KR101504392B1

KR101504392B1 - 아데노바이러스 벡터의 제조방법

Info

Publication number: KR101504392B1
Application number: KR1020117010793A
Authority: KR
Inventors: 알프레드 루이첸스; 존 알프레드 루이스
Original assignee: 크루셀 홀란드 비.브이.
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2015-03-19
Also published as: WO2010060719A1; JP5770633B2; CA2742474C; KR20110093793A; JP2012507270A; EA019928B1; US20110207202A1; AU2009319254A1; AU2009319254B2; ES2532015T3; CA2742474A1; PL2350268T3; CN102203242A; BRPI0921651A2; MX2011004292A; US10041049B2; HK1160664A1; EA201170638A1; NZ593235A; EP2350268B1

Abstract

본 발명은 관류 시스템 및 고세포밀도로의 감염을 사용하는, 재조합 아데노바이러스 35를 대량으로 제조하는 방법을 제공한다.

Description

아데노바이러스 벡터의 제조방법{Method for the production of adenoviral vectors}

본 발명은 세포 배양 및 아데노바이러스 생산 분야에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 본 발명은 포유동물 세포의 배양에 대한 개선된 방법, 이들 세포의 아데노바이러스에 의한 감염 및 그로부터 아데노바이러스 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

재조합 바이러스 벡터를 사용하는 DNA 백신화 분야에서 최근의 개발은 임상 등급 재료를 대규모 생산하는 필요를 가져왔다. 세계에서, 예를 들면, 결핵과 말라리아와 싸우기 위해 저개발국과 최빈국에 충분한 양의 재조합 아데노-기재 백신을 공급할 수 있는 방법이 요구된다. 출생 코호트(birth cohort)의 평가는 2010-2015년에 저개발국 및 최빈국에 대해 150,000,000 이상의 출생이 예상된다는 것을 나타내고 있다. 이 출생 코호트를 기반으로 예상되는 연간 백신 수요는 1년을 기준으로 대략 1.5x10¹⁹바이러스 입자(VP)에 달할 것이다 (http://esa.un.org/unpp /index.asp?panel=2).

아데노바이러스를 생산하는 여러 공정들이 기재되어 왔다. 이들 공정은 롤러병, 세포 공장((Nunclon, Nunc사 제품 또는 CellStack, Corning사 제품) 또는 세포 큐브(Corning사 제품)에서 착생의 세포 배양물을 사용한다. 착생의 세포 배양물에 대한 생산 공정은 아데노-기재 백신에 대한 세계적인 요구를 만족시킬 수 없다. 그러므로, 착생 공정에 사용된 세포는 현탁 배양물에 적응한다(예를 들면, HEK293 및 PER.C6^® 세포주). 현탁 배양물의 사용에 의해, 생산 공정의 규모를 대규모 생물반응기로 확대할 수 있다. 아데노바이러스 생산을 위한 현탁 세포 배양물은 통상적으로 3 내지 20L 규모에 도달하고 최대 100L까지 (Kamen et al., 2004), 및 250L까지 (Xie et al., 2003) 성공적인 규모 확대가 보고된 바 있다. 10,000L까지의 규모 확대가 처리된 실험이 보고된다 (Xie et al., 2003).

그러나, 10,000L까지의 규모확대의 최대 단점은, 10,000L 생물반응기 시설을 고안하고 건설하는데 필요한 높은 자본 투자 (CAPEX)이다. 더욱이 BSL 2 조건하에서, 10,000L 시설을 건설할 CAPEX 위원회가 제품의 성공 여부를 알기 전에 구성되어야 한다 (IV 및 이전 단계). 10,000L 생물반응기 공장에 대한 총투자 비용은 ? 25,000,000 내지 ? 20,000,000로 보고되었다 (Estape et al., 2006). 그러므로, 소규모, 예를 들면, 1000L 이하의 생물반응기로의 제조가 바람직할 것이다.

기존의 공정을 사용하여, 1.5x10¹⁹VP/year의 목표에 도달하기 위해 1000L 규모로 1년에 150 회분(batch) 이상이 생산되어야 한다. 그러므로, 바람직하기는 비-금지 비용(non-prohibitive cost)으로 아데노바이러스 백신에 대한 전 세계적 요구를 만족시키기 위해 아데노바이러스 입자의 수득률을 증가시키기 위한 아데노바이러스 생산용 시스템의 개선이 요구된다.

아데노바이러스 제조 최적화에서 만나는 이슈 중 하나는 소위 "세포 밀도 효과"이다. 회분식 작업에서, 여러 참조문헌들은 아데노바이러스 제조를 위한 감염에서 최적 세포 밀도가 존재함을 제안한다. 최적은 0.5 ~ 1x10⁶ 세포/mL에 놓인다 (Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004). 회분식 교반 탱크 생물 반응기에서의 아데노바이러스 (Ad5) 생산에서, 세포당 바이러스 생산성은 약 0.9x10⁶ cells/mL까지 일정하게 유지되다가 약 1x10⁶ cells/mL에서 급격히 떨어진다는 것이 관찰된다(Altaras et al., 2005). 2x10⁶ cells/mL를 넘어 감염성 입자들은 검출되지 않았다. 감염에서 세포 밀도에 의한 특이 생산 저하와 관련한 중지점(break point)은 매질에 의존한다. 지금까지 1x10⁶ cells/mL을 넘는 세포 밀도에서 특정 생산 최적화를 유지하면서 바이러스 입자의 높은 수득률을 지지할 잠재력을 나타내는 이용가능한 시판 매질은 없었다 (Kamen et al., 2004). 이와 같은 저하의 원인은 아직 알려져 있지 않지만, 아마도 바이러스 생산에 대한 제한된 영양물 이용가능성에 기인하거나 또는 바이러스 생산을 억제하는 높은 대사 산물 농도에 기인할 것이다.

글루코스, 글루타민 및 아미노산의 첨가와 같은 공급-배치 작업은 최대 2x10⁶ cells/mL까지의 세포 밀도에서 감염을 허용한다. 그러나, 높은 세포 밀도에서 얻어진 생산성은 1x10⁶ cells/mL의 세포밀도에서 감염에 의해 얻은 것보다 낮았다(Kamen et al., 2004).

관류 공정에서, 세포들은 배지가 생물반응기를 통해 관류되는 동안, 중공섬유, 스핀 필터 또는 음향 분리기에 의해 생물 반응기 중에 보유된다. 이들 공정에서, >100x10⁶ cells/mL의 세포밀도에 때때로 도달될 수 있다 (예를 들면, Yallop et al., 2005).

감염된 관류 세포는 중공섬유 시스템에 대한 관류 중 미성숙 세포 손실을 나타낸다. 이것은 아마도 바이러스 감염에 기인한 그들의 높은 전단 감도와 관련될 수 있다 (Cortin et al., 2004). 더 약하고, 감염된 세포에 대한 튜브, 중공 섬유 또는 연동 펌프에서 유도된 하이드로-다이나믹 응력은 이러한 현상에 대한 가장 큰 원인일 것 같았다. 감염된 세포는 더 약하므로, 관류가 감염기(infection phase) 전체에 걸쳐 유지되어야 한다면 특히 음향 분리기 (Henry et al., 2004)가 바람직할 것으로 제안되어 왔다. 그러나, 관류 모드에서 수행된 감염은 관류 속도 2 vol/day로, 오직 최대 세포 밀도 3x10⁶ cells/mL까지만 유지될 수 있다. 세포 밀도 6x10⁶ cells/mL의 감염은 특이 생산성에서 5배의 감소를 가져왔다 (Henry et al., 2004).

보고된 다른 것에 의한 세포 밀도 효과에도 불구하고, 한 보고서는 종양 아데노바이러스 벡터에 대한 생산 플랫폼으로서의 인간 종양 세포의 성공적인 관류 배양을 기재하였다(Yuk et al, 2004). 이 보고서는 교류접선흐름 (ATF) 기술을 사용한 고-세포-밀도 관류 공정을 기재한다. 9 x 10⁶ HeLaS3 cells/mL의 감염에서 평균 생균 세포(viable cell) 밀도에서, 약 4 x 10¹¹ VP/mL의 평균 바이러스 역가가 관찰되었다. 보고서에서는 생산 세포로서 선호되지 않은 종양 세포가 사용되었는데, 종양 세포의 사용은 생산된 아데노바이러스 입자가 인간에게 투여될 때 안전성 위험을 내포할 수 있기 때문이다. 그 보고서에서 재조합 아데노바이러스는 Ad5를 기재로 한다. 이와 같은 아데노바이러스는 인간 개체의 대부분이 Ad5에 대한 이미-존재하는 중화 항체를 함유하므로 백신으로서 사용하기에 제한된 가능성을 갖고, 따라서 다른 혈청형으로부터의 재조합 아데노바이러스가 백신으로 사용하기에 더욱 적당하다 (예를 들면, WO 00/70071 참조). 특히, Ad35와 같은, 서브그룹 B의 재조합 아데노바이러스가 백신으로 사용하기에 특히 유리하다 (WO 00/70071).

어느 제한된 정보를, 특히 유리한 혈청형 35의 경우, Ad5 이외의 다른 혈청형으로부터 재조합 아데노바이러스를 대규모로 생산하는데 이용할 수 있다. Ad35와 Ad5 간의 몇몇 차이가 음이온 교환을 사용한 그들의 정제와 관련하여 기재되었다(예를 들면, WO 2005/080556). 다양한 혈청형의 재조합 아데노바이러스의 어느 정도 다른 물리적 성질들은 생산 공정에서 또는 특정 조건하에서 차이를 가져온다. 이와 같은 잠재적인 차이는 특히 산업 규모에서 중요한데, 심지어 겉보기로는 소규모에서의 작은 차이가 연간 전세계 수요의 생산을 위해 파악된 규모에서 큰 경제적 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, Ad5에 대해 보고된 세포 밀도 효과가 다른 혈청형에 대해서와 유사한지는 지금까지 알려지지 않는다. 그러므로, rAd35 백신에 대한 전세계 수요를 만족시키기 위해, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35 (rAd35) 생산을 위한 시스템을 개선하는 것이 요구된다.

본 발명자들은 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(rAd35)의 수득률은 생산 세포가 관류 배양에서 10x10⁶ 생균 세포/mL를 넘는 밀도로 감염될 때 더욱 증가한다는 것을 발견하였다. 반대로, 재조합 아데노바이러스 혈청형 5 (rAd5)의 수득률은 10 x 10⁶ 생균 세포/mL로 감염되었을 때와 비교하여 20 x 10⁶ 또는 30 x 10⁶ 생균 세포/mL로 감염된 생산 세포에서 더 낮았다. 그러므로, Ad35는 적용된 조건하에서 생산자 세포 중에서 rAs5와 다르게 증식한다. 이에 더하여, 본 발명자들은 또 다른 혈청형은 또 다르게 행동하는 것을 발견하였고, 최적의 결과를 얻기 위해 특이 아데노바이러스 혈청형에 대한 공정은 각각의 혈청형에 대해 미세-조정되어야 한다고 제안된다. 본 발명은 얻어진 rAd35의 수득률, 품질 및 하류 공정을 위한 수확물의 용이한 처리의 면에서 rAd35의 생산에 대한 최적 시스템을 제공한다.

