组成，经常在蛋白质的N-或C-末端，通常用于纯化的目的。
本发明进一步提供了编码根据本发明的RSV F蛋白的核酸分子。
在优选实施例中，对编码根据本发明的蛋白质的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞(优选地，人类细胞)中表达。密码子优化的方法是已知的并且已经在先前描述(例如WO 96/09378)。与野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，则认为序列是密码子优化的。在此，非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的密码子，并且更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子置换。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子优化的序列。被优选的密码子置换一般导致更高表达。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的蛋白。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的蛋白序列的核苷酸取代，以反映有待表达蛋白的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括或可以不包括内含子。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本发明还提供了包含如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，因此根据本发明的核酸分子是载体的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可以用于真核细胞的转化并将整个或部分整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所希望的核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适合克隆DNA并且可以用于转录目的核酸的任何载体。根据本发明的适合的载体是例如：腺病毒载体、甲病毒、副粘病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒载体等。本领域技术人员能够选择合适的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列中。
包含编码融合前RSV F蛋白的核酸分子的宿主细胞也形成本发明的一部分。融合前RSV F蛋白可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术涉及在宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人类细胞系(例如HEK293细胞、PER.C6细胞)或酵母、真菌、昆虫细胞等)、或转基因动物或植物中表达这些分子。在某些实施例中，细胞是来自多细胞的生物，在某些实施例中，它们是脊椎动物或无脊椎动物来源的。在某些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，细胞是人类细胞。通常，宿主细胞中重组蛋白(如本发明的融合前RSV F蛋白)的产生包括将以可表达形式的编码蛋白的异源核酸分子引入该宿主细胞中，在有助于该核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及允许蛋白在所述细胞中表达。以可表达形式编码蛋白的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够引起核酸表达的序列，如一种或多种增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。本领域技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。
细胞培养基可从不同的供应商获得，并且可以常规地选择适合的培养基用于宿主细胞以表达目的蛋白，在此是融合前RSV F蛋白。适合的培养基可以含有或可以不含血清。
“异源核酸分子”(在此还称为“转基因”)是非天然存在于宿主细胞中的核酸分子。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外的调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因并且是技术人员已知的，例如这些可以包含病毒、哺乳动物、合成启动子等。用于获得在真核细胞中的表达的适合的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素polyA信号(US 5,122,458))可以存在于该(这些)转基因后面。可替代地，若干广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司(Invitrogen)的pcDNA和pEF载体系列、来自碧迪科学公司(BD Sciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达目的蛋白，或用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、聚A序列等。
细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续工艺正变得更常见的并且也是适合的。适合的培养基也是技术人员熟知的，并且通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的适合的条件是已知的(参见例如TissueCulture[组织培养],Academic Press[学术出版社],Kruse和Paterson编辑,(1973),以及R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册],第四版(Wiley-Liss Inc.[威利利斯公司],2000,ISBN 0-471-34889-9))。
本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白和/或核酸分子，和/或载体的组合物。本发明因此提供了包含融合前RSV F蛋白的组合物，该融合前RSV F蛋白显示在RSV F蛋白的融合前构象中存在但在融合后构象中不存在的一种表位。本发明还提供了包含编码这种融合前RSV F蛋白的核酸分子和/或载体的组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体的免疫原性组合物。本发明还提供了根据本发明的稳定化的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答的用途。进一步提供了用于在受试者中对抗RSV F蛋白的免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者根据本发明的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体。还提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体，用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答。进一步提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体用于制造用于在受试者中诱导对抗RSVF蛋白的免疫应答的药物的用途。
