BR112020004143A2 - método para a indução segura de imunidade contra vírus sincicial respiratório (rsv) - Google Patents

Abstract

  A presente invenção refere-se a métodos para induzir uma resposta imune segura contra o vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito humano em sua necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO

PARA A INDUÇÃO SEGURA DE IMUNIDADE CONTRA VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (RSV)". Campo da Invenção

[0001] A invenção refere-se a métodos para induzir com segurança imunidade eficaz contra RSV. Em particular, a invenção se refere a vetores de expressão do serotipo 26 de adenovírus que expressam a proteína F de RSV, proporcionando a indução segura de imunidade contra múltiplas cepas de RSV em sujeitos humanos. Antecedentes da Invenção

[0002] O vírus sincicial respiratório (RSV, do inglês "respiratory syncytial virus") é um patógeno de crianças altamente contagioso do trato respiratório que se crê ser responsável por ~200.000 mortes de crianças anualmente. Em crianças com menos de 2 anos de idade, o RSV é responsável por aproximadamente 50% das hospitalizações devido a infecções respiratórias, com um pico de hospitalização ocorrendo aos 2-4 meses de idade. Foi relatado que quase todas as crianças terão sido infectadas com o RSV pelos dois anos de idade, e infecção repetida durante a vida é atribuída a baixa imunidade natural. Nos idosos, a carga da doença de RSV é similar àquelas causadas por infecções pela gripe A não pandêmica.

[0003] O RSV é um paramixovírus, pertencente à subfamília pneumovirinae. O seu genoma codifica várias proteínas, incluindo as proteínas membranares conhecidas como Glicoproteína (G) de RSV e proteína de fusão (F) de RSV que são os principais alvos antigênicos para anticorpos neutralizantes.

[0004] Ao contrário da proteína G de RSV, a proteína F é conservada entre as cepas de RSV; o que a torna em um candidato a vacina atraente capaz de induzir anticorpos amplamente neutralizantes.

A proteína F é uma proteína transmembranar e é incorporada na membrana do viríon a partir da membrana celular durante a gemulação do vírus. A proteína F de RSV facilita a infecção por fusão das membranas virais e das células de hospedeiro. No processo de fusão, a proteína F sofre redobramento irreversivelmente de uma conformação pré-fusão lábil para uma conformação pós-fusão estável. O precursor proteico, F0, requer clivagem durante a maturação intracelular por uma protease do tipo furina. Existem dois sítios de furina, clivagem dos quais resulta na remoção de um peptídeo p27 e a formação de dois domínios: um domínio N-terminal F2 e um domínio C-terminal F1 (Figura 1). Os domínios F2 e F1 são conectados por duas pontes de cistina. Os anticorpos contra a proteína de fusão podem prevenir a captação de vírus na célula e ter assim um efeito neutralizante. Além de ser um alvo para anticorpos neutralizantes, a RSV F contém epítopos de células T citotóxicos (Pemberton et al, 1987, J. Gen.Virol. 68: 2177-2182).

[0005] Apesar de 50 anos de pesquisa, ainda não há vacina licenciada contra o RSV. Um grande obstáculo para o desenvolvimento da vacina é o legado do agravamento da doença com a vacina em um ensaio clínico na década de 1960 com uma vacina de RSV inativada por formalina (FI). As crianças vacinadas com FI-RSV não estavam protegidas contra a infecção natural e as crianças infectadas tiveram uma doença mais grave do que as crianças não vacinadas, incluindo duas mortes. Este fenômeno é referido como "agravamento da doença".

[0006] Desde o ensaio com a vacina FI-RSV, várias abordagens para gerar uma vacina RSV foram prosseguidas. As tentativas incluem cepas mutantes clássicas do RSV vivas atenuadas por frio ou sensíveis à temperatura, vacinas de subunidade de proteína (quimérica), vacinas de peptídeo e proteínas de RSV expressas a partir de vetores virais recombinantes, incluindo vetores adenovirais. Embora algumas dessas vacinas mostrem dados pré-clínicos promissores, nenhuma vacina foi licenciada para uso humano devido a preocupações de segurança ou falta de eficácia.

[0007] Os anticorpos neutralizantes de RSV mais potentes se ligam a um sítio específico (sítio zero) na proteína F de RSV, que só é exposto quando a proteína RSV está em sua conformação de pré- fusão, o que torna essa conformação específica muito atraente como antígeno de vacina. No entanto, a proteína F na sua conformação pré- fusão é muito instável e rapidamente sofre uma grande mudança conformacional para a conformação pós-fusão. Devido à sua instabilidade, a conformação pré-fusão tem, portanto, uma propensão a se dobrar prematuramente na conformação estável pós-fusão. Este fenômeno é uma característica intrínseca da proteína tanto na solução quanto na superfície dos vírions.

[0008] Candidatos a vacinas baseados na proteína F do RSV falharam devido a problemas, por exemplo, com a estabilidade, pureza, reprodutibilidade e potência. De fato, apesar de muitos esforços para produzir uma vacina contra RSV que contenha formas de pré-fusão da proteína F de RSV, não foram descritos polipeptídeos de F de RSV de pré-fusão estáveis que foram testados em seres humanos.

[0009] Portanto, ainda existe a necessidade de vacinas e métodos seguros e eficazes de vacinação contra o RSV. A presente invenção visa proporcionar tais métodos para a vacinação contra o RSV de um modo seguro. Sumário da Invenção

[0010] De acordo com a presente invenção, foi demonstrado pela primeira vez que adenovetores recombinantes que expressam a proteína F do RSV estabilizada na conformação de pré-fusão induzem uma resposta imune segura e eficaz (imunogênica) contra o RSV quando administrada a sujeitos humanos.

[0011] A invenção fornece, assim, um método para induzir uma resposta imune segura contra o vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito humano em sua necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv) de adenovírus.

[0012] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição de vacina compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de Fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv), para uso em um método de indução de uma resposta imune segura contra o vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito em sua necessidade.

[0013] Em certas modalidades da invenção, a dose total é de cerca de 5x1010 a cerca de 1x1011 partículas virais (pv) de adenovírus. Em certas modalidades, a dose é de cerca de 5x1010 ou cerca de 1x1011 pv de adenovírus. Breve descrição das Figuras

[0014] Figura 1: Representação esquemática da proteína de RSV F. Um precursor proteico inclui os domínios F2 e F1 e o peptídeo p27 que é removido das proteínas maduras por clivagem com proteases do tipo furina. Os sítios de clivagem são indicados por setas. Os números no topo das caixas indicam posições de aminoácidos na proteína de comprimento total, excluindo o peptídeo sinal. Em F1, os elementos estruturais são mostrados: peptídeo de fusão (FP), região de redobramento 1 (RR1) incluindo a repetição em héptade A (HRA) e região de redobramento 2 (RR2) incluindo a repetição em héptade B (HRB).

[0015] Figura 2: Expressão relativa de superfície de variantes de proteína F. Variantes de comprimento total da proteína F foram expressas em células HEK293T. As células foram coradas com anticorpo anti-RSV F (CR9503) e analisadas por citometria de fluxo (FACS). Os valores de Intensidade de Fluorescência Média (MFI, do inglês "Mean Fluorescent Intensity") foram calculados e normalizados para MFI da amostra de células transfectadas de tipo selvagem F (Fwt) de controle. A MFI de Fwt foi definida para 1. As barras representam valores médios, barras de erro representam o intervalo de valores.

[0016] Figura 3: Fração da proteína F pré-fusão na superfície celular. Variantes de comprimento total da proteína F foram expressas em células HEK293T. As células foram coradas com o anticorpo CR9503 anti-RSV F e anticorpo CR9501 anti-pré-fusão RSV F e analisadas por Citometria de Fluxo. Os valores da Intensidade de Fluorescência Média (MFI) foram calculados e a MFI medida por CR9501 foi normalizada para MFI medida por CR9503. Os valores de MFI normalizados indicam fração do pre-F na superfície celular. As barras representam valores médios, barras de erro representam o intervalo de valores.

[0017] Figura 4: Expressão relativa de superfície de variantes de proteína F. Versões solúveis com a região transmembranar e a região citoplasmática suprimida (FsI) e variantes de comprimento total da proteína F foram expressas em células HEK293T. O nível de expressão da proteína solúvel foi medido no sobrenadante da cultura por octeto e as variantes de comprimento total foram testadas através de coloração de células utilizando anticorpo anti-RSV F (CR9503) e analisadas por Citometria de Fluxo. Os valores de Intensidade de Fluorescência Média (MFI, do inglês "Mean Fluorescent Intensity") foram calculados e normalizados para MFI da amostra de células transfectadas de tipo selvagem F (Fwt) de controle. A MFI de Fwt foi definida para 1. As barras representam valores médios, barras de erro representam o intervalo de valores.

[0018] Figura 5: Estabilidade da temperatura das variantes da proteína F. Variantes de comprimento total da proteína F foram expressas em células HEK293T. Após o choque térmico, as células foram coradas com anticorpo anti-RSV F (CR9501 - linhas sólidas e CR9503 - linhas tracejadas) e analisadas por citometria de fluxo. A percentagem de células positivas para a coloração foi determinada. Os símbolos representam valores médios, barras de erro representam o intervalo de valores. (A) A percentagem de células positivas para a coloração foi determinada. Os valores de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) foram calculados e normalizados para MFI da amostra de células 37C. A MFI da amostra a 37°C foi definida para 1. As linhas pontilhadas correspondem à coloração de fundo a 60°C.

[0019] Figura 6: Estabilidade das proteínas F. PreF é mais estável que a proteína FA2 na conformação de pré-fusão na superfície celular no ensaio de estresse de calor. Células A549 foram infectadas com Ad26 e Ad35 compreendendo a inserção FA2 (pb de RSV F em peso, barras cinzentas) ou inserção FA2 (wt RSV F, barras cinzentas) ou inserção estabilizada pré-fusão F (preF2.2, barras pretas) em MOI indicada. As células foram tratadas à temperatura na temperatura indicada durante 15 minutos antes da coloração. Topo: percentagem de células apresentando pré-fusão F na sua superfície (detectada pelo anticorpo CR9501); fundo: percentagem de células apresentando qualquer forma da proteína F, pré-fusão e pós-fusão (detectada pelo anticorpo CR9503). Os valores foram normalizados para amostras a 37°C. Todas as barras representam uma única medida.

[0020] Figura 7: Ad26.RSV.preF2.1 e F2.2 induzem uma resposta imune celular após administração única em camundongos. As barras horizontais representam a média geométrica da resposta dentro de um grupo. O nível de fundo é calculado como o percentil de 95% das unidades formadoras de manchas (SFU, do inglês "spot forming units") observadas em esplenócitos não estimulados, e é indicado com uma linha pontilhada.

[0021] Figura 8: Ad26.RSV.preF2.1 e F2.2 induzem anticorpos neutralizantes de vírus aumentados quando comparados com Ad26.RSV.FA2, após imunização única em camundongos. Camundongos Balb/c (n = 4 por grupo) foram imunizados com a dose indicada de 108 a 1010 partículas virais (pv) Ad26.RSV.FA2 ou Ad26.RSV.preF2.1 ou Ad26.RSV.preF2.2, ou com tampão de formulação e as respostas imunes humorais foram ensaiadas no soro isolado 8 semanas após a imunização. (A) Anticorpos neutralizadores de vírus foram determinados contra RSV A Long usando um ensaio de micro-neutralização com uma leitura baseada em ELISA. Os títulos são dados como o valor log2 do CI50. (B) Os títulos de anticorpos F pré- fusão ou pós-fusão foram determinados por ELISA e a razão entre os anticorpos F pré- e pós-fusão para todas as amostras que apresentaram títulos F pré- e pós-fusão acima do limite inferior de quantificação (LLoQ) foi calculada. (C) ELISA de subclasse foi realizada utilizando RSV F A2 pós-fusão como reagente de revestimento, e a razão de IgG2a/IgG1 (log10) é representada graficamente. As razões observadas para amostras de referência Th1 (soro derivado de animais imunizados com vetores de expressão Adenoviral de RSV F) e Th2 (soro derivado de animais imunizados com FI-RSV) são indicadas com linhas tracejadas. O LLoQ é indicado com linhas pontilhadas (painéis A) e as barras horizontais representam as respostas médias por grupo.

