CN111163800A - 用于安全诱导针对rsv的免疫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(RSV)的安全免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺病毒和药学上可接受的载体的组合物，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物的总剂量为从约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)。

Description

用于安全诱导针对RSV的免疫的方法
技术领域
本发明涉及用于安全诱导针对RSV的有效免疫的方法。特别地，本发明涉及表达RSV F蛋白的腺病毒血清型26表达载体，其在人受试者中提供针对多种RSV毒株的免疫的安全诱导。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种高度传染性的儿童呼吸道病原体，据信其致约200,000例儿童死亡/年。在2岁以下的儿童中，RSV占因呼吸道感染而住院的约50％，其中住院高峰发生在2-4月龄。据报道，几乎所有儿童到两岁时都会经历RSV感染，并且一生中反复感染归因于低的自然免疫力。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性A型流感感染引起的那些相似。
RSV是一种属于肺病毒亚科的副粘病毒。它的基因组编码各种蛋白，包括称为RSV糖蛋白(G)和RSV融合蛋白(F)的膜蛋白，它们是用于中和抗体的主要抗原靶标。
与RSV G蛋白不同，F蛋白在RSV毒株之间是保守的；这使它成为一种有吸引力的疫苗候选物，能够引发广泛地中和性抗体。F蛋白是跨膜蛋白，并且在病毒出芽期间从细胞膜掺入病毒体膜中。RSV F蛋白通过融合病毒和宿主细胞膜促进感染。在融合过程中，F蛋白从不稳定的融合前构象不可逆地再折叠成稳定的融合后构象。蛋白前体F0在细胞内成熟期间需要通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。有两个弗林蛋白酶位点，切割这两个位点导致p27肽的去除和两个结构域的形成：N末端F2结构域和C末端F1结构域(图1)。F2和F1结构域通过两个胱氨酸桥连接。针对该融合蛋白的抗体可以防止细胞中的病毒吸收，并且因此具有中和作用。除了作为用于中和抗体的靶标外，RSV F还含有细胞毒性T细胞表位(Pemberton等人，1987，J.Gen.Virol.[基因病毒学杂志]68:2177-2182)。
尽管进行了50年的研究，仍然没有针对RSV的许可疫苗。疫苗开发的一个主要障碍是20世纪60年代临床试验中使用福尔马林灭活的(FI)RSV疫苗的疫苗强化疾病的遗留问题。FI-RSV接种疫苗的儿童未能免受自然感染的影响，并且受感染的儿童比未接种疫苗的儿童患有更严重的疾病，其中包括两人死亡。这种现象被称为“强化疾病”。
自从使用FI-RSV疫苗进行试验以来，已经开始探索产生RSV疫苗的各种方法。尝试包括RSV的经典活减毒冷传代的或温度敏感性突变毒株、(嵌合的)蛋白亚单位疫苗、肽疫苗和由重组病毒载体(包括腺病毒载体)表达的RSV蛋白。尽管这些疫苗中的一些显示出有希望的临床前数据，但由于安全性考虑或缺乏疗效，没有疫苗被许可用于人。
最有效的RSV中和抗体与RSV F蛋白上的特定位点(位点零)结合，该特定位点只有当RSV蛋白处于其融合前构象时才暴露，这使得该特定构象作为疫苗抗原非常有吸引力。然而，处于融合前构象的F蛋白非常不稳定，并且容易发生向融合后构象的主要构象转变。由于它的不稳定性，融合前构象因此倾向于过早重折叠成稳定融合后构象。这种现象是在溶液中和在病毒体表面上的蛋白的固有特征。
基于RSV F蛋白的疫苗候选物由于例如稳定性、纯度、可再现性和效力的问题而失败。事实上，尽管为生产针对含有融合前形式的RSV F蛋白的RSV的疫苗做了很多努力，但尚未描述在人体中测试过的稳定的融合前RSV F多肽。
因此，仍然需要安全且有效的疫苗和针对RSV的疫苗接种方法。本发明的目的是提供这类用于以安全的方式接种针对RSV的疫苗的方法。
发明内容
根据本发明，第一次证明了表达以融合前构象稳定化的RSV F蛋白的重组腺载体，当将其施用于人受试者时，诱导出针对RSV的安全有效的(免疫原性)免疫应答。
因此，本发明提供了一种在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(RSV)的安全免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺病毒和药学上可接受的载体的组合物，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，该组合物的总剂量为腺病毒的约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)。
在另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，该疫苗组合物包含重组腺病毒和药学上可接受的载体，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物总剂量约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)，用于在有需要的受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(RSV)的安全免疫应答的方法。
在本发明的某些实施例中，该总剂量为腺病毒的从约5x 1010至约1x 1011病毒颗粒(vp)。在某些实施例中，该剂量为腺病毒的约5x 1010或约1x 1011vp。
附图说明
图1：RSV F蛋白的示意图。蛋白前体包括F2和F1结构域以及p27肽，该p27肽通过用弗林蛋白酶样蛋白酶切割从成熟蛋白中除去。切割位点用箭头表示。框顶部的数字表示除信号肽外的全长蛋白中的氨基酸位置。在F1中，显示了结构元件：融合肽(FP)、包括七肽重复序列A(HRA)的重折叠区1(RR1)和包括七肽重复序列B(HRB)的重折叠区2(RR2)。
图2：F蛋白变体的相对表面表达。F蛋白的全长变体在HEK293T细胞中表达。将细胞用抗RSV F抗体(CR9503)染色，并通过流式细胞术(FACS)分析。计算平均荧光强度(MFI)值并将其标准化为对照F野生型(Fwt)转染的细胞样品的MFI。Fwt的MFI设定为1。条形表示平均值，误差条表示值的范围。
图3：融合前F蛋白在细胞表面的分数。F蛋白的全长变体在HEK293T细胞中表达。将细胞用抗RSV F抗体CR9503和抗融合前RSV F抗体CR9501染色，并通过流式细胞术分析。计算平均荧光强度(MFI)值，并将通过CR9501测量的MFI标准化至通过CR9503测量的MFI。标准化的MFI值表示pre-F在细胞表面上的分数。条形表示平均值，误差条表示值的范围。
图4：F蛋白变体的相对表面表达。在HEK293T细胞中表达F蛋白的具有跨膜区和细胞质区缺失的可溶性版本(Fsl)和全长变体。通过octet在培养物上清液中测量可溶性蛋白的表达水平，并使用抗RSV F抗体(CR9503)通过细胞染色测试全长变体，并通过流式细胞术分析。计算平均荧光强度(MFI)值并将其标准化为对照F野生型(Fwt)转染的细胞样品的MFI。Fwt的MFI设定为1。条形表示平均值，误差条表示值的范围。
图5：F蛋白变体的温度稳定性。F蛋白的全长变体在HEK293T细胞中表达。热休克后，将细胞用抗RSV F抗体(CR9501-实线和CR9503-虚线)染色，并通过流式细胞术分析。确定对染色阳性的细胞百分比。符号表示平均值，误差条表示值的范围。(A)确定对染色阳性的细胞百分比。(B)计算平均荧光强度(MFI)值并将其标准化为37℃细胞样品的MFI。37℃样品的MFI设定为1。点划线对应于在60℃的背景染色。
图6：F蛋白的稳定性。在热应激测定中，PreF在细胞表面上比呈融合前构象的FA2蛋白更稳定。用Ad26和Ad35感染A549细胞，该Ad26和Ad35包含指定MOI的插入物FA2(wt RSVF，灰色条)或融合前F稳定化的插入物(preF2.2，黑色条)。在染色前将细胞在指定温度下温度处理15分钟。上部分图：在其表面上呈递融合前F的细胞百分比(通过CR9501抗体检测)；下部分图：呈递任何形式的F蛋白(融合前和融合后)的细胞百分比(通过CR9503抗体检测)。将值标准化为37℃样品。所有条形表示单次测量。
图7：Ad26.RSV.preF2.1和F2.2在小鼠中单次施用后引发细胞免疫应答。水平条描绘了组内应答的几何平均值。背景水平计算为在未受刺激的脾细胞中观察到的点形成单位(SFU)的95％百分位数，并用点划线表示。
图8：在小鼠中单次免疫后，当与Ad26.RSV.FA2相比，Ad26.RSV.preF2.1和F2.2诱导增加的病毒中和性抗体。将Balb/c小鼠(每组n＝4)用指定剂量的108至1010病毒颗粒(vp)Ad26.RSV.FA2或Ad26.RSV.preF2.1或Ad26.RSV.preF2.2，或者配制品缓冲液免疫，并在免疫后8周分离的血清中测定体液免疫应答。(A)使用具有基于ELISA的读出的微量中和测定针对RSV A Long确定病毒中和性抗体。效价作为IC50的log2值给出。(B)通过ELISA确定融合前或融合后F抗体效价，并计算显示融合前和融合后F效价高于定量下限(LLoQ)的所有样品的融合前和融合后F抗体之间的比率。(C)使用融合后RSV F A2作为包被试剂进行亚类ELISA，并绘制IgG2a/IgG1比率(log10)。将观察到的Th1(衍生自用RSV F表达腺病毒载体免疫的动物的血清)和Th2(衍生自FI-RSV免疫的动物的血清)参照样品的比率用点划线表示。LLoQ用点划线表示(图A)，并且水平条表示每组的平均应答。
