JP5770633B2 - アデノウイルスベクターの産生方法 - Google Patents
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Description
本発明者らは、産生細胞を潅流培地にて10×106生存細胞/mLを超える密度で感染させた際に、組み換えアデノウイルス抗原型35(rAd35)の収率がさらに上昇したことを見出した。対照的に、産生細胞を20×106または30×106生存細胞/mLで感染する場合、組み換えアデノウイルス抗原型5(rAd5)の収率は10×106生存細胞/mLでの感染と比較して低かった。従って、rAd35は、使用した条件下産生細胞中でrAd5と異なって増殖する。さらに、本発明者らは、他の抗原型が再度異なって挙動し、最適な結果を得るためには特定のアデノウイルス抗原型に対する処理を各抗原型に対して微調整しなければならないことを示唆することを見出した。本発明は、rAd35産生用の最適なシステムを、収率、得られたrAd35の品質および下流処理用採取の取り扱いの容易さに関して提供する。
本発明は、大量の組み換えアデノウイルス35の産生用の新規方法を開示する。この最適化方法は、培地を高細胞密度で細胞あたりの高ウイルス産生率の保存とともに感染させる能力に依存する。これによって、高ウイルス濃度を有する採取ウイルス溶液を単一のバイオリアクターで得る方法を提供する。本発明の方法のrAd35に対する典型的な収率は、約2〜3×1011VP/mLである。実際、本発明の方法を用いて、非常に大量、例えば少なくとも約5×1011VP/mL、好ましくは少なくとも約6,7,8または9×1011VP/mLの量のrAd35粒子を産生し得ると考えられる。好ましくは少なくとも1×1012VP/mL、より好ましくは少なくとも1.5×1012VP/mL、さらにより好ましくは少なくとも2×1012VP/mL、例えば約1×1012から5×1012VP/mLの間のrAd35を産生する。通常、該方法は約1×1013VP/mLを超えるrAd35を産生しない。本発明による方法で得ることができる収率は、1000Lを超える作業容積を有するバイオリアクター施設を必要とすることなく所望量の特定のrAd35系ワクチンを世界中で調製するのにおそらく十分なものである。
本発明に係る産生細胞(しばしば従来技術および本明細書にて「パッケージング細胞」、「補体細胞」または「宿主細胞」と称する)は、所望のアデノウイルスを増殖し得るあらゆる産生細胞とすることができる。例えば、組み換えアデノウイルスベクターの増殖が、アデノウイルス欠如を補完する産生細胞にて行われる。かかる産生細胞は、そのゲノムに少なくともアデノウイルスE1配列を有するのが好ましく、このことにより組み換えアデノウイルスをE1領域における欠失によって補完することができる。さらにアデノウイルスは、Adゲノムに重要でないE3領域に欠失を有する場合があり、従ってかかる欠失を補完する必要がない。E1によって不死化されたヒト網膜細胞のような任意のE1補完産生細胞、例えば911またはPER.C6細胞(米国特許第5,994,128号参照)、E1形質転換された羊膜細胞(欧州特許第1230354号参照)、E1形質転換されたA549細胞(例えば、国際公開第98/39411号、米国特許第5,891,690号参照)、GH329:HeLa(Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219)、293等を用いることができる。特定の実施形態において、産生細胞は、例えばHEK293細胞、PER.C6細胞、911細胞、IT293SF細胞等である。好ましくは、PER.C6細胞(ECACC寄託96022940;米国特許第5,994,12号参照)またはそれに由来する細胞を産生細胞として使用する。
バイオリアクターは、懸濁液依存動物細胞培養から大規模な生物学的産物の産生用に広範囲にて使用されている。本発明によれば、アデノウイルス増殖に用いるバイオリアクターは、例えば撹拌タンク、処理可能なバイオリアクター、エアリフトリアクター等とすることができる。
本発明の方法において、産生細胞を組み換えアデノウイルスで感染させる。通常、ウイルスを適切な産生細胞へ最適な条件下で曝して、ウイルスの取り込みを可能とする。最適条件は、細胞の種類および選択したアデノウイルスの種類に依存する。当業者は、最適な条件、例えば撹拌、pH、温度、溶存酸素(dO2またはDO)、感染の多様性(MOI)を見つける方法を知っている。通常、最適な撹拌は、約50から300rpmの間、典型的に約100〜200、例えば約150であり、典型的なDOは20〜60%、例えば40%であり、最適なpHは6.7から7.7であり、最適な温度は30から39℃、例えば34〜37℃、最適なMOIは5から1000の間、例えば約50〜300である。一般に、アデノウイルスは産生細胞を自然に感染させ、産生細胞をrAd粒子と接触させることは、細胞の感染に十分である。通常、アデノウイルスの播種株を培養物に添加して感染を開始し、その後アデノウイルスが産生細胞にて増殖する。これは当業者にとって全て定型的な方法である。