[0022] Figura 9: Ad26.RSV.preF2.2 induz respostas de anticorpos que neutralizam uma ampla gama de isolados de RSV. Soros de camundongos Balb/c que foram imunizados com 1010 partículas virais (pv) Ad26.RSV.FA2 (n = 3) ou Ad26.RSV.preF (n = 4) ou tampão de formulação (n = 2) foram utilizados em ensaios de neutralização de vírus (ensaio de micro-neutralização com uma leitura baseada em ELISA) com as cepas de RSV A (painéis superiores) e B (painéis inferiores) indicadas. Os títulos são dados como o valor log2 de CI50 e as barras horizontais representam a resposta média por grupo. O LLoQ é indicado com uma linha tracejada.

[0023] Figura 10: A imunização única com Ad26.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.preF2.2 em doses baixas protege os ratos do algodão contra a provocação com o RSV A2 homólogo. Ratos do algodão (Sigmodon hispidus) (n = 7 a 9 por grupo) foram imunizados com as doses indicadas (em pv/animal) de Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2 (painéis da esquerda), Ad35.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.FA2 (painéis da direita) por administração intramuscular única. As imunizações de controle foram realizadas com tampão de formulação, FI-RSV ou aplicação intranasal de uma dose baixa de RSV A2. Às sete semanas após a imunização, os animais foram provocados por via intranasal com 105 pfu de RSV A2. Os títulos virais no pulmão (A-B) e no nariz (C-D) foram determinados por ensaio de placa 5 dias após a provocação. (E- F) Os soros tomados imediatamente antes da provocação foram utilizados para realizar um ensaio de neutralização do vírus com a cepa RSV A Long (ensaio de micro-neutralização com uma leitura baseada em ELISA). A linha pontilhada representa o nível mais baixo de quantificação (LLoQ). Barras horizontais representam o título médio por grupo.

[0024] Figura 11: A imunização de Ad26.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.preF2.2 de ratos do algodão não resulta em pontuações aumentadas de alveolite após a provocação com RSV A2. Ratos do algodão (Sigmodon hispidus) (n = 7 a 9 por grupo) foram imunizados com as doses indicadas (em pv/animal) de Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2 (painel superior), Ad35.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.FA2 (painel inferior) por administração intramuscular única. As imunizações de controle foram realizadas com tampão de formulação, FI-RSV ou aplicação intranasal de uma dose baixa de RSV A2. Às sete semanas após a imunização, os animais foram provocados por via intranasal com 105 pfu de RSV A2. A alveolite foi avaliada pelo exame histopatológico de um lobo pulmonar 5 dias após a provocação, em uma escala não linear de 0 a 4. A linha pontilhada horizontal marca a pontuação máxima dos animais de controle que foram pré-expostos ao RSV-A2 antes da provocação para imitar uma exposição natural ao RSV que não conduz a ERD. Descrição Detalhada da Invenção

[0025] Embora o vírus sincicial respiratório (RSV) infete as pessoas ao longo da vida, a maioria das pessoas não consegue ter uma resposta imune protetora duradoura. Além disso, em idosos, a resposta imune em declínio contribui para o aumento da suscetibilidade a doenças graves após a infecção pelo RSV, causando morbidade e mortalidade significativa. Existem indicações na literatura de que tanto o anticorpo neutralizante quanto a proteção mediada por células T desempenham um papel na prevenção da infecção por RSV. Portanto, acredita-se que uma vacina bem-sucedida contra o RSV, em particular para idosos, deve aumentar os níveis de anticorpos neutralizantes potentes e induzir uma resposta robusta das células T.

[0026] A infecção por RSV induz anticorpos específicos para o vírus que são principalmente direcionados contra a proteína de fusão (F). Os anticorpos neutralizantes de RSV mais potentes encontrados no soro humano se ligam a um sítio específico (sítio ɸ ou sítio zero) na proteína F de RSV, que só é exposto quando a proteína RSV está em sua conformação de pré-fusão, o que torna essa conformação específica muito atraente como antígeno de vacina. No entanto, a proteína F na sua conformação pré-fusão é muito instável e rapidamente sofre uma grande mudança conformacional para a conformação pós-fusão.

[0027] Na investigação que levou à presente invenção, uma proteína F de RSV estabilizada foi preparada com um conjunto único de mutações de aminoácidos em comparação com o antígeno F RSV do tipo selvagem da cepa A2 de RSV (Genbank ACO83301.1). Ao demonstrar a ligação específica in vitro a anticorpos específicos de pré- fusão, foi demonstrado que de fato foi obtido um antígeno F RSV estabilizado na conformação de pré-fusão.

[0028] De acordo com a presente invenção, foi agora demonstrado que a proteína F de RSV estabilizada mantém sua conformação pré- fusão in vivo, é imunogênica e pode ser administrada com segurança a sujeitos humanos em sua necessidade.

[0029] Assim, de acordo com a presente invenção, são fornecidos métodos para induzir uma resposta imune segura contra o RSV em um sujeito humano em sua necessidade, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv) de adenovírus.

[0030] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição de vacina compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de Fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv), para uso em um método de indução de uma resposta imune segura contra o vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito em sua necessidade.

[0031] Em certas modalidades da invenção, a composição compreende um adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de Fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 5x1010 a cerca de 1x1011 partículas virais (pv) de adenovírus.

[0032] Em certas modalidades, a dose é de cerca de 5x10 10 ou cerca de 1x1011 pv de adenovírus.

[0033] De acordo com a presente invenção, foi demonstrado que o adenovírus que codifica a proteína F de RSV na conformação de pré- fusão (em particular a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1) é altamente imunogênico. As respostas imunes humorais são aumentadas em comparação a doses semelhantes de adenovírus que codificam a proteína F do RSV do tipo selvagem, que não é estabilizada na conformação pré-fusão e provavelmente transita rapidamente para a conformação pós-fusão após a expressão.

[0034] Em certas modalidades, a resposta imune compreende a indução de anticorpos direcionados contra a proteína F de RSV. Assim, de acordo com certas modalidades, a resposta imune compreende a indução de anticorpos que se ligam especificamente à proteína F do RSV, conforme medido em um ELISA.

[0035] Em certas modalidades, a resposta imune compreende a indução de anticorpos neutralizantes de RSV. Em certas modalidades, os anticorpos neutralizantes são capazes de neutralizar as cepas de A e B de RSV. Em certas modalidades, a resposta imune compreende a indução de anticorpos capazes de neutralizar as cepas A e B de RSV em um ensaio de VNA.

[0036] Como aqui utilizado, a "indução de anticorpos" significa que o nível de anticorpos medido após a administração da composição compreendendo adenovírus recombinantes que expressam a proteína

F de RSV de SEQ ID Nº: 1 é superior ao nível de anticorpos antes da administração da referida composição.

[0037] Em certas modalidades, a resposta imune compreende a indução de anticorpos específicos para a proteína F de RSV na conformação pré-fusão e anticorpos específicos para a proteína F de RSV na conformação pós-fusão, em que o aumento do título médio geométrico (GMT) de anticorpos específicos para proteína F de RSV na conformação pré-fusão é maior que o aumento GMT de anticorpos específicos para proteína F de RSV na conformação pós-fusão, em ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA). Os métodos da presente invenção resultam assim em um aumento maior de anticorpos que se ligam especificamente à proteína F de RSV na conformação pré-fusão, em comparação com anticorpos que se ligam especificamente à proteína F de RSV na conformação pós-fusão. Sem desejar estar vinculado a uma teoria específica, acredita-se que isso resulte em uma resposta imune mais efetiva, pois acredita-se que os anticorpos específicos da pré-fusão sejam mais efetivos na neutralização do vírus RSV e, portanto, mais efetivos na prevenção da infecção pelo RSV (Gilman MS, Castellanos CA, Chen M, Ngwuta JO, Goodwin E, Moin SM, Mas V, Melero JA, Wright PF, Graham BS, McLellan JS, Walker LM. Sci Immunol. 2016 Dec 16;1(6). pii: eaaj1879. doi: 10.1126/sciimmunol.aaj1879. Epub 9 de Dez de 2016. Rapid profiling of RSV antibody repertoires from the memory B cells of naturally infected adult donors). Em certas modalidades, a razão entre o aumento GMT de anticorpos específicos F pós-fusão conforme medido em ELISA e o aumento médio do título geométrico de anticorpos neutralizantes conforme medido em um ensaio VNA, é reduzida após a administração da referida composição em comparação com a referida razão antes da administração da referida composição. Os métodos da presente invenção resultam assim em uma composição mais favorável da resposta humoral específica do RSV que favorece a neutralização de anticorpos sobre anticorpos de ligação.

[0038] Em certas modalidades, a resposta imune compreende ainda uma resposta celular conforme indicada pelas células T produtoras de IFNgama, conforme medida em um ELISPOT IFNy em resposta à estimulação com um conjunto de peptídeos que cobrem a proteína F de SEQ ID Nº: 1 e/ou pela medição de subconjuntos de células T CD4 e CD8 que expressam IFNγ, IL-2 e TNFα por coloração intracelular (ICS) após estimulação com um conjunto de peptídeos que cobrem a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1. Foi sugerido que células T específicas para RSV podem apoiar a prevenção de infecção e limitar a doença; isso pode ser especialmente benéfico para os adultos mais velhos, uma vez que foi descrito que a resposta celular pode diminuir com a idade (Openshaw PJM, Chiu C, Culley FJ, Johansson C.Annu Rev Immunol. 26 de Abril de 2017;35:501-532. doi: 10.1146/annurev- immunol-051116-052206. Epub 6 de Fev de 2017. Protective and Harmful Immunity to RSV Infection.)

[0039] Ao induzir uma resposta imune segura e imunogênica, os métodos da presente invenção podem ser usados para prevenir doença grave do trato respiratório inferior conducente a hospitalização e para reduzir a frequência de complicações como pneumonia e bronquiolite devido a infecção por RSV e replicação em um sujeito.

[0040] Como aqui utilizado, os termos ácido nucleico, molécula de ácido nucleico, ácido nucleico ou sequência nucleotídica e polinucleotídeo são utilizados indistintamente e todos se referem aos biopolímeros lineares (cadeias) feitos a partir de nucleotídeos, incluindo DNA ou RNA. Será entendido por um perito que numerosas moléculas de ácido nucleico diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo como resultando da degenerescência do código genético. Também é entendido que peritos, usando técnicas de rotina, podem fazer substituições de nucleotídeos que não afetem a sequência polipeptídica codificada pelos polinucleotídeos aí descritos para refletir o uso de códons de qualquer organismo hospedeiro particular onde é pretendido expressar os polipeptídeos. Portanto, a não ser que de outro modo especificado, uma "molécula de ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. Sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons. As sequências aqui em questão são fornecidas na direção de 5' para 3', como é costume na área técnica.

[0041] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codificam a proteína F pré-fusão do RSV é otimizada para os códons para a expressão em células de mamíferos, tais como células humanas. Métodos de otimização de códons são conhecidos e foram descritos previamente (por exemplo, WO 96/09378). Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico codificando a proteína F pré- fusão do RSV compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 2. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a proteína F do RSV consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 2.

[0042] De acordo com a invenção, o sujeito em necessidade é um sujeito humano. De preferência, o sujeito é um sujeito idoso, isto é, um ser humano com 60 anos ou mais. De acordo com a presente invenção, foi demonstrado que a administração de adenovírus recombinantes compreendendo ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV na conformação pré-fusão é segura e imunogênica, ou seja, resulta em uma resposta humoral e celular potente, também em sujeitos mais velhos que podem ter um sistema imunológico enfraquecido.

[0043] Em certas modalidades, o adenovírus recombinante (também referido como vetor adenoviral) é um adenovírus recombinante humano. A preparação de vetores adenovirais recombinantes é bem conhecida na técnica. O termo "recombinante" para um adenovírus, tal como aqui usado, implica que tenha sido modificado através do manuseamento do homem, por exemplo, extremidades alteradas do terminal, ativamente nele clonadas e/ou que compreende um gene heterólogo, ou seja, não é um adenovírus do tipo selvagem que ocorre naturalmente.