본 발명은 재조합 아데노바이러스 혈청형 35 (rAd35)의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은: a) 생산자 세포를 현탁액 중에서 관류 시스템으로 배양하는 단계; b) 상기 세포를 10x10⁶ 생균 세포/mL 내지 16x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염시키는 단계; c) 감염된 세포를 관류 시스템에서 추가로 배양하여 상기 rAd35를 증식시키는 단계; 그리고 d) 상기 rAd35를 수확하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 단계 b)의 세포는 약 10x10⁶ 내지 14x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염된다.

특정 구현예에서, 상기 단계 c)의 관류 시스템은 교류접선흐름 (alternating tangential flow:ATF) 관류 시스템이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 단계 a)의 관류 시스템은 교류접선흐름(ATF) 관류 시스템이다. 바람직한 구현예에서 상기 단계 a) 및 c) 둘 다에서의 관류 시스템은 교류접선흐름(ATF) 관류 시스템이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가로: e) rAd35를 정제하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 추가로: f) 정제된 rAd35를 함유하는 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1 영역의 적어도 일부가 결핍되고, 이형 핵산을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 생산된 rAd35의 천연 입자 대 염증성 입자의 비는 30:1 미만이고, 바람직하기는 20:1 미만이다.

본 발명의 또 다른 면은 적어도 1x10¹² rAd35 바이러스 입자 (VP)/mL를 생산하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은: a) 생산자 세포를 현탁액 중에서 관류 시스템으로 배양하는 단계; b) 상기 세포를 10x10⁶ 생균 세포/mL 내지 16x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염시키는 단계; c) 감염된 세포를 관류 시스템에서 추가로 배양하여 상기 rAd35를 증식시키고, 그것에 의해 rAd35 바이러스 입자의 농도가 최소한 1x10¹² VP/mL에 도달하는 단계; 그리고 d) 상기 rAd35를 수확하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 2L 내지 1000L의 작업 용량을 갖고, 배양 매질, 생산자 세포, 및 적어도 1x10¹² rAd35 virus particles (VP)/mL.를 포함하는 생물반응기를 제공한다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 작업 용량이 50L 내지 500L이다. 바람직한 구현예에서, 생물반응기는 ATF 관류 시스템에 연결되어 있다.

도 1은 쉐이커에서 rAd35에 의한 고세포밀도로의 감염이다.
도 2는 쉐이커와 2L 생물반응기에서 rAd35.TB-S에 의한 고세포밀도로의 감염이다.
도 3은 쉐이커에서 rAd35.eGFP에 의한 고세포밀도로의 감염이다.

본 발명은 재조합 아데노바이러스 35의 대량생산을 위한 새로운 방법을 기재한다. 이러한 최적화된 공정은 세포당 높은 바이러스 생산성을 유지하면서 높은 세포 밀도로 배양물을 감염시키는 능력에 의존한다. 여기서, 본 방법은 단일 생물반응기에서 높은 바이러스 농도로 수확된 바이러스 용액을 얻는 방법을 제공한다. rAd35에 대한 본 방법의 통상적인 수득률은 약 2-3x10¹¹ VP/mL이다. 참으로, 매우 많은 양, 예를 들면, 적어도 약 5x10¹¹ VP/mL, 바람직하기는 적어도 약 6, 7, 8, 또는 9x10¹¹ VP/mL의 rAd35 입자가 본 발명의 방법을 사용하여 생산될 수 있다고 믿어진다. 바람직하기는 적어도 1x10¹² VP/mL, 더욱 바람직하기는 적어도 1.5x10¹² VP/mL, 더욱 바람직하기는 적어도 2x10¹² VP/mL, 예를 들면, 약 1x10¹² 내지 5x10¹² VP/mL의 rAd35가 생산된다. 통상적으로, 방법은 rAd35의 수득이 약 1x10¹³ VP/mL를 초과하지 않을 것이다. 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 수득률은 작업용량이 1000L보다 큰 생물반응기를 요구함 없이, 세계에서 특정 rAd35 기재 백신의 필요량을 제조하는데 충분하다.

본 발명은 재조합 아데노바이러스 혈청형 35 (rAd35)의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은: a)생산자 세포를 현탁액 중에서 관류 시스템으로 배양하는 단계; b) 상기 세포를 10x10⁶ 생균 세포/mL 내지 16x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염시키는 단계; c) 감염된 세포를 관류 시스템에서 추가로 배양하여 상기 rAd35를 증식시키는 단계; 그리고 d) 상기 rAd35를 수확하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 단계 b)의 세포는 약 10x10⁶ ~ 50x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염된다. 추가의 구현예에서, 상기 단계 b)의 세포는 rAd35로 약 10x10⁶ ~ 20x10⁶ 생균 세포/mL의 세포밀도 감염된다. 또 다른 추가의 구현예에서, 상기 단계 b)의 세포는 rAd35로 약 10x10⁶ ~ 16x10⁶ 생균 세포/mL의 세포밀도, 예를 들면, 약 10, 11, 12, 13, 14 또는 15x10⁶ 생균 세포/mL로 감염된다.

또 다른 구현예에서, 상기 단계 b)의 세포는 rAd35로 약 20x10⁶ 내지 50x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 감염된다.

생산자 세포 및 재조합 아데노바이러스

본 발명에 따른 생산자 세포 (때때로 본 분야에서 '패키징 세포' 또는 '보체 세포' 또는 '숙주세포'로 언급된다)는 원하는 아데노바이러스가 증식될 수 있는 어느 생산자 세포일 수 있다. 예를 들면, 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스에서의 결핍을 보충하는 생산자 세포에서 수행된다. 이와 같은 생산자 세포는 바람직하기는 그들의 게놈에 적어도 아데노바이러스 E1 서열을 갖고, 그리고 그것에 의해 E1 영역에 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스를 보충할 수 있다. 더욱이 아데노바이러스는 E3 영역에 결실을 가질 수 있고, 이것은 Ad 게놈에서 없을 수 있고, 따라서 이와 같은 결실은 보충되어야 하는 것은 아니다. E1에 의해 불멸화된 인간 망막세포, 예를 들면, 911 또는 PER.C6 세포 (미국 특허 5,994,128 참조), E1-변형 양수세포 (EP patent 1230354 참조), E1-변형 A549 세포 (예를 들면, WO 98/39411, 미국 특허 5,891,690 참조), GH329:HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293 등과 같은 어느 E1-보충 생산자 세포가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 예를 들면, HEK293 세포, 또는 PER.C6 세포, 또는 911 세포, 또는 IT293SF 세포 등이다. 바람직하기는 PER.C6 세포 (ECACC 수탁 96022940; US 특허 5,994,128 참조), 또는 그로부터 유래된 세포들이 생산자 세포로 사용된다.

유리하기는, 높은 세포밀도 감염에 적용되는 방법에서 재조합 아데노바이러스 혈청형 35 (rAd35)의 rAd5와 비교한 성질은 지금까지 알려지지 않았다. 본 발명자들은 또한 또 다른 혈청형은 동일한 공정에서 다르게 행동하고, 재조합 아데노바이러스의 대규모 생산을 위한 최적 조건이 다양한 혈청형에 대해 확립되어야 한다는 것을 제안한다. 따라서, 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 rAd35이다.

바람직하기는, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능이 결핍되고, 예를 들면, 바이러스 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 E1a 영역 및/또는 E1b 영역이 결핍된다. 특정 구현예에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능 및 비필수 E3 영역의 적어도 일부에서 결핍된다. 아데노바이러스 벡터는 "다중 결핍"일 수 있고, 이것은 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 게놈의 두 개 이상의 영역 각각에서 하나 이상의 본질적 유전자 기능이 결핍된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 E1-결핍 또는 E1-, E3-결핍 아데노바이러스 벡터는 추가로 E4 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 및/또는 E2 영역의 적어도 하나의 필수 유전자에서 결핍될 수 있다 (예를 들면, E2A 영역 및/또는 E2B 영역). 전체 E4 영역의 결실된 아데노바이러스 벡터는 더 낮은 숙주 면역 반응을 도출할 수 있다. 적절한 아데노바이러스 벡터의 예는 (a) E1 영역 전체 또는 일부 및 E2 영역의 전체 또는 일부, (b) E1 영역 전체 또는 일부, E2 영역 전체 또는 일부, 및 E3 영역 전체 또는 일부, (c) E1 영역 전체 또는 일부, E2 영역 전체 또는 일부, E3 영역 전체 또는 일부, 및 E4 영역 전체 또는 일부, (d) E1a 영역의 적어도 일부, E1b 영역의 적어도 일부, E2a 영역의 적어도 일부, 및 E3 영역의 적어도 일부, (e) E1 영역의 적어도 일부, E3 영역의 적어도 일부, 및 E4 영역의 적어도 일부, 그리고 (f) 전체 필수 아데노바이러스 유전자 산물 (예를 들면, ITRs 및 패키징 시그널만을 포함하는 앰플리콘)이 결핍된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아데노바이러스 게놈으로부터 필수 영역의 결실의 경우, 이들 영역에 의해 암호화된 기능은 트란스에서, 바람직하기는 생산자 세포에 의해 제공되어야 하고, 즉 E1, E2 및/또는 E4 영역의 일부 또는 전체가 아데노바이러스로부터 결실되면, 이들은 생산자 세포에, 예를 들면, 게놈에 통합되어, 또는 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 형태로 존재하여야 한다.

복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 벡터 DNA의 기원으로서 아데노바이러스 또는 키메릭 아데노바이러스의 어느 종, 균주, 서브형, 또는 종, 균주 또는 서브형의 혼합물을 이용하여 생성될 수 있고 (예를 들면, WO 96/26281, WO 00/03029 참조), 이것은 예를 들면, 아데노바이러스 벡터에 특정 원하는 세포 유형을 감염시키는 능력을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, rAd35가 아데노바이러스로 사용된다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 E1-영역의 적어도 일부, 예를 들면, E1A 및/또는 E1B 암호화 서열이 결핍되어 있고, 그리고 추가로 이형 핵산을 포함한다. 적합한 이형 핵산은 당업자에게 잘 알려져 있고, 그리고 예를 들면 전이유전자 개방형 해독틀, 예를 들면, rAd 벡터가 백신화 목적에 사용될 때 그에 대한 면역 반응이 바람직한 폴리펩티드를 암호화하기 위한 개방형 해독틀, 예를 들면, 말라리아(예를 들면, WO 2004/055187 참조), HIV, 결핵(예를 들면, WO 2006 /053871 참조), 특정 바이러스 등에 대한 면역반응을 생성하기에 적합한 전이유전자를 포함할 수 있고, 모두 당업자에게 잘 알려져 있다. 사실, 이형 핵산의 특성은 본 발명에 중요하지 않고, 어느 이형 핵산도 가능하고, 따라서 추가로 상세히 설명할 필요가 없다.