图9：Ad26.RSV.preF2.2引发中和大范围的RSV分离株的抗体应答。将来自用1010病毒颗粒(vp)Ad26.RSV.FA2(n＝3)或Ad26.RSV.preF(n＝4)或配制品缓冲液(n＝2)免疫的Balb/c小鼠的血清和所指示的RSV A(上图)和B毒株(下图)用于病毒中和测定(具有基于ELISA的读出的微量中和测定)。效价作为IC50的log2值给出，并且水平条表示每组的平均应答。LLoQ用点划线表示。
图10：用低剂量的Ad26.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.preF2.2单次免疫来保护棉鼠免受同源RSV A2的激发。用指定剂量(以vp/动物计)的Ad26.RSV.preF2.2、Ad26.RSV.FA2(左图)、Ad35.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.FA2(右图)通过单次肌肉内施用来免疫棉鼠(刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidus))(每组n＝7至9)。用配制品缓冲液、FI-RSV或鼻内给予低剂量RSVA2进行对照免疫。免疫后第七周，用105pfu RSV A2鼻内激发动物。在激发后5天通过噬菌斑测定确定肺(A-B)和鼻病毒效价(C-D)。(E-F)将就在激发前刚采集的血清用于用RSV ALong毒株的病毒中和性测定(具有基于ELISA的读出的微量中和测定)。点划线表示定量的较低水平(LLoQ)。水平条表示每组的平均效价。
图11：RSV A2激发后，棉鼠的Ad26.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.preF2.2免疫没有导致肺泡炎评分增加。用指定剂量(以vp/动物计)的Ad26.RSV.preF2.2、Ad26.RSV.FA2(上图)、Ad35.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.FA2(下图)通过单次肌肉内施用来免疫棉鼠(刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidus))(每组n＝7至9)。用配制品缓冲液、FI-RSV或鼻内给予低剂量RSVA2进行对照免疫。免疫后第七周，用105pfu RSV A2鼻内激发动物。在激发后5天，通过在从0至4的非线性标度上对一个肺泡进行组织病理学检查来对肺泡炎进行评分。水平点划线标记在激发前预先暴露于RSV-A2的对照动物的最大评分，以模拟不导致ERD的RSV的自然暴露。
具体实施方式
尽管呼吸道合胞病毒(RSV)终生感染人，但大多数人无法进行持久的保护性免疫应答。此外，在老年人中，免疫应答的减弱导致RSV感染后对严重疾病的易感性增加，从而导致显著的发病率和死亡率。在文献中有迹象表明中和抗体和T细胞介导的保护都在预防RSV感染中起作用。因此，认为成功的RSV疫苗，特别是针对老年人的RSV疫苗，应同时提高有效的中和抗体水平并诱导强烈的T细胞应答。
RSV感染诱导了病毒特异性抗体，该病毒特异性抗体主要针对融合(F)蛋白。最有效的发现于人血清的RSV中和抗体与RSV F蛋白上的特定位点(位点Φ或位点零)结合，该特定位点只有当RSV蛋白处于其融合前构象时才暴露，这使得该特定构象作为疫苗抗原非常有吸引力。然而，处于融合前构象的F蛋白非常不稳定，并且容易发生向融合后构象的主要构象转变。
在通向本发明的研究中，与来自RSV A2毒株(Genbank ACO83301.1)的野生型RSVF抗原相比，制备了具有独特的氨基酸突变集的稳定化的RSV F蛋白。通过证明体外与融合前特异性抗体的特异性结合，表明确实获得了处于融合前构象的稳定化的RSV F抗原。
根据本发明，现已表明稳定化的RSV F蛋白在体内保持其融合前构象，具有免疫原性，并且可以安全地施用于有需要的人受试者。
因此，根据本发明，提供了用于在有需要的人受试者中诱导针对RSV的安全免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺病毒和药学上可接受的载体的组合物，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物的总剂量为腺病毒的从约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)。
在另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，该疫苗组合物包含重组腺病毒和药学上可接受的载体，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物总剂量约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)，用于在有需要的受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(RSV)的安全免疫应答的方法。
在本发明的某些实施例中，该组合物包含重组腺病毒和药学上可接受的载体，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物的总剂量为腺病毒的从约5x 1010至约1x 1011病毒颗粒(vp)。
在某些实施例中，该剂量为腺病毒的约5x 1010或约1x 1011vp。
根据本发明，现已表明编码以融合前构象的RSV F蛋白(特别是SEQ ID NO:1的RSVF蛋白)的腺病毒是高度免疫原性的。如与相似剂量的编码野生型RSV F蛋白的腺病毒相比，体液免疫应答增强，该野生型RSV F蛋白在融合前构象中不稳定，并可能在表达后迅速转变为融合后构象。
在某些实施例中，免疫应答包括针对RSV F蛋白的抗体的诱导。因此，根据某些实施例，如在ELISA中所测量的，免疫应答包括与RSV F蛋白特异性结合的抗体的诱导。
在某些实施例中，该免疫应答包括对RSV中和抗体的诱导。在某些实施例中，该中和抗体能够中和RSV A和B毒株。在某些实施例中，免疫应答包括在VNA测定中诱导能够中和RSV A和B毒株的抗体。
如本文所用，“抗体的诱导”意指在施用包含表达SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的重组腺病毒的组合物后测量的抗体水平高于在施用所述组合物之前的抗体水平。
在某些实施例中，该免疫应答包括对处于诱导融合前构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体和对处于融合后构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的诱导，其中在酶联免疫吸附测定(ELISA)中，对处于融合前构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的几何平均滴度(GMT)增加高于对处于融合后构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的GMT增加。因此，如与特异性结合处于融合后构象的RSV F蛋白的抗体相比，本发明的方法导致与处于融合前构象的RSV F蛋白特异性结合的抗体的更大增加。不希望受特定理论的束缚，据信这导致更有效的免疫应答，因为融合前特异性抗体被认为在中和RSV病毒方面更有效，并且从而在预防RSV感染方面更有效(Gilman MS,Castellanos CA,Chen M,Ngwuta JO,Goodwin E,MoinSM,Mas V,Melero JA,Wright PF,Graham BS,McLellan JS,Walker LM.Sci Immunol.[科学免疫学]2016年12月16日；1(6).pii:eaaj1879.doi:10.1126/sciimmunol.aaj1879.Epub2016年12月9日.Rapid profiling of RSV antibody repertoires from the memory Bcells of naturally infected adult donors[快速分析来自自然感染的成年供体的记忆B细胞的RSV抗体谱])。
在某些实施例中，如与在施用所述组合物之前的比率相比，在施用所述组合物之后，如在ELISA中测量的融合后F特异性抗体的GMT增加与如在VNA测定中测量的中和抗体的平均几何效价增加之间的比率降低了。因此，本发明的方法导致RSV特异性体液应答的更有利的组合物，该组合物有利于中和抗体而不是结合抗体。
在某些实施例中，免疫应答进一步包括细胞应答，如通过在IFNy ELISPOT中测量的产生IFNγ的T细胞所表示的，该细胞应答是响应于用覆盖SEQ ID NO:1的F蛋白的肽池的刺激，和/或通过在用覆盖SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的肽池刺激后，用细胞内染色(ICS)测量表达IFNγ、IL-2和TNFα的CD4和CD8 T细胞亚群所表示的。已经提出RSV特异性T细胞可以支持预防感染和限制疾病；这对于老年人尤其有益，因为已经描述了细胞应答可能随着年龄的增长而降低(Openshaw PJM,Chiu C,Culley FJ,Johansson C.Annu Rev Immunol.[免疫学年鉴]2017年4月26日；35:501-532.doi:10.1146/annurev-immunol-051116-052206.Epub 2017年2月6日.Protective and Harmful Immunity to RSV Infection.[对RSV感染的保护性和有害免疫力])