[0044] Em certas modalidades, um adenovírus recombinante, de acordo com a invenção, é deficiente em, pelo menos, uma função de gene essencial da região E1, por exemplo, a região E1a e/ou a região E1b, do genoma adenoviral que é necessária para a replicação viral. Em certas modalidades, o adenovírus de acordo com a invenção é deficiente em, pelo menos, parte da região E3 não essencial. Em determinadas modalidades, o adenovírus é deficiente em pelo menos uma função de gene essencial da região E1 e pelo menos parte da região E3 não essencial. O vetor adenoviral pode ser "múltiplo deficiente", o que significa que o vetor adenoviral é deficiente em uma ou mais funções de genes essenciais em cada uma de duas ou mais regiões do genoma adenoviral. Por exemplo, os vetores adenovirais, acima mencionados, deficiente em E1 ou deficiente em E1 e E3, podem ser adicionalmente deficientes em, pelo menos, um gene essencial da região E4 e/ou, pelo menos, um gene essencial da região E2 (por exemplo, a região E2A e/ou região E2B).

[0045] Em certas modalidades, o adenovírus é um adenovírus humano do serotipo 26 ou 35. As vacinas, de acordo com a invenção, com base nesses serotipos aparecem mais potentes do que as descritas na técnica anterior que foram baseadas em Ad5, desde que aqueles não conseguiram proporcionar uma proteção completa contra a provocação de replicação de RSV após uma única administração intramuscular (Kim et al, 2010, Vaccine 28: 3801-3808; Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610; Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375). O serotipo da invenção ainda, geralmente, tem baixa capacidade de seroprevalência e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes preexistentes na população humana. Os vetores adenovirais recombinantes desses serotipos com diferentes transgenes são avaliados em ensaios clínicos e, até o momento, mostram um excelente perfil de segurança. A preparação de vetores rAd26 é descrita em, por exemplo, WO 2007/104792 e em Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Exemplos de sequências do genoma de Ad26 são encontrados em GenBank com o acesso EF 153474 e na SEQ ID Nº: 1 do documento WO 2007/104792. A preparação de vetores rAd35 é descrita, por exemplo, nas patentes US Nº. 7.270.811, WO 00/70071 e em Vogel et al, (2003) J Virol 77 (15): 8263-71. Exemplos de sequências do genoma de Ad35 são encontrados em GenBank com o acesso AC_000019 e na Figura 6 de WO 00/70071.

[0046] Um adenovírus recombinante de acordo com a invenção pode ser competente para replicação ou deficiente para replicação. Em certas modalidades, o adenovírus é de replicação deficiente, por exemplo, porque contém uma deleção na região E1 do genoma. Tal como é conhecido pelo perito, em caso de deleções de regiões essenciais do genoma do adenovírus, as funções codificadas por essas regiões têm de ser fornecidas em trans, de preferência, pela célula produtora, ou seja, quando uma parte ou a totalidade de regiões de E1, E2 e/ou E4 são excluídas do adenovírus, estas têm de estar presentes na célula produtora, por exemplo integradas no genoma da mesma, ou sob a forma dos chamados adenovírus auxiliares ou plasmídeos auxiliares. O adenovírus também pode ter uma deleção na região E3, que é dispensável para replicação, e, desse modo essa deleção não tem de ser complementada.

[0047] Para adenovírus deficientes em E1 não do subgrupo C, tais como Ad35 (subgrupo B) ou Ad26 (subgrupo D), prefere-se trocar a sequência de codificação de E4-orf6 destes adenovírus não do subgrupo C com o E4-orf6 de um adenovírus de subgrupo C, tal como Ad5. Tal permite a propagação destes adenovírus em linhagens de células complementares, bem conhecidas, que expressam os genes E1 de Ad5, como, por exemplo, células 293 ou células PER.C6 (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 03/104467, incorporado na sua totalidade neste documento por referência). Em certas modalidades, um adenovírus que pode ser utilizado é um adenovírus humano do serotipo 35, com uma deleção na região E1, na qual o ácido nucleico que codifica o antígeno da proteína F de RSV foi clonado e com uma região E4 orf6 de Ad5. Em certas modalidades, o adenovírus na composição de vacina da invenção é um adenovírus humano do serotipo 26, com uma deleção na região E1, na qual o ácido nucleico que codifica o antígeno da proteína F de RSV foi clonado, e com uma região E4 orf6 de Ad5.

[0048] Em modalidades alternativas, não há necessidade para colocar uma região heteróloga de E4orf6 (por exemplo, de Ad5) no vetor adenoviral, mas em vez disso o vetor não do subgrupo C deficiente em E1 é propagado numa linhagem celular que expressa ambos E1 e um E4orf6 compatível, por exemplo, a linhagem celular 293-ORF6 que expressa tanto E1 e E4orf6 de Ad5 (ver, por exemplo, Brough et al, 1996, J Virol 70: 6497-501 descrevendo a geração de células 293- ORF6; Abrahamsen et al, 1997, J Virol 71: 8946-51 e Nan et al, 2003, Gene Therapy 10: 326-36, descrevendo a geração de vetores adenovirais do não subgrupo C com E1 suprimido).

[0049] Alternativamente, pode ser utilizada uma célula complementar que expressa E1 a partir do serotipo que deve para ser propagado (ver, por exemplo o documento WO 00/70071, WO 02/40665).

[0050] Para os adenovírus do subgrupo B, tais como o Ad35, contendo uma deleção na região E1, é preferido manter a extremidade 3' da fase de leitura aberta de E1B 55K no adenovírus, por exemplo, 166 pb, diretamente a montante da fase de leitura aberta pIX ou um fragmento que compreende este como um fragmento de 243 pb diretamente a montante do códon de iniciação pIX (marcado na extremidade 5' por um sítio de restrição Bsu36I no genoma Ad35), uma vez que isso aumenta a estabilidade do adenovírus, porque o promotor do gene pIX é, em parte, residente nessa área (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 2004/001032, aqui incorporado como referência).

[0051] O ácido nucleico codifica a proteína F do RSV de SEQ ID Nº: 1 pode ser introduzido no adenovírus, por exemplo, por técnicas padrão de biologia molecular. Pode, por exemplo, ser clonado numa região E1 ou E3 eliminada de um vetor adenoviral. O ácido nucleico (ou transgene) está, geralmente, operacionalmente ligado a sequências de controle da expressão. Tal pode, por exemplo, ser realizado através da colocação do ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV sob o controle de um promotor. Podem ser adicionadas outras sequências regulatórias. Muitos promotores podem ser usados para a expressão de um transgene(s) e são conhecidos pelo perito na técnica. Um exemplo não limitativo de um promotor adequado para a obtenção de expressão em células eucarióticas é um promotor de CMV (US 5.385.839), por exemplo, o promotor precoce imediato do CMV, por exemplo, que compreende nt. -735 a +95 potenciador/promotor do gene precoce imediato do CMV. Um sinal de poliadenilação, por exemplo, o sinal poliAa da hormona de crescimento bovino (US 5.122.458), pode estar presente atrás do transgene(s).

[0052] Em certas modalidades, os adenovetores recombinantes da invenção compreendem como nucleotídeos no terminal 5’ a sequência nucleotídica: CTATCTAT. Estas modalidades são vantajosas porque tais vetores exibem uma melhor replicação em processos de geração, o que resulta em lotes de adenovírus com homogeneidade melhorada, em comparação com vetores possuindo as originais sequências no terminal 5' (geralmente CATCATCA) (ver também a publicação PCT Nº WO 2013/135615 e patente US Nº 8,932,607), incorporadas aqui na sua totalidade por referência.

[0053] Em certas modalidades, as composições compreendendo o adenovírus recombinante pode ainda compreender, ou são administradas em conjunto com, um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são conhecidos na área por aumentar ainda mais a resposta imunitária a um determinante antigênico aplicado, e composições farmacêuticas compreendendo adenovírus e adjuvantes adequados são, por exemplo, divulgadas no documento WO 2007/110409, aqui incorporado como referência. Os termos "adjuvante" e "estimulante imune" são aqui utilizados indistintamente, e são definidos como uma ou mais substâncias que provocam a estimulação do sistema imunológico. Neste contexto, um adjuvante é usado para intensificar uma resposta imune às proteínas F pré-fusão de RSV da invenção. Exemplos de adjuvantes adequados incluem sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio; composições de emulsão em óleo (ou composições óleo-em-água), incluindo emulsões de esqualeno-água, tais como MF59 (ver, por exemplo, WO 90/14837); formulações de saponina, tais como por exemplo QS21 e Complexos Imunoestimulantes (ISCOMS) (ver, por exemplo, US 5.057.540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620);

derivados bacterianos ou microbianos, exemplos dos quais são lípido A de monofosforila (MPL), MPL 3-O-deacilado (3dMPL), oligonucleotídeos contendo motivo CpG, toxinas bacterianas ADP-ribosilantes ou seus mutantes, tais como enterotoxina lábil ao calor LT de E. coli, toxina CT da cólera e semelhantes. Também é possível a utilização de adjuvante codificante do vetor, por exemplo, através de ácido nucleico heterólogo que codifica para uma fusão do domínio de oligomerização da proteína de ligação a C4 (C4bp) com o antígeno de interesse (por exemplo, Solabomi et al, 2008, Infect Immun 76: 3817-23). Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem alumínio como adjuvante, por exemplo, sob a forma de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de alumínio e potássio, ou suas combinações, em concentrações de 0,05 - 5 mg, por exemplo, 0,075- 1,0 mg de teor de alumínio por dose.

[0054] A administração de composições pode ser realizada utilizando as vias normais de administração. Modalidades não limitantes incluem a administração parentérica, tal como por injeção, por exemplo, intradérmica, intramuscular, etc, ou por via subcutânea ou transcutânea, ou administração na mucosa, por exemplo, intranasal, por via oral, e outros semelhantes. A administração intranasal tem sido, geralmente, vista como uma via preferida para vacinas contra o RSV. A vantagem mais importante da estratégia intrasal viva é a estimulação direta da imunidade do trato respiratório local e a falta de aumento da doença associada. A administração intranasal é também uma via preferida adequada, de acordo com a presente invenção. A vantagem da administração intramuscular é que é simples e bem estabelecida. Em uma modalidade da invenção, a composição é administrada por injeção intramuscular, por exemplo, no músculo deltoide do braço, ou músculo vasto lateral da coxa. O perito conhece as várias possibilidades para administrar uma composição,

por exemplo, uma vacina, de modo a induzir uma resposta imunitária ao(s) antígeno(s) na vacina.

[0055] Os adenovírus recombinantes podem ser preparados e propagados em células hospedeiras, de acordo com métodos bem conhecidos, que envolvem cultura celular das células hospedeiras que estão infectadas com o adenovírus. A cultura de células pode ser qualquer tipo de cultura de células, incluindo cultura de células aderentes, por exemplo, células ligadas à superfície de um recipiente de cultura ou a microveículoes, bem como cultura em suspensão.

[0056] A maioria das culturas em suspensão em grande escala são operadas como processos descontínuos ou descontínuos alimentados, porque são os mais simples de operar e ampliar de escala. Hoje em dia, os processos contínuos com base em princípios de perfusão são cada vez mais comuns e são também adequados (ver, por exemplo, WO 2010/060719 e WO 2011/098592, ambos aqui incorporados como referência, que descrevem métodos adequados para a obtenção e purificação de grandes quantidades de adenovírus recombinantes).

[0057] As células produtoras são cultivadas para aumentar o número de células e de vírus e/ou títulos de vírus. A cultura de uma célula é realizada para permitir que metabolize e/ou cresça e/ou divida- se e/ou produza vírus de interesse, de acordo com a invenção. Tal pode ser realizado através de métodos, tais como os bem conhecidos por peritos na técnica e inclui, mas não está limitado a, o fornecimento de nutrientes para as células, por exemplo, no meio de cultura apropriado. Os meios de cultura adequados são bem conhecidos para o perito na técnica e podem ser geralmente obtidos a partir de fontes comerciais, em grandes quantidades, ou realizados de acordo com os protocolos normalizados. A cultura pode ser feita, por exemplo, em placas, frascos rotativos ou em biorreatores, usando sistemas descontínuos, descontínuos alimentados, contínuos e semelhantes. São conhecidas as condições apropriadas para a cultura de células (por exemplo, ver Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Paterson, editores (1973), e RI Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, quarta edição (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

[0058] Uma célula produtora (por vezes também referida na área e aqui como "célula de empacotamento" ou "célula complementar" ou "célula hospedeira"), que pode ser utilizada, pode ser qualquer célula produtora, em que um adenovírus desejado pode ser propagado. Por exemplo, a propagação de vetores de adenovírus recombinantes é realizada em células produtoras que complementam deficiências no adenovírus. Tais células produtoras, de preferência, têm no seu genoma, pelo menos, uma sequência E1 de adenovírus e, assim, são capazes de complementar adenovírus recombinantes com uma deleção na região E1. Qualquer célula produtora complementar de E1 pode ser utilizada, tal como as células da retina humanas imortalizadas por E1, por exemplo, células 911 ou PER.C6 (ver patente US 5,994,128), amniócitos transformados com E1 (ver a patente EP 1230354), células A549 transformadas com E1 (ver, por exemplo, WO 98/39411, patente US 5.891.690), GH329:HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293 e semelhantes. Em certas modalidades, as células produtoras são, por exemplo, células HEK293 ou células PER.C6 ou células 911 ou células IT293SF e semelhantes.