本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子或载体可以用于预防(防治)和/或治疗RSV感染。在某些实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。
根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体可以用于例如由RSV所引起的疾病或病症的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗(如(现有或将来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体)组合。
本发明进一步提供了利用根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法。在特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法包括给予对其有需要的受试者有效量的如上所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指蛋白质、核酸分子或载体有效用于预防、缓解和/或治疗由被RSV感染所引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少RSV的传播或抑制或减少与被RSV感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的，缓解可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
为给予至受试者，例如人类，本发明可以采用药物组合物，这些药物组合物包含如在此所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体以及药学上可接受的运载体或赋形剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该运载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的运载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro,编辑,Mack Publishing Company[马克出版公司][1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients[药用辅料手册],第3版,A.Kibbe编辑,PharmaceuticalPress[英国医药出版社][2000]。尽管还可以运用冻干制剂，但RSV F蛋白、或核酸分子优选地是作为无菌溶液配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5，例如pH 5.0到7.5的范围内。RSV F蛋白典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且该组合物还可以含有盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将RSV F蛋白配制成可注射制剂。
在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在此可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的RSV F蛋白的免疫应答。适合的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO90/14837)；皂苷配制品，像例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540、WO90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)；真核蛋白(例如其抗体或片段(例如对抗抗原本身或CD1a，CD3，CD7，CD80)和受体的配体(例如CD40L，GMCSF，GCSF等)，其在与受体细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05mg-5mg，例如每剂量铝含量为从0.075mg-1.0mg。
融合前RSV F蛋白还可以与像例如聚合物、脂质体、病毒体、病毒样粒子组合或结合来给予。这些融合前F蛋白可以在有或者没有佐剂下与纳米颗粒组合、用纳米颗粒壳体包裹或与纳米颗粒结合。封装在脂质体内描述于例如US4,235,877中。与大分子结合披露在例如US 4,372,945或US 4,474,757中。在其他的实施例中，这些RSV F蛋白被组装为多聚体的更高级组装。
在其他实施例中，组合物不包含佐剂。
在某些实施例中，本发明提供了用于产生对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的方法，这些方法包括提供根据本发明的组合物并且将其配制成药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的对抗某一病原体或疾病的免疫性的活性组分的药剂或组合物，它将引起与被该病原体或该疾病感染相关的症状的严重程度、持续时间或其他表现的至少降低(多达完全缺乏)。在本发明中，疫苗包含有效量的融合前RSV F蛋白和/或编码融合前RSV F蛋白的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，它导致对抗RSV F蛋白的免疫应答。这提供了在受试者中预防引起住院的严重下呼吸道疾病并且降低由RSV感染和复制引起的并发症(如肺炎和细支气管炎)的频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是一种药物组合物，并且因此典型地包括药学上可接受的稀释剂、运载体或赋形剂。它可以包含或可以不包含另外的活性成分。在某些实施例中，它可以是一种组合疫苗，该组合疫苗进一步包含了诱发例如对抗RSV的其他蛋白质和/或对抗其他感染原的免疫应答的其他组分。另外的活性组分的给予可以例如通过分开给予或通过给予本发明的疫苗与另外的活性组分的组合产物来进行。