通过诱导安全和免疫原性的免疫应答，本发明的方法可用于在受试者中预防引起住院治疗的严重下呼吸道疾病并且降低由RSV感染和复制引起的并发症例如肺炎和细支气管炎的频率。
如本文所用，术语核酸、核酸分子、核酸序列或核苷酸序列、和多核苷酸可互换使用，并且全部是指由核苷酸(包括DNA和RNA)制成的线性生物聚合物(链)。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由其中描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核酸分子”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。从5’至3’方向提供了本文中的序列，如本领域中所习惯的。
在某些实施例中，对编码RSV融合前F蛋白的核酸分子进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞，例如人类细胞中表达。密码子优化的方法是已知的并且已经在先前描述(例如WO 96/09378)。在优选实施例中，编码RSV融合前F蛋白的核酸分子包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在某些实施例中，编码RSV F蛋白的核酸由SEQ ID NO:2的核酸序列组成。
根据本发明，有需要的受试者是人受试者。优选地，该受试者是老年受试者，即60岁及以上的人。根据本发明，已经表明施用包含编码处于融合前构象的RSV F蛋白的核酸的重组腺病毒是安全且具有免疫原性的，即，即使在免疫系统弱的老年受试者中也能产生有效的体液和细胞应答。
在某些实施例中，重组腺病毒(也称为腺病毒载体)是人重组腺病毒。重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。如本文所用，针对腺病毒的术语“重组”暗示它已被人工修饰，例如其具有在其中以保持活性地克隆的经改变的末端和/或其包含异源基因，即它不是天然存在的野生型腺病毒。
在某些实施例中，根据本发明的重组腺病毒在病毒复制必需的腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一个必需基因功能上是有缺陷的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该腺病毒在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述E1缺陷的，或E1、E3缺陷的腺病毒载体可以进一步在E4区域的至少一个必需基因和/或E2区域(例如，E2A区域和/或E2B区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。
在某些实施例中，该腺病毒是血清型26或35的人腺病毒。基于这些血清型的根据本发明的疫苗似乎比现有技术中描述的基于Ad5的疫苗更有效，因为那些在单次肌肉内施用后未能提供针对RSV激发复制的完全保护(Kim等人，2010，Vaccine[疫苗]28:3801-3808；Kohlmann等人，2009，J Virol[病毒学杂志]83:12601-12610；Krause等人，2011,VirologyJournal[病毒学杂志]8:375)。本发明的血清型在人群中还通常具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴定量。在临床试验中评估这些具有不同转基因的血清型的重组腺病毒载体，并且迄今为止显示具有优异的安全性特性。例如在WO 2007/104792中和在Abbink等人，(2007)Virol[病毒学]81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列发现于基因库登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如，在美国专利号7,270,811中、在WO 00/70071中以及在Vogels等人，(2003)，J Virol[病毒学杂志]77(15):8263-71中，描述了rAd35载体的制备。Ad35的示例性基因组序列发现于基因库登录号AC_000019中和WO 00/70071的图6中。
根据本发明的重组腺病毒可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的E1区域中含有缺失。如技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须优选的是由生产细胞反式提供，即，当E1、E2和/或E4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在E3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。
对于非亚组C E1缺陷型腺病毒，例如Ad35(亚组B)或Ad26(亚组D)，优选地是将这些非亚组C腺病毒的E4-orf6编码序列与亚组C的腺病毒(例如Ad5)的E4-orf6进行交换。这允许在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如293细胞或PER.C6细胞(参见，例如Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-2143；WO 03/104467，将其通过引用以其全文并入本文)。在某些实施例中，可以使用的腺病毒是血清型35的人腺病毒，其具有已经将编码RSV F蛋白抗原的核酸克隆到其中的E1区中的缺失，并具有Ad5的E4 orf6区。在某些实施例中，本发明的疫苗组合物中的腺病毒是血清型26的人腺病毒，其具有已经将编码RSV F蛋白抗原的核酸克隆到其中的E1区中的缺失，并具有Ad5的E4 orf6区。
在替代性实施例中，不需要将异源(例如Ad5的)E4orf6区置于腺病毒载体中，但是需要E1缺陷型非亚组C载体在表达E1和相容的E4orf6二者的细胞系(例如，表达来自Ad5的E1和E4orf6二者的293-ORF6细胞系)中繁殖(参见例如Brough等人，1996，J Virol[病毒学杂志]70:6497-501描述了293-ORF6细胞的产生；Abrahamsen等人，1997，J Virol[病毒学杂志]71:8946-51和Nan等人，2003，Gene Therapy[基因疗法]10:326-36每个描述了使用这种细胞系产生E1缺失的非亚组C腺病毒载体)。
可替代地，可以使用从待繁殖的血清型表达E1的补充细胞(参见例如WO 00/70071，WO 02/40665)。
对于在E1区域具有缺失的亚型B腺病毒(如Ad35)，优选地是将E1B 55K开放阅读框的3'末端保留在腺病毒中，例如pIX开放阅读框直接上游的166bp或包含所述166bp的片段，例如pIX起始密码子直接上游的243bp的片段(在5'端由Ad35基因组中的Bsu36I限制性位点标记)，因为pIX基因的启动子部分驻留在该区域，这增加了腺病毒的稳定性(参见例如Havenga等人，2006，J.Gen.Virol.[基因病毒学杂志]87:2135-2143；WO 2004/001032，通过引用并入本文)。
可以通过例如标准分子生物学技术将编码SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的核酸引入腺病毒。例如，可以将它克隆至腺病毒载体的缺失的E1或E3区域。通常，核酸(或转基因)可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码RSV F蛋白的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外的调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因，并且是本领域技术人员已知的。用于获得在真核细胞中的表达的适合的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素polyA信号(US 5,122,458))可以存在于该(这些)转基因后面。
在某些实施例中，本发明的重组腺病毒载体包含作为5'末端核苷酸的核苷酸序列：CTATCTAT。这些实施例是有利的，因为与具有原始5'末端序列(通常为CATCATCA)的载体相比，这些载体在生产过程中显示出改善的复制，导致各批次的腺病毒具有改善的同质性(还参见PCT公开号WO 2013/135615和美国专利号8,932,607)，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施例中，包含重组腺病毒的组合物可以进一步包含一种或多种佐剂，或与其一起施用。佐剂是本领域已知的，以进一步增加对所用抗原决定簇的免疫应答，并且包含腺病毒和适合佐剂的药物组合物例如在WO 2007/110409中披露，其通过引用并入本文。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的RSV融合前F蛋白的免疫应答。合适的助剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540、WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(例如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)。还可以使用载体编码的佐剂，例如，通过使用编码目的抗原与C4-结合蛋白(C4bp)的低聚反应域的融合物的异源核酸(例如，Solabomi等人，2008，InfectImmun[感染与免疫]76:3817-23)。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05-5mg，例如每剂量铝含量为0.075-1.0mg。