[0059] Tipicamente, o adenovírus será exposto à adequada célula produtora numa cultura, o que permite a captação do vírus. Habitualmente, a agitação ótima é entre cerca de 50 e 300 rpm, tipicamente cerca de 100-200, por exemplo, cerca de 150, DO típico é de 20-60%, por exemplo, 40%, o pH ótimo situa-se entre 6,7 e 7,7, a temperatura ótima é entre 30 e 39°C, por exemplo 34-37°C, e MOI ótima é entre 5 e 1000, por exemplo, cerca de 50-300. Tipicamente, o adenovírus infeta espontaneamente as células produtoras e colocando as células produtoras em contato com partículas rAd é suficiente para a infecção das células. Geralmente, um estoque de adenovírus é adicionado à cultura para iniciar a infecção e, subsequentemente, o adenovírus propaga-se nas células produtoras. Tal é tudo rotina para o perito na técnica.

[0060] Após a infecção de um adenovírus, o vírus replica-se dentro da célula e, assim é amplificado, um processo aqui referido como a propagação de adenovírus. A infecção de adenovírus resulta, finalmente, na lise das células que são infectadas. As características líticas dos adenovírus permitem assim dois modos diferentes de geração de vírus. O primeiro modo é a colheita do vírus antes da lise celular, empregando fatores externos para lisar as células. O segundo modo é a colheita do sobrenadante do vírus após (quase) completa lise celular com o vírus produzido (ver, por exemplo, patente US 6.485.958, que descreve a colheita de adenovírus sem lise das células hospedeiras por um fator externo). Prefere-se empregar os fatores externos para ativamente lisar as células para a colheita do adenovírus.

[0061] Os métodos que podem ser utilizados para a lise celular ativa são conhecidos pelo perito na técnica, e foram discutidos, por exemplo, em WO 98/22588, p. 28-35. Os métodos úteis neste contexto são, por exemplo, congelamento-descongelamento, cisalhamento contínuo, lise hipertônica e/ou hipotônica, cisalhamento líquido, sonificação, extrusão a alta pressão, lise com detergente, combinações dos anteriores, e similares. Em uma modalidade da invenção, as células são lisadas utilizando pelo menos um detergente. A utilização de um detergente para a lise tem a vantagem de que se trata de um método fácil e que é facilmente escalável.

[0062] Os detergentes que podem ser utilizados e a forma como são utilizados, são geralmente conhecidos pelo perito na técnica. Vários exemplos são, por exemplo, discutidos em WO 98/22588, p. 29-33. Os detergentes podem incluir tensoativos aniônicos, catiônicos, zwitteriônicos e detergentes não iônicos. A concentração do detergente pode ser variada, por exemplo, dentro do intervalo de cerca de 0,1 % - 5% (p/p). Em uma modalidade, o detergente utilizado é o Triton X-100.

[0063] A nuclease pode ser empregue para remover contaminantes, ou seja, principalmente a partir da célula produtora, os ácidos nucleicos. Exemplos de nucleases adequadas para utilização na presente invenção incluem Benzonase®, Pulmozyme®, ou qualquer outra de DNase e/ou RNase comummente utilizada na área. Em modalidades preferidas, a nuclease é Benzonase®, que hidrolisa rapidamente ácidos nucleicos através da hidrólise de ligações fosfodiéster internas entre nucleótidos específicos, reduzindo, assim, a viscosidade do lisado celular. Benzonase® pode ser obtida comercialmente da Merck KGaA (código W214950). A concentração em que é empregue a nuclease é, de preferência dentro da gama de 1-100 Unidades/mL. Alternativamente, ou em adição ao tratamento com nucleases, também é possível precipitar seletivamente DNA da célula hospedeira a partir de preparações de adenovírus, durante a purificação de adenovírus, por meio de agentes precipitantes seletivos, tais como o brometo de domifeno (ver, por exemplo, US 7.326.555; Goerke et al., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12-21; WO 2011/045378; WO 2011/045381).

[0064] Os métodos para a colheita de adenovírus a partir de culturas de células produtoras foram extensivamente descritos em WO 2005/080556.

[0065] Em certas modalidades, o adenovírus colhido é sujeito a uma purificação adicional. A purificação do adenovírus pode ser realizada em vários passos, compreendendo a clarificação, ultrafiltração, diafiltração ou separação por cromatografia, tal como descrito em, por exemplo, WO 05/080556, aqui incorporada como referência. A clarificação pode ser realizada através de um passo de filtração, a remoção de detritos celulares e outras impurezas a partir do lisado celular. A ultrafiltração é utilizada para concentrar a solução de vírus. A diafiltração, ou troca de tampão, usando ultrafiltros é uma forma de remoção e troca de sais, açúcares e afins. O perito na técnica sabe encontrar as condições ótimas para cada etapa de purificação. Também WO 98/22588, incorporado na sua totalidade como referência, descreve métodos para a geração e purificação de vetores adenovirais. Os métodos compreendem o crescimento de células hospedeiras, infecção das células hospedeiras com adenovírus, a colheita e lise das células hospedeiras, concentração do lisado em bruto, troca do tampão do lisado em bruto, tratamento do lisado com nucleases e purificação adicional do vírus, utilizando cromatografia.

[0066] De preferência, a purificação emprega pelo menos um passo de cromatografia, como, por exemplo, discutido em WO 98/22588, p. 61-70. Muitos processos foram descritos para a purificação adicional de adenovírus, em que os passos de cromatografia são incluídos no processo. O perito na técnica estará ciente desses processos e pode variar a forma exata de utilização dos passos cromatográficos para otimizar o processo. É, por exemplo, possível purificar adenovírus por passos de cromatografia de permuta aniônica, ver, por exemplo, WO 2005/080556 e Konz et al, 2005, Hum Gene Ther 16: 1346-1353. Muitos outros métodos de purificação de adenovírus já foram descritos e estão dentro do alcance do perito na técnica. Outros métodos para a geração e purificação de adenovírus são descritos por exemplo em (WO 00/32754; WO 04/020971; US 5.837.520; US 6.261.823; WO 2006/108707; Konz et al, 2008, Methods Mol Biol 434: 13-23; Altaras et al, 2005, Adv Biochem Eng Biotechnol 99: 193-260), todos aqui incorporados como referência.

[0067] Para a administração a seres humanos, a invenção pode empregar composições farmacêuticas que compreendem o adenovírus recombinante e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

No presente contexto, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o veículo ou excipiente, às dosagens e concentrações empregues, não irá causar quaisquer efeitos indesejados ou nocivos nos sujeitos aos quais é administrado.

Tais veículoes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A.

R.

Gennaro, Editor, Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S.

Frokjaer e L.

Hovgaard, Editores, Taylor & Francis [2000]; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª edição, A.

Kibbe, Editor, Pharmaceutical Press [2000]). O adenovírus recombinante purificado é, de preferência, formulado e administrado como uma solução estéril, embora seja também possível utilizar preparações liofilizadas.

As soluções estéreis são preparadas por filtração estéril ou por outros métodos conhecidos per se na técnica.

As soluções são, então, liofilizadas ou preenchidas em recipientes de dosagem farmacêutica.

O pH da solução está, geralmente, na gama de pH 3,0 a 9,5, por exemplo pH 5,0 a 7,5. O adenovetor recombinante encontra-se tipicamente numa solução possuindo um tampão farmaceuticamente aceitável adequado.

A solução também pode conter um sal.

Opcionalmente, o agente de estabilização pode estar presente, tal como a albumina.

Em certas modalidades, detergente é adicionado.

Em certas modalidades, a o adenovírus recombinante pode ser formulado em uma preparação injetável.

Estas formulações contêm quantidades eficazes de adenovírus, sendo soluções estéreis líquidas, suspensões líquidas ou versões liofilizadas e, opcionalmente, contêm estabilizantes ou excipientes.

Uma vacina de adenovírus também pode ser transformada em aerossol para administração intranasal (ver, por exemplo, WO 2009/117134).

[0068] Por exemplo, o adenovírus pode ser armazenado num tampão, que é também utilizado no padrão mundial de adenovírus (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing março 2002, p. 43-48): 20 mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2,5% glicerol. Outra formulação útil de tampão adequada para administração a seres humanos é Tris 20 mM, MgCl 2 2 mM, NaCl 25 mM, sacarose a 10% p/v, polisorbato-80 a 0,02% p/v. Obviamente, muitos outros tampões podem ser usadose vários exemplos de formulações adequadas para o armazenamento e para a administração farmacêutica de preparações purificadas (adeno)vírus, podem, por exemplo, ser encontrados na patente europeia Nº 0853660, patente US

6.225.289 e nos pedidos de patentes internacionais WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763, WO 03/078592, WO 03/061708.

[0069] Em certas modalidades da invenção, é utilizada uma formulação de adenovírus como descrito em WO2015/040002. Assim, em uma modalidade preferida, a composição compreendendo o vetor de adenovírus compreendendo um ácido nucleico que codifica a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1 compreende além do adenovírus recombinante; um tampão citrato, em que a concentração de citrato varia entre cerca de 5 mM e 30 mM; hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD), em que a concentração de HBCD varia entre cerca de 1% (p/p) e 10% (p/p); um sal, por exemplo cloreto de sódio em uma concentração entre cerca de 20 mM e cerca de 200 mM; e detergente não iônico, por exemplo, Polissorbato-80 em uma concentração variando de cerca de 0,005% (p/p) a cerca de 0,5% (p/p); em que a referida formulação tem um pH variando entre 5,5 e 6,5.

[0070] Em certas modalidades, as composições têm um pH variando entre cerca de 5,7 e 6,3, e compreendem citrato a uma concentração variando entre cerca de 5 e 30 mM; HBCD a uma concentração variando entre 1% (p/p) e 10% (p/p); NaCl a uma concentração variando entre 20 mM e 200 mM; Polissorbato-80 a uma concentração variando entre cerca de 0,01% (p/p) e 0,05% (p/p).

[0071] Em certas modalidades, as composições compreendem citrato em uma concentração de cerca de 15 mM; HBCD a uma concentração de cerca de 5% (p/p); NaCl a uma concentração de cerca de 75 mM; e Polissorbato-80 a uma concentração de cerca de 0,03% (p/p).

[0072] Em certas modalidades, as composições compreendem ainda etanol, em que a concentração de etanol varia entre cerca de 0,1% (p/p) e 1% (p/p).

[0073] Em uma modalidade preferida, as composições compreendem citrato em uma concentração de cerca de 15 mM; HBCD a uma concentração de cerca de 5% (p/p); NaCl a uma concentração de cerca de 75 mM, Polissorbato-80 a uma concentração de cerca de 0,03% (p/p) e etanol a uma concentração de cerca de 0,4% (p/p).

[0074] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS Exemplo 1. Estabilizando a proteína F de RSV na sua conformação pré- fusão

[0075] Os plasmídeos que codificam sequências de F de RSV básicas foram sintetizados e as substituições de aminoácidos foram introduzidas na proteína por mutagênese dirigida ao sítio. As variantes proteicas foram transitoriamente expressas em células HEK293. A expressão relativa da proteína na superfície celular foi avaliada por citometria de fluxo. A estabilidade das proteínas F na conformação pré- fusão foi avaliada num ensaio de estabilidade ao calor.

[0076] A sequência de proteína utilizada para variantes de proteínas F A2 de RSV foi recuperado a partir do GenBank, número de acesso

ACO83301.1. As substituições de aminoácidos foram introduzidas na sequência por mutagênese dirigida ao sítio (Kit de mutagênese dirigida ao sítio QuikChange II XL, Agilent technologies). Os iniciadores de mutagênese foram projetados usando a ferramenta on-line PrimerX. As células HEK293T (CRL-11268) foram adquiridas na American Tissue Culture Collection e cultivadas sob condições convencionais de cultura celular (37°C, 10% de CO2).

