JP5118798B2 - アデノウイルス製剤 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、遺伝子治療および/またはワクチン用途に使用するウイルス製剤および関連医薬品に関する。本明細書に記載の特に好ましいウイルス製剤は、約2〜8℃の範囲で保存した場合の安定性の向上を示す一方で非経口投与にも適した液体アデノウイルス製剤である。これらの製剤は、緩衝液、糖、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびにフリーラジカル酸化を抑制するフリーラジカルスカベンジャーおよび/またはキレート化剤を含みうる。本発明に記載の特に好ましい安定化ウイルス製剤は、商業的に許容されうる期間にわたる約2〜8℃の範囲でのアデノウイルス製剤の安定性を増強することが本発明で示された、フリーラジカル酸化を抑制する賦形剤の1つ又はそれらの組合せの含有に基づく製剤である。
【0002】
(発明の背景)
遺伝子治療およびワクチン研究の分野において約2℃〜約8℃のような有用な温度範囲でより長期間にわたって安定である液体ウイルス製剤の開発が課題となっている。アデノウイルスベクターは、現在、遺伝子運搬/治療のための主要アプローチの1つと考えられている。遺伝子治療の分野においてアデノウイルスは高い潜在能力を有するため、2〜8℃で1〜2年の貯蔵期間を有するヒトへの非経口投与に適したウイルス製剤が依然として必要とされている。米国軍部はヒト用の生アデノウイルスワクチンを開発しているが、それらは、腸溶性カプセル経口剤形として運搬される凍結乾燥製剤であった(Chanockら,1966,J.Am.Med.Assoc.195:151−158;Griffinら,1970,Arch.Intern.Med.125:981−986;Topら,1971,J.Infect.Dis.124:148−154)。これらの初期凍結乾燥製剤中で使用される賦形剤(ゼラチン、脱脂乳、ヒト血清アルブミン)のため、これらの凍結乾燥製剤は、ヒトへの非経口投与にはあまり適しているとはいえない。アデノウイルスの構造および特定に関する報告にもかかわらず、ヒトにおける非経口投与のためのアデノウイルスの安定化および製剤化の開発に関してはほとんど公開されていない。さらに、それらの製剤の研究のほとんどは、水性製剤ではなく凍結乾燥製剤に関するものであり、これは恐らく、安定な液体製剤に対する見込みが幾分乏しいことによるものであろう。
【0003】
安定性のデータを伴うアデノウイルスの液体製剤については、限られたものではあるが幾つか報告されている。
【0004】
WO99/41416は、グリセロール、リン酸ナトリウム、トリス(Tris)およびスクロース、MgCl2およびポリソルベート80を含有するウイルス製剤を開示している。報告されている最も安定な製剤は、4℃で1年後に0.52 logの感染性の減少を示した。
【0005】
WO98/02522は、約0.75M〜1.5Mの濃度のスクロースを含有するウイルス製剤を開示している。そのような製剤は、ヒトへの非経口的使用には許容されないであろう。
【0006】
Nyberg−Hoffmanら(1999,Nature Medicine 5(8):955−956)は、トリス、スクロースおよびMgCl2を含有する凍結液体アデノウイルス製剤を開示している。
【0007】
Croyleら(1998,Pharm.Dev.Technol.3(3):373−383)は、高濃度のスクロース、トレハロースまたはソルビトール/ゼラチンと共にトリスおよびリン酸緩衝溶液を含有する凍結乾燥ウイルス製剤、凍結液体ウイルス製剤および液体ウイルス製剤を開示している。
【0008】
したがって、2〜8℃で約1〜2年間にわたり安定であり非経口投与に適した組換えウイルス液体製剤の開発が依然として必要とされている。そのような液体製剤は、より低いコスト、開発期間の削減および顧客の使用し易さなどの利点をもたらす。本発明は、2〜8℃の範囲の温度でより長期間にわたる増強された安定性を示す改良された組換えウイルス液体製剤を開示することにより、これらの要求について検討し、それらを満足させるものである。
【0009】
(発明の概要)
本発明は、遺伝子治療および/またはワクチン用途に使用する安定化されたウイルス製剤および関連医薬品に関する。本明細書に開示する好ましいウイルス製剤は、組換えアデノウイルスを含む液体製剤、約2〜8℃の範囲内およびそれ以上の温度で保存した場合に改善されたウイルス安定性を示すと同時に非経口投与にも適した製剤に関連づけられうる。これらの製剤は、緩衝液、糖、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびに含まれるウイルスの安定性を増強する追加的な成分、例えばフリーラジカルスカベンジャーおよび/またはキレート化剤(これらに限定されるものではない)を含みうる。本発明の、アデノウイルスに基づく製剤は、2年近くの期間にわたる2〜8℃およびそれ以上の温度での長期保存に適している。保存安定性の増強を示す本発明の組換えウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ロトウイルス、ポックスウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましいウイルスは、ヒトAd5、Ad2、Ad6、Ad24血清型を含む(これらに限定されるものではない)アデノウイルスであり、特に、ヒトへの遺伝子治療またはヒトへの遺伝子に基づくワクチン接種技術、例えば、遺伝子に基づくそのようなワクチン接種技術を用いる予防的または治療的用途(これらに限定されるものではない)に使用する組換えアデノウイルスである。
【0010】
本発明の製剤は、(i)最適には、緩衝液溶液であり、さらに、(ii)最低限度の量の少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、(iii)二価陽イオン、(iv)凍結保護剤、(v)塩を含み、(vi)好ましくは、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する1以上の追加的な賦形剤を含む。本発明の製剤は、2〜8℃以上の温度での長期安定性を促進すると同時に該製剤を非経口注射、特に筋肉内注射に有用なものとする有用な範囲の全浸透圧モル濃度に基づく。
【0011】
この目的において、本発明の第1の実施形態は、該緩衝液としてのトリス、該凍結保護剤としてのスクロース、該塩としてのNaCl、該二価陽イオンとしてのMgCl2、および該界面活性剤としてのポリソルベート(Polysorbate)−80またはポリソルベート−40を含む一連のアデノウイルス製剤(組換えアデノウイルスを含むがこれに限定されるものではない)に関する。
【0012】
本発明の第2の実施形態は、本明細書に記載のウイルス製剤(この場合もまた、遺伝子治療および/または遺伝子ワクチン接種技術において有用なトランスジーンまたはその一部を含有する組換えアデノウイルスを含むアデノウイルスを含むが、これらに限定されるものではない)の短期および長期安定性を増強することが本発明で示された、金属イオンキレート化剤およびヒドロキシルラジカルスカベンジャーの両方を含むフリーラジカル酸化の阻害剤の1以上の含有に関する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する1以上の成分を含有するウイルス製剤である。これらの成分の添加は、これらの阻害剤を含有しないコア製剤と比較して、2〜8℃以上の範囲の温度における長期安定性を増強することが、本発明で示される。これらの製剤はまた、非経口投与に適している。この目的において、本発明は、ウイルス含有製剤の安定性を有効に増強するフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも1つを含有するウイルス製剤に関する。例示しているアデノウイルスに基づく製剤、例えばA113は、好ましい製剤を代表するものであるが、これらの製剤は、代替的な製剤成分に基づく追加的な製剤および使用方法に対する限定を何ら示唆するものではない。