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内にて複製し、その結果増幅される。アデノウイルス感染は、最終的に感染細胞の溶解をもたらす。従って、アデノウイルス溶解特性は、ウイルス産生の2つの異なるモードを可能とする。第一モードは、細胞溶解前にウイルスを採取し、外部因子を用いて細胞を溶解することである。第二モードは、産生細胞による(ほぼ)完全な細胞溶解後にウイルス上清を採取することである(例えば、外部因子による宿主細胞の溶解なしにアデノウイルスを採取することを記載した米国特許第6,485,958号明細書を参照)。後者のモードに関して、完全な細胞溶解、そのためウイルスの高い収率を達成するためには、より長い培養時間を必要とする。さらに、宿主細胞含有量の培地への段階的な流出は、得られたウイルスの質および収率に有害である可能性がある。そのため、本発明によれば、外部因子を使用して、アデノウイルス採取用の細胞を積極的に溶解することが好ましい。
特定の実施形態において、採取されたアデノウイルスをさらに精製する。アデノウイルスの精製を、例えばここに参考して援用した国際公開第05/080556号に記載されたような浄化、限外濾過、膜分離精製またはクロマトグラフィでの分離を含むいくつかの工程にて行うことができる。浄化は、細胞破片および他の不純物を細胞溶解物から取り除く濾過工程によって行うことができる。限外濾過を用いて、ウイルス溶液を濃縮する。限外濾過器を用いる膜分離精製または緩衝剤交換は、塩、糖等の除去および交換のための方法である。当業者は、それぞれの精製工程の最適条件を見つける方法を知っている。また、ここに参照して援用した国際公開第98/22588号には、アデノウイルスベクターの産生および精製方法を開示する。該方法は、宿主細胞を成長させ、宿主細胞をアデノウイルスで感染し、宿主細胞を採取および溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝剤との交換、溶解物をヌクレアーゼで処理し、さらにクロマトグラフィを用いてウイルスを精製することを含む。
特定の実施形態において、精製されたアデノウイルスを医薬品組成物に処方する。これは数々の方法に従って、また全て当業者に知られた一連の方法に従って種々の緩衝剤を使用して実行することが可能である。一般に、アデノウイルス粒子を製薬学的に許容し得る組成物に取り入れることを伴い、該組成物がアデノウイルスおよび少なくとも製薬学的に許容し得る賦形剤を含有する。かかる組成物を当業者に既知の条件下で調製することができ、特定の実施形態ではヒトへの投与に適している。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを1.5Lの容積および0.2から0.5×106生存細胞/mLの細胞密度で接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。ATF潅流処理を4.7×106総細胞/mLの細胞密度にて開始した。ATFはRefine Technology社,(East Hanover, NJ)からのものである。89時間後、細胞密度が12.4×106総細胞/mLに達した。この時点において、細胞の一部を採取し、細胞を5分間300gにて遠心分離した。細胞沈殿物を以下の濃度まで新鮮な無血清培地に再懸濁した:
1.3×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
1.0×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
20×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
30×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
実施例1ではrAd5を使用した。しかしながら、異なるアデノウイルス抗原型が既知であり、異なる目的のために記載されている。かかる抗原型は、異なる性質を有するため、一つの抗原型に有用な処理が他の抗原型に必ずしも常に適切なものではない。これは特に産業規模の処理に関連し、一見小さい相違が経済的に非常に重要である可能性がある。例えば、ワクチンの使用の特に有利な一つの抗原型はAd35であり、本発明者らは以下の例においてrAd35の収率を改善して大量に得るための実現可能性を試験した。本例は、低い細胞密度におけるrAd35ベクターでの感染を、細胞をより高い細胞密度にて感染させた後述の例との比較として示す。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを1.5Lの体積および0.2から0.5×106生存細胞/mLの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。培地潅流を6.8×106総細胞/mLの細胞密度でATFシステムを使用して開始した。70時間後、細胞密度が36.8×106総細胞/mLまで達した。この時点にて、以下の感染を行った:
・振盪容器中の感染における細胞密度:
1.3×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
1.0×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
20×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
30×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
・8.7×106総細胞/mL(84%生存)における2Lバイオリアクター規模の感染