组合物的施用可以使用标准施用途径执行。非限制性实施例包括不经肠施用，如通过注射，如皮内、肌肉内等，或者皮下、经皮、或粘膜施用，例如鼻内、经口等。鼻内施用通常被视为针对RSV的疫苗的优选途径。实时鼻内策略的最重要的优点是直接刺激局部呼吸道免疫和缺乏相关的疾病强化。鼻内施用也是根据本发明的合适的优选途径。肌肉内施用的优点在于它简单且是公认的。在本发明的一个实施例中，通过肌内注射施用组合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外侧肌。技术人员已知施用组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。
根据熟知的方法，可以在宿主细胞中制备和繁殖重组腺病毒，这些方法需要用腺病毒感染的宿主细胞的细胞培养物。细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。
大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续过程变得更加普遍并且也是合适的(参见例如WO 2010/060719和WO 2011/098592，两者均通过引用并入本文，其描述了用于获得和纯化大量重组腺病毒的合适方法)。
培养生产细胞以增加细胞和病毒数量和/或病毒效价。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或产生根据本发明的目的病毒。这可以通过如本领域技术人员熟知的方法来实现，并且包括但不限于(例如在合适的培养基中)为细胞提供营养物。合适的培养基是本领域技术人员熟知的，并且通常可以从大量的商业来源获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的合适条件是已知的(参见例如Tissue Culture[组织培养],文学出版社(Academic Press),Kruse和Paterson编辑(1973)，以及R.I.Freshney,Culture of animalcells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册],第四版(威利利斯公司(Wiley-Liss Inc.),2000,ISBN 0-471-34889-9))。
可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文中也被称为“包装细胞”或“补充细胞”)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒E1序列，并且从而能够补充在E1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充E1的生产细胞，如由E1永生化的人类网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见美国专利5,994,128)、E1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、E1转化的A549细胞(参见例如WO 98/39411，美国专利5,891,690)、GH329：海拉细胞(Gao等人，2000，Human GeneTherapy[人基因治疗]11:213-219)、293、以及类似物。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞等。
典型地，腺病毒将在培养基中暴露于合适的生产细胞，允许摄取病毒。通常，最佳搅拌速度为约50至300rpm之间，通常为约100-200rpm，例如约150rpm，典型的DO为20％-60％，例如40％，最佳pH在6.7和7.7之间，最佳温度在30℃和39℃之间，例如34℃-37℃，并且最佳MOI在5和1000之间，例如约50-300。典型地，腺病毒自发感染生产细胞，并促使生产细胞与rAd颗粒接触，足以感染这些细胞。通常，向培养基中添加腺病毒种子原料以引发感染，并且随后腺病毒在生产细胞中繁殖。这对于本领域技术人员来说都是常规的。
在感染腺病毒后，病毒在细胞内复制，并且从而被扩增，该过程在本文中被称为腺病毒的繁殖。腺病毒感染最终会导致被感染细胞的溶解。因此，腺病毒的溶解特性允许两种不同的病毒生产模式。第一模式是在细胞溶解(使用外部因素来溶解细胞)之前收获病毒。第二种模式是在细胞被产生的病毒(几乎)完全溶解后收获病毒上清液(参见例如美国专利6,485,958，其描述了通过外部因素在不溶解宿主细胞情况下收获腺病毒)。优选地使用外部因素来以保持活性的方式溶解细胞以收获腺病毒。
可用于活性细胞裂解的方法是本领域技术人员已知的，并且已描述于例如WO 98/22588(第28-35页)中。在这方面有用的方法是例如冻融、固体剪切、高渗和/或低渗溶解、液体剪切、超声处理、高压挤出、洗涤剂溶解、上述组合等。在本发明的一个实施例中，使用至少一种洗涤剂溶解细胞。使用洗涤剂用于溶解的优点在于它是一种简单的方法，并且易于扩展。
可以使用的洗涤剂及其使用方式是本领域技术人员通常已知的。例如在WO 98/22588(第29-33页)中讨论了若干实例。洗涤剂可以包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的浓度可以变化，例如在约0.1％-5％(w/w)的范围内。在一个实施例中，所用的洗涤剂是Triton X-100。
核酸酶可用于去除污染物(即主要来自生产细胞，核酸)。适用于本发明的示例性核酸酶包括
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或本领域中通常使用的任何其他脱氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。在优选的实施例中，核酸酶是
Figure BDA0002408968990000142
其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键来快速水解核酸，从而降低细胞溶解产物的粘度。
Figure BDA0002408968990000143
可以从德国默克集团(Merck KGaA)(代码W214950)商购获得。使用了核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围内。可替代地，或除了核酸酶处理之外，还可以使用选择性沉淀剂(例如多巴胺溴化物)在腺病毒纯化期间选择性沉淀宿主细胞DNA，使其远离腺病毒制剂(参见例如US 7,326,555；Goerke等人，2005，Biotechnology and bioengineering[生物技术和生物工程]，第91卷:12-21；WO 2011/045378；WO 2011/045381)。
用于从生产细胞的培养物中收获腺病毒的方法已经广泛描述于WO 2005/080556中。
在某些实施例中，进一步纯化收获的腺病毒。腺病毒的纯化可以在若干个步骤中进行，这些步骤包括澄清、超滤、渗滤或用如通过引用并入本文的例如WO 05/080556中所述的色谱分离。澄清可以通过过滤步骤进行，从细胞溶解产物中除去细胞碎片和其他杂质。使用超滤来浓缩病毒溶液。使用超滤器的渗滤或缓冲液交换是用于除去和交换盐、糖等的一种方式。本领域技术人员知道如何找到针对每个纯化步骤的最佳条件。还有WO 98/22588(其全部内容通过引用并入本文)描述了用于生产和纯化腺病毒载体的方法。这些方法包括让宿主细胞生长、用腺病毒感染宿主细胞、收获和溶解宿主细胞、浓缩粗溶解产物、更换粗溶解产物的缓冲液、用核酸酶处理溶解产物、以及使用色谱法进一步纯化病毒。
优选地，纯化采用至少一个例如WO 98/22588(第61-70页)中所讨论的层析步骤。已经描述了用于进一步纯化腺病毒的许多方法，其中色谱步骤包括在这些方法中。本领域技术人员将了解这些方法，并且可以改变采用色谱步骤的确切方式以优化这些方法。例如可以通过阴离子交换层析步骤纯化腺病毒，参见例如WO 2005/080556和Konz等人，2005，Hum Gene Ther[人基因疗法]16:1346-1353。已经描述了许多其他腺病毒纯化的方法，并且在技术人员的可及范围内。用于生产和纯化腺病毒的另外的方法披露于例如(WO 00/32754；WO 04/020971；US 5,837,520；US 6,261,823；WO 2006/108707；Konz等人，2008，Methods Mol Biol[分子生物学方法]434:13-23；Altaras等人，2005，Adv Biochem EngBiotechnol[生化工程/生物技术进展]99:193-260)，以上均通过引用并入本文。