【0013】
本発明の第3の主要実施形態は、本明細書の全体に記載している条件およびウイルス製剤の長期安定性を有効に増強することが示されている有効量のプラスミドDNAを単独で又はフリーラジカル酸化阻害剤と共に含有することを含む。したがって、本発明はまた、添加されるとウイルス含有製剤の安定性を有効に増強する量の核酸を含有するウイルス製剤に関する。
【0014】
2〜8℃までの範囲での長期安定性の増強は、本明細書に開示するウイルス製剤の貯蔵期間の延長をもたらし、許容されうるウイルス感染性の減少を伴う約1〜2年の期間にわたるこれらの液体製剤の保存および最終的な宿主投与を可能にする。また、本発明の製剤は、延長された凍結/融解サイクルにわたる安定性を示す。
【0015】
(図面の簡単な記載)
図1は、製剤A101〜A107におけるAd5gagの回収/安定性に対する1サイクルの凍結/融解(−70℃〜5℃)の効果を示す。
【0016】
図2は、製剤A101〜A107におけるAd5gagの回収/安定性に対する1〜3サイクルの凍結融解の効果を示す。
【0017】
図3は、製剤A101〜A107におけるAd5gagの感染性の減少を示す。
【0018】
図4は、108、1010および1011vp/mLのA105中のAd5gagの安定性に対する12サイクルの凍結/融解の効果を示す。
【0019】
図5は、凍結、融解および15℃でのインキュベーションがA105中のAd5gagの感染性に与える効果を示す。
【0020】
図6は、1×107vp/mLおよび1×109vp/mLの製剤A102、A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(72時間)を示す。
【0021】
図7は、2〜8℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日まで)を示す。
【0022】
図8は、15℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【0023】
図9は、25℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【0024】
図10は、37℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【0025】
図11は、pH7.4およびpH8.6におけるAd5gagの不活性化のアレニウスプロットを示す。
【0026】
図12は、2〜8℃、15℃および25℃におけるAd5gagの感染性に対するpHの効果を示す。
【0027】
図13は、15℃および25℃におけるAd5gagの長期安定性(12ヶ月間まで)に対するpHの効果を示す。
【0028】
図14は、2〜8℃におけるAd5gagの長期安定性(12ヶ月間まで)に対するpHの効果を示す。
【0029】
図15は、2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するMgCl2の効果を示す。
【0030】
図16は、30℃におけるAd5gagの安定性に対するMgCl2濃度の効果を示す。
【0031】
図17は、2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)の効果を示す。
【0032】
図18は、2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)濃度の効果を示す。
【0033】
図19は、1ヶ月間にわたる25℃および30℃でのAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)濃度の効果を示す。
【0034】
図20は、25℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート型(PS−80およびPS−40)の効果を示す。
【0035】
図21は、37℃における安定性に対するウイルス濃度の効果を示す。
【0036】
図22は、Ad5gagの安定性に対するアスコルビン酸および鉄の効果を示す。
【0037】
図23は、2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対する酸化阻害剤の効果を示す。
【0038】
図24は、107および109vp/mLにおける−70℃および−15℃でのAd5gagの安定性を示す。
【0039】
図25は、109vp/mLおよび1011vp/mLにおける−70℃でのA105中のAd5gagの安定性を示す。
【0040】
図26は、109vp/mLおよび1011vp/mLにおける−15℃でのA105中のAd5gagの安定性を示す。
【0041】
図27は、1ヶ月間にわたる25℃および30℃でのAd5gagの安定性に対するPS−80およびEDTA/エタノールの組合せの効果を示す。
【0042】
図28は、製剤A113、A132、A133、A134、A135、A136およびA137で示された1ヶ月間および2ヶ月間にわたる30℃でのAd5gagの安定性に対する種々の酸化阻害剤の効果を示す。
【0043】
図29は、2〜8℃での18ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの長期安定性を示す。
【0044】
図30は、2〜8℃での1ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの長期安定性を示す。
【0045】
図31は、2〜8℃および15℃での9ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの安定性を示す。
【0046】
図32は、2〜8℃および15℃での9ヶ月間の保存の後の、TransgeneおよびSchering−Ploughにより開示されている製剤中のAd5gagの安定性と比較した場合の、本発明の選択された製剤中のAd5gagの安定性を示す。
【0047】
(発明の詳細な記載)
本発明は、個々のウイルス成分を安定化する製剤、好ましくは遺伝子治療および/またはワクチン用途に使用される医薬品に関する。本発明に開示する好ましい安定化ウイルス含有製剤は、約2〜8℃以上の範囲で保存した場合に改善された安定性を示すと同時に非経口投与にも適した液体アデノウイルス製剤である。それぞれのウイルス(例えば、組換えアデノウイルス)を安定化しうるこれらの好ましい製剤は、緩衝液、糖、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびに該添加ウイルスの安定性を増強する追加的な成分、例えば、フリーラジカルスカベンジャーおよび/またはキレート化剤(すなわち、フリーラジカル酸化の阻害剤)(これらに限定されるものではない)を含みうる。−70℃および−20℃での長期間にわたる優れたウイルス安定性に加えて、種々の濃度のアデノウイルスを含む製剤は、少なくとも1〜2年間までの期間にわたる2℃〜8℃以上での長期保存に適している。長期保存安定性の増強を示しうるウイルス製剤は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ロトウイルス、ポックスウイルスを含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。