[0077] Os anticorpos CR9501 e CR9503 de proteína F anti-RSV IgG1 totalmente humanos foram construídos por clonagem das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (VL) num único vetor de expressão de IgG1. As células PER.C6® (Crucell) foram transfectadas com as construções de expressão de IgG1 e os anticorpos expressos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura utilizando cromatografia POROS Mabcapture A (Applied Biosystems) e, em seguida, o tampão foi trocado para 50 mM de NaAc, 50 mM de NaCl, pH 5,5. A concentração de anticorpo foi medida por absorção ótica a 280 nm. A qualidade do anticorpo também foi confirmada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC, do inglês "size-exclusion chromatography"), SDS-PAGE e focalização isoelétrica. O anticorpo CR9501 compreende regiões VH e VL de 58C5 (como descrito em WO2011/020079) que se liga especificamente à proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão e não na conformação pós-fusão. CR9503 compreende as regiões VH e VL do motavizumab, que reconhece tanto a conformação pré-fusão quanto a pós-fusão de F de RSV. Expressão de proteínas e tratamento de temperatura:

[0078] Os plasmídeos foram transfectados transientemente em células HEK293T aderentes, utilizando reagentes de transfecção 293fectina (Cat# 12347-019) (Life Technologies) de acordo com as recomendações dos fornecedores. 48 horas após a transfecção, as células foram colhidas destacando-as com tampão FACS contendo

EDTA (sem tripsina, ver a próxima seção) e suspensão de células foi tratada termicamente durante 10 minutos, quer num banho de água ou em bloco de PCR para as experiências de estabilidade de temperatura. Após o tratamento térmico, as células foram preparadas para a análise de citometria de fluxo.

[0079] Para a análise de proteínas F expressas em adeno, células A549 foram infectadas com vírus Ad26 em uma MOI de 10.000 ou 5.000 e vírus Ad35 em uma MOI de 5.000, 2.500 ou 1.250. Após 48 h, as células foram separadas e tratadas termicamente durante 15 minutos a 37°C, 50°C e 56°C. Após o tratamento térmico, as células foram coradas utilizando CR9501-Alexa647 ou CR9503-Alexa647 e Iodeto de Propídio (PI). Após a coloração, as células foram fixadas e analisadas utilizando o analisador de células BD FACS CANTO II. Análise de Citometria de Fluxo:

[0080] Para cada coloração, os seguintes controles foram incluídos: 1) amostra de controle negativo, ou seja, células que não foram submetidas a qualquer tratamento e não coraram com qualquer anticorpo marcado com um fluoróforo; 2) amostras de controle positivo, isto é, células que são coradas com apenas um fluoróforo (um de cada um que é utilizado para a experiência).

[0081] As células foram ressuspensas na citometria de fluxo (tampão FC, 5 mM de EDTA, 1% de FBS em PBS) e distribuídas em volumes de 50 µL da suspensão celular por poço numa placa de 96 poços com uma tampa (fundo em U ou V). Protocolos de dois passos ou de um passo foram usados para coloração.

[0082] No caso do protocolo de dois passos, 50 µL do primeiro Abs (ou tampão para controles negativos) foram adicionados aos poços e incubados à TA durante 30 min. Utilizaram-se CR9501 e CR9503 biotinilados a 2 µg/mL (concentração final num poço de 1 µg/mL). Após incubação, as células foram lavadas duas vezes com o tampão FC.

Depois 50 µL de estreptavidina-APC (Sondas Moleculares cat#SA1005, 0,1 mg/mL são utilizados a 1:100) ou foi adicionado tampão para os controles negativos aos poços e incubados à TA durante 30 min. As células foram lavadas novamente duas vezes com o tampão FC. Após a última lavagem, as células foram ressuspensas em 100 µL de tampão FC +/- mancha vivo-morto (PI de Invitrogen, cat#P1304MP, utilizado a 2 µg/mL) e incubou-se à TA durante 15 minutos. As células foram centrifugadas a 200 g (1000 rpm) durante 5 min., o tampão com PI foi removido e as células foram ressuspensas em 150 µL do tampão FC.

[0083] No caso de um protocolo de um passo, os anticorpos CR9501 e CR9503 foram marcados com a sonda fluorescente Alexa647 (Sondas Moleculares, cat#A-20186) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram coradas de acordo com o protocolo acima, excluindo o passo de estreptavidina-APC.

[0084] A partir da população de células vivas, determinou-se a percentagem de células positivas para a ligação do anticorpo CR9501/CR9503. As células positivas para a ligação de CR9503 expressam a proteína F de RSV na sua superfície. As células positivas para ligação a CR9501 expressam F pré-fusão de RVS na sua superfície.

[0085] A intensidade da coloração do anticorpo (intensidade média de fluorescência - MFI) é proporcional à quantidade de proteína F na superfície celular. A MFI foi calculada a partir da população de células vivas que expressam a proteína F. Resultados: Expressão de células superficiais das variantes de proteína F completas:

[0086] Um subconjunto de mutações que foi previamente identificado para aumentar a expressão ou estabilidade do ectodomínio da proteína F de RSV na conformação pré-fusão, foi introduzido na sequência de F A2 de RSV de comprimento total do tipo selvagem (número de acesso Genbank ACO83301). As mutações foram introduzidas sozinhas ou em múltiplas combinações, e o efeito na expressão e estabilidade da proteína foi avaliado.

[0087] O nível de expressão da proteína foi medido como intensidade média de fluorescência (MFI) por citometria de fluxo após coloração com o anticorpo CR9503 que reconhece a proteína F pré- fusão e pós-fusão. A combinação das duas substituições de aminoácidos que foram previamente descritas para estabilização da proteína pré-F de RSV solúvel (ou seja, N67I e S215P) também aumentou o nível de expressão da proteína F de RSV de comprimento total em 2,3 vezes, em relação ao tipo selvagem de F de RVS de comprimento total (Figura 2).

[0088] Um aumento proeminente na expressão foi observado para variantes com 3 substituições de aminoácidos combinadas. Curiosamente, a combinação de mais de três mutações em uma variante não aumentou mais a expressão da proteína. Isto pode ser devido à capacidade limitada da membrana celular para acomodar múltiplas cópias de proteína F.

[0089] A quantidade de F pré-fusão na superfície da célula foi avaliada por coloração com anticorpo CR9501 específico de pré-fusão (Figura 3). A transfecção das células com todas as variantes de F resultou em uma quantidade mais ou menos semelhante de proteína F pré-fusão na superfície da célula. A presença do domínio transmembranar estabiliza a proteína de comprimento total até certo ponto e, portanto, as diferenças na estabilidade pré-fusão não são tão aparentes sob as condições ambientais entre as proteínas F completas. Portanto, o ensaio de estabilidade ao calor foi desenvolvido para melhor discriminar a estabilidade de variantes de comprimento total, como descrito abaixo.

[0090] A cepa A2 que foi utilizada como uma sequência parental para as variantes de proteína F previamente descritas (WO2014/174018 e WO2014/202570) é uma cepa laboratorial adaptada à linhagem celular que acumulou duas mutações únicas e raras (ou seja, de Lisina 66 e Isoleucina 76). Na presente invenção, estes dois resíduos foram mutados para coincidir com os isolados clínicos naturais (K66E, I76V). As mutações K66E e I76V foram incluídas em desenhos de proteína selecionados. Em comparação com variantes com Lys66 e Ile76, as variantes com glutamato a 66 (K66E) têm uma tendência para expressar um pouco mais elevada. A adição de valina no resíduo 76 (uma substituição dupla de K66E e I76V) não influencia o nível de expressão quando comparado com variantes apenas com substituição de K66E (Figura 4). Estabilidade das variantes de proteína F de comprimentos total na superfície celular:

[0091] Em condições ambientais em uma escala de tempo curto, nenhuma diferença significativa na estabilidade da conformação pré- fusão foi observada entre variantes F de comprimento total com as diferentes combinações de mutações estabilizadoras. Uma temperatura elevada é conhecida por eficientemente desencadear in vitro o redobramento da proteína F de RSV a partir da conformação de pré- fusão para a conformação de pós-fusão. Portanto, um ensaio de choque térmico foi estabelecido e usado para avaliar a estabilidade das proteínas de comprimento total ligadas à membrana. Logo, as células HEK293T foram transfectadas com os construtos de proteína F e utilizadas para o ensaio de 48 horas após a transfecção. As células foram separadas das placas de cultura de células e a suspensão de células foi tratada termicamente a temperaturas crescentes durante 10 minutos. Após o tratamento térmico, as células foram coradas com os anticorpos de F anti-RSV e analisadas por citometria de fluxo. Os dados da Citometria de Fluxo foram analisados de duas maneiras diferentes. A percentagem das células, positivas para coloração com os anticorpos anti-F foi analisada e também foi calculada a intensidade média de fluoresccia (MFI) das células positivas (Figura 5).

[0092] Tanto a coloração com CR9501 (anticorpo que reconhece apenas a proteína F pré-fusão) e com CR9503 (anticorpo que reconhece a proteína F pré- e pós-fusão) foram utilizadas nos ensaios de Citometria de Fluxo. O anticorpo CR9503 serviu como um controle positivo. No caso em que a proteína F perde a conformação pré-fusão, mas ainda está na superfície da célula, a proteína ainda é detectada com o anticorpo CR9503. A perda de coloração com ambos os anticorpos indica que a proteína não está disponível na superfície celular para a ligação do anticorpo, por exemplo, devido à agregação.

[0093] Proteínas de comprimento total com três ou mais substituições de aminoácidos foram testadas no ensaio e comparadas com F de RSV de tipo selvagem. A expressão destas variantes foi a mais alta e, portanto, estas variantes foram os candidatos preferidos. Todas as proteínas continham as substituições N67I e S215P, e uma ou duas mutações estabilizadoras extras foram adicionadas.

[0094] A proteína do tipo selvagem não modificada tinha uma coloração bastante estável com o anticorpo CR9503. A MFI da coloração com CR9503 foi elevada a temperaturas mais elevadas, no entanto, a distribuição de valores também foi muito elevada. Isso indicou que nenhuma agregação de proteínas ocorreu após o choque térmico. Metade da conformação pré-fusão foi perdida após incubação das células a aproximadamente 55 °C, após incubação a 60 °C toda a conformação pré-fusão foi perdida, como foi demonstrado pela diminuição da ligação de CR9501 às amostras F de tipo selvagem após choque térmico em temperaturas crescentes.

[0095] Todas as variantes de proteína F pré-fusão testadas foram mais estáveis do que F de RSV de tipo selvagem, sendo a maioria da coloração com CR9501 também mantida após tratamento a temperaturas mais elevadas (Figura 5 e 6). Proteínas com substituição de aminoácidos K498R foram menos estáveis que as restantes. A adição da mutação K66E estabilizou ainda mais as proteínas, uma vez que também as variantes com a substituição de aminoácidos K498R se tornaram tão estáveis como outras e não se observou perda de conformação pré-fusão a 60°C. Apenas combinações selecionadas das mutações estabilizadoras foram testadas com K66E e I76V combinadas. Todas as quatro proteínas testadas foram estáveis quando a percentagem de células positivas foi analisada, porém quando MFI foi analisada, a variante com K498R mostrou clara redução na ligação de CR9501 após tratamento com 60°C, indicando que esta variante é menos estável quando avaliada no ensaio de estresse de temperatura.

[0096] Em conclusão, uma combinação de três mutações estabilizadoras (incluindo N67I e S215P) foi considerada suficiente para elevado nível de expressão e estabilidade. As mutações D486N foram selecionadas como uma terceira mutação estabilizadora devido à sua posição na estrutura da proteína. K66E e I76V foram incluídas por não terem efeito negativo na expressão e estabilidade da proteína, mas tornaram a sequência mais próxima das que ocorrem naturalmente.