针对向人施用，本发明可以采用包含重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该运载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的运载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用辅料手册],第3版,A.Kibbe编辑,英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。尽管还可以运用冻干制品，但该纯化的重组腺病毒优选地是作为无菌溶液进行配制和施用。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。然后将这些溶液冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH值一般在pH 3.0到9.5的范围内，例如pH 5.0到7.5。该重组腺载体通常是在具有合适的药学上可接受的缓冲液的溶液中。该溶液还可以含有盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将重组腺病毒配制成可注射制剂。这些配制品包含有效量的腺病毒(为无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干形式)并任选地包含稳定剂或赋形剂。也可以雾化腺病毒疫苗用于鼻内施用(参见例如WO 2009/117134)。
例如，腺病毒可以储存于缓冲液中，该缓冲液还可以用于腺病毒世界标准(Adenovirus World Standard)(Hoganson等人，Development of a stable adenoviralvector formulation[稳定的腺病毒载体配制品的发展]，Bioprocessing[生物加工]2002年3月，第43-48页)：20mM Tris pH 8，25mM NaCl，2.5％甘油。适用于向人施用的另一种有用的配制品缓冲液是20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-800.02％w/v。显然，可以使用许多其他缓冲液，并且适合用于储存和药物施用经纯化的(腺)病毒制剂的配制品的几个实例可以在以下文献中发现的：欧洲专利号0853660，美国专利6,225,289和国际专利申请WO 99/41416、WO 99/12568、WO 00/29024、WO 01/66137、WO 03/049763、WO 03/078592、WO 03/061708。
在本发明的某些实施例中，使用腺病毒配制品如WO 2015/040002中所述。因此，在优选实施例中，包含腺病毒载体(包含编码SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的核酸)的组合物除了重组腺病毒外，包含柠檬酸盐缓冲液，其中柠檬酸盐浓度范围在约5mM和30mM之间；羟丙基-β-环糊精(HBCD)，其中HBCD的浓度范围在约1％(w/w)和10％(w/w)之间；盐，例如浓度在约20mM和约200mM之间的氯化钠；以及非离子洗涤剂，例如浓度范围在从约0.005％(w/w)至约0.5％(w/w)之间的聚山梨酯80；其中所述配制品的pH范围在5.5和6.5之间。
在某些实施例中，该组合物的pH范围在约5.7和6.3之间，并且包含浓度范围在约5至30mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在1％(w/w)和10％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在20mM和200mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.05％(w/w)之间的聚山梨酯80。
在某些实施例中，组合物包含浓度在约15mM的柠檬酸盐；浓度在约5％(w/w)的HBCD；浓度在约75mM的NaCl，和浓度在约0.03％(w/w)的聚山梨酯80。
在某些实施例中，组合物还包含乙醇，其中乙醇浓度范围在约0.1％(w/w)至1％(w/w)之间。
在优选实施例中，组合物包含浓度在约15mM的柠檬酸盐；浓度在约5％(w/w)的HBCD；浓度在约75mM的NaCl，浓度在约0.03％(w/w)的聚山梨酯80和浓度在约0.4％(w/w)的乙醇。
在以下非限制性实例中进一步阐明了本发明。
实例
实例1.使呈其融合前构象的RSV F蛋白稳定化
合成编码基本RSV F序列的质粒，并通过定点诱变将氨基酸取代引入蛋白中。将蛋白变体在HEK293细胞中瞬时表达。通过流式细胞术评估细胞表面上的相对蛋白表达。在热稳定性测定中评估呈融合前构象的F蛋白的稳定性。
将用于RSV A2 F蛋白变体的蛋白序列从基因库，登录号ACO83301.1中检索。通过定点诱变(QuikChange II XL定点诱变试剂盒，安捷伦科技公司(Agilent technologies))在该序列中引入氨基酸取代。使用在线工具PrimerX设计诱变引物。HEK293T细胞(CRL-11268)购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)并在标准细胞培养条件(37℃，10％CO2)下培养。
通过将重链(VH)和轻链(VL)可变区克隆到单个IgG1表达载体中来构建完全人IgG1抗RSV F蛋白抗体CR9501和CR9503。将
Figure BDA0002408968990000181
细胞(库赛尔公司(Crucell))用IgG1表达构建体转染并使用POROS Mabcapture A色谱法(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))从培养物上清液纯化表达的抗体，并且然后将缓冲液更换为50mM NaAc，50mMNaCl，pH 5.5。通过280nm处的光学吸收测量抗体浓度。也通过尺寸排阻色谱法(SEC)、SDS-PAGE和等电聚焦确认抗体质量。抗体CR9501包含58C5(如WO2011/020079中所述)的VH区和VL区，该58C5特异性结合呈融合前构象的RSV F蛋白而不与呈融合后构象的RSV F蛋白结合。CR9503包含莫维珠单抗(motavizumab)的VH和VL区，莫维珠单抗识别RSV F的融合前和融合后构象。
蛋白表达和温度处理：
根据供应商的推荐，使用293fectine(目录号12347-019)转染试剂(生命科技公司(Life Technologies))将质粒瞬时转染到贴壁HEK293T细胞中。转染后48小时，通过与含EDTA的FACS缓冲液(无胰蛋白酶，参见下一部分)分离来收获细胞，并将细胞悬浮液在水浴或PCR模块中热处理10分钟，用于温度稳定性实验。在该热处理后，制备细胞用于流式细胞术分析。
为了分析腺病毒表达的F蛋白，用MOI为10000或5000的Ad26病毒和MOI为5000、2500或1.250的Ad35病毒感染A549细胞。48小时后，将细胞分离并在37℃、50℃和56℃热处理15分钟。热处理后，使用CR9501-Alexa647或CR9503-Alexa647和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色。染色后，固定细胞并使用BD FACS CANTO II细胞分析仪分析。
流式细胞术分析：
对于每次染色，包括以下对照：1)阴性对照样品，即未经任何处理且未用荧光团标记的任何抗体染色的细胞；2)阳性对照样品，即仅用一个荧光团(用于该实验的每种荧光团中之一)染色的细胞。
将细胞重悬浮于流式细胞仪(FC缓冲液、5mM EDTA，PBS中的1％FBS)中，并在具有盖子的96孔板(U-或V-底板)中以每孔50μl细胞悬浮液的体积分布。使用两步式或一步式方案用于染色。
在两步式方案的情况下，将50μl的第一Ab(或用于阴性对照的缓冲液)添加至这些孔中，并在室温下孵育30分钟。将生物素化的CR9501和CR9503以2μg/ml使用(孔中最终浓度1μg/ml)。孵育后，用FC缓冲液洗涤细胞2次。然后向这些孔中添加50μl的链霉亲和素-APC(分子探针公司(Molecular Probes)目录号SA1005，0.1mg/ml，以1:100使用)或用于阴性对照的缓冲液，并在室温下孵育30分钟。用FC缓冲液再次洗涤细胞2次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于100μl的FC缓冲液+/-活-死染色剂(来自英杰公司(Invitrogen)的PI，目录号P1304MP，以2μg/ml使用)中并在室温下孵育15分钟。将细胞以200g(1000rpm)离心5分钟，除去具有PI的缓冲液，并将细胞重悬于150μl的FC缓冲液中。
在一步式方案的情况下，根据制造商的说明书，用荧光探针Alexa647(分子探针公司(Molecular Probes)目录号A-20186)标记CR9501和CR9503抗体。根据上述方案(不包括链霉亲和素-APC步骤)对细胞进行染色。
从活细胞群中，确定对CR9501/CR9503抗体结合阳性的细胞百分比。对CR9503结合阳性的细胞在其表面上表达RSV F蛋白。对CR9501结合阳性的细胞在其表面上表达融合前RSV F。
抗体染色的强度(中值荧光强度-MFI)与细胞表面上F蛋白的量成比例。从表达F蛋白的活细胞群计算MFI。
结果：
全长F蛋白变体的表面细胞表达：
在野生型全长RSV A2 F序列(登录号基因库ACO83301)中引入先前鉴定为增加呈融合前构象的RSV F蛋白胞外域的表达或稳定性的突变子集。单独或以多种组合引入突变，并评估对蛋白表达和稳定性的影响。
在用识别融合前和融合后F蛋白两者的CR9503抗体染色后，通过流式细胞术测量蛋白的表达水平为平均荧光强度(MFI)。先前描述的用于稳定化可溶性RSV pre-F蛋白(即N67I和S215P)的两个氨基酸取代的组合也使全长RSV F蛋白的表达水平相对于野生型全长RSV F增加了2.3倍(图2)。