好ましいウイルスは、ヒトアデノウイルス、特に、動物において、無視しうる腫瘍増殖を示す又は腫瘍増殖を全く示さない亜群、例えば、亜群C(Ad1、Ad2、Ad5およびAd6)、亜群D(Ad8、Ad9、Ad10、Ad13、Ad15、Ad17、Ad19、Ad20、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad27、Ad28、Ad29、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad37、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad44、Ad45、Ad46およびAd4)および亜群E(Ad4)からの血清型である。包括的なアデノウイルス分類法については、Fundamental Virology,第3版,Ch.30,p.980,Fieldsら編,1996,Lippincott−Ravenを参照されたい。特に好ましい血清型は、選ばれたC血清型Ad5、Ad2およびAd6、ならびに亜群D血清型Ad24である。本明細書に記載の指針によれば、当業者は、本明細書に開示する製剤を、例示されていないアデノウイルス血清型および他のウイルスに適合させることが可能である。この目的において、本発明は、別の精製ウイルスを安定化するためのこれらの製剤の使用、およびその組成物に関する。
【0048】
本発明の製剤は、種々の程度のウイルス濃度においてアデノウイルスに安定性をもたらし、種々の脊椎生物、好ましくは哺乳類、特にヒトに投与することができる。本発明の安定化ウイルス製剤は、好ましくは、組換えアデノウイルスに基づく組成物であり、例えばワクチンとして投与した場合に、未感染個体に予防上の利点をもたらし、および/または、感染個体内のウイルス負荷(viral load)レベルを減少させて個々の微生物感染(例えば、HIV感染)の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらしうる。本発明の好ましい態様は、約1×107vp/mL(ウイルス粒子/ミリリットル)〜約1×1013vp/mLの範囲のウイルス濃度を有する本明細書に記載の安定性特性の増強を示す組換えアデノウイルス製剤(すなわち、当業者に利用可能な任意の哺乳類/ヒト遺伝子治療または遺伝子ワクチンに基づく方法の場合のような宿主への投与の後に標的宿主内で発現されるトランスジーンの全部または一部を含有するアデノウイルス)である。より好ましい範囲は、約1×109vp/mL〜1×1012vp/mLであり、特に好ましいウイルス濃度は、約1×1011vp/mL〜1×1012vp/mLである。本発明の製剤の治療用、予防用または診断用組成物は、それぞれの障害を治療、予防または診断するのに十分な量で個体に投与する。もちろん、ヒトへの投与のための有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢のような種々の要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含まれる。ヒト投与対象(レシピエント)に投与される発現可能なDNAの量は、組換えウイルス構築物中で使用する転写および翻訳プロモーターの強度に左右され、そしてワクチンとして使用される場合には、発現された遺伝子産物の免疫原性、およびアデノウイルスのようなウイルスに対する既存免疫のレベルに左右される。本発明の製剤は、最適には、緩衝溶液である。生理的に許容される緩衝液中の本発明のウイルス製剤、好ましくは、約7.0〜約9.0を含む(これらに限定されるものではない)pH範囲内、好ましくは、約7.5〜約8.5のpH範囲内のトリス(トロメタミン)、ヒスチジン、ホスファート、シトラート、スクシナート、アセタート、グリシンおよびボラートで緩衝化された製剤(これらに限定されるものではない)を提供することは、当業者に公知であろう。本明細書に開示する例示されている製剤においては、トリスが好ましい。
【0049】
本発明の製剤のもう1つの態様は、容器表面への吸着を減少させ恐らくはウイルスの安定性の増強をもたらすために加えられる少なくとも1つの非イオン性界面活性剤の最小量を含む製剤に関する。本発明の製剤中で使用する非イオン性界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン、例えばポリソルベート(Polysorbate)−80(Tween 80(登録商標))、ポリソルベート−60(Tween 60(登録商標))、ポリソルベート−40(Tween 40(登録商標))およびポリソルベート−20(Tween 20(登録商標))(これらに限定されるものではない)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばBrij58(登録商標)、Brij 35(登録商標)(これらに限定されるものではない)、ならびにその他、例えばTriton X−100(登録商標)、Triton X−114(登録商標)、NP40(登録商標)、Span85およびPluronicシリーズの非イオン界面活性剤(例えばPluronic 121)が含まれる。
【0050】
該添加ウイルス成分を更に安定化する追加的な成分は、MgCl2、CaCl2およびMnCl2を含む(必ずしもこれらに限定されるものではない)二価陽イオンの塩の少なくとも1つの添加を含む。好ましい二価陽イオンは、約0.1mM〜約5mMの範囲の濃度のMgCl2およびCaCl2である。
【0051】
大きな温度範囲および長い保存期間にわたるウイルスの安定化に寄与するもう1つの成分は、凍結保護剤、特に、ヒトへの投与に適した濃度の凍結保護剤である。凍結保護剤は、ポリヒドロキシ炭化水素、例えばソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトール、および/または二糖類、例えばスクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースの添加を含む。
【0052】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤の追加的な成分は、宿主にとって生理的に許容されるイオン強度で存在する塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムを含む(これらに限定されるものではない)塩を含む。該製剤中に塩を含有させる目的は、所望のイオン強度または浸透圧モル濃度を得ることにある。イオン強度への寄与は、緩衝化合物により生成されるイオンから及び非緩衝塩のイオンから生じうる。
【0053】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤の中心的要素は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する成分の含有に関する。本明細書の全体にわたり示されているとおり、医薬製剤におけるウイルス安定性は、緩衝液のタイプ、塩濃度、pH、光暴露、保存温度などにより影響されうる。また、フリーラジカル酸化を抑制しうる成分は、本明細書に開示する中心的アデノウイルス製剤の安定性特性を更に増強することが、本発明で示されている。使用されうるフリーラジカル酸化阻害剤には、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、またはそれらの特定の組合せが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。フリーラジカル酸化の阻害剤はEDTA/EtOHの組合せ、EtOHのみ、またはトリエタノールアミン(TEOA)であることが好ましい。他の成分との組合せが該フリーラジカル酸化阻害剤の有効性を決定しうることが、本発明で示されている。例えば、EDTA/EtOHの組合せは安定性の増強に非常に有効であることが示されており、MgCl2の不存在下のDTPA(単独)も安定性を増強する。したがって、当業者は、種々の成分を「混合し調整する」ことが可能であり、いくつかの場合にはスカベンジャーおよびキレート剤が必要であり、一方、他の製剤ではキレート剤のみが必要かもしれない。好ましくは、キレート剤の選択が、スカベンジャーの添加が必要か否かを決定する。追加的なフリーラジカルスカベンジャーおよびキレート剤は当技術分野で公知であり、本明細書に記載の製剤および使用方法に適用される。フリーラジカル酸化のそのような阻害剤の添加は、液体ウイルス製剤の長期安定性における実質的な増強をもたらすことが、本明細書に開示されている。本発明は、本明細書に開示する好ましい製剤のみにおけるこれらの賦形剤の使用に限定されるものではなく、実際には、これらの化合物の1以上の添加による有用な温度範囲内での安定性の増強に適した追加的な例示されていないウイルス製剤も包含する意であることが注目される。