본 분야의 당업자는, 예를 들면 미국특허 6,492,169 또는 WO 03/104467 및 본 명세서의 참고문헌에 기재된 바와 같은 발명을 사용하여, 특이 숙주 세포에서 다양한 혈청형의 아데노바이러스 벡터를 증식시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, E1-결핍 rAd35의 증식을 위해, 예를 들면, 당업자에게 알려진 바와 같이, PER.C6 또는 HEK293 세포와 같은 Ad5의 E1A 및 E1B를 발현하는 생산자 세포의 존재를 근거로, Ad35의 E1B-55K 를 발현하는 특이 생산자 세포가 구축될 수 있다. 선택적으로 및 바람직하기는, 기존의 (Ad5-) 보체 세포주, 예를 들면 PER.C6 또는 HEK293가, 예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된, WO 03/104467에 광범위하게 기재된 바와 같이, Ad5의 E4-orf6 암호화 서열을 rAd35 벡터에 봉입함에 의해, E1-결핍 rAd35의 증식을 위해 세포의 변형 없이 사용될 수 있다. 그러므로, 어느 혈청형의 아데노바이러스 벡터의 증식은 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 수단 및 방법을 사용하여 생산자 세포 상에서 수행될 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 그것의 구축방법 및 그것의 증식방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191, 및 6,113,913, 및 Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", Chapters 67 및 68, Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), 및 기타 본 명세서에 기재된 참고문헌에 기재되어 있다.

아데노바이러스 벡터의 구축은 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), 및 기타 본 명세서에 언급된 참고문헌에 기재된 바와 같은, 표준 분자 생물학적 기법의 사용을 포함한다.

본 발명에 따른 생산자 세포는 세포 및 바이러스 수 및/또는 바이러스 역가를 증가시키기 위해 배양된다. 세포의 배양은 세포가 본 발명에 따른 관심의 바이러스의 대사, 및/또는 성장 및/또는 분열 및/또는 생산을 할 수 있도록 수행된다. 이것은 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들면, 적절한 배양 매질에서 세포에 영양분을 제공하는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 다양한 배양 매질이 사용될 수 있고 사용된 세포 및 환경에 최적의 배양 매질을 선택하는 것은 본 분야의 당업자의 통상적인 업무의 일부이다. 그러므로, 본 발명의 목적에 적합한 배양 매질은 본 분야의 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 대량으로 시판물로, 또는 표준 프로토콜에 따른 주문품으로 얻을 수 있다. 배양은 예를 들면, 디쉬, 롤러병 또는 생물반응기에서, 회분식, 유가배양식, 연속식 시스템 등을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양을 통해 대규모 (연속) 세포 생산을 얻기 위해, 본 분야에서 현탁액 중에 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 그리고 동물- 또는 인간-유래 혈청 또는 동물-또는 인간-유래 혈청성분의 부재하에 배양될 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하다. 세포를 배양하기에 적합한 조건은 알려져 있다 (예를 들면, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), 및 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9) 참조).

세포 배양 시스템 및 관류 시스템

생물반응기는 현탁물 의존 동물 세포 배양으로부터 생물학적 산물을 대규모로 생산하는데 널리 사용되어 왔다. 본 발명에 따르면, 아데노바이러스 증식에 사용된 생물반응기는 예를 들면, 교반 탱크, 일회용 생물반응기, 공기양수 반응기 등일 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 생물반응기는 교반 탱크이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 생물반응기는 작업 용량이 상한과 하한을 포함하여, 약 2L 내지 2000L이고, 즉 2L는 최소 작업용량이고 2000L은 최대 작업용량이다. 이들 값 사이의 어느 개개의 값의 작업용량을 갖는 생물반응기는 본 발명에 사용될 수 있다는 의미이다. 본 명세서에서 사용된 숫자에 대한 용어 "약"은 값±10%를 의미한다. 특정 바람직한 구현예에서, 작업용량은 10L 내지 1000L, 바람직하기는 20L 내지 800L, 예를 들면, 30L 내지 600L, 예를 들면 50L 내지 500L, 예를 들면, 약 250 L 또는 약 500L이다. 본 발명에 따른 작업 용량을 갖는 생물반응기를 사용하는 이점은 대용량 생물반응기의 사용, 즉 작업 용량이 2000 L 초과, 바람직하기는 1000L인 생물반응기의 사용을 피하고, 그러므로 이와 같은 매우 큰 생물반응기의 건설에 대한 거대한 자본 및 시간 투자가 불필요하다는 것이다. 더욱이, 생성물, 즉 rAd는 본 발명의 방법으로 제조되어 사용될 때 훨씬 농축되고, 이것은 생물반응기로부터 rAd의 수확 및/또는 추가의 하류방향 공정에서 시간과 비용을 절약한다. 작업용량은 생물반응기 중 유효 배양 용량이다. 교반 탱크는 일반적으로 높이-대-직경의 비가 1:1 내지 3:1이다.

배양물은 블레이드 디스크 또는 마린 프로펠러 패턴을 기준으로 통상적으로 하나 이상의 교반기로 혼합된다. 블레이드보다 약한 전단력을 제공하는 교반 시스템이 기재되어 있다. 교반은 자기적으로 결합된 드라이브에 의해 직접 또는 간접적으로 구동될 수 있다. 간접 드라이브는 교반기 샤프트 위의 밀봉을 통해 미생물 오염의 위험을 감소시킨다. 상기 생물반응기의 계측 및 제어는: 교반, 온도, 용해 산소, pH 및 바이오매스 제어를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 세포 배양 매질의 교반, pH, 온도, 용해 산소 농도는 원칙적으로 결정적인 것이 아니라 선택된 세포의 유형에 의존한다. 바람직하기는, 교반, pH, 온도, 용해산소 농도는 세포의 성장에 최적이도록 선택된다. 당업자는 배양을 위한 최적 교반, pH, 온도, 용해산소농도를 찾는 방법을 알고 있다. 통상적으로, 최적 교반은 50~300 rpm, 예를 들면, 100~250rpm이고, 최적 pH는 6.7~7.7이고, 최적 온도는 30~39℃, 예를 들면, 34, 35, 36, 37 또는 38℃이다.

대부분의 대규모 현탁 배양물은 회분식 또는 유가배양식 공정으로 작동하는데, 이들이 작동 및 규모확대에 가장 수월하기 때문이다. 그러나, 관류 원리를 기본으로 하는 연속 공정이 더욱 일반적이 되고 있다. 본 발명에 따르면, 생산자 세포는 관류 시스템으로 배양된다. 세포의 관류 배양은 본 분야에서의 그것의 기존의 의미를 갖고, 즉 이것은 배양 중 세포가, 분리에 앞서 낮은 세포 밀도를 갖는 액체가 유출되고 세포 배양 매질의 유입이 있는 분리 장치에 의해 유지된다. 관류 배양의 사용은 고밀도(예를 들면, 10-50 x 10⁶ 생균 세포/mL)에서 세포의 성장의 도전에 대한 응답이다. 밀도를 2-4 x 10⁶ 생균 세포/mL를 넘도록 증가시키기 위해, 매질은 영양 결핍을 막고 독성 산물을 제거하기 위해 자주 또는 간헐적으로 신선 공급물로 대체된다. 관류는 또한 배양 환경 (pH, dO₂, 영양 수준, 등)의 더 나은 제어를 허용한다. 배양물을 통한 신선 매질의 관류는 다양한 분리 장비 (예를 들면, 발이 고운 스핀 필터, 중공 섬유 또는 평판막 필터, 셋팅 튜브)로 세포를 유지함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 공정의 바람직한 구현예에서, 분리 장치는 중공섬유를 포함하는 필터 모듈이다.

용어 "중공 섬유"는 튜브형 막을 의미한다. 튜브의 내부 직경은 바람직하기는 0.3~6.0 mm, 바람직하기는 0.5~3.0 mm, 가장 바람직하기는 0.5~2.0 mm이다. 특정 구현예에서, 막의 메쉬 크기(구멍 크기)는 메쉬에서 구멍의 크기가 세포의 직경에 근접하도록 선택되어, 세포 조각들이 필터를 통과하는 동안 세포의 높은 보유를 보장한다. 또 다른 구현예에서, 메쉬 크기는 세포의 직경보다 상당히 작다. 바람직하기는 메쉬 크기는 0.1~30㎛이고, 예를 들면, 0.1~3㎛이고, 예를 들면, 약 0.2 ㎛이다. 중공 섬유를 포함하는 필터 모듈은 예를 들면, General Electric (이전에는 Amersham사)사에서 시판된다. 바이러스 입자는 적용된 메쉬 크기보다 작음에도 불구하고 상당한 양의 아데노바이러스 입자들이 본 발명의 방법 동안 유출 배지에서 관찰되지 않았다.

관류는 특정 대사 산물을 원하는 수준으로 유지하고 그리고 제거하고, 그것에 의해 배지의 불순물을 감소시키기 위해 사용된다. 관류 속도는 다양한 방법, 예를 들면, 대체 용적/단위시간의 항으로, 또는 관류기간 동안, 유지되어야 하는 특정 대사산물의 수준의 항으로 측정될 수 있다. 통상적으로 관류는 배양 중 모든 시간 동안 수행되지 않고 일반적으로 배양 중 필요에 따라 때때로 수행되는 것이 통상적이다. 예를 들면, 관류는 통상적으로 글루코스와 같은 특정 매질 성분이 소비되기 시작하고 대체가 필요할 때까지 시작되지 않는다.

여러 관류 시스템들이 본 분야에 알려져 있고 원칙적으로 본 발명의 방법에 적합하다. 용어 "관류 시스템"은 분리 장비와 연결된 생물반응기의 결합을 의미한다. 분리 장비는 생물반응기 (예를 들면, 미세 메쉬 스핀 필터)에 병합되거나 또는 생물반응기의 외부 (예를 들면, 중공섬유)에 남아있을 수 있다. 둘 다의 경우, 위에서 설명한 바와 같이, 분리 장비는 반응기로부터 세포 매스의 유실을 막고 매질을 신선하게 할 수 있다.