对于组合了3个氨基酸取代的变体，观察到表达的显著增加。有趣的是，在一个变体中超过三个突变的组合不会进一步增加蛋白表达。这可能是由于细胞膜容纳多种F蛋白拷贝的能力有限。
通过用融合前特异性抗体CR9501染色来评估细胞表面上的融合前F的量(图3)。用所有F变体转染这些细胞导致细胞表面上或多或少相似量的融合前F蛋白。跨膜结构域的存在使全长蛋白稳定到一定程度，并且因此全长F蛋白之间的融合前稳定性差异在环境条件下不那么明显。因此，开发热稳定性测定以更好地区分全长变体的稳定性，如下所述。
用作先前描述的F蛋白变体(WO 2014/174018和WO 2014/202570)的亲本序列的A2毒株是适应细胞系的实验室毒株，其累积了两种独特且罕见的突变(即赖氨酸66和异亮氨酸76的突变)。在本发明中，突变这两个残基以匹配天然临床分离株(K66E，I76V)。K66E和I76V突变包括在选定的蛋白设计中。与具有Lys66和Ile76的变体相比，在66处具有谷氨酸的变体(K66E)具有表达略高的趋势。当单独与具有K66E取代的变体相比时，在残基76处添加缬氨酸(K66E和I76V的双重取代)不影响表达水平(图4)。
细胞表面上全长F蛋白变体的稳定性：
在短时间范围内的环境条件下，在具有稳定性突变的不同组合的全长F变体之间未观察到融合前构象稳定性的显著差异。已知升高的温度作为RSV F蛋白从融合前构象重折叠为融合后构象的有效体外触发。因此，建立了热休克测定并用于评估膜结合的全长蛋白的稳定性。不久，用F蛋白构建体转染HEK293T细胞，并在转染后48小时用于测定。将细胞从细胞培养皿中分离，并将细胞悬浮液在升高的温度下热处理10分钟。在热处理后，用抗RSV F抗体将细胞染色并通过流式细胞术分析。以两种不同的方式分析流式细胞仪数据。分析对用抗F抗体染色阳性的细胞百分比，并计算阳性细胞的平均荧光强度(MFI)(图5)。
将用CR9501(仅识别融合前F蛋白的抗体)和CR9503(识别融合前和融合后F蛋白二者的抗体)染色均用于流式细胞术测定。CR9503抗体作为阳性对照。在F蛋白失去融合前构象但仍位于细胞表面的情况下，仍然用CR9503抗体检测该蛋白。用两种抗体染色的丧失表明在细胞表面上没有可用于抗体结合的蛋白，例如由于聚集。
在测定中测试具有三个或更多个氨基酸取代的全长蛋白，并与野生型RSV F对比。这些变体的表达最高，并且因此这些变体是优选的候选物。所有这些蛋白都含有N67I和S215P取代，并添加了一个或两个额外的稳定性突变。
未经修饰的野生型蛋白具有相当稳定的用CR9503抗体进行的染色。CR9503染色的MFI在较高温度下升高，但值的扩散也非常高。这表明在热休克后没有发生蛋白聚集。在约55℃孵育细胞后，一半的融合前构象损失，在60℃孵育后，所有融合前构象均损失，如通过热休克后在升高的温度下CR9501与野生型F样品的结合降低所证实的。
所有测试的融合前F蛋白变体比野生型RSV F更稳定，其中大多数CR9501染色在较高温度下处理后仍保留(图5和6)。具有K498R氨基酸取代的蛋白不如其他蛋白稳定。K66E突变的添加进一步稳定了这些蛋白，同样，具有K498R氨基酸取代的变体也变得与其他氨基酸取代一样稳定，并且在60℃没有观察到融合前构象的损失。用K66E和I76V的组合仅测试了稳定性突变的选定组合。当分析阳性细胞的百分比时，所有四种测试的蛋白都是稳定的，但是当分析MFI时，具有K498R的变体显示在60℃处理后CR9501结合明显降低，表明当在温度应激测定中评价时该变体较不稳定。
总之，认为三种稳定性突变(包括N67I和S215P)的组合足以实现高表达水平和稳定性。由于其在蛋白结构中的位置，选择D486N突变作为第三稳定性突变。K66E和I76V被包括在内，因为它们对蛋白表达和稳定性没有负面影响，而使序列更接近天然存在的序列。
选择具有突变K66E、N67I、I76V、S215P和D486N(F2.2)的融合前RSV F蛋白(SEQ IDNO:1)用于构建腺病毒载体。在高达60℃的温度稳定性测定中，这种蛋白在融合前构象中显示为稳定的，并可以高水平表达。
实例2.腺病毒载体的制备
将RSV F基因克隆到Ad35和Ad26的E1区：
编码本发明的融合前F蛋白的核酸序列是基因优化的，用于人表达，并由Geneart合成。Kozak序列(5’GCCACC 3’)直接包含于ATG起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5’TGA TAA 3’)添加至RSV.pre-F编码序列的末端。经由HindIII和XbaI位点将RSV.pre-F基因插入pAdApt35BSU质粒和pAdApt26质粒中。
细胞培养：
将PER.C6细胞(Fallaux等人，1998，Hum Gene Ther[人基因治疗]9:1909-1917)维持在具有10％胎牛血清(FBS)、补充以10mM MgCl2的杜氏改良培养基(DMEM)中。
腺病毒生成、感染和传代：
通过单同源重组，所有的腺病毒生成于
Figure BDA0002408968990000221
细胞中，并且如之前所述进行生产(针对rAd35：Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-2143；针对rAd26：Abbink等人，2007，J Virol[病毒学杂志]81:4654-4663)。简言之，根据制造商(美国生命技术公司(Life Technologies))提供的说明书使用脂质体，用Ad载体质粒转染PER.C6细胞。为了拯救例如携带RSV.pre-F转基因表达盒的Ad35载体，使用pAdApt35BSU.RSV.pre-F质粒和pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6粘粒，而对于携带RSV.pre-F转基因表达盒的Ad26载体，则使用pAdApt26.RSV.pre-F质粒和pWE.Ad26.dE3.5orf6.粘粒。在完全CPE后一天收获细胞，冻融，以3,000rpm离心5min，并且存储在-20℃。接下来，将病毒进行噬斑纯化并且在培养于多孔24组织培养板的单孔中的PER.C6中进行扩增。进一步扩增在使用T25组织培养烧瓶和T175组织培养烧瓶培养的PER.C6中进行。使用3ml至5ml的T175粗溶解产物来接种含有70％融汇层的PER.C6细胞的20×T175三层组织培养烧瓶。使用两步式CsCl纯化法纯化该病毒。最终，将该病毒以等分在-85℃储存。
实例3.使用在体内表达融合前RSV F的重组腺病毒血清型26和35诱导针对RSV F的免疫。
在小鼠中评估Ad26.RSV.preF2.1和Ad26.RSV.preF.2.2的免疫原性，比较细胞和体液免疫应答与由相同剂量的Ad26.RSV.FA2诱导的应答(即表达野生型RSV F蛋白)。将Balb/c小鼠(每组n＝4)用指定剂量的108至1010病毒颗粒(vp)Ad26.RSV.FA2或Ad26.RSV.preF2.1或Ad26.RSV.preF2.2，或者配制品缓冲液免疫。在初次给药后8周，使用ELISpot确定每106个脾细胞RSV F A2特异性IFNγ点形成单位(SFU)的数量。结果显示，与Ad26.RSV.FA2相比，Ad26.RSV.preF2.1和Ad26.RSV.preF.2.2在小鼠中诱导增加的体液免疫应答，具有广泛的中和能力和维持的细胞应答。用Ad26.RSV.preF2.1和Ad26.RSV.preF.2.2进行单次肌肉内免疫引发细胞应答(图7)，其特征在于诱导对IFNγ、IL2和/或TNFα阳性的CD8+T细胞(数据未示出)。
细胞应答的数量和质量在Ad26.RSV.preF2.1、Ad26.RSV.preF.2.2和Ad26.RSV.FA2之间是相当的。相反，Ad26.RSV.preF2.1和Ad26.RSV.preF.2.2诱导显著高于Ad26.RSV.FA2的RSV中和性抗体效价。对抗体应答的更密切分析证明，Ad26.RSV.preF2.1和Ad26.RSV.preF.2.2诱导更高水平的针对融合前F的抗体，而融合后F效价仍然与Ad26.RSV.FA2相当，导致显著增加的preF/postF抗体比率。此外，抗体应答的IgG2a/IgG1比率保持不变，表明体液应答的Th1偏斜与先前对Ad26.RSV.FA2所证实的相似(图8)。
对于Ad26.RSV.preF2.2，进一步证明了引发的抗体能够中和各种RSV A和B毒株、实验室毒株以及临床分离株，类似于对Ad26.RSV.FA2所观察到的(图9)。
随后，在棉鼠模型中评估Ad26.RSV.preF2.2和Ad35.RSV.preF2.2载体构建体的功效和免疫原性。这些动物允许人RSV复制，在第4天和第5天肺中具有峰值RSV效价。这些实验中的对照组包括鼻内感染低剂量RSV A2的组，从而模拟自然暴露，以及用FI-RSV免疫的组，其使用在稀释液(显示其诱导棉鼠中的ERD)中的临床研究中诱导增强的呼吸系统疾病(ERD)的原始批次100。