[0097] A proteína F pré-fusão de RSV com as mutações K66E, N67I, I76V, S215P e D486N (F2.2) (SEQ ID Nº: 1) foi selecionada para a construção de vetores adenovirais. Esta proteína se mostrou estável na conformação pré-fusão no ensaio de estabilidade de temperatura até 60°C, e pode ser expressa a elevados níveis. Exemplo 2. Preparação de vetores adenovirais Clonagem do gene de RSV F na região E1 de Ad35 e Ad26:

[0098] As sequências de ácido nucleico, codificando para as proteínas F pré-fusão da invenção, foram optimizadas para o gene para expressão humana e sintetizadas pela Geneart. Uma sequência Kozak (5' GCCACC 3') foi incluída diretamente em frente do códon de iniciação ATG, e foram adicionados dois códons de terminação (5' TGA TAA 3') no final da sequência codificante de RSV.pre-F. Os genes de RSV.pre- F foram inseridos no plasmídeo pAdApt35BSU e no plasmídeo pAdApt26 através sítios HindIII e XbaI. Cultura celular:

[0099] Células PER.C6 (Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-1917) foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro fetal bovino (FBS) a 10%, suplementado com MgCl 2 a 10 mM. Geração de Adenovírus, infecções e passagens:

[0100] Todos os adenovírus foram gerados em células PER.C6® por recombinação homóloga única e produzidos como anteriormente descrito (para rAd35: Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; para rAd26: Abbink et al., 2007, J. Virol. 81: 4654-4663). Resumidamente, as células PER.C6 foram transfectadas com plasmídeos vetor Ad, usando Lipofectamina de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Life Technologies). Para resgate de, por exemplo, vetores Ad35 contendo a cassete de expressão de transgenes RSV.pre-F, foram utilizados o plasmídeo pAdApt35BSU.RSV.pre-F e o cosmídeo pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6, enquanto para os vetores Ad26 contendo a cassete de expressão do transgene RSV.pre-F, foram utilizados o plasmídeo pAdApt26.RSV.pre- F e cosmídeo pWE.Ad26.dE3.5orf6. As células foram colhidas um dia após CPE completo, congeladas-descongeladas, centrifugadas durante 5 min a 3000 rpm e armazenadas a 20°C. De seguida, os vírus foram purificados em placas e amplificados em PER.C6 cultivadas em um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços múltiplos. A amplificação adicional foi realizada em PER.C6 cultivadas usando um frasco de cultura de tecidos T25 e um frasco de cultura de tecidos T175. Do lisado bruto T175, foram utilizados 3 a 5 mL para inocular frascos de cultura de tecidos de três camadas 20×T175 contendo 70% de camadas confluentes de células PER.C6. O vírus foi purificado usando um método de dois passos de purificação de CsCl. Finalmente, o vírus foi armazenado em alíquotas a 85°C. Exemplo 3. Indução da imunidade contra F de RSV utilizando adenovírus recombinante dos serotipos 26 e 35 que expressam F pré- fusão de RSV in vivo.

[0101] A imunogenicidade de Ad26.RSV.preF2.1 e Ad26.RSV.preF.2.2 foi avaliada em camundongos, comparando respostas imunes celulares e humorais com respostas induzidas por doses idênticas de Ad26.RSV.FA2 (isto é, expressando a proteína F de RSV do tipo selvagem). Camundongos Balb/c (n = 4 por grupo) foram imunizados com a dose indicada de 108 a 1010 partículas virais (pv) Ad26.RSV.FA2 ou Ad26.RSV.preF2.1 ou Ad26.RSV.preF2.2, ou com tampão de formulação. Às 8 semanas aPós-Primário, o número de unidades formadoras de manchas (SFU) de F A2 de RSV específicas de IFNγ por 106 esplenócitos foi determinado utilizando ELISpot. Foi demonstrado que Ad26.RSV.preF2.1 e Ad26.RSV.preF.2.2 induziam respostas imunes humorais aumentadas em camundongos quando comparado com Ad26.RSV.FA2, com ampla capacidade de neutralização e respostas celulares mantidas. Uma única imunização intramuscular com Ad26.RSV.preF2.1 e Ad26.RSV.preF.2.2 provocou uma resposta celular (Figura 7) que foi caracterizada pela indução de células T CD8+ positivas para IFNγ, IL2 e/ou TNFα (dados não mostrados).

[0102] A quantidade e qualidade das respostas celulares foram comparáveis entre Ad26.RSV.preF2.1, Ad26.RSV.preF.2.2 e Ad26.RSV.FA2. Em contraste, Ad26.RSV.preF2.1 e Ad26.RSV.preF.2.2 induzem títulos de anticorpos neutralizantes de RSV significativamente mais elevados do que Ad26.RSV.FA2. Uma análise mais detalhada das respostas de anticorpos demonstrou que Ad26.RSV.preF2.1 e Ad26.RSV.preF.2.2 induziam níveis mais elevados de anticorpos contra F pré-fusão, enquanto os títulos de F pós-fusão permaneciam comparáveis a Ad26.RSV.FA2, resultando em razões de anticorpos preF/posF significativamente aumentados. Além disso, a relação IgG2a/IgG1 da resposta do anticorpo permaneceu inalterada, demonstrando uma distorção similar de Th1 da resposta humoral, como demonstrado anteriormente para Ad26.RSV.FA2 (Figura 8).

[0103] Para Ad26.RSV.preF2.2 foi, além disso, demonstrado que os anticorpos produzidos eram capazes de neutralizar várias cepas A e B de RSV, cepas laboratoriais bem como isolados clínicos, semelhantes aos observados para Ad26.RSV.FA2 (Figura 9).

[0104] Posteriormente, a eficácia e imunogenicidade dos construtos vetoriais Ad26.RSV.preF2.2 e Ad35.RSV.preF2.2 foram avaliadas no modelo do rato do algodão. Estes animais são permissivos à replicação de RSV humano, com pico de títulos de RSV nos pulmões nos dias 4 e

5. Os grupos de controle nas experiências incluíram grupos intranasalmente infectados com uma dose baixa de RSV A2, mimetizando assim a exposição natural, assim como grupos imunizados com FI-RSV, utilizando o lote 100 original que induziu doença respiratória aumentada (ERD) em estudos clínicos na diluição que foi mostrada para induzir ERD em ratos do algodão.

[0105] Imunização intramuscular única de animais com Ad26.RSV.preF2.2 em doses variando de 105 a 108 pv/animal, ou Ad35.RSV.preF2.2 em doses variando de 106 a 109 pv/animal resultou em proteção completa dos pulmões da infecção com a vacina homóloga da cepa A2 RSV, exceto para 3 animais imunizados com 105 pv Ad26.RSV.preF2.2 (Figura 10A e 10B). A proteção dependente de dose da replicação de RSV no nariz foi observada para ambos os vetores. Isso variou de proteção total a 108 pv/animal, a proteção parcial a 105 pv para Ad26.RSV.preF2.2, enquanto para Ad35.RSV.preF2.2, narizes de animais imunizados com 109 pv foram totalmente protegidos de A2 RSV, e 106 pv resultaram em proteção parcial (Figura 10C e 10D). Os narizes dos animais imunizados com Ad26.RSV.preF2.2 e Ad35.RSV.preF2.2 foram melhor protegidos da infecção por A2 RSV do que quando imunizados com as respectivas contrapartes F de tipo selvagem Ad26.RSV.FA2 e Ad35.RSV.FA2, quando analisadas ao longo da dose (p = 0,0003 e p = 0,0001). A proteção da infecção por RSV foi acompanhada por indução dependente da dose de títulos de neutralização de vírus contra RSV A Long, já que foi induzida pelas doses mais baixas de Ad26.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.preF2.2 aplicadas (Figura 10E e 10F). Comparações estatísticas entre doses de títulos de VNA A Long revelaram que Ad26.RSV.preF2.2 é mais imunogênico que Ad26.RSV.FA2 (p = 0,0414), enquanto que a elicitação de títulos de VNA não foi significativamente diferente entre Ad35.RSV.preF2.2 e Ad35.RSV.FA2.

[0106] Foi ainda demonstrado que Ad26.RSV.preF e Ad35.RSV.preF não induzem sinais histopatológicos de Doença Respiratória Aumentada (ERD, do inglês "Enhanced Respiratory Disease") aPós-Provocação com A2 RSV, em qualquer das concentrações testadas. O rato do algodão é o modelo mais utilizado e melhor estudado para monitorar a ERD. Neste modelo animal, a vacinação com FI-RSV induz consistentemente ERD aPós-Provocação com RSV, que é visível por análise histopatológica de seções dos pulmões infectados quanto a parâmetros como alvéolos, consistindo principalmente em infiltrados neutrófilos e peribronquiolite, consistindo principalmente em infiltrados linfocitários. Em ratos do algodão, as pontuações induzidas por FI-RSV para estes parâmetros podem ser observadas a partir do dia 1 após a infecção por RSV e atingem o pico em 4 a 5 dias após a provocação com RSV.

[0107] ERD foi analisada 5 dias após a provocação com A2 RSV, marcando 4 parâmetros de alterações inflamatórias pulmonares (peribronquiolite, perivasculite, pneumonia intersticial, alveolite). A imunização com FI-RSV resultou em pontuações melhoradas para a maioria dos marcadores histopatológicos, o que foi especialmente aparente para a alveolite (Figura 11), o marcador que foi anteriormente demonstrado ser o marcador mais discriminante para ERD. Nenhum aumento na alveolite ou qualquer outro marcador histopatológico de ERD foi observado em animais imunizados com Ad26.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.preF2.2 em regime de apenas primário após a provocação com RSV, mesmo em baixas doses de vacina que podem induzir baixa afinidade e/ou baixos níveis de anticorpos (Figura 11). Isso está confirmando nossos resultados anteriores com vetores Ad26.RSV.FA2 e Ad35.RSV.FA2.

[0108] De acordo com a invenção, mostrou-se assim que Ad26.RSV.preF2.2 e Ad35.RSV.preF2.2 são potentes vetores adenovirais que expressam F A2 de RSV que é estabilizada na conformação pré-fusão. Estes vetores induzem fortes respostas imunitárias humorais e celulares. A resposta imune provocada é protetora contra a provocação de A2 RSV e fornece uma ampla gama de neutralização de vírus in vitro contra isolados clínicos e laboratoriais de RSV. Nenhuma indução de ERD foi observada em ratos do algodão, após exposição a RSV de animais vacinados e, portanto, confirma os dados gerados com Ad26 e Ad35 codificando para o antígeno F A2 RSV de tipo selvagem. Nem os ratos do algodão nem camundongos mostraram sinais evidentes de reatogenicidade após a injeção de qualquer um de Ad26.RSV.preF2.2 ou Ad35.RSV.preF2.2.

Exemplo 4. Estudo de serotipos 26 de adenovírus recombinantes da vacina RSV que expressam F pré-fusão de RSV em humanos

[0109] Foi realizado um Estudo de Fase 1 Randomizado, Duplo- cego, Primeiro-no-Humano, para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade de duas vacinas de Ad26.RSV.preF, com um ano de intervalo, em adultos com 60 anos ou mais de saúde estável. Este estudo foi registrado no identificador clinictrials.gov como NCT02926430. Objetivos:

[0110] O objetivo principal do estudo incluiu avaliar a segurança e a tolerabilidade de 2 doses únicas de 5x1010 partículas virais [pv] ou 1x1011 pv de Ad26.RSV.preF, administradas por via intramuscular a adultos acima de 60 anos de idade. O objetivo secundário incluiu avaliar as respostas imunes humoral e celular como medidas pelo teste de neutralização do vírus (VNA), anticorpos de ligação à proteína F (ELISA pré-F e pós-F) e coloração intracelular de citocinas (ICS). Concepção do Estudo

[0111] Este é um estudo de Fase 1 de centro único, randomizado, controlado por placebo, duplo-cego, para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade de duas vacinações Ad26.RSV.preF, administradas com 1 ano de intervalo, em 72 sujeitos do sexo masculino e feminino com 60 anos e mais com saúde estável. Os sujeitos foram randomizados em paralelo em uma razão de 1:1:1:1:2 para 1 de 5 grupos para receber duas injeções intramusculares (IM) únicas da vacina em estudo com 12 meses de intervalo (Tabela 1). Resultados de Segurança:

[0112] Foi realizada uma análise provisória aos 28 dias após a primeira vacinação. Os sujeitos que receberam 5x1010 pv Ad26.RSV.preF no Dia 1 foram reunidos (grupo 1 e 2), o mesmo para os sujeitos que receberam 1x1011 pv Ad26.RSV.preF (grupo 3 e 4). A análise provisória primária após a primeira dose de todos os 72 sujeitos demonstra que esta vacina é bem tolerada em ambos os níveis de dose. A duração média dos eventos adversos solicitados (EA) variou de 1 a 3,5 dias. Não houve nenhum EA grave relacionado (EAG) com a vacina e nenhum EA resultou em abandono do estudo. Não houve diferença aparente na reatogenicidade entre as duas doses de vacina utilizadas. Os dados provisórios não revelaram um efeito da dose na segurança.