본 발명자들은 여러 관류 시스템을 사용하여 파일럿 실험을 수행하였고 교류접선흐름(ATF) 관류 시스템이 가장 좋은 결과를 제공하였다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 생물반응기는 ATF 관류 시스템과 (연결하여) 작업하였다(예를 들면, ATF System, Refine Technology, Co., East Hanover, NJ). 이 시스템은 중공 섬유 하우징의 말단 중 하나에 설치된 격막 펌프로 이루어진다. 하우징의 또 다른 말단은 연결 조립체에 부착되어 있고, 이것은 차례로 이용가능한 포트를 통해 생물반응기에 연결된다. 격막 펌프와 제어 시스템은 중공섬유를 통해 교류접선흐름을 발생하는 역할을 한다. 이것은 중공 섬유의 막 표면 (즉, 접선)과 동일한 방향의 흐름이 있고, 이 흐름은 앞뒤로 이동하며, 그리고 상기 필터 표면과 실질적으로 수직인 방향으로 또 다른 흐름이 있다는 것을 의미한다. 접선 흐름은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법에 따라 그리고 예를 들면, US 6,544,424에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.

ATF 관류 시스템의 작동이 기재되어 왔다 (Furey, 2002). ATF 시스템은 세포가 장기간 배양될 수 있도록 하고 그리고 블록된 필터를 갖지 않고 높은 세포 밀도에 도달할 수 있도록 한다. 참으로, 100 x 10⁶ 생균 세포/mL를 초과하는 극히 높은 세포 밀도가 ATF 관류시스템의 사용에 의해, 예를 들면, PER.C6 세포를 가지고 얻어질 수 있다 (예를 들면, Yallop et al 참조). 그러나, 초기 보고서에서, 관류 시스템의 PER.C6 세포는 완전히 다른 목적으로 사용되었고 아데노바이러스로 감염되지 않았다.

ATF 시스템의 추가의 이점은 시스템이 낮은 전단응력을 발생한다는 것이다. 에너지가 액체 표면에 더해지고, 낮은 전단 층류(shear laminar flow)가 발생된다. 이것은 특히 본 발명에서 유리하고, 여기서 세포는 아데노바이러스로 감염된다. 관류 공정 중, 감염 후, ATF 시스템으로 세포 밀도에서의 손실이 발견되지 않았고 미성숙 세포의 손실이 관찰되지 않았고, 오히려 세포 성장이 관찰되었다. 세포들은 손상되지 않고 유지되므로, 바이러스 증식을 위한 최적 조건이 생성된다.

그러므로, ATF에 의한 관류는 전배양 단계 (본 발명에 따른 단계) 동안 유리한데, 이것은 매우 높은 세포 밀도를 얻도록 하고, 세포가 아데노바이러스에 의한 이후의 감염을 위해 좋은 조건에 있어, 높은 수득률을 얻는데 기여할 수 있기 때문이다. 상기의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해, 배양 매질은 특정 구현예에서 생산자 세포의 세포 성장 중 일부 시간 동안 적어도 부분적으로 관류된다 (단계 a). 특정 구현예에서, 관류는 일단 세포 밀도가 약 2x10⁶ 생균 세포/mL 내지 8x10⁶ 생균 세포/mL에 도달하면 개시된다.

더욱이, ATF 시스템을 갖는 관류는 감염 단계 (본 발명의 단계 c) 이후 유리한데, 감염된 세포로부터 매우 높은 아데노바이러스 수득률을 얻도록 하기 때문이다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 공정의 전배양 단계와 후-감염 단계 모두는 ATF 관류 시스템을 적용한다. ATF 동안 사용된 배지의 용적은 당업자에 의해 쉽게 확립되고 조정될 수 있으므로 세포의 필요에 따라 변할 수 있고, 통상적으로 0.5-5 vessel volumes/day (vol/d), 예를 들면, 1~3 vol/d에서 변하고, 예를 들면, 약 2 vol/d이다. 특정의 유리한 구현예에서, 회복 속도는 본 발명자들이 본 명세서에 나타낸 바에 따르면, 약 1 내지 2 vol/d이고, 이것은 동일한 시간에 매질 소비 및 따라서 그와 관련된 비용이 여전히 합당하면서, 얻어진 rAd35의 수득률과 품질의 면에서 매우 양호한 결과를 가져온다.

최종적으로 ATF 관류 시스템은 확장가능(scalable) 시스템이다. 다양한 크기의 ATF 유니트들을 이용할 수 있다. 공기 흐름은 중공섬유막을 통해 배양물을 구동하는데 사용되기 때문에, 흐름은 기술을 R&D에서부터 1000L까지 확대된 생산까지 사용할 수 있도록 하는, 매우 신속하고, 낮은 전단 접선흐름속도를 발생할 수 있다(Furey, 2002). 가능하기는, 추가의 개발로 ATF 관류 시스템의 추가 규모확대도 가능하다.

Yuk et al에서, rAd5는 종양세포주를 사용하여 생산되고, 그리고 여기서 완전한 공정이 단일 생물반응기에서 수행되고, 이것은 생산 생물반응기에서 약 8-10일 동안 수행될 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 두 개의 다른 생물반응기가 사용되고, 하나는 전배양용 (단계 a: 전배양 생물반응기)이고, 다른 하나는 세포의 감염용 (단계 b) 및 후-감염 배양용(단계 c)이다. 이들 단계에서 두 개의 별개의 생물반응기를 사용하는 이점은 생산 생물반응기에서 오직 약 1.5~5, 전형적으로는 약 2~3일의 배양이 요구되고, 따라서 매년 훨씬 많은 작업을 수행할 수 있다는 것이다. 감염 중 신규 배지를 다량으로 첨가하는 것은 추가로 생산 생물반응기에서 관류 중 요구되는 배지의 용적을 감소시키는 이점이 있다. 선택적인 구현예에서, 단일 생물반응기에서 본 발명의 a-c 모든 단계를 수행하는 것이 또한 가능하다.

감염

본 발명의 방법에서, 생산자 세포는 재조합 아데노바이러스로 감염된다. 전형적으로, 바이러스는 바이러스의 섭취를 허용하는 최적의 조건하에서 적절한 생산자 세포에 노출될 것이다. 최적의 조건들은 세포 유형 및 선택된 아데노바이러스의 유형에 따른다. 본 분야의 당업자는 최적의 조건, 즉 교반을 위한 pH, 온도, 용존산소 (dO₂ 또는DO), 감염다중도(MOI)를 찾는 방법을 알고 있다. 일반적으로, 최적 교반은 약 50~300 rpm, 통상적으로 약 100~200, 예를 들면, 약 150이고, 통상의 DO는 20~60%, 예를 들면, 40%, 최적 pH는 6.7~7.7이고, 최적 온도는 30~39℃, 예를 들면, 34~37℃이고, 그리고 최적 MOI는 5~1000, 예를 들면, 약 50~300이다. 통상적으로, 아데노바이러스는 생산자 세포를 자발적으로 감염시키고, 그리고 세포의 감염을 위해 생산자 세포를 rAd 입자와 접촉시키는 것으로 충분하다. 일반적으로, 아데노바이러스 종균주가 감염을 개시하기 위해 배양물에 첨가되고, 그리고 이어서 아데노바이러스가 생산자 세포에서 증식한다. 이것은 본 분야의 당업자에게 모두 정례적이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 관류는 감염에 앞서 정지되고, 감염 1~20 시간 후, 예를 들면, 3~15시간 후, 예를 들면, 감염 5 시간 후 다시 시작된다. 이러한 지연은 바이러스 입자들이 세포에 도입되도록 하고 바이러스 입자들이 시스템으로부터 씻겨져 나오는 것을 막는다. 감염 후, 관류 속도는 관류에 의해 유지되는 글루코스 수준의 항으로 정해진다. 예를 들면, 본 발명에서 매질에서의 글루코스 농도는 통상 약 2 mmol/L~20 mmol/L, 전형적으로는 약 5~10 mmol/L에서 유지된다.

유리하게도, 생물반응기를 세포당 높은 바이러스 생산성을 유지하면서, rAd35를 사용하여 고세포 밀도로, 즉 10x10⁶ 생균 세포/mL 보다 높게 감염시키는 것이 가능하였다. 특정 구현예에서, 비생산성(specific productivity)은 약 0.5x10⁵~1.5x10⁵ VP/cell이다.

더욱이, 본 발명에서, 감염 전 세포 배양물의 생존력은 75%보다 높게 유지된다. 배양물에서 세포 총량의 적어도 75%는 감염 순간에 생존가능하다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 감염시 세포 배양물의 생존력은 적어도 80%이고, 추가의 구현예에서는 적어도 85%이다. 생존력은 당업자에게 이용가능한 통상의 방법, 예를 들면, 트리판 블루 배제검사, Casy 세포계수법 등으로 측정될 수 있다.

특정 구현예에서, 감염시 세포 밀도는 약 10x10⁶ ~ 50x10⁶ 생균 세포/mL이고, 예를 들면, 약 10x10⁶ ~ 20x10⁶ 생균 세포/mL이고, 예를 들면, 약 10x10⁶ ~ 15x10⁶ 생균 세포/mL, 예를 들면, 약 10x10⁶ ~ 14x10⁶ 생균 세포/mL, 예를 들면, 약 12-13x10⁶ 생균 세포/mL이다. 이러한 세포 밀도는 세포 조각들과 숙주세포 DNA의 축적이 제한된 높은 바이러스 생산성을 허용하고, 이것은 아데노바이러스 수확 하류방향 공정에서 이들 구현예의 이점을 제공한다. 그러므로, 본 발명은 rAd35 생산을 위한 최적의 공정을 제공하고, 양호한 품질의 rAd35를 다수 생산함과 동시에 하류방향 공정 목적을 다룰 수 있는 수확 재료를 제공한다.