【0054】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤は、2〜8℃以上の温度での長期安定性を促進すると同時に該製剤を非経口的(特に筋肉内)注射に有用なものとする全浸透圧モル濃度の有用な範囲に基づく。この目的のための全浸透圧モル濃度(溶液中の分子の総数)の有効範囲は、約200mOs/L〜約800mOs/Lであり、好ましい範囲は約250mOs/L〜約450mOs/Lである。本明細書に開示する製剤のための特に好ましい浸透圧モル濃度は、約300mOs/Lである。したがって、該溶液の全浸透圧モル濃度が適当な範囲内に維持されるためには、スクロースまたはソルビトールのような凍結保護剤の量が製剤中の塩の量に左右されることが明らかである。したがって、塩を含有しない製剤は約5%〜約25%のスクロースを含有することが可能であり、好ましいスクロース範囲は約7%〜約15%であり、塩を含有しない製剤中の特に好ましいスクロース濃度は10%〜12%である。あるいは、塩を含有しないソルビトールに基づく製剤は、約3%〜約12%の範囲内のソルビトールを含有することが可能であり、塩を含有しない製剤中では、好ましい範囲は約4%〜7%であり、特に好ましい範囲は約5%〜約6% ソルビトールである。もちろん、有効な浸透圧モル濃度のレベルを維持するためには、塩を含有しない製剤では、それぞれの凍結保護剤の範囲の増大が保証される。再び限定例ではない具体例としてスクロースおよびソルビトールを挙げると、75mM NaCl中のスクロースに基づく溶液の有効な範囲は約2%〜約7.5% スクロースであり、75mM NaCl中のソルビトールに基づく溶液は約1%〜約4% ソルビトールである。
【0055】
前記の考察を考慮すると、本発明は、ウイルス安定性特性の増強を示し少なくとも緩衝液、塩、糖および界面活性剤を含有する、遺伝子治療および/または遺伝子ワクチン接種用途に使用するアデノウイルス(例えば、組換えアデノウイルス)を含有する製剤に関する。
【0056】
本発明の特定の実施形態は、該緩衝液としてのトリス、該凍結保護剤としてのスクロース、該塩としてのNaCl、該二価陽イオンとしてのMgCl2および該界面活性剤としてのポリソルベート−80またはポリソルベート−40を含むそのような組換えアデノウイルス製剤に関する。
【0057】
本発明の特定の実施形態においては、該製剤はpH約7.5〜pH約8.5の範囲までトリスで緩衝化され、スクロースが、該塩濃度に応じて10%(重量対容量)以上の範囲内で添加され、該塩が、全浸透圧モル濃度が約200mOs/L〜約800mOs/Lの範囲となるように該スクロース濃度を相補するためにNaCl 250mM以上の範囲内の濃度で添加されるNaClであり、該二価陽イオンが約0.1mM〜約10mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約1%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約1%の濃度のポリソルベート−40である。
【0058】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤はpH約7.5〜pH約8.5の範囲まで約1mM〜約10mM トリスで緩衝化され、スクロースが約2%〜約8%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約25mM〜約250mMの範囲で存在し、該スクロース濃度およびNaCl濃度が、全浸透圧モル濃度が約200mOs/L〜約800mOs/Lの範囲となるように相補的であり、該二価陽イオンが約0.1mM〜約5mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.25%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.25%の濃度のポリソルベート−40である。
【0059】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤は約8.0のpHまで約2.5mM〜約7.5mM トリスで緩衝化され、スクロースが約2%〜約8%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約25mM〜約250mMの範囲で存在し、該スクロースおよびNaClが、約250mOs/L〜約450mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約0.5mM〜約2.5mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−40である。
【0060】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤は約8.0のpHまで約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約4%〜約6%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約50mM〜約100mMの範囲で存在し、該スクロースおよびNaClが、約250mOs/L〜約450mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約1mM〜約2mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−40である。
【0061】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約5%(重量対容量)で存在し、NaClが約75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約300mOs/Lであり、MgCl2が約1mM〜2mMで存在し、ポリソルベート−80が約0.02%の濃度で存在するか又はポリソルベート−40が約0.005%の濃度で存在する。
【0062】
本発明の例示されている1つの態様においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約310mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、A105と称される。
【0063】
もう1つの具体例は、PS−80が0.005%で存在するA105とは対照的に、少なくとも0.1%までの有効なPS−80の範囲を示す。この製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、MgCl2が1mMであり、ポリソルベート−80が0.1%の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、A111と称される。
【0064】