[0113] Em conclusão: os EA solicitados e não solicitados relatados após a vacinação foram leves na maioria dos sujeitos, de natureza transitória e resolvidos sem sequelas. Com base no exposto, concluiu- se que ambas as doses de Ad26.RSV.preF eram seguras e bem toleradas pelos participantes dos dois grupos de dosagem. Ensaios de Imunogenicidade ELISA Pré-F

[0114] Os níveis totais de IgG contra a conformação estabilizada pré-F (com base em RSV A2 F, Genbank ACO83301.1) foram avaliados. A proteína pré-F foi biotinilada e capturada sequencialmente por placas revestidas com estreptavidina em placas de microtitulação de 96 poços. As amostras de teste diluídas em série foram incubadas e anticorpos pré-F específicos foram detectados com anticorpos anti-IgG humanos conjugados com peroxidase de rábano, seguido por uma reação quimioluminescente. A IC50 foi relatada como o título de ligação. ELISA Pós-F

[0115] Foram avaliados os níveis totais de IgG contra a proteína pós-F (RSV A2 F, Genbank ACO83301.1). A proteína pós-F foi revestida em placas de microtitulação de 96 poços. As amostras de teste diluídas em série foram incubadas e anticorpos pós-F específicos foram detectados com anticorpos anti-IgG humanos conjugados com peroxidase de rábano, seguido por uma reação quimioluminescente. A IC50 foi relatada como o título de ligação.

Ensaio de neutralização da cepa A2 de RSV (A2-FFL) ou cepa B de RSV (A2-BAGdup-O36634.1F-FFL)

[0116] A funcionalidade das respostas de anticorpos induzidas pela vacina foi investigada pela determinação de anticorpos neutralizantes de vírus (VNA) em um ensaio de neutralização de vírus usando células A549 e vírus RSV A2 que expressa luciferase (Luc) (RSV A2 FFL ou RSV B FFL). Os anticorpos neutralizantes foram medidos nas células A549 como uma função da redução na expressão do gene repórter Luc do vagalume após uma única rodada de infecção com RSV A2-FFL (ou B Gdup-FFL). Uma quantidade fixa de RSV A2 FFL (ou B Gdup-FFL) foi misturada com uma amostra de soro clínico diluída em série. Após uma hora de incubação, células A549 foram adicionadas à mistura. A infecção ou inibição de RSV A2-FFL (ou B Gdup FFL) foi medida em 20- 21 horas pelo sistema de expressão do gene repórter Luc. IC50 foi relatada como o título de neutralização. ELISpot

[0117] PBMC congeladas foram analisadas por IFNγ ELISpot. As PBMC foram estimuladas com conjuntos de peptídeos correspondentes ao inserto da vacina proteica preF (SEQ ID Nº: 1). Foi reportado o número de PBMC estimuladas SFC/106, após a subtração de PBMC estimuladas. Respostas de células T CD4+ e CD8+ (ICS)

[0118] A indução ou reforço de subconjuntos de células T CD4 e CD8 que expressam IFNγ, IL-2 e TNFα foi determinada por ICS após estimulação com peptídeo de proteína F de RSV. As respostas totais de citocinas foram relatadas como a percentagem de células T CD4+ e CD8+ que produzem pelo menos IFNγ, IL-2 e/ou TNFα. Para o balanço Th1/Th2, foram relatadas as células CD4 que expressam IFNγ (Th1) ou IL-4 (Th2). As células T CD4+ ou CD8+ de resposta total (escala log10), expressando IFNγ, IL-2, TNFα como uma única citocina ou em qualquer combinação das mesmas, são adicionadas e relatadas.

Resultados de Imunogenicidade

[0119] A análise da imunogenicidade humoral incluiu os seguintes imunoensaios primários (objetivo secundário): VNA para a cepa A2 de RSV e ELISA de ligação à proteína F pré-fusão e pós-fusão. Além disso, foi realizado uma VNA para uma cepa B de RSV. A análise de imunogenicidade celular incluiu o ensaio IFNγ ELISPOT. Os resultados são mostrados nas Tabelas 2-7.

[0120] Como esperado, respostas humorais e celulares específicas de F de RSV foram detectadas em todos os sujeitos na linha de base (dia 1), refletindo uma historial de exposição natural ao RSV ao longo da vida (Tabelas 2-5).

[0121] A Tabela 2 inclui os resultados das respostas de VNA contra a cepa A2 do RSV, apresentadas nas estatísticas descritivas dos valores reais e do número de aumento na linha de base com o intervalo de confiança (CI) de 95% correspondente. O número de aumento do título médio geométrico (GMT) para anticorpos neutralizantes de RSV A2 após uma dose de Ad26.RSV.preF a 5x1010 ou 1x1011 pv foi de 2,5 e 3,2, respetivamente.

[0122] Os resultados das respostas de VNA contra a cepa B de RSV são mostrados na Tabela 3, que também inclui estatísticas descritivas dos valores reais e número de aumento da linha de base com o CI de 95% correspondente.

[0123] O número de aumento GMT para anticorpos neutralizantes de RSV B após uma dose de Ad26.RSV.preF a 5x1010 ou 1x1011 pv foi de 3,1 e 3,4, respetivamente. Assim, os anticorpos neutralizantes de RSV A2 e RSV B aumentaram após a vacinação no dia 28 pós vacinação. Ad26.RSV preF na dose de 1x1011 pv resultou em níveis mais altos de anticorpos neutralizantes em comparação com a dose de 5x1010 pv.

[0124] ELISA de ligação pré-F avaliou a ligação de anticorpos à conformação pré-fusão da proteína F de RSV, enquanto o ELISA de ligação pós-F avaliou a ligação de anticorpos à conformação pós-fusão da proteína F de RSV. As estatísticas descritivas dos valores reais e do número de aumento da linha de base com o CI correspondente a 95% dos resultados são apresentadas na Tabela 2 para as ambas as respostas de anticorpos de ligação a proteínas pré-F (ELISA) e respostas de anticorpos de ligação a proteínas pós-F (ELISA). O anticorpo de ligação a preF IgG total mostrou aumentos de GMT de 2,2 (5x1010 pv) e 2,9 (1x1011 pv), enquanto o anticorpo de ligação a IgG pósF total mostrou aumentos de GMT de 1,9 (5x1010 pv) ou 2,1 (1x1011 pv). Assim, tanto o nível de ligação de anticorpos à proteína F na conformação pré-fusão (anticorpos preF) quanto de anticorpos pósF aumentaram após uma dose da vacina. Os resultados de ELISA de ligação a preF seguiram o mesmo padrão que o ensaio VNA. Os níveis mais elevados de anticorpos de ligação a preF foram observados no grupo que recebeu Ad26.RSV.preF na dose de 1x1011 pv. Não foi observada resposta na dose na indução de anticorpos pósF utilizando a dose de 5x1010 pv ou 1x1011 pv de Ad26.RSV.preF.

[0125] As respostas de células T induzidas por Ad26.RSV.preF são medidas por IFNγ ELISpot, em que PBMC são reestimuladas com os peptídeos de proteína preF. As estatísticas descritivas dos valores reais da resposta das células T específicas de RSV-F (IFNγ) antes e após a vacinação são apresentadas na Tabela 4. As respostas celulares medianas nesses idosos, medidas por IFNγ ELISPOT, aumentaram de 103 e 95 na linha de base para 325 e 305 SFU/10 6 PBMC (5x1010 e 1x1011 pv, respetivamente). O total de células T CD4+ que respondem, expressando IFNγ, IL-2, TNFα como uma citocina única ou em qualquer combinação das mesmas, é adicionado e apresentado na Tabela 5. Foi observado um aumento na resposta das células T CD4+ aos 28 dias após a vacinação com A26.RSV.preF: a resposta mediana total de citocinas foi de 0,03% e 0,03% no dia 1 em comparação com 0,13% e 0,12% no dia 28 após a imunização (5x1010 e 1x1011 pv, respetivamente). O total de células T CD8+ que respondem, expressando IFNγ, IL-2, TNFα como uma citocina única ou em qualquer combinação das mesmas, também são apresentadas na Tabela 5, a resposta total mediana de citocinas foi de 0,07% e 0,04% no dia 1 em comparação com 0,15% e 0,06% no dia 28 após a imunização (5x1010 e 1x1011 pv, respetivamente).

[0126] Como mostrado na Tabela 6, a administração de Ad26.preF alterou a razão entre anticorpos que se ligam à F pré-fusão (anticorpos preF) e anticorpos que se ligam à F pós-fusão (anticorpos pósF). Um aumento médio geométrico na razão preF/pósF nos sujeitos vacinados com Ad26.preF foi observado de 1,5 e 1,2 na linha de base para 1,7 a 1,8 (5x1010 e 1x1011 pv, respetivamente). A administração de Ad26.RSV.preF favoreceu claramente um maior aumento de anticorpos de ligação a preF.

[0127] A razão média geométrica de preF/VNA nos sujeitos vacinados com Ad26.preF foi semelhante nos dois grupos (5x1010 e 1x1011 pv): 0,8 na linha de base e 0,7 aos 28 dias após a vacinação (Tabela 7), enquanto a razão média geométrica pósF/VNA nos sujeitos vacinados com Ad26.preF foi de 0,5 e 0,6 na linha de base e 0,4 e 0,4 (5x1010 e 1x1011 pv, respetivamente) no dia 29 (Tabela 8).

[0128] Em ensaios clínicos conduzidos anteriormente, VAC18192RSV1001 (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT02440035) e VAC18192RSV1003 (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT02561871) com o protótipo Ad26.RSV FA2 RSV que expressa o tipo selvagem de RSV F a partir de RSV A2, sujeitos saudáveis de 18 a 50 anos de idade receberam Ad26.RSV.FA2 na dose de 5x1010 pv. As respostas imunes humoral e celular aumentaram 28 dias após o recebimento de Ad26.RSV.FA2. O aumento da média geométrica para os anticorpos neutralizantes do RSV foi de 2,0 e 1,9 para RSV A2 e RSV B, respetivamente. O aumento médio do anticorpo de ligação IgG pósF total mostrou aumentos médios geométricos de 3,0 vezes, enquanto a média geométrica da ligação pré-IgG mostrou um aumento de 2,4 vezes. As respostas celulares medianas nesses sujeitos, medidas por IFNγ ELISPOT, aumentaram de 76 para 290 SFU/106 PBMC (dados não mostrados). Nestes ensaios clínicos com Ad26.RSV.FA2, não foi observado um aumento na razão preF/pósF. Mais impressionante, a razão da média geométrica de preF/pósF foi de 1,4 na linha de base e diminuiu para 1,1 aos 28 dias após a vacinação. A razão da média geométrica de preF/VNA foi de 0,6 na linha de base e 0,7 aos 28 dias após a vacinação; enquanto a razão da média geométrica pósF/VNA foi de 0,4 na linha de base e aumentou ligeiramente para 0,6 aos 28 dias após a vacinação (Tabelas 10-12).

[0129] Em conclusão, de acordo com a presente invenção, demonstrou-se que as respostas imunes humoral e celular aumentaram fortemente 28 dias após a primeira dose da vacina para ambos os níveis de dose de Ad26.RSV.preF (isto é, adenovírus recombinante que codifica a proteína F de RSV na conformação pré-fusão, em particular a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1). As respostas humorais mais elevadas foram observadas com a dose de 1x1011 pv, que é ainda segura. O aumento da resposta imune humoral foi preferencialmente direcionado contra os epítopos pré-F, como ilustrado por uma mudança na razão de anticorpos de ligação preF/pósF a partir da linha de base. Uma dose de Ad26.RSV.preF foi segura e bem tolerada neste estudo de fase 1 e aumentou as respostas humorais e celulares favoráveis em RSV com adultos mais velhos, mesmo com uma dose mais elevada de 1x1011 pv de adenovírus.