본 명세서에 기재된 또 다른 구현예에서, 감염에서의 세포 밀도는 약 15x10⁶

~ 50x10⁶ 생균 세포/mL, 예를 들면, 약 17x10⁶ ~ 45x10⁶ 생균 세포/mL, 예를 들면, 약 20x10⁶ ~ 40x10⁶, 예를 들면, 25x10⁶ ~ 35x10⁶ 생균 세포/mL, 예를 들면, 약 30x10⁶ 생균 세포/mL이다. 이들 세포 밀도에서의 감염은 재조합 아데노바이러스, 특히 rAd35를 더 높은 농도로 생산할 것이고, 지금까지 기재된 rAd35에 대한 수득률을 능가할 것이다. 본 명세서에 처음으로 나타낸 바와 같이, 높은 세포 밀도(약 10x10⁶ 생균 세포/mL)에서의 rAd5 감염과는 반대로, 관류 시스템으로 현탁물 중의 생산물 세포를 사용하여 10x10⁶ 생균 세포/mL 초과 밀도에서 rAd35로의 감염은 감염시 세포 밀도를 적어도 30x10⁶ 생균 세포/mL까지 증가시키면서, 여전히 rAd35의 부피생산성을 증가시켰다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 적어도 1x10¹² rAd35 바이러스 입자 (VP)/mL으로 생산하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 공정은 천연 입자 대 감염성 입자의 비가 30:1 미만으로 rAd35의 회복을 허용하고, 이것은 인간에게 투여될 아데노바이러스에 대해 중요한 요인이다. 이것은 예를 들면, QPA 분석을 적용하여, 바이러스 입자(VP)/감염 단위 (IU)의 비로 측정될 수 있다 (Wang et al, 2005). 낮은 비율은 이와 같은 경우 동일한 수의 세포를 감염시키기 위해 투여되어야 하는 바이러스 입자의 수가 더 적으므로 유리하다. 현재의 FDA 규정은 VP/IU 비율이 30:1 미만일 것을 요구하고, 따라서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 이러한 특정 요구사항을 충족시키는 다량의 rAd35을 제조하는데 적합하다. Yuk et al (2004)의 저자들은 본 명세서에 기재된 수보다 더 작은 바이러스 입자의 무명수(absolute number)를 보고하였고, 추가로 Yuk et al (2004)에 기재된 샘플의 VP/IU 비는 대략 100이다 (Yuk et al, 2004의 도 2A/2B).

반대로, 본 발명자들은 더 높은 절대 수득률(absolute yield) 및 더욱이 20:1보다 낮은 상당히 더 나은 VP/IU 비율을 보고한다. 그러므로, 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 VP/IU의 비가 20:1 미만, 예를 들면, 20:1 내지 5:1인 rAd35의 회분들을 제공한다.

세포 수확 및 용해 방법

아데노바이러스의 감염 후, 바이러스는 세포 내부를 복제하고 그것에 의해 증폭된다. 아데노바이러스 감염은 마지막으로 감염되는 세포의 용해를 가져온다. 그러므로 아데노바이러스의 용해 특성은 바이러스 생산의 두 가지의 다른 모드를 허용한다. 제1 모드는 세포 용해 전에 바이러스를 수확하고, 세포를 용해시키기 위해 외부 인자를 적용하는 것이다. 제2 모드는 생산된 바이러스에 의해 세포가 (거의) 완전히 용해된 후 바이러스 현탁물을 수확하는 것이다 (예를 들면, 외부 인자에 의해 숙주 세포의 용해 없이 아데노바이러스의 수확을 기재한 미국특허 제 6,485,958호 참조). 후자의 모드의 경우, 완전한 세포 용해, 따라서 바이러스의 높은 수득률을 얻는데 더 긴 배양시간이 필요하다. 더욱이, 숙주 세포의 매질로의 점진적인 누설은 얻어진 바이러스의 완전성 및 수득률에 불리할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스를 수확하기 위한 세포를 적극적으로 용해시키기 위한 외부 요소의 적용이 바람직하다.

활성 세포 용해에 사용될 수 있는 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있고, 예를 들면, WO 98/22588, p. 28-35에 기재되어 있다. 이와 관련하여 유용한 방법은, 예를 들면, 냉동-해동, 고체 전단, 고장성 및/또는 저장성 용혈, 액체 전단, 초음파분해, 고압 압출, 세제 용해, 상기의 결합 등이다. 본 발명의 한 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 세제를 사용하여 용해된다. 용해를 위한 세제의 사용은, 이것이 쉬운 방법이고 쉽게 확장가능하므로 유리하다.

사용가능한 세제, 및 그들을 적용할 수 있는 방법은 본 분야의 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 여러 실시예들, 예를 들면, WO 98/22588, p. 29-33에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용되는 세제들은 음이온성, 양이온성, 양쪽성, 및 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 세제의 농도가 예를 들면 약 0.1%-5% (w/w)의 범위에서 변할 수 있다는 것은 본 분야의 당업자들에게 명백하다. 한 구현예에서, 사용된 세제는 Triton X-100이다.

뉴클레아제가 오염물, 즉 대부분의 생산자 세포, 핵산을 제거하기 위해 적용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적절한 예시적인 뉴클레아제는 Benzonase®, Pulmozyme®, 또는 기타 본 분야에 통상적으로 사용되는 DNase 및/또는 RNase를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제는 Benzonase®이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 사이의 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해함으로써 핵산을 신속히 가수분해하고, 그것에 의해 세포 용해물의 점도를 낮춘다. Benzonase®는 Merck KGaA (code W214950)로부터 시판된다. 뉴클레아제가 적용되는 농도는 바람직하기는 1-100 units/ml의 범위이다.

생산자 세포의 배양물로부터 아데노바이러스를 수확하는 방법은 오직 WO 2005/080556에 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 수확 시기는 감염 후 약 24 내지 120 시간, 예를 들면, 감염 후 약 48 내지 96 시간, 예를 들면 감염 후 72시간이다.

정제 방법

특정 구현예에서, 수확된 아데노바이러스는 추가로 정제된다. 아데노바이러스의 정제는 본 명세서에 병합된 WO 05/080556에 기재된 바와 같은 정화, 한외여과, 투석여과 또는 크로마토그래피에 의한 분리를 포함하여 여러 단계로 수행될 수 있다.

정화는 세포 용해물로부터 세포 조각들과 기타 불순물을 제거하는 여과 단계에 의해 수행될 수 있다. 한외여과는 바이러스 용액을 농축하는데 사용될 수 있다. 투석여과 또는 한외여과를 사용하는, 완충액 교환은 염, 당 등의 제거 및 교환을 위한 방법이다. 본 분야의 당업자는 각각의 정제 단계에 대한 최적의 조건들을 발견하는 방법을 알고 있다. 또한, 본 명세서에 병합된 WO 98/22588는 아데노바이러스 벡터의 생산 및 정제 방법을 기재한다. 상기 방법은 숙주 세포를 성장시키고, 상기 숙주 세포를 아데노바이러스로 감염시키고, 숙주 세포를 수확 및 용해하고, 조 용해물을 농축시키고, 조 용해물의 완충액을 교환하고, 용해물을 뉴클레아제로 처리하고, 그리고 바이러스를 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하는 것을 포함한다.

정제는 예를 들면, WO 98/22588, p. 59-61에 기재된 바와 같이 밀도 구배 원심분리에 의해 달성될 수 있다.

그러나, 바람직하기는 정제는 예를 들면, WO 98/22588, p. 61-70에 논의된 바와 같은, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 적용한다. 여러 공정들이 아데노바이러스의 추가 정제를 위해 기재되어 있고, 여기서 크로마토그래피 단계가 공정에 포함된다. 본 분야의 당업자는 이러한 공정을 알고 있고, 공정을 최적화하기 위해 크로마토그래피 단계를 적용하는 정확한 방법을 바꿀 수 있다.

예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 아데노바이러스를 정제하는 것이 가능하고, 예를 들면, WO 05/080556를 참조하라. 아데노바이러스 정제에서, 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하는 것이 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 바이러스들은 충분히 깨끗할 것이다. 그러나, 특정 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 단계가 공정의 강건함을 증가시키기 위해 추가로 수행될 수 있다. 이 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전 또는 후 일 수 있다. 당연히, 다른 정제 단계들이 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 적절히 결합될 수 있다.

아데노바이러스를 정제하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용이 광범위하게 기재되어 왔고, 이러한 면은 따라서 본 분야의 당업자의 범위 내이다. 많은 다양한 크로마토그래프 매트릭스가 아데노바이러스의 정제에 사용되어 왔고 그리고 적합하고, 그리고 본 발명의 당업자는 예를 들면, 다음의 분야에 의해 안내된, 바이러스를 정제하기 위한 최적 음이온 교환 재료를 쉽게 발견할 수 있다.

미국특허 5,837,520 (또한 Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416 참조)는 아데노바이러스를 정제하는 방법을 기재하고, 여기서 숙주 세포 용해물은 뉴클레오디트, 이어서 음이온 교환 및 금속이온 친화성 크로마토그래피로 처리된다.

미국특허 6,485,958는 재조합 아데노바이러스를 정제하기 위한 강 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 기재한다.

음이온 교환 크로마토그래피가 아데노바이러스 입자의 정제를 위해 유동화 베드 칼럼을 사용하여 적용되어 왔다. WO 00/50573 참조.

추가로, 아데노바이러스 입자의 정제를 위한 확장된 베드 음이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피용 특정 크로마토그래피 수지가 미국특허 6,586,226에 기재되었다.

음이온 교환 칼럼에 더하여, Pall (예를 들면, Mustang^TM series) 및 Sartorius (예를 들면, Sartobind series)에 의해 생산된 바와 같은 음이온 교환 막 크로마토그래피 산물들이 적합하다. 아데노바이러스 정제에서의 이들 필터의 사용 및 그들의 이점은 예를 들면, WO 03/078592 및 WO 2005/080556를 참조하라.

미국특허 6,537,793는 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 숙주 세포로부터 아데노바이러스 입자의 정화를 기재하고, 특히 이 목적을 크로마토그래프로 확인하기 위한 Q Sepharose XL 유형의 수행을 가르친다. 본 발명의 한 구현예에서, 아데노바이러스는 Q Sepharose XL 칼럼을 사용하여 더욱 정제된다.

정제 과정은 또한 크기 배제 크로마토그래피 단계를 적절히 적용할 수 있다.

국제출원 WO 97/08298는 바이러스의 손상을 막기 위해, 음이온 교환 및 크기 배제 단계를 포함하여, 특정 크로마토그래프 매트릭스를 사용하여 아데노바이러스를 정제하는 것을 기재한다. 미국특허 6,261,823는 아미노바이러스 정제 방법을 기재하고, 여기서 아데노바이러스 제제는 음이온 교환 크로마토그래피 그리고 이어서 크기 배제 크로마토그래피로 처리된다. 크기 배제 단계에서, 저 분자량의 불순물로부터 바이러스 입자의 집단 분리가 달성된다.

아데노바이러스 정제를 위해 수산화인회석(hydroxyapatite) 매질을 적용하는 것이 또한 가능하다. WO 02/44348 참조.

또한, 예를 들면, WO 03/097797, p. 26에 기재된 바와 같이 역-상 흡착 단계가 사용될 수 있다.

국제출원 WO 97/08298은 바이러스의 손상을 막기 위한 음이온 교환 및 크기 배제 단계를 포함하여, 특정 크로마토크래프 매트릭스를 사용하는 아데노바이러스의 정제를 기재한다.

WO 2006/108707에 기재된 바와 같은, 특정의 한외여과법이 아데노바이러스의 정제에 매우 적합하다. 이와 같은 단계들은 특정 크로마토그래피 정제 단계에 더하여 또는 그 대신으로 수행될 수 있다.