可以将组合物给予至受试者，例如人类受试者。用于单独给予的组合物中的RSV F蛋白的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所推荐的剂量将通过实验进行并且对本领域技术人员来说是常规的。
根据本发明的组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括胃肠外给予，如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来给予组合物。本领域的技术人员已知给予组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。
如在此所使用的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，受试者为人类受试者。
蛋白质、核酸分子、载体、和/或组合物还可以在同源或异源初免-加强方案中作为初次来给予或作为加强来给予。如果执行加强疫苗接种，则典型地，这种加强疫苗接种将在该组合物第一次给予受试者(在此类情况下称为“初次疫苗接种”)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时间处给予至同一受试者。在某些实施例中，给予包括初次给予和至少一次加强给予。
此外，本发明的蛋白可以用作诊断工具，例如通过确定这种个体的血清中是否存在能够结合本发明的蛋白的抗体来测试个体的免疫状态。因此,本发明还涉及用于检测患者中RSV感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使获得自所述患者的生物样品与根据本发明的蛋白接触；以及b)检测抗体-蛋白复合物的存在。
通过这种方法可获得和/或获得的稳定化的融合前RSV F蛋白，以及如上所述的其用途也成为本发明的一部分。
实例
实例1：SEQ ID NO:21的稳定的融合前RSV F多肽的制备
为了增加处于融合前构象的RSV F的稳定性，在先前描述的(WO 2014/174018和WO2014/202570)融合前RSV F变体中引入了两个另外的氨基酸取代。这些构建体在基因艺术公司(Gene Art)(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))进行合成和密码子最佳化。将这些构建体克隆到pCDNA2004中或通过该领域内普遍知道的标准方法(包括定点突变诱发和PCR)产生，并且测序。使用的表达平台是293Freestyle细胞(生命技术公司(Life Technologies))。根据厂商说明书使用293Fectin(生命技术公司(Life Technologies))对细胞进行瞬时转染，并在37℃和10％CO2下培养5天。收集培养物上清液并以300g旋转5分钟以去除细胞和细胞碎片。随后使用0.22μm真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在4℃储存直至使用。
实例2：融合前RSV F蛋白的纯化
通过两步式纯化方案(应用cat-离子交换柱用于初始的纯化，并且随后应用superdex200柱用于抛光步骤以除去残留的污染物)纯化重组多肽。对于初始的离子交换步骤，将培养物上清液用2倍体积的50mM NaOAc(pH 5.0)稀释，并以5ml/分钟通过5ml HiTrapCapto S柱。随后，将柱用10倍柱体积(CV)的20mM NaOAc、50mM NaCl、0.01％(v/v)tween20(pH 5)进行洗涤，并用2倍CV的20mM NaOAc、1M NaCl、0.01％(v/v)tween20(pH 5)进行洗脱。使用旋转浓缩器浓缩洗脱液，并使用superdex200柱(使用40mM Tris、500mM NaCl、0.01％(v/v)tween20(pH 7.4))作为运行缓冲液进一步纯化蛋白质。在图1中，显示了凝胶过滤柱的色谱图。主要峰含有融合前RSV F蛋白。再次合并含有该峰的级分，并且使用OD280确定蛋白质浓度并在4℃储存直至使用。在图2中，显示了最终蛋白制剂的非还原和还原的SDS-PAGE分析，并且可以看出纯度>95％。使用蛋白质印迹法和蛋白F特异性抗体(未显示)验证条带的同一性。
将定量Octet(生物膜层干涉技术)用于测量上清液中的蛋白质浓度。将CR9501(特异性识别融合前RSV F蛋白的抗体)和CR9503(识别融合后RSV F蛋白)通过标准方案生物素化并固定在链霉亲和素生物传感器(ForteBio公司，Portsmouth(朴茨茅斯)，英国)上。然后，将包被的生物传感器在模拟细胞培养上清液中封闭。如下进行定量实验：温度30℃，震荡速度1000rpm，测定时间300秒。
使用标准曲线计算蛋白质的浓度。使用在模拟培养基中稀释的融合前RSV F蛋白(Krarup等人,2015,同上)制备每种包被的抗体的标准曲线(图3)。使用ForteBio数据分析6.4软件(ForteBio公司)进行数据分析。
实例3：RSV F蛋白的温度稳定性
通过差示扫描荧光测定法(DSF)确定纯化的蛋白质的温度稳定性。将纯化的融合前F蛋白与SYPRO橙色荧光染料(生命技术公司(Life Technologies)S6650)在96孔光学qPCR板中混合。通过实验确定最佳的染料和蛋白质浓度(数据未显示)。蛋白稀释液均在PBS中进行，并且将仅含有染料的阴性对照样品用作参考扣除。使用以下参数在qPCR仪器(应用生物系统公司(Applied Biosystems)ViiA 7)中进行测量：从25℃-95℃以0.015℃/秒的温度斜升。不断地收集数据。使用GraphPad PRISM软件(版本5.04)绘制解链曲线。使用非线性EC50位移方程在50％最大荧光下计算解链温度。SEQ ID NO:21的RSV F蛋白的解链温度为68.5度(图4)。在位置357上和位置371上没有取代的参考融合前RSV F具有65.0的解链温度，这意味着双突变使解链温度增加了3.5度。
表1.标准氨基酸、缩写和特性
| 氨基酸 | 3字母 | 1字母 | 侧链极性 | 侧链电荷(pH 7.4) |
| 丙氨酸 | Ala | A | 非极性 | 中性 |
| 精氨酸 | Arg | R | 极性 | 阳性 |
| 天冬酰胺 | Asn | N | 极性 | 中性 |
| 天冬氨酸 | Asp | D | 极性 | 阴性 |
| 半胱氨酸 | Cys | C | 非极性 | 中性 |
| 谷氨酸 | Glu | E | 极性 | 阴性 |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q | 极性 | 中性 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 非极性 | 中性 |
| 组氨酸 | His | H | 极性 | 阳性(10％)中性(90％) |
| 异亮氨酸 | Ile | I | 非极性 | 中性 |
| 亮氨酸 | Leu | L | 非极性 | 中性 |
| 赖氨酸 | Lys | K | 极性 | 阳性 |