TABELA 1: Concepção do estudo

Grupo N Dia 1 Dia 𝟑𝟔𝟓𝒂

1 12 Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) Ad26.RSV.preF (5x1010 pv)

2 12 Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) Placebo

3 12 Ad26.RSV.preF (1x1011 pv) Ad26.RSV.preF (1x1011 pv)

4 12 Ad26.RSV.preF (1x1011 pv) Placebo

5 24 Placebo Placebo a Por razões operacionais, a segunda vacinação pode ocorrer entre 12 e 14 meses após a primeira vacinação

TABELA 2: Estatística Descritiva dos Ensaios de Imunogenicidade Humoral; Conjunto Completo de Análises

Ad26.RSV.preF (5x1010 Ad26.RSV.preF (1x1011 pv) pv) Placebo

Humoral: ELISA preF

Linha de Base 24 24 23

DIA 1

N 24 24 23

Média geométrica (95% CI) 334 (255;438) 407 (293;566) 269 (212;341)

Pós-dose 1 23 24 23

DIA 29

N 23 24 23

Média geométrica (95% CI) 709 (519;967) 1193 (897;1588) 255 (203;321)

Aumento da média geométrica 2,2 (1,7;2,8) 2,9 (2,2;3,9) 0,9 (0,9;1,0) (95% CI)

Humoral: ELISA pósF

Linha de Base 24 24 23

DIA 1

N 24 24 23

Média geométrica (95% CI) 219 (172;279) 326 (228;466) 174 (132;231)

Pós-dose 1 23 24 23

DIA 29

N 23 24 23

Média geométrica (95% CI) 407 (305;543) 680 (509;908) 170 (129;224)

Aumento da média geométrica 1,9 (1,5;2,3) 2,1 (1,8;2,4) 1,0 (0,9;1,0) (95% CI)

Humoral: Cepa A2 de RSV

Linha de Base 24 24 23

DIA 1

N 24 24 23

Média geométrica (95% CI) 432 (328;569) 512 (345;759) 402 (280;578)

Pós-dose 1 23 24 23

DIA 29

N 23 24 23

Média geométrica (95% CI) 1031 (839;1267) 1617 (1126;2323) 431 (299;622)

Aumento da média geométrica 2,5 (1,9;3,2) 3,2 (2,3;4,2) 1,1 (1,0;1,1) (95% CI)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 3: Títulos de Anticorpos Neutralizantes para a cepa B de RSV: Estatísticas Descritivas dos valores Reais e Número de Aumento da Linha de base; Conjunto Completo de Análises Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) (1x1011 pv) Placebo Linha de Base 24 24 23

DIA 1 N 24 24 23 Média 1787 (1252;2551) 2710 (1678;4376) 1632 geométrica (95% CI) (1065;2502)

Pós-dose 1 23 24 23

DIA 29 N 23 24 23 Média 5383 (3770;7686) 9302 (6273;13795) 1556 geométrica (95% CI) (1073;2257) Aumento da 3,1 (2,1;4,7) 3,4 (2,3;5) 1 (0,8;1,1) média geométrica (95% CI)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 4: ELISpot: Estatística Descritiva dos Valores Reais; Conjunto Completo de Análises Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) (1x1011 pv) Placebo Linha de Base 23 21 21 DIA 1 N 23 21 21 Mediana (Q1; 103 (42;175) 95 (37;245) 114 (42;169) Q3)

Pós-dose 1 23 21 22 DIA 29 N 23 21 22 Mediana (Q1; 325 (249;478) 305 (172;492) 94 (61;223) Q3)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 5: Resposta à Citocina Total (ICS): Estatística Descritiva dos Valores Reais; Conjunto Completo de Análises

Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) (1x1011 pv) Placebo

CD4 Linha de 20 20 22 Base

DIA 1 N 20 20 22 Mediana (Q1; Q3) 0,03 0,03 0,02 (<0,02;0,07) (<0,02;0,10) (<0,02;0,06)

Pós-dose 19 19 20 1

DIA 29 N 19 19 20 Mediana (Q1; Q3) 0,13 0,12 <0,02 (0,08;0,16) (0,05;0,18) (<0,02;0,04)

CD8 Linha de 20 20 22 Base

DIA 1 N 20 20 22 Mediana (Q1; Q3) 0,07 0,04 0,09 (0,02;0,20) (<0,02;0,12) (<0,02;0,31)

Pós-dose 19 19 20 1

DIA 29 N 19 19 20 Mediana (Q1; Q3) 0,15 0,06 0,10 (0,08;0,29) (0,03;0,20) (0,03;0,66)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 6: Razão de Resposta de Anticorpo Pré-Proteína F RSV versus Pós-Proteína F ao longo do Tempo; Conjunto Completo de Análises Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF (5x1010 pv) (1x1011 pv) Placebo

Linha de 24 24 23 Base DIA 1 N 24 24 23 Média geométrica (95% CI) 1,5 (1,3;1,8) 1,2 (1;1,6) 1,5 (1,3;1,8)

Pós-dose 1 23 24 23 DIA 29 N 23 24 23 Média geométrica (95% CI) 1,7 (1,5;2,1) 1,8 (1,4;2,3) 1,5 (1,3;1,8)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 7: Razão de Resposta de Anticorpo Pré-Proteína F RSV versus VNA A2 ao longo do Tempo; Conjunto Completo de Análises Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF (5x10¹⁰ pv) (1x10¹¹ pv) Placebo

Linha de Base 24 24 23 DIA 1 N 24 24 23 Média geométrica (95% CI) 0,8 (0,6; 0,9) 0,8 (0,7; 1,0) 0,7 (0,5; 0,9)

Pós-dose 1 23 24 23 DIA 29 N 23 24 23 Média geométrica (95% CI) 0,7 (0,5; 0,9) 0,7 (0,6; 0,9) 0,6 (0,4; 0,8)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 8: Razão de Resposta de Anticorpo Pós-Proteína F RSV versus VNA A2 ao longo do Tempo; Conjunto Completo de Análises

Ad26.RSV.preF Ad26.RSV.preF Placebo

(5x10¹⁰ pv) (1x10¹¹ pv)

Linha de Base 24 24 23

DIA 1

N 24 24 23

Média geométrica (95% 0,7 (0,5; 0,9) CI) 0,5 (0,4; 0,6) 0,6 (0,5; 0,8)

Pós-dose 1 23 24 23

DIA 29

N 23 24 23

Média geométrica (95% 0,6 (0,4; 0,8) CI) 0,4 (0,3; 0,5) 0,4 (0,3; 0,6)

N: número de sujeitos com dados

Tabela 9: Estatística Descritiva de todos os Ensaios Humorais; Conjunto de Análises de Imunogenicidade (Estudo VAC18192RSV1001 + VAC18192RSV1003) Ad26.RSV.FA2, (5x10¹⁰ pv)

Humoral: ELISA pre

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 248 (203; 304)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 596 (493; 720) Aumento da média geométrica (95% CI) 2,4 (2,0; 2,9)

Humoral: ELISA pós

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 184 (151; 224)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 556 (445; 695) Aumento da média geométrica (95% CI) 3,0 (2,5; 3,7)

Humoral: Cepa A2 de RSV

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 433 (345; 543)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 856 (675; 1085) Aumento da média geométrica (95% CI) 2,0 (1,7; 2,4)

Humoral: Cepa B de RSV

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 2231 (1851; 2689)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 23 DIA 29 N 23 Média geométrica (95% CI) 3983 (3206; 4948) Aumento da média geométrica (95% CI) 1,9 (1,6; 2,1)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 10: Razão de Resposta de Anticorpo Pré-Proteína F RSV versus Pós-Proteína F ao longo do Tempo; Conjunto de Análises de Imunogenicidade (Estudo VAC18192RSV1001 + VAC18192RSV1003) Ad26.RSV.FA2, (5x10¹⁰ pv)

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 1,4 (1,2; 1,6)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 1,1 (0,9; 1,2)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 11: Razão de Resposta de Anticorpo Pré-Proteína F RSV versus VNA A2 ao longo do Tempo; Conjunto de Análises de Imunogenicidade (Estudo VAC18192RSV1001 + VAC18192RSV1003) Ad26.RSV.FA2, (5x10¹⁰ pv)

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 0,6 (0,5; 0,7)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 0,7 (0,6; 0,9)

N: número de sujeitos com dados

TABELA 12: Razão de Resposta de Anticorpo Pós-Proteína F RSV versus VNA A2 ao longo do Tempo; Conjunto de Análises de Imunogenicidade (Estudo VAC18192RSV1001 + VAC18192RSV1003) Ad26.RSV.FA2, (5x10¹⁰ pv)

Linha de Base 35 DIA 1 N 35 Média geométrica (95% CI) 0,4 (0,3; 0,5)

Dose Pós-Ad.RSV.FA2 35 DIA 29 N 35 Média geométrica (95% CI) 0,6 (0,5; 0,8)

N: número de sujeitos com dados

Listagem de Sequências Sequência de aminoácidos da proteína F de pré-fusão do RSV (as mutações comparadas à cepa A2 de RSV estão em negrito e sublinhadas) SEQ ID Nº: 1: Sequência de aminoácidos RSV preF2.2:

MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE LSNIKEIKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAVVS LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSIPNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP LVFPSNEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAVK STTNIMITTI

IIVIIVILLS LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN SEQ ID Nº: 2: códon otimizado de ácido nucleico que codifica a proteína F pré-fusão pre-F2.2 de RSV

ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACC GCCGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTC TACCAGAGCACCTGCAGCGCCGTGAGCAAGGGCTACCTGAGCGCCCT GAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACAT CAAGGAGATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAA GCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCT GATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACAGAGCCAGAAGAGAGCTGCC CAGATTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACC CTGAGCAAGAAGAGAAAGAGAAGATTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTG GGCAGCGCCATCGCCAGCGGCGTGGCCGTGAGCAAGGTGCTGCACCT GGAGGGCGAGGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAA GGCCGTGGTGAGCCTGAGCAACGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGG TGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGA ACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCC AGCAGAAGAACAACAGACTGCTGGAGATCACCAGAGAGTTCAGCGTGA ACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGAGCACCTACATGCTGACCAACAGCG AGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGA AGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGAGACAGCAGAGCTACAGCA TCATGAGCATCATCAAGGAGGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGC CCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCC CCCTGTGCACCACCAACACCAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCA GAACCGACAGAGGCTGGTACTGCGACAACGCCGGCAGCGTGAGCTTCT TCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCG ACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACG TGGACATCTTCAACCCCAAGTACGACTGCAAGATCATGACCAGCAAGAC CGACGTGAGCAGCAGCGTGATCACCAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCT GCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACAGAGGCATCA TCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGAGCAACAAGGGCGTGG ACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGG GCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACC CCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTGA ACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGC TGCTGCACAACGTGAACGCCGTGAAGAGCACCACCAACATCATGATCA CCACCATCATCATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGT GGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACCCTGAG CAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para induzir uma resposta imune segura contra o vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito humano em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma composição compreendendo adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 1x1010 a cerca de 2x1011 partículas virais (pv).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as composições compreendem adenovírus recombinante compreendendo ácido nucleico que codifica uma proteína de Fusão (F) de RSV compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma dose total de cerca de 5x1010 a cerca de 1x1011 partículas virais (pv).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende a indução de anticorpos que se ligam especificamente à proteína F de RSV.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende a indução de anticorpos neutralizantes de RSV.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende a indução de anticorpos específicos para a proteína F de RSV na conformação pré-fusão e anticorpos específicos para a proteína F de RSV na conformação pós-fusão, e em que o aumento do título médio geométrico (GMT) de anticorpos específicos para proteína F de RSV na conformação pré-fusão é maior que o aumento do título médio geométrico (GMT) de anticorpos específicos para proteína F de RSV na conformação pós-fusão, em ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a razão entre o aumento do título médio geométrico (GMT) de anticorpos específicos F pós-fusão conforme medido em ELISA e o aumento do título médio geométrico (GMT) de anticorpos neutralizantes, conforme medido em um ensaio VNA, é reduzida após a administração da referida composição em comparação com a referida razão antes da administração da referida composição.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende ainda uma resposta celular conforme indicada pelas células T produtoras de IFNgama, conforme medida em um ELISPOT IFNy em resposta à estimulação com um conjunto de peptídeos que cobrem a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1 e/ou pela medição de subconjuntos de células T CD4 e CD8 que expressam IFNγ, IL-2 e TNFα por coloração intracelular (ICS) após estimulação com um conjunto de peptídeos que cobrem a proteína F de RSV de SEQ ID Nº: 1.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano de 60 anos ou mais.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína F de RSV compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 2.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o adenovírus recombinante é um adenovírus humano.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é do serotipo 26 ou 35.