バイオリアクターの感染の1時間後、試料をバイオリアクターから回収し、2つの250mL振盪容器に30mL/振盪容器で移した。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを1.5Lの体積および0.2から0.5×106生存細胞/mLの細胞密度にて接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。ATF潅流処理を5.1×106総細胞/mLの細胞密度にて開始した。70時間後、細胞密度が25×106総細胞/mLまで達した。この時点で細胞の一部を採取した。細胞を5分間300gにて遠心分離し、細胞沈殿物を以下の濃度まで新鮮な無血清培地に再懸濁した :
1.3×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
10×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
20×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
30×106生存細胞/mL、30mL/振盪容器、2つの250mL振盪容器
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを0.25×106生存細胞/mLの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞を2Lバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。約3.7×106総細胞/mLの細胞密度を達成(接種後4日目)したとき、ATFシステムを開始した。67時間後、40.7×106総細胞/mLの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で2Lバイオリアクター内にて細胞密度12.7×106総細胞/mL(87%生存率、したがって11×106生存細胞/mL)まで希釈した。その後、2LのバイオリアクターをAd35.TB−Sで70VP/細胞のMOIにて感染させ、36℃、10%CO2、pH7.3rpmおよびDO40%にて培養した。ATFシステムを、感染後15時間、5つの容器容量/日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後1,2,3および4日目、2Lのバイオリアクターを細胞数およびAEX−HPLCによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、1mLの試料を100μLの10%トリトンX−100と混合し、37℃で30分間培養した。培養後、試料を2.42μLのベンゾナーゼ/MgCl2と混合し、その後培養を30分間37℃で行った。最後に、100μLの50%サッカロースを試料へ添加した。5分間2500gにて遠心分離した工程後、試料を−65℃未満の温度にてAEX−HPLCによる分析をするまで保存した。結果を表1に示す。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを0.59×106生存細胞/mLの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞を2Lバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。約2.9×106総細胞/mLの細胞密度を達成(接種後4日目)したとき、ATFシステムを開始した。潅流118時間後、29×106総細胞/mLの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で2Lバイオリアクター内にて細胞密度16.4×106総細胞/mL(82%生存率、したがって13.4×106生存細胞/mL)まで希釈した。その後、2LのバイオリアクターをAd35.TB−Sで70VP/細胞のMOIにて感染させ、36℃、pH7.3rpmおよびDO40%にて培養した。ATFシステムを、感染後15時間、2つの容器容量/日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後1,2および3日目、2Lのバイオリアクターを細胞数およびAEX−HPLCによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、1mLの試料を100μLの10%トリトンX−100と混合し、37℃にて30分間培養した。培養後、試料を2.42μLのベンゾナーゼ/MgCl2と混合し、その後培養を30分間37℃で行った。最後に、100μLの50%サッカロースを試料へ添加した。5分間2500gにて遠心分離した工程後、試料を−65℃未満の温度にてAEX−HPLCによる分析をするまで保存した。結果を表2に示す。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを0.44×106総細胞/mLの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞を2Lバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。ATFシステムを接種後4日目に約2.72×106総細胞/mLの細胞密度にて開始した。