本発明のもう1つの実施形態は、pH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化される製剤により例示され、スクロースが約5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−40が0.005%の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、実施例1に示すとおり、A128と称される。
【0065】
さらにもう1つの具体例は、ポリソルベートが、ポリソルベート−40の有効範囲を示す0.1%の濃度で存在する以外はA128と同一の製剤である。この製剤は、本発明では、実施例1に示すとおり、A129と称される。
【0066】
本発明は更に、前記成分のうちの少なくとも1つの成分を省いた組換えアデノウイルス製剤に関する。それらには、製剤A108(二価陽イオンを含有しない)または製剤A109(界面活性剤を含有しない)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0067】
本発明の必須の特性は、非還元性フリーラジカルスカベンジャーおよび/またはキレート剤が、ウイルス製剤、特に本明細書に開示する組換えアデノウイルス製剤の短期保存および長期保存の両方の安定性を最大にするのに重要であるという知見にある。この目的において、そして前記のとおり、本発明の決定的に重要な好ましい実施形態は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する1以上の成分を含有するウイルス製剤である。これらの成分の添加は、これらの阻害剤を含有しないコア製剤と比較して、2〜8℃の範囲まで又はそれ以上の温度での長期安定性を増強することが、本明細書に示されている。また、これらの製剤は非経口投与に適している。保存中の感染性の喪失をもたらすアデノウイルス不活性化の主要経路は酸化であることが、これらの製剤の安定性の増強から示される。
【0068】
本発明は、pH約7.5〜pH約8.5の範囲までトリスで緩衝化された組換えアデノウイルス製剤に関する。この場合、スクロースが、該塩濃度に応じて10%(重量対容量)以上の範囲内で添加され、該塩が、全浸透圧モル濃度が約200mOs/L〜約800mOs/Lの範囲となるように該スクロース濃度を相補するためにNaCl 250mM以上の範囲内の濃度で添加されるNaClであり、該二価陽イオンが約0.1mM〜約10mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約2%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約1%の濃度のポリソルベート−40である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の1以上の成分、例えば、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(必ずしもこれらに限定されるものではない)を含む。
【0069】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤はpH約7.5〜pH約8.5の範囲まで約1mM〜約10mM トリスで緩衝化され、スクロースが約2%〜約8%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約25mM〜約250mMの範囲で存在し、該スクロース濃度およびNaCl濃度が、全浸透圧モル濃度が約200mOs/L〜約800mOs/Lの範囲となるように相補的であり、該二価陽イオンが約0.1mM〜約5mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.25%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.5%の濃度のポリソルベート−40である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の1以上の成分、例えば、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)およびジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(必ずしもこれらに限定されるものではない)を含む。
【0070】
本発明のもう1つの特定の実施形態においては、該製剤は約8.0のpHまで約2.5mM〜約7.5mM トリスで緩衝化され、スクロースが約2%〜約8%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約25mM〜約250mMの範囲で存在し、該スクロースおよびNaClが、約250mOs/L〜約450mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約0.5mM〜約2.5mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.05%の濃度のポリソルベート−40である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の1以上の成分、例えば、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)およびジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(必ずしもこれらに限定されるものではない)を含む。
【0071】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤は約8.0のpHまで約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約4%〜約6%(重量対容量)の範囲で存在し、NaClが約50mM〜約100mMの範囲で存在し、該スクロースおよびNaClが、約250mOs/L〜約450mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約1mM〜約2mMの範囲のMgCl2であり、該界面活性剤が約0.001%〜約0.1%の濃度のポリソルベート−80または約0.001%〜約0.01%の濃度のポリソルベート−40である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の1以上の成分、例えば、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(必ずしもこれらに限定されるものではない)を含む。
【0072】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが約5%(重量対容量)で存在し、NaClが約75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約300mOs/Lであり、MgCl2が約1mMで存在し、ポリソルベート−80が約0.02%の濃度で存在するか又はポリソルベート−40が約0.005%の濃度で存在する。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の1以上の成分、例えば、エタノール(EtOH)、EDTA、EDTA/エタノールの組合せ、トリエタノールアミン(TEOA)、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)(必ずしもこれらに限定されるものではない)を含む。
【0073】