| 甲硫氨酸 | Met | M | 非极性 | 中性 |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 非极性 | 中性 |
| 脯氨酸 | Pro | P | 非极性 | 中性 |
| 丝氨酸 | Ser | S | 极性 | 中性 |
| 苏氨酸 | Thr | T | 极性 | 中性 |
| 色氨酸 | Trp | W | 非极性 | 中性 |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 极性 | 中性 |
| 缬氨酸 | Val | V | 非极性 | 中性 |
表2.抗体CR9501和CR9502的氨基酸序列
序列
RSV F蛋白全长序列亚型A(SEQ ID NO:13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
RSV F蛋白B1全长序列(SEQ ID NO:15)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQ ID NO:14(次要纤维蛋白)
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
RSV F蛋白CL57-v224全长序列(SEQ ID NO:20)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
RSV F、N67I、S215P、D486N、以及357K和371Y(SEQ ID NO:21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
CR9501重链(SEQ ID NO:16):
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501轻链(SEQ ID NO:17):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECCR9502重链(SEQ ID NO:18):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502轻链(SEQ ID NO:19):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
Claims (17)
1.一种重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含与在位置357上的氨基酸的突变和在位置371上的氨基酸的突变组合的在位置215上的氨基酸残基的突变。
2.根据权利要求1所述的融合前RSV F蛋白，其包含在位置215上的氨基酸S到P(S215P)的突变、在位置357上的氨基酸T到K(T357K)的突变和在位置371上的氨基酸N到Y(N371Y)的突变。
3.根据权利要求1或2所述的融合前RSV F蛋白，其进一步包含选自下组的至少一个突变，该组由以下组成：
(a)在位置67上的氨基酸残基的突变；和
(b)在位置486上的氨基酸残基的突变。
4.根据权利要求3所述的融合前RSV F蛋白，其中另外的该至少一个突变选自下组，该组由以下组成：
(a)在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变；和
(b)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其中该蛋白包含至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位，其中该至少一个表位被融合前特异性单克隆抗体识别，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区域、SEQ ID NO:2的重链CDR2区域、SEQ ID NO:3的重链CDR3区域和SEQ ID NO:4的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区域、和SEQ ID NO:6的轻链CDR3区域，和/或该融合前特异性单克隆抗体包含SEQID NO:7的重链CDR1区域、SEQ ID NO:8的重链CDR2区域、SEQ ID NO:9的重链CDR3区域和SEQ ID NO:10的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:67的轻链CDR2区域、和SEQ ID NO:11的轻链CDR3区域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其中该蛋白是三聚体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其包含截短的F1结构域和连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域。
8.根据权利要求7所述的融合前RSV F蛋白，其中该异源三聚化结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:14)。
9.根据权利要求7或8所述的融合前RSV F蛋白，其中该三聚化结构域连接至该RSV F蛋白的氨基酸残基513。
10.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其中该RSV F蛋白包含SEQID NO:21的氨基酸序列。
11.一种核酸分子，其编码根据前述权利要求1-10中任一项所述的融合前RSV F蛋白。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中该核酸分子已经被密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
13.一种载体，其包含根据权利要求11或权利要求12所述的核酸分子。
14.一种组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的融合前RSV F蛋白、根据权利要求11或权利要求12所述的核酸分子和/或根据权利要求13所述的载体。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的融合前RSV F蛋白、根据权利要求11或权利要求12所述的核酸分子、和/或根据权利要求13所述的载体，用于诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的融合前RSV F蛋白、根据权利要求11或权利要求12所述的核酸分子、和/或根据权利要求13所述的载体，用作疫苗。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的融合前RSV F蛋白、根据权利要求11或权利要求12所述的核酸分子、和/或根据权利要求13所述的载体，用于防治和/或治疗RSV感染。
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