약제학적 제제의 제조

특정 구현예에서, 정제된 아데노바이러스는 약제학적 조성물로 제제화된다. 이것은 다양한 방법에 따라 그리고 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 상투적인 방법에 따라 다양한 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이것은 아데노바이러스 입자를, 아데노바이러스 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물이 되도록 한다. 이와 같은 조성물은 당업자에게 알려진 조건하에서 제조될 수 있고, 특정 구현예에서 인간에게 투여하기에 적합하다.

예를 들면, 아데노바이러스는 집단 분리 동안 완충액을 사용하여 완충액 교환되고 - 그리고 최종적으로는 완충액에 저장되고 이것은 또한 아데노바이러스 국제 표준으로 사용된다 (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p. 43-48): 20 mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤.

당연히, 여러 다른 완충액들이 사용될 수 있고, 정제된 (아데노)바이러스 제제의 보관 및 약제학적 투여에 적합한 제제화의 여러 예를, 유럽특허 제0853660, 및 국제 특허 출원WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763에서 찾을 수 있다.

특정 구현예에서, 아데노바이러스는 백신으로 사용되고, 이들은 통상적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및/또는 희석제에서 유지된다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 희석제는 본 분야에 잘 알려져 있고 다양한 범위의 치료 산물에 광범위하게 사용된다. 바람직하기는, 담체는 백신에서 잘 작업하게 적용된다. 더욱 바람직하기는, 백신은 추가로 애주번트를 포함한다. 애쥬번트는 본 분야에서 적용된 항원 결정기에 대한 면역 반응을 더욱 증가시킨다고 알려져 있고, 아데노바이러스 및 알루미늄 포스페이트를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들면, WO 2007/110409에 기재된다.

인간에게 투여하기 위해, 본 발명은 rAd 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 적용할 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 담체 또는 부형제가, 사용된 투여량 및 농도에서 투여받은 개체에 어느 원하지 않는 또는 해로운 효과를 일으키지 않을 것이라는 것을 의미한다. 이와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 본 분야에 잘 알려져 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조).

정제된 rAd는, 동결건조 제제를 이용하는 것이 본 발명의 범위에 속하기는 하지만 멸균 용액으로서 제제화되고 투여되는 것이 바람직하다. 멸균 용액은 멸균 여과에 의해 또는 본 분야에 알려진 다른 방법에 의해 제조된다. 용액은 그리고 나서 동결건조되거나 또는 약제학적 제형 용기에 채워진다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0~9.5, 예를 들면, pH 5.0~7.5의 범위이다. rAd는 통상 안정한 약제학적으로 허용가능한 완충액을 갖는 용액의 형태이고, rAd의 용액은 또한 염을 함유할 것이다. 임의로, 알부민과 같은 안정화 용액이 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 세제가 첨가된다. 특정 구현예에서, rAd는 주사가능 제제로 제제화된다. 이들 제제는 유효량의 rAd를 함유하고, 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조 버전이고, 임의로 안정화제 또는 부형제를 함유한다.

본 발명은 아데노바이러스 벡터, 특히 rAd35를 매우 높은 수득률로 생산하는 방법을 기재하고, 본 발명자들이 인식하는 바에 따르면, 본 명세서에서 얻어지고 기재된 수득률은 이전에 보고된 바 없었다. 본 발명의 공정에서, 생물반응기가 사용되고 부피 당 매우 많은 수의 아데노바이러스 입자를 갖는 생물반응기는 본 발명의 직접 (중간) 산물이다. 그러므로 본 발명은 또한 작업 용량이 2L~2000L, 바람직하기는 10L~1000L이고 다음을 포함하는 생물반응기를 제공한다: 배지, 생산자 세포 및 적어도 1x10¹² rAd35 바이러스 입자(VP)/mL. 배지는 상기한 바와 같이, 세포의 증식 및 아데노바이러스에 의한 감염에 적합한 어느 배지일 수 있다. 생물반응기 용적, 생산자 세포 및 rAd35 입자의 수 및 VP/IU 비율의 면은 본 발명의 방법에 관하여 상기한 바와 같다. 바람직한 구현예에서, 생물반응기는 ATF 관류 시스템과 연결된다.

또 다른 면에서, 본 발명은 적어도 1x10¹² rAd35 바이러스 입자 (VP)/mL를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: a) 관류 시스템으로 현탁액 중에서 생산자 세포를 배양하고; b) 상기 세포를 10x10⁶ 생균 세포/mL 내지 16x10⁶ 생균 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염시키고; c) 감염된 세포를 관류 시스템으로 추가로 배양하여 상기 rAd35를 증식시키고, 그것에 의해 rAd35 바이러스 입자의 농도는 적어도 1x10¹² VP/mL에 도달하고; 그리고 d) 상기 rAd35를 수확하는 단계를 포함한다. 본 공개 전에, 이와 같은 높은 수득률을 어떻게 달성하는가는 말 할 것도 없고, 이와 같은 높은 수득률의 rAd35가 실행가능한지는 전혀 알려지지 않았다.

본 발명은 이들 수득률이 본 명세서에 기재된 방법에 따라 가능하다는 것을 기재한다. 바람직하기는 수확된 rAd35의 천연 입자 대 감염 입자의 비는 30:1 미만이다. 유리하기는 추가의 구현예가 상기와 같이 본 발명의 방법에 따라 기재된다.

본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 설명된다. 실시예들은 본 발명을 어느 방법으로도 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명확히 한다.

실시예

실시예 1: Ad5 벡터를 사용한 높은 세포 밀도로의 감염

PER.C6^®작업 세포 은행의 세포를 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 부피 1.5L 및 세포 밀도 0.2~0.5x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 4.7x10⁶ total cells/mL의 세포 밀도에서 ATF 관류 공정을 개시하였다. ATF는 Refine Technology, Co., East Hanover, NJ사 제품이었다. 89 시간 후, 세포 밀도는 12.4x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 세포의 일부를 수확하고 세포를 300g로 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 신선 무혈청 매질에서 다음의 농도로 재-현탁하였다:

- 1.3x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

- 10x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

- 20x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

- 30x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

쉐이커를 Ad5.CS (rAd5 벡터; Shott et al, 2008)로 90 VP/cell MOI로 감염시키고 36℃, 10% CO₂ 및 100 rpm에서 배양하였다. 감염 후 제1일 및 제2일에 10, 20, 및 30 x10⁶ 생균 세포/mL로 감염된 쉐이커에 대해 매질 회복을 수행하였다. 이러한 매질 회복을 원심분리 단계에 의해 5분 동안 300 g에서 수행하였고 세포 펠렛을 쉐이커 당 30 mL의 신선 매질에 재-현탁하였다. 감염 후 제3일에, 쉐이커를 수확하고 AEX-HPLC 분석을 위해 샘플화하였다. 각 쉐이커의 샘플 부피 1mL를 10% Triton X-100 100 ㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하여 수확물의 세포 용해를 수행하였다. 배양 후 샘플을 2.42 ㎕ 벤조나아제/MgCl₂와 혼합하고 이어서 순차적인 37℃에서 30분 동안의 인큐베이션하였다. 최종적으로 50% 슈크로스 100 ㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 단계 후, 생산된 바이러스 입자의 수(VP/mL)를 측정하기 위해 AEX-HPLC를 수행함에 의해 분석할 때까지 샘플을 -65℃ 이하에서 보관하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.

10x10⁶ 생균 세포/mL의 세포 밀도에서 감염의 체적 수율(volumetric yield)은 1x10⁶ 생균 세포/mL에서보다 10배 높다. 이것은 초기 보고서에서 보고된 훨씬 낮은 밀도의 세포 밀도 효과를 가정하면(즉, 약 0.5-3x10⁶ cells/mL, 예를 들면, Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004; Altaras et al., 2005) 다소 예상 밖이다. 그러나, 10x10⁶ cells/mL를 넘어서, 세포 밀도 효과가 관찰되었고 체적 수율은 감소하였다.

그러므로 재조합 Ad5에서, 세포밀도효과가 관류 시스템에서 나타났다.

실시예 2: rAd35를 사용한 낮은 세포 밀도로의 감염(1-1.6x10⁶ 생균 세포/mL)

실시예 1에서는 rAd5가 사용되었다. 그러나, 다양한 아데노바이러스 혈청형들이 알려져 있고 다양한 목적에 대해 기재되었다. 이들 혈청형은 다른 성질들을 갖고, 따라서 하나의 혈청형에 유용한 공정이 다른 혈청형에 반드시 적합한 것은 아니다. 이것은 특히 산업 규모 공정과 관련될 수 있고, 작은 차이가 경제적으로 크게 중요한 것으로 보인다. 예를 들면, 백신에 사용하기에 특히 유리한 혈청은 Ad35이고, 다음의 실시예에서, 본 발명자들은 rAd35를 다량으로 얻기 위해 그것의 수득률을 증가시키는 가능성을 시험하였다. 이 실시예는 세포가 더 높은 세포 밀도로 감염된 다음의 실시예와 비교하여, rAd35 벡터를 사용한 낮은 세포 밀도로의 감염을 나타낸다.

PER.C6^®작업 세포 은행의 세포를 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 10L 생물반응기를 부피 5L 및 세포 밀도 0.2~0.35x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 접종 후 제4일에 (세포 밀도가 2~3.5x10⁶ 생균 세포/mL에 도달했을 때), 세포 현탁물을 5L 신선 매질로 희석시키고 이어서 rAd35.TB-S (rAd35 vector; Radosevic et al, 2007)로 MOI 70 VP/cell로 감염시켰다. 바이러스 증식을 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 수행하였다. 감염 후 제3일에 생물반응기를 세포 계수 및 바이러스 생산 측정을 위해 샘플 조사하였다. 바이러스를 방출하기 위해, 각각의 생물반응기의 샘플 1 mL를 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플을 벤조네이트/MgCl₂ 2.42㎕와 혼합하고 이어서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 최종적으로 50% 슈크로스 100㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 단계 후, 샘플을 AEX-HPLC로 분석할 때까지 -65℃ 이하의 온도에서 보관하였다. 상기 공정에 따라 총 10개의 생물반응기 작업을 수행하고 분석하였고, 이들 작업은 일관된 결과를 가져왔다 (도시하지 않음). 평균 바이러스 입자 생산은 2.3x10¹¹ VP/mL이었다.

매년 약 1.5x10¹⁹ VP의 요구를 위해 약 65000 L의 이와 같은 수득률이 진행되어야 한다. 이것은 다량의 설비를 필요로 하고 따라서 백신 개발 동안 대규모의 선행 투자가 필요하다.