用剂量范围为从105至108vp/动物的Ad26.RSV.preF2.2或剂量范围为从106至109vp/动物的Ad35.RSV.preF2.2单次肌肉内免疫动物导致肺部完全免受疫苗同源的RSVA2毒株的感染(除了用105vp Ad26.RSV.preF2.2免疫的3只动物外)(图10A和10B)。对于两种载体均观察到鼻中RSV复制的剂量依赖性保护。对于Ad26.RSV.preF2.2，保护范围为从108vp/动物的完全保护，到105vp的部分保护，而对于Ad35.RSV.preF2.2，使用109vp免疫的动物的鼻完全免受RSV A2的感染且106vp导致部分保护(图10C和10D)。当跨剂量分析时，用Ad26.RSV.preF2.2和Ad35.RSV.preF2.2免疫的动物的鼻子比用其各自的野生型F对应物Ad26.RSV.FA2和Ad35.RSV.FA2免疫时更好地免受RSV A2感染(p＝0.0003，和p＝0,0001)。免受RSV感染伴随着针对RSV A Long的病毒中和效价的剂量依赖性诱导，其已经由应用的最低剂量的Ad26.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.preF2.2引发(图10E和10F)。VNA A Long效价的跨剂量统计学比较揭示了，Ad26.RSV.preF2.2比Ad26.RSV.FA2更具免疫原性(p＝0.0414)，而Ad35.RSV.preF2.2和Ad35.RSV.FA2之间的VNA效价的引发无显著差异。
进一步证明了，在任何测试浓度下，Ad26.RSV.preF和Ad35.RSV.preF在RSV A2激发后不诱导强化呼吸系统疾病(ERD)的组织病理学迹象。棉鼠是监测ERD最常用和研究最多的模型。在该动物模型中，在RSV激发后用FI-RSV接种持续诱导ERD，这通过对感染的肺切片的组织病理学分析以得到肺泡炎(主要由嗜中性粒细胞浸润组成)和细支气管周围炎(主要由淋巴细胞浸润组成)的参数而可见。在棉鼠中，可以从RSV感染后第1天观察到这些参数的FI-RSV诱导的评分，以及在RSV激发后4至5天观察到峰值。
在用RSV A2激发后5天通过给肺炎性变化(细支气管周围炎、血管周炎、间质性肺炎、肺泡炎)的4个参数评分来分析ERD。用FI-RSV免疫导致大多数组织病理学标志物的评分升高，这对于肺泡炎尤其明显(图11)，该标志物之前被证明是对ERD最具鉴别力的标志物。在RSV激发后，在仅接受初次给药的方案中，在通过Ad26.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.preF2.2免疫的动物中未观察到肺泡炎或任何其他ERD组织病理学标志物的增加，即使在可能诱导低亲和力和/或低水平的抗体的低疫苗剂量下也是如此(图11)。这证实了我们先前使用Ad26.RSV.FA2和Ad35.RSV.FA2载体的结果。
根据本发明，因此已显示Ad26.RSV.preF2.2和Ad35.RSV.preF2.2是表达RSV F A2(其以融合前构象形式被稳定化)的有效腺病毒载体。这些载体诱导强烈的体液和细胞免疫应答。引发的免疫应答对RSV A2激发具有保护作用，并且在体外针对RSV的临床和实验室分离株提供广泛的病毒中和。在接种疫苗的动物的RSV暴露后，在棉鼠中未观察到ERD诱导，并且因此证实了用编码野生型RSV F A2抗原的Ad26和Ad35产生的数据。注射Ad26.RSV.preF2.2或Ad35.RSV.preF2.2后，小鼠和棉鼠均未显示明显的反应原性迹象。
实例4.在人中表达融合前RSV F的RSV疫苗重组腺病毒血清型26的研究
进行这项随机、双盲、首次人体1期研究，以评估在60岁及以上、健康状况稳定的成人中间隔一年的两次接种Ad26.RSV.preF疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。该试验已在Clinicaltrials.gov上标识为NCT02926430进行了注册。
目的：
该研究的主要目的包括评估对60岁以上成年人进行肌内施用的2次单一剂量的5x1010病毒颗粒[vp]或1x 1011vp的Ad26.RSV.preF的安全性和耐受性。次要目的包括评估通过病毒中和测定(VNA)、F蛋白结合抗体(pre-F和post-F ELISA)和细胞内细胞因子染色(ICS)测量的体液和细胞免疫应答。
研究设计
这是一项单中心、随机、安慰剂对照、双盲、1期研究，以评估在72位年龄在60岁及以上且健康状况稳定的男性和女性受试者中，间隔1年施用的，2次Ad26.RSV.preF疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。并行以1:1:1:1:2的比率将受试者随机分为5组中的1组，间隔12个月接受2次单次肌肉(IM)注射研究疫苗(表1)。
安全性结果：
在第一接种后28天进行期中分析。在第1天接受5x 1010vp Ad26.RSV.preF的受试者被合并在一起(组1和2)，同样处理接受1x 1011vp Ad26.RSV.preF的受试者(组3和4)。所有72位受试者的首次剂量后的初步期中分析表明，该疫苗在两种剂量水平下均具有良好的耐受性。诱发的不良事件(AE)的中位持续时间通常范围为1至3.5天。没有严重的与疫苗相关的不良事件(SAE)，也没有AE导致退出研究。使用的两种疫苗剂量之间的反应原性没有明显差异。期中数据未显示剂量对安全性的影响。
总之，在大多数受试者中，接种后报道的全部和未诱发的AE都是轻微的，性质是短暂的，并且没有后遗症。基于以上所述，可以得出结论，两种剂量的Ad26.RSV.preF都安全且被两个剂量组的参与者耐受性良好。
免疫原性测定
Pre-F ELISA
评估了针对pre-F稳定化的构象的总IgG水平(基于RSV A2 F，GenbankACO83301.1)。pre-F蛋白经过生物素化，并被链霉亲和素包被的板依次捕获在96孔微量滴定板上。孵育连续稀释的测试样品，并用与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG抗体检测pre-F特异性抗体，然后进行化学发光反应。IC50报道为结合效价。
Post-F ELISA
评估了针对post-F蛋白的总IgG水平(RSV A2 F，Genbank ACO83301.1)。将post-F蛋白包被在96孔微量滴定板上。孵育连续稀释的测试样品，并用与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG抗体检测post-F特异性抗体，然后进行化学发光反应。IC50报道为结合效价。
RSV中和测定A2毒株(A2-FFL)或B毒株(A2-BAGdup-O36634.1F-FFL)
通过在病毒中和测定中使用A549细胞和表达萤光素酶(Luc)的RSV A2病毒(RSVA2 FFL或RSV B FFL)确定病毒中和抗体(VNA)，研究了疫苗诱导的抗体应答的功能。在单轮感染RSV A2-FFL(或B Gdup-FFL)后，根据萤火虫Luc报告基因表达的减少测量A549细胞中的中和抗体。将固定量的RSV A2 FFL(或B Gdup-FFL)与连续稀释的临床血清样品混合。孵育1小时后，将A549细胞添加至混合物中。通过Luc报告基因表达系统在20-21小时测量RSVA2-FFL(或B Gdup FFL)的感染或抑制。IC50报道为中和效价。
ELISpot
通过IFNγELISpot分析冷冻的PBMC。用与preF蛋白疫苗插入物(SEQ ID NO:1)匹配的肽池刺激PBMC。报告了模拟品刺激的PBMC减除后SFC/106刺激PBMC的数量。
CD4+和CD8+T细胞应答(ICS)
在RSV F蛋白肽刺激后，通过ICS确定表达IFNγ、IL-2和TNFα的CD4和CD8 T细胞亚群的诱导或增强。总细胞因子应答报道为产生至少IFNγ、IL-2和/或TNFα的CD4+和CD8+T细胞的百分比。对于Th1/Th2平衡，报道了表达IFNγ(Th1)或IL-4(Th2)的CD4细胞。添加并报告以单个细胞因子或其任何组合表达IFNγ、IL-2、TNFα的CD4+或CD8+T细胞的总应答(log10尺度)
免疫原性结果
体液免疫原性分析包括以下主要免疫测定(次要目的)：对RSV A2毒株进行VNA，并将ELISA与融合前和融合后F蛋白结合。此外，对RSV B毒株进行VNA。细胞免疫原性分析包括IFNγELISPOT测定。结果显示于表2-7中。
如所预期的，在基线(第1天)在所有受试者中检测到RSV F特异性的体液和细胞应答，反映出一生中自然暴露于RSV的历史(表2-5)。
表2包括针对RSV A2毒株的VNA应答的结果，以实际值的描述性统计形式呈现，且在相对应的95％置信区间(CI)下，相对于基线的倍数增加。1剂量的以5x 1010或1x 1011vp的Ad26.RSV.preF后，RSV A2中和抗体的几何平均效价(GMT)倍数升高分别为2.5和3.2。
针对RSV B毒株的VNA应答的结果显示于表3中，其还包括实际值的描述性统计，以及在相对应的95％CI下，相对于基线的倍数增加。1剂量的以5x 1010或1x 1011vp的Ad26.RSV.preF后，RSV B中和抗体的GMT倍数升高分别为3.1和3.4。因此，在接种后第28天，RSV A2和RSV B中和抗体均增加。与5x 1010vp的剂量相比，剂量为1x 1011vp的Ad26.RSVpreF导致更高的中和抗体水平。
Pre-F结合ELISA评估抗体与融合前构象的RSV F蛋白的结合，而post-F结合ELISA评估抗体与融合后构象的RSV F蛋白的结合。表2中呈现了pre-F蛋白结合抗体应答(ELISA)和post-F蛋白结合抗体应答(ELISA)的实际值的描述性统计，和在相对应的95％CI下，结果相对于基线的倍数增加。总preF IgG结合抗体显示GMT倍数增加为2.2(5x 1010vp)和2.9(1x1011vp)，而总postF IgG结合抗体显示GMT倍数增加为1.9(5x 1010vp)或2.1(1x 1011vp)倍。因此，在一个疫苗剂量后，抗体与处于融合前构象的F蛋白的结合(preF抗体)的水平和postF抗体的水平都增加。preF结合ELISA的结果遵循与VNA测定相同的模式。在接受1x 1011vp剂量的Ad26.RSV.preF组中观察到preF结合抗体的最高水平。使用5x 1010vp或1x 1011vp剂量的Ad26.RSV.preF在诱导postF抗体时未观察到剂量应答。