前記製剤においては、少なくとも1つの非還元性フリーラジカルスカベンジャーを、該コア製剤の安定性を有効に増強する濃度まで加えることができる。特に有効な範囲は、(i)約1μM〜約500μM、好ましくは約50μM〜約250μMの範囲、特に好ましくは100μMまたはその付近の濃度のEDTA、(ii)約0.1%〜約5.0%、好ましくは約0.25%〜約2.0%の範囲、特に好ましくは全量が0.5%またはその付近のエタノール、(iii)約1μM〜約500μM、好ましくは約50μM〜約250μMの範囲、特に好ましくは100μMまたはその付近の濃度のDTPA、(iv)約0.1mM〜約10mM、好ましくは約0.5mM〜約5mMの範囲、特に好ましくは1mMまたはその付近の濃度のCaCl2、(v)約1mM〜約100mM、好ましくは約5mM〜約25mMの範囲、特に好ましくは10mMまたはその付近の濃度のクエン酸ナトリウムを含む。また、フリーラジカル酸化のこれらの阻害剤は種々の組合せで加えることが可能であり、それらは、2つのスカベンジャー(例えば、113)、単体(例えば、A114)、または二価陽イオンのような別の成分の不存在下の可能な単体スカベンジャー(例えば、A116)を含むが、これらに限定されるものではない。
【0074】
もう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A113と称される。
【0075】
もう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約310mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、トリエタノールアミン(TEOA)が1mMで存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A114と称される。
【0076】
もう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約350mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、クエン酸ナトリウムが10mMで存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A115と称される。
【0077】
更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、DTPAが100μMで存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A116と称される。
【0078】
更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、DTPAが100μMで存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A116と称される。
【0079】
もう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリス−HClで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、マンニトールが3%(w/v)で存在する。この製剤は、本発明では、A121と称される。
【0080】
更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、エタノールが0.5%(A132)および1.0%(A134)の濃度で存在する。これらの2つの製剤は、実施例1に開示されている。
【0081】
もう1つの実施形態は、pH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約310mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A133と称される。
【0082】
もう1つの好ましい実施形態は、pH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約500mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが1.0%で存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A135と称される。
【0083】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.1%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在する。この製剤は、本発明では、実施例1にも示すとおり、A136と称される。
【0084】
前記のとおり、MgCl2のような好ましい二価陽イオンを異なる二価陽イオンCaCl2で置換することも本発明の範囲内である。そのような置換は、本明細書に開示する製剤のいずれかに関連づけられうる。そのような置換の一例は製剤A120であり、これは、pH8.0で5.0mM トリス−HClを含み、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、CaCl2が1mMで存在する。製剤A120は実施例1に示されている。
【0085】
本発明は更に、前記の成分のうちの少なくとも1つの成分を省いた組換えアデノウイルス製剤に関する。それらには、製剤A116(賦形剤:100μMのDTPA;二価陽イオンは含有しない)、製剤A117(賦形剤:100μMのEDTAおよび0.5%のEtOH;二価陽イオンを含有しない)、製剤A118(1.0mMのトリエタノールアミン;二価陽イオンを含有しない)、製剤A119(賦形剤:10mMのクエン酸ナトリウム;二価陽イオンを含有しない)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0086】
本発明は更に、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する前記賦形剤に加えて、プラスミドDNAを約0.01mg/ml〜約10mg/mlの濃度で更に含む組換えウイルス製剤に関する。プラスミドDNAの添加は、本明細書に例示する組換えアデノウイルスのような組換えウイルス製剤の安定性を有効に増強する。したがって、任意のコア製剤(例えば、フリーラジカル酸化阻害剤のような追加的な賦形剤を含有しないA105およびA128)に及びそのような賦形剤を含むコア製剤に、プラスミドDNAを加えることができる。該プラスミドDNAのための好ましい濃度範囲は約0.5mg/l〜約5.0mg/mlであり、さらに好ましいプラスミドDNA濃度は1mg/mlである。
【0087】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリス−HClで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、プラスミドDNAが1mg/mlで存在する。この製剤は、本発明では、A137と称される。
【0088】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、プラスミドDNAが1mg/mlで存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A138と称される。
【0089】
本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、該製剤はpH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化され、マンニトールが2.7%(重量対容量)(147mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A149と称される。
【0090】