실시예 3: 고세포 밀도 (>10x10⁶ 생균 세포/mL)로의 rAd35의 감염 공정의 타당성 조사.

PER.C6^®작업 세포 은행으로부터, 세포를 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 부피 1.5L 및 세포 밀도 0.2~0.5x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. ATF 시스템을 사용하여, 매질 관류를 6.8x10⁶ 총 세포/mL의 세포 밀도에서 개시하였다. 70 시간 후, 세포 밀도는 36.8x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 다음의 감염을 수행하였다:

ㆍ 다음의 세포 밀도로 쉐이커에서 감염:

o 1.3x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

o 10x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

o 20x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

o 30x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

ㆍ 8.7x10⁶ 총 세포/mL (84% 생존력)에서 2L 생물반응기 규모로 감염

o 생물반응기의 감염 1시간 후, 샘플을 생물반응기로부터 꺼내고 250mL 쉐이커 2개에 쉐이커 당 30 mL씩 옮겼다

250 mL 쉐이커에서의 감염 공정을 위해, 2L 생물반응기로부터 세포 현탁물의 일부를 수확하였고 이 현탁물을 5분간 300 g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 신선 무혈청 매질에서 상기 농축물로 재현탁시켰다. 쉐이커를 Ad35.TB-S로 70 VP/cell의 MOI로 감염시키고 36℃, 10% CO₂ 및 100 rpm에서 배양하였다. 감염 후 제1 및 제2일에 10, 20, 및 30x10⁶ 생균 세포/mL에서 감염된 쉐이커에 대해 매질 회복을 수행하였다. 이러한 매질 회복을 5분 동안 300g에서의 원심분리단계에서 수행하였고, 세포 펠렛을 쉐이커 당 30 mL 신선 매질에 재-현탁하였다. 감염 후 제3일에, 쉐이커를 수확하고 AEX-HPLC 분석을 위해 샘플화하였다. 수확물의 세포 용매를 각각의 쉐이커의 샘플 용적 1 mL를 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하여 수행하였다. 배양 후, 샘플을 2.42 ㎕ 벤조나제/MgCl₂와 혼합하고 이어서 30분 동안 37℃의 배양단계를 수행하였다. 마지막으로 50% 슈크로스 100㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서의 원심분리 단계 후, 샘플을 AEX-HPLC을 수행함에 의해 분석할 때까지 -65℃ 이하에서 보관하였다.

2L 생물반응기 중의 나머지 세포들을 신선 무혈청 매질을 사용하여 세포농도 8.7x10⁶ 총 세포/mL (84% 생존능력)로 희석하였다. 생물반응기를 Ad35.TB-S로 MOI 70 VP/cell로 감염시키고 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 배양하였다. ATF 시스템을 1일당 1 생물반응기 용적의 매질 회복 속도로 감염 후 15시간에 시작하였다. 감염 후 제1, 2, 3, 및 4일에, 세포 계수 (CASY 세포 계수기)를 위해 샘플화하고 AEX-HPLC에 의해 바이러스 생산을 측정하였다. 샘플 제조를 상기와 같이 수행하였다. 샘플을 AEX-HPLC를 수행함에 의해 분석할 때까지 -65℃에서 보관하였다.

생물반응기를 감염시키고 대략 1시간 후, 2L 생물반응기로부터 적어도 60 mL의 샘플을 취하고 (250 mL 쉐이커에서) 2개의 감염을 쉐이커 당 30 mL의 부피로 시작하였다. 감염 후 제1일 및 제2일에, 매질 회복을 수행하여 관류 시스템을 모방하였다. 이 매질 회복은 5분 동안 300g에서의 원심분리 단계에 의해 수행되고 세포 펠렛은 쉐이커 당 30 mL 신선 매질에 재현탁되었다. 감염 후 제3일에, 쉐이커를 수확하고 AEX-HPLC 분석을 위해 샘플화하였다. 샘플 제조를 상기와 같이 수행하였다. 샘플을 AEX-HPLC를 수행함에 의해 분석할 때까지 -65℃에서 보관하였다.

결과를 도 2에 나타내었다. 결과는 1.3x10⁶ 생균 세포/mL 내지 30x10⁶ 생균 세포/mL의 감염이 가능하다는 것을 나타낸다. rAd5의 결과와는 반대로, rAd35의 총 수득률은 10x10⁶ 생균 세포 세포/mL 샘플 이상의 감염에서도 세포 밀도와 함께 증가하였다. 30x10⁶ 생균 세포/mL에서 1.4x10¹² VP/mL의 세포 용적에 도달하였다.

결과는 높은 세포 밀도에서, 즉 10x10⁶ 생균 세포/mL 이상에서 Ad35.TB-S 로의 감염이 가능하다는 것을 분명히 나타낸다. 30x10⁶ 생균 세포/mL에서도, 감염은 높은 용적 수득률을 제공하였다.

1.3x10⁶ 세포에서 120,000 VP/cell로부터 30x10⁶ 생균 세포/mL에서 47,000 VP/cell로의 단위 생산성에서의 감소가 나타났다는 것을 확인할 수 있다. 세포 현탁물 (이것은 생물반응기에서 감염되었다)로부터 출발한 쉐이커는 수확 수득률 8.0x10¹¹ VP/mL 및 단위 생산성 92.000 VP/cell을 나타낸다. 2L 생물반응기에서의 결과는 다소 낮았다: 수확 생산성은 5x10¹¹ VP/mL에 도달하였고, 단위 생산성은 57,000 VP/cell였다.

실시예 4: 또 다른 rAd35에 의한 높은 세포 밀도로의 감염의 타당성 조사.

PER.C6^®작업 세포 은행의 세포를 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 부피 1.5L 및 세포 밀도 0.2~0.5x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. ATF 관류 공정을 5.1x10⁶ 총 세포/mL의 세포 밀도에서 시작하였다. 70 시간 후, 세포 밀도는 25x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 다음의 감염을 수행하였다. 세포를 5분간 300g에서 원심분리하였고 세포 펠렛을 신선 무혈청 매질에서 다음 농도로 재현탁하였다:

ㆍ 1.3x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

ㆍ 10x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

ㆍ 20x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

ㆍ 3x10⁶ 생균 세포/mL, 30 mL/shaker, 250mL 쉐이커 2개

쉐이커를 Ad35.eGFP (또 다른 전이 유전자, viz. GFP 유전자를 포함하는 rAd35)로 MOI 70 VP/cell으로 감염시키고 36℃, 10% CO₂ 및 100 rpm에서 배양하였다. 감염 후 제1일 및 제2일에, 10, 20, 및 30x10⁶ 생균 세포/mL로 감염된 쉐이커에 대해 매질 회복을 수행하였다. 이 매질 회복을 원심분리 단계에서 5분 동안 300g에서 수행하고 세포 펠렛을 쉐이커 당 30 mL의 신선 매질 중에 재현탁하였다. 감염 후 제3일에, 쉐이커를 수확하고 AEX-HPLC분석을 위해 샘플화하였다. 수확물의 세포 용해를 각각의 쉐이커의 샘플 1mL를 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하여 수행하였고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플을 벤조나제/MgCl₂ 2.42㎕와 혼합하고 이어서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 마지막으로, 50% 슈크로스 100 ㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분간 2500g에서 원심분리 후, 샘플을 AEX-HPLC를 수행하여 분석할 때까지 -65℃에서 보관하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 결과는 높은 세포 밀도로의 감염이 또한 또 다른 Ad35 벡터 (Ad35.eGFP)로도 실행가능하다는 것을 나타낸다. 체적 수율 (도 3) 및 단위 생산성 (자료는 도시하지 않음)은 Ad35.TB-S 벡터에서와 동일한 범위였다.

실시예 5: rAd35 벡터를 이용한 높은 세포밀도에서의 추가의 감염 실험

PER.C6^®작업세포은행의 세포들을 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일 마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 세포 밀도 0.25x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 2L 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 세포 밀도가 대략 3.7x10⁶ 총 세포/mL에 도달했을 때 (접종 후 제4일), ATF 시스템을 시작하였다. 67 시간 후, 세포 밀도는 40.7x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 세포 현탁물의 일부를 수확하고 나머지 세포를 2L 생물반응기에서 신선 매질로 세포밀도 12.7x10⁶ 총 세포/mL (87% 생존력, 따라서 11x10⁶ 생균 세포/mL)로 희석하였다. 이어서 2L 생물반응기를 Ad35.TB-S로 MOI 70 VP/cell로 감염시키고 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 배양하였다. ATF 시스템을 1일 당 5 용기 부피의 매질 회복 속도에서 감염 후 15 시간에 시작하였다. 감염 후 제 1, 2, 3, 및 4일에, 2L 생물반응기를 세포 계수 및 AEX-HPLC에 의한 바이러스 생산을 위해 샘플화하였다. 바이러스를 방출하기 위해, 1 mL 샘플을 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플을 2.42 ㎕ benzonase /MgCl₂와 혼합하고 그리고 순차적으로 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로 50% 슈크로스 100㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 후, 샘플을 -65℃에서 AEX-HPLC에 의해 분석될 때까지 보관하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 5의 결과

감염 후 일자	세포 계수 (x10⁶ 총 세포/mL)	AEX-HPLC (VP/mL)	QPA (IU/mL)	AEX/QPA (VP/IU)
0	12.70	NA	NA	NA
1	22.18	LOQ 이하	1.77 x10⁹	-
2	9.20	1.34 x10¹²	8.5 x10¹⁰	15.8
3	10.10	1.46 x10¹²	8.3 x10¹⁰	17.6
4	7.60	1.43 x10¹²	8.3 x10¹⁰	17.2

결과는 10x10⁶ 생균 세포/mL 이상의 세포 밀도에서의 감염이 관류 시스템과 결합된 생물반응기에서 실행가능하고 회분 공정 (실시예 2)와 비교하여 용적 수득률이 거의 7배 증가할 수 있다는 것을 증명한다. 감염된 배양물의 조숙 세포 손상은 관찰되지 않았고, 이것은 ATF 공정이 감염된 세포를 배양하기에 적절한 시스템이라는 것을 나타낸다.

rAd 배치에 대한 FDA 요구사항은 VP/IU의 비가 < 30인 것이다. QPA (Q-PCR based potency assay; Wang et al, 2005) 분석은 모든 샘플이 이 조건을 충족한다는 것을 나타낸다. 반대로, Yuk et al (2004)에 기재된 샘플은 VP/IU 비가 약 100이다 (도 2A/2B). 천연 입자 대 염증성 입자의 비는 아데노바이러스에 대한 타탕한 계수이고, 낮은 비는 rAd 회분의 경우 바람직하다. 본 실시예에서 제조된 배치는 약 15:1 내지 18:1의 이와 같이 낮은 비를 갖는다.