通过Ad26.RSV.preF诱导的T细胞应答通过IFNγELISpot测量，其中PBMC用preF蛋白肽重新刺激。表4中呈现了接种前后RSV-F特异性T细胞应答(IFNγ)实际值的描述性统计。如通过IFNγELISPOT测量的，这些老年受试者的中位细胞应答从基线的103和95增加到325和305SFU/106PBMC(分别地，5x 1010和1x 1011vp)。添加并在表5中呈现以单个细胞因子或其任何组合表达IFNγ、IL-2、TNFα的总应答CD4+T细胞。接种A26.RSV.preF后28天，观察到CD4+T细胞应答增加：中位总细胞因子应答在免疫后第1天为0.03％和0.03％，而在免疫后第28天为0.13％和0.12％(分别地，5x 1010和1x 1011vp)。表5还呈现了以单细胞因子或其任何组合形式表达IFNγ、IL-2、TNFα的总应答CD8+T细胞，中位总细胞因子应答在免疫后第1天为0.07％和0.04％，而在免疫后第28天为0.15％和0.06％(分别地，5x 1010和1x1011vp)。
如表6所示，Ad26.preF的施用改变了与融合前F结合的抗体(preF抗体)和与融合后F结合的抗体(postF抗体)之间的比率。看到接种Ad26.preF的受试者的preF/postF比率的几何平均值从基线的1.5和1.2增加到1.7至1.8(分别地，5x 1010和1x 1011vp)。因此，Ad26.RSV.preF的施用显然有利于preF结合抗体的更高的升高。
两组接种Ad26.preF的受试者的几何平均preF/VNA比率相似(5x 1010和1x1011vp)：基线时为0.8，并且在接种后28天为0.7(表7)，而在接种Ad26.preF的受试者中，几何平均postF/VNA比率在基线时为0.5和0.6，在第29天时为0.4和0.4(分别地，5x 1010和1x 1011vp)(表8)。
在先前进行的具有表达了来自RSV A2的野生型RSV F的原型Ad26.RSV FA2 RSV的临床试验VAC18192RSV1001(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02440035)和VAC18192RSV1003(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02561871)中，年龄18-50岁的健康受试者接受了5x 1010vp剂量的Ad26.RSV.FA2。接受Ad26.RSV.FA2后28天，体液和细胞免疫应答均增加。RSV中和抗体的几何平均倍数升高对于RSV A2和RSV B分别为2.0和1.9。总postFIgG结合抗体的平均倍数升高显示3.0倍的几何平均值增加，而preF IgG结合的几何平均倍数升高显示2.4倍升高。如通过IFNγELISPOT测量的，这些受试者的中值细胞应答从76增加到290SFU/106PBMC(数据未显示)。在这些用Ad26.RSV.FA2进行的临床试验中，未观察到preF/postF比率增加。更惊人的是，几何平均preF/post F比率在基线时为1.4，而在接种后28天降至1.1。几何平均preF/VNA比率在基线时为0.6，而在接种后28天时为0.7；而几何平均postF/VNA比率在基线时为0.4，并且在接种后28天时略微增加至0.6(表10-12)。
总之，根据本发明，表明在Ad26.RSV.preF(即编码处于融合前构象的RSV F蛋白的重组腺病毒，特别是SEQ ID NO:1的RSV F蛋白)的两种剂量水平的第一疫苗剂量后28天，体液免疫应答和细胞免疫应答均大大增加。用1x 1011vp剂量观察到最高的体液应答，这仍然是安全的。体液免疫应答的增强优选地针对pre-F表位，如与基线相比preF/postF结合抗体比率的变化所示。在此1期研究中，一剂量Ad26.RSV.preF是安全且耐受性良好的，并且即使在较高剂量的1x 1011vp腺病毒的情况下，也能增强经历RSV的老年人的良好体液和细胞应答。
表1：研究设计
Figure BDA0002408968990000291
a出于操作原因，第二接种可能会在第一接种后的12-14个月之间进行
Figure BDA0002408968990000292
Figure BDA0002408968990000301
Figure BDA0002408968990000311
Figure BDA0002408968990000312
Figure BDA0002408968990000321
Figure BDA0002408968990000322
Figure BDA0002408968990000331
Figure BDA0002408968990000332
Figure BDA0002408968990000341
Figure BDA0002408968990000342
Figure BDA0002408968990000351
Figure BDA0002408968990000361
Figure BDA0002408968990000362
Figure BDA0002408968990000363
Figure BDA0002408968990000371
Figure BDA0002408968990000372
序列表
RSV融合前F蛋白的氨基酸序列(与RSV A2毒株相比的突变为粗体和下划线)
SEQ ID NO:1：RSV preF2.2氨基酸序列：
Figure BDA0002408968990000381
SEQ ID NO:2：编码RSV F pre-F2.2融合前蛋白的密码子优化的核酸
Figure BDA0002408968990000382

Claims (11)

1.一种在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(RSV)的安全免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺病毒和药学上可接受的载体的组合物，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该组合物的总剂量为从约1x 1010至约2x 1011病毒颗粒(vp)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中这些组合物包含重组腺病毒和药学上可接受的载体，该重组腺病毒包含编码RSV融合(F)蛋白的核酸，该RSV融合(F)蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，这些组合物的总剂量为从约5x 1010至约1x 1011病毒颗粒(vp)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中免疫应答包括与RSV F蛋白特异性结合的抗体的诱导。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中该免疫应答包括对RSV中和抗体的诱导。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中该免疫应答包括对处于诱导融合前构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体和对处于融合后构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的诱导，并且其中在酶联免疫吸附测定(ELISA)中，对处于融合前构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的几何平均效价(GMT)增加高于对处于融合后构象的RSV F蛋白具有特异性的抗体的几何平均效价(GMT)增加。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如与在施用所述组合物之前的比率相比，在施用所述组合物之后，如在ELISA中测量的融合后F特异性抗体的几何平均效价(GMT)增加与如在VNA测定中测量的中和抗体的几何平均效价增加之间的比率降低了。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该免疫应答进一步包括细胞应答，如通过在IFNy ELISPOT中测量的产生IFNγ的T细胞所表示的，该细胞应答是响应于用覆盖SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的肽池刺激，和/或通过在用覆盖SEQ ID NO:1的RSV F蛋白的肽池刺激后，用细胞内染色(ICS)测量表达IFNγ、IL-2和TNFα的CD4和CD8 T细胞亚群所表示的。
8.根据前述权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该受试者是60岁或以上的人。
9.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该编码RSV F蛋白的核酸包含SEQID NO:2的核酸序列。
10.根据前述权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该重组腺病毒是人腺病毒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该腺病毒属于血清型26或35。
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