もう1つの実施形態は、pH8.0で約5.0mM トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、ヒスチジンが5mMで存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A151aと称される。
【0091】
本発明のもう1つの実施形態は、30℃、pH7.5で約5.0mM トリスで緩衝化された製剤を開示し、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が1mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、ヒスチジンが5mMで存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A151bと称される。
【0092】
本発明のもう1つの実施形態においては、該製剤は30℃、pH7.5で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が2mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、ヒスチジンが5mMで存在し、トリエタノールアミンが5mMで存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A152と称される。
【0093】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、該製剤は30℃、pH7.5で約5.0mM トリスで緩衝化され、スクロースが5%(重量対容量)(146mM)で存在し、NaClが75mMで存在し、全浸透圧モル濃度が約400mOs/Lであり、MgCl2が2mMで存在し、ポリソルベート−80が0.005%の濃度で存在し、EDTAが100μMで存在し、エタノールが0.5%で存在し、ヒスチジンが5mMで存在し、トリエタノールアミンが5mMで存在し、グリセロールが5%(v/v)で存在する。この製剤は、実施例1に示すとおり、A153と称される。
【0094】
前記のとおり、本発明の化合物を使用する投与計画は、患者のタイプ、アデノウイルスに対する既存免疫のレベル、種、年齢、体重、性別および医学的状態;治療すべき状態の重症度;投与経路;患者の腎、肝および心臓血管機能;および使用するその個々の化合物を含む種々の要因に応じて選択される。通常の技量を有する医師または獣医は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該薬物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、薬物の分布、平衡および消失に関する考慮を含む。
【0095】
また、本明細書に記載の製剤化された組換えウイルスは、発現されるトランスジーンの免疫原性を増強しうるアジュバントと共に製剤化することができる。多数のこれらのアジュバントが当技術分野で公知であり利用可能であり、それらには、サポニン、モノホスホリルリピドA、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとから構成される非イオン性ブロック共重合体、または発現トランスジーンの免疫原性を増強する他の化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の組換えウイルスと共に使用するもう1つのアジュバントとしては、1以上の形態のリン酸アルミニウムに基づくアジュバント(このリン酸アルミニウムに基づくアジュバントは約0.9のモルPO4/Al比を有する)が挙げられる。更なる無機質に基づくアジュバントを1以上の形態のリン酸カルシウムから得ることが可能である。DNAワクチンアジュバントとして使用するこれらの無機質に基づく化合物は、PCT国際出願番号PCT/US98/02414(WO 98/35562)(それを参照により本明細書に組み入れることとする)に開示されている。
【0096】
本明細書に記載の組換えウイルス製剤は、当技術分野で公知のいずれかの手段(例えば、腸内および非経口経路)により脊椎動物宿主(好ましくは、哺乳類宿主、特に、ヒト・レシピエント)に投与される。これらの運搬経路は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内運搬、経口運搬、舌下投与、皮下投与、経皮(transdermal)投与、経皮(transcutaneous)投与、経皮(percutaneous)投与または任意の形態の粒子射撃、例えばバイオロスチック(biolostic)装置、例えば「遺伝子銃」または入手可能な任意の無針(needle−free)注射装置によるものを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の組換えウイルスのの好ましい運搬方法は、筋肉内注射および無針注射である。特に好ましい方法は筋肉内運搬である。
【0097】
本明細書に開示する製剤組成物によれば、本発明はまた、本明細書に開示するウイルス含有製剤を作製することを含んでなる、ウイルス製剤を安定化する方法に関する。そのような製剤は、約2〜8℃の範囲およびそれ以上で保存した場合にウイルス安定性の改善をもたらすと同時に、非経口投与、特にヒトへの非経口投与に適している。したがって、これらの定められた方法は、開示されている、特に例示されている本発明のウイルス含有製剤に関する。また、本発明は、得られる製剤が約2〜8℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるようフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも1つを該製剤に加えることを含んでなるウイルス製剤の安定化方法に関する。また、本発明は、得られる製剤が同様に約2〜8℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるよう核酸を該製剤に加えることを含んでなるウイルス製剤の安定化方法に関する。したがって、本発明は、関心のあるウイルス、好ましくは組換えウイルスを本明細書に記載の任意の製剤中に維持することを含んでなるウイルス製剤の安定化方法、特に、得られる製剤が同様に約2〜8℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるよう、該製剤へのフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも1つの添加および/または核酸の添加により該ウイルスを維持することを含んでなる方法に関する。
【0098】
以下の実施例は、本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【0099】
材料
FL HIV−gagトランスジーンを含有するアデノウイルス5型(Ad5gag)を、これらの実験に使用した。このAd5FLHIVgag組換えウイルスは、参照により本明細書に組み入れる1999年8月13日付け出願の米国仮特許出願60/148、981に詳細に記載されている。該組換えAd5gagウイルスは、カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【0100】
方法:
1.TCID50アデノウイルス感染性アッセイ:
TCID50アッセイは、96ウェルフォーマットにおいてTCID50端点希釈法を用いてアデノウイルスの感染性を力価測定するための方法である。アデノウイルスに感染した該96ウェルプレートの各ウェル中の細胞は、テトラゾリウム色素(MTS)に基づくウイルス染色法を用いて表示される。ウェル当たりの発色の量は、アデノウイルスの複製の程度を反映する生きた細胞の量と相関づけられる。
【0101】
2.QPAアデノウイルス感染性アッセイ
該QPAアッセイは、細胞への感染の24時間後の蓄積アデノウイルスゲノムを定量するためのQ−PCR技術の利用に基づくアデノウイルスの感染性の迅速定量のための方法である。