약 1.5x10¹⁹ VP의 연간 요구와 약 1.5x10¹² VP/ml의 수득률을 위해, 약 10000 L 가 처리되어야 할 것이다. 이들 부피는 1000L 또는 그 이하로 처리될 수 있고, 그러므로 백신 개발 동안 선행 비용 헌신을 감소시킬 수 있다.

실시예 6: 감소된 관류속도로 rAd35 벡터를 사용한 높은 세포 밀도로의 추가의 감염 실험

PER.C6^®작업세포은행의 세포를 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 세포 밀도 0.59x10⁶ 생균 세포/mL로 접종하였다. 세포를 2L 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 세포 밀도가 대략 2.9x10⁶ 총 세포/mL에 도달했을 때 (접종 후 제4일), ATF 시스템을 시작하였다. 118 시간 후, 세포 밀도는 29x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 세포 현탁물의 일부를 수확하고 나머지 세포를 2L 생물반응기에서 신선 매질로 세포밀도 16.4x10⁶ 총 세포/mL (82% 생존력, 따라서 13.4x10⁶ 생균 세포/mL) 로 희석하였다. 이어서 2L 생물반응기를 Ad35.TB-S로 MOI 70 VP/cell로 감염시키고 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 배양하였다. ATF 시스템을 1일 당 2 용기 부피의 매질 회복 속도에서 감염 후 15 시간에 시작하였다. 감염 후 제 1, 2 및 3일에, 2L 생물반응기를 세포 계수 및 AEX-HPLC에 의한 바이러스 생산을 위해 샘플화하였다. 바이러스를 방출하기 위해, 1 mL 샘플을 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플을 2.42 ㎕ 벤조나제/MgCl₂와 혼합하고 그리고 순차적으로 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로 50% 슈크로스 100 ㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 후, 샘플을 -65℃에서 AEX-HPLC에 의해 분석될 때까지 보관하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

결과는 10x10⁶ 생균 세포/mL 이상의 세포 밀도로의 감염이 관류 시스템과 결합된 생물반응기에서 실행가능하고 회분 공정 (실시예 2)과 비교하여 체적 수율이 거의 10배 증가할 수 있다는 것을 증명한다. 감염된 배양물의 조숙 세포 손상은 관찰되지 않았고, 이것은 ATF 공정이 감염된 세포를 배양하기에 적절한 시스템이라는 것을 나타낸다.

실시예 6의 결과

감염 후 일자	세포 계수 (x10⁶ 총 세포/mL)	AEX-HPLC (VP/mL)	QPA (IU/mL)	AEX/QPA (VP/IU)
0	16.4	NA	NA	NA
1	21.4	LOQ 이하	Below LOQ	NA
2	29.18	1.34 x10¹²	2.23 x10¹¹	6.0
3	31.50	2.26 x10¹²	3.16 x10¹¹	7.2

rAd 배치에 대한 FDA 요구사항은 VP/IU의 비가 < 30인 것이다. QPA (역가 검정을 근거로 하는 Q-PCR; Wang et al, 2005) 분석은 모든 샘플이 이 조건을 충족한다는 것을 나타낸다. 반대로, Yuk et al (2004)에 기재된 샘플은 VP/IU 비가 약 100이다 (도 2A/2B). 천연 입자 대 염증성 입자의 비는 아데노바이러스에 대해 타탕한 계수이고, 낮은 비율은 rAd 회분의 경우 바람직하다. 본 실시예에서 제조된 배치는 일정하게, 10: 1 미만의 낮은 비율을 가졌다.

약 1.5x10¹⁹ VP의 연간 요구와 약 2x10¹² VP/ml의 수득률을 위해, 약 7500 L 가 처리되어야 할 것이다. 이들 부피는 1000L 또는 그 이하로 처리될 수 있고, 그러므로 백신 개발 동안 선행 비용 헌신을 감소시킬 수 있다.

실시예 7: 감소된 관류 속도로 rAd35 벡터를 사용한 높은 세포 밀도로의 추가의 감염 실험

PER.C6^®작업세포은행의 세포들을 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일마다 2차 배양하여 2L 생물반응기를 세포 밀도 0.44x10⁶ 총 세포/mL로 접종하였다. 세포를 10L 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 세포 밀도가 대략 2.72x10⁶ 총 세포/mL에 도달했을 접종 후 제4일에 ATF 시스템을 시작하였다. 144 시간 후, 세포 밀도는 30.5x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 세포 현탁물의 일부를 수확하고 나머지 세포를 2L 생물반응기에서 신선 매질로 세포밀도 16.2x10⁶ 총 세포/mL (81% 생존력, 따라서 13.1x10⁶ 생균 세포/mL)로 희석하였다. 이어서 2L 생물반응기를 Ad35.TB-S로 MOI 70 VP/cell로 감염시키고 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 배양하였다. ATF 시스템을 1일 당 2 용기 부피의 매질 회복 속도에서 감염 후 5 시간에 시작하였다. 감염 후 제2, 3 및 4일에, 2L 생물반응기를 세포 계수 및 AEX-HPLC에 의한 바이러스 생산을 위해 샘플화하였다. 바이러스를 방출하기 위해, 1 mL 샘플을 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 샘플을 2.42 ㎕ 벤조나제/MgCl₂와 혼합하고 그리고 순차적으로 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로 50% 슈크로스 100㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 후, 샘플을 -65℃에서 AEX-HPLC에 의해 분석될 때까지 보관하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

실시예 7의 결과

감염 후 일자	세포 계수 (x10⁶ 총 세포/mL)	AEX-HPLC (VP/mL)	QPA (IU/mL)	AEX/QPA (VP/IU)
0	16.19	NA	NA	NA
1	20.40	NA	NA	NA
2	24.14	1.42 x10¹²	1.77 x10¹¹	8.0
3	24.60	2.20 x10¹²	1.82 x10¹¹	12.1
4	16.26	1.90 x10¹²	1.51 x10¹¹	12.5

결과는 다시, 10x10⁶ 생균 세포/mL 이상의 세포 밀도로의 감염이 관류 시스템이 결합된 생물반응기에서 실행가능하고 회분 공정 (실시예 2)와 비교하여 용적 수득률이 거의 10배 증가할 수 있다는 것을 증명한다. 실시예 6 및 7과 함께, 감염 후 관류 속도는 바이러스 생산을 약속함 없이 1일당 2 용기 부피로 제한될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 50L 규모에서 rAd35 벡터를 사용한 높은 세포밀도로의 추가의 감염 실험

PER.C6^®작업세포은행의 세포들을 해동시키고 37℃ 및 10% CO₂의 습식 인큐베이터에서 무혈청 배지로 증식시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 3-4일 마다 2차 배양하여 10L 생물반응기를 세포 밀도 0.52x10⁶ 총 세포/mL로 접종하였다. 세포를 10L 생물반응기에서 37℃, 40% DO, 및 pH 7.3에서 증식하였다. 세포 밀도가 대략 5.3x10⁶ 총 세포/mL에 도달했을 때 (접종 후 제4일) ATF 시스템을 시작하였다. 169 시간 후, 세포 밀도는 77x10⁶ 총 세포/mL에 도달하였다. 이 시점에서, 세포 현탁물 10L를 수확하고 50L 생물반응기에서 신선 매질로 세포밀도 15.5x10⁶ 총 세포/mL (81% 생존력, 따라서 12.6x10⁶ 생균 세포/mL)로 희석하였다. 이어서 50L 생물반응기를 Ad35.TB-S로 MOI 70 VP/cell로 감염시키고 36℃, pH 7.3 및 DO 40%에서 배양하였다. ATF 시스템을 1일 당 2 용기 부피의 매질 회복 속도에서 감염 후 5 시간에 시작하였다. 감염 후 제2 및 3일에, 50L 생물반응기를 세포 계수 및 AEX-HPLC에 의한 바이러스 생산을 위해 샘플화하였다. 바이러스를 방출하기 위해, 1 mL 샘플을 10% Triton X-100 100㎕와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 접종 후, 샘플을 2.42 ㎕ 벤조나제/MgCl₂와 혼합하고 그리고 순차적으로 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로 50% 슈크로스 100㎕를 샘플에 첨가하였다. 5분 동안 2500g에서 원심분리 후, 샘플을 -65℃에서 AEX-HPLC에 의해 분석될 때까지 보관하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 8의 화합물

감염 후 일자	세포 계수 (x10⁶ 총 세포/mL)	AEX-HPLC (VP/mL)	QPA (IU/mL)	AEX/QPA (VP/IU)
0	15.5	NA	NA	NA
2	21.4	1.67 x10¹²	1.15 x10¹¹	14.6
3	23.5	1.84 x10¹²	1.99 x10¹¹	9.2

결과는 10x10⁶ 생균 세포/mL 이상의 세포 밀도로의 감염이 관류 시스템이 결합된 50L 생물반응기에서 실행가능하고 회분 공정 (실시예 2)과 비교하여 체적 수율이 50L 규모에서 거의 10배 증가할 수 있다는 것을 증명한다. 연간 바이러스 요구를 만족시키기 위해 매년 처리되어야 할 수확 용량을 본 공정으로 수행할 수 있다. 약 1.5x10¹⁹ VP의 연간 요구와 약 2x10¹² VP/ml의 수득률을 위해, 약 7500 L 가 처리되어야 할 것이다. 이들 부피는 1000L 또는 그 이하로 처리될 수 있고, 그러므로 백신 개발 동안 선행 비용 헌신을 감소시킬 수 있다.

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European Collection of Cell Cultures

96022940

19960229

Claims

생물 반응기에서 재조합 아데노바이러스 혈청형 35 (rAd35)의 제조방법으로, 상기 방법은:
a) 생산자 세포를 생물 반응기에서 현탁액 중에서 관류 시스템으로 배양하는 단계;
b) 상기 세포를 생물 반응기에서 10x10⁶ 생존 세포/mL 내지 16x10⁶ 생존 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염시키는 단계;
c) 감염된 세포를 관류 시스템으로 생물 반응기에서 추가로 배양하여 상기 rAd35를 증식시키는 단계; 및
d) 상기 rAd35를 채취하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 세포는 10x10⁶ 내지 14x10⁶ 생존 세포/mL의 밀도로 rAd35로 감염되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 관류 시스템은 교호접선류 (alternating tangential flow:ATF) 관류 시스템인 방법.
제1항에 있어서,
e) rAd35를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1 영역의 최소한 일부가 결핍되어 있고, 이형 핵산을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 관류 시스템은 교호접선류 (ATF) 관류 시스템인 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)는 제1 생물반응기에서 수행되고, 그리고 단계 b) 및 c)는 제2 생물반응기에서 수행되는 방법.
제4항에 있어서,
f) 정제된 rAd35를 함유하는 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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