潅流144時間後、30.5×106総細胞/mLの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で2Lバイオリアクター内にて細胞密度16.2×106総細胞/mL(81%生存率、したがって13.1×106生存細胞/mL)まで希釈した。その後、2LのバイオリアクターをAd35.TB−Sで70VP/細胞のMOIにて感染させ、36℃、pH7.3およびDO40%にて培養した。ATFシステムを、感染後5時間、2つの容器容量/日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後2,3および4日目、2Lのバイオリアクターを細胞数およびAEX−HPLCによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、1mLの試料を100μLの10%トリトンX−100と混合し、37℃にて30分間培養した。培養後、試料を2.42μLのベンゾナーゼ/MgCl2と混合し、その後培養を30分間37℃で行った。最後に、100μLの50%サッカロースを試料へ添加した。5分間2500gにて遠心分離した工程後、試料を−65℃未満の温度にてAEX−HPLCによる分析をするまで保存した。結果を表3に示す。
PER.C6(登録商標)作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて37℃、10%CO2で解凍し、増殖した。2Lバイオリアクターを0.52×106総細胞/mLの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を3から4日間ごとに行った。細胞を10Lのバイオリアクター内で37℃、DO40%およびpH7.3にて増殖した。約5.3×106総細胞/mLの細胞密度を達成(接種後4日目)したとき、ATFシステムを開始した。潅流169時間後、77×106総細胞/mLの細胞密度を達成した。この時点において、10Lの細胞懸濁液を新鮮な培地で50Lバイオリアクター内にて15.5×106総細胞/mL(81%生存率、それゆえ12.6×106生存細胞/mL)の細胞密度まで希釈した。その後、50LのバイオリアクターをAd35.TB−Sで70VP/細胞のMOIにて感染させ、36℃、pH7.3および40%DOにて培養した。ATFシステムを、感染後5時間、2つの容器容量/日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後2から3日目、50Lのバイオリアクターを細胞数およびAEX−HPLCによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、1mLの試料を100μLの10%トリトンX−100と混合し、37℃にて30分間培養した。培養後、試料を2.42μLのベンゾナーゼ/MgCl2と混合し、その後培養を30分間37℃で行った。最後に、100μLの50%サッカロースを試料へ添加した。5分間2500gにて遠心分離した工程後、試料を−65℃未満の温度にてAEX−HPLCによる分析をするまで保存した。結果を表4に示した。
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Claims (9)
- 組み換えアデノウイルス抗原型35(rAd35)を産生するに当たり、
(a)PER.C6細胞(ECACC受託番号96022940)を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、
(b)前記細胞を密度10×106生存細胞/mLから16×106生存細胞/mLの間の密度にてrAd35で感染させる工程と、
(c)感染細胞を潅流システムでさらに培養して前記rAd35を増殖させ、rAd35ウイルス粒子が少なくとも1×1012VP/mLとなるようにする工程と、
(d)前記rAd35を採取する工程と
を備えることを特徴とする方法。 - 前記工程b)における細胞をrAd35で10×106から14×106生存細胞/mLの間の密度において感染させる請求項1に記載の方法。
- 前記工程c)における潅流システムが、交互接線流(ATF)潅流システムである請求項1又は請求項2に記載の方法。
- e)rAdを精製する工程をさらに備える請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- f)精製されたrAd35を含有する医薬品組成物を調製する工程をさらに備える請求項4に記載の方法。
- 前記組み換えアデノウイルスが、E1領域の少なくとも一部を欠如し、異種核酸を含有する請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程a)における潅流システムが、交互接線流(ATF)潅流システムである請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程a)を第一のバイオリアクター内にて行い、前記工程b)およびc)を第二のバイオリアクター内にて行う請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記産生rAd35の物理的粒子に対する感染性粒子(VP/IU)の比率が30:1未満である請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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