【0102】
以下の実施例は、本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【0103】
実施例1
例示されている製剤の番号および成分
製剤番号は、付随する安定性のデータと共に本明細書の特許請求の範囲を支持する例示製剤を表す。
【0104】
製剤番号 説明
A101 10mM トリス、10% グリセロール(v/v)、1mM MgCl2、pH7.5。
A102 6mM リン酸塩、150mM NaCl、10% グリセロール(v/v)、pH7.2。
A103 6mM リン酸塩、150mM NaCl、pH7.2。
A104 5mM トリス、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A105 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A106 5mM トリス、14% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A107 5mM トリス、8% ソルビトール(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A108 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、pH8.0。
A109 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、pH8.0。
A110 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.02% PS−80、pH8.0。
A111 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、pH8.0。
A112 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0、100μm DTPA、pH8.0。
A113 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A114 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、1.0mM TEOA、pH8.0。
A115 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、10mM クエン酸ナトリウム、pH8.0。
A116 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、100μM DTPA、pH8.0。
A117 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A118 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、1.0mM TEOA、pH8.0。
A119 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、10mM クエン酸ナトリウム、pH8.0。
A120 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、1mM CaCl2、pH8.0。
A121 5mM トリス、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、3%(w/v)マンニトール、0.005% PS−80、pH8.0。
A125 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、10mM アスコルビン酸、0.005% PS−80、pH8.0。
A126 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.05% PS−80、pH8.0。
A127 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.15% PS−80、pH8.0。
A128 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−40、pH8.0。
A129 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−40、pH8.0。
A130 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A131 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、5mM MgCl2、0.005% PS−80、pH8.0。
A132 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、0.5% EtOH、pH8.0。
A133 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、pH8.0。
A134 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、1.0% EtOH、pH8.0。
A135 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、1.0% EtOH、pH8.0。
A136 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A137 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、HIV−1 gag配列を含む1mg/ml プラスミドDNA、pH8.0。
A138 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、HIV−1 gag配列を含む1mg/ml プラスミドDNA、pH8.0
A149 5mM トリス、75mM NaCl、2.7%(w/v)マンニトール、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A151a 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、pH8.0。
A151b 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5。
A152 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、5mM TEOA、30℃でpH7.5。
A153 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、5mM TEOA、5%(v/v)グリセロール、30℃でpH7.5。
A155 15mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A159 5mM トリス、75mM NaCl、2.7% マンニトール(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、pH8.0。
A160 5mM トリス、75mM NaCl、2.7% マンニトール(w/v)、1mM MgCl2、0.005% PS−80、100μM EDTA、5mM ヒスチジン、pH8.0。
A165 5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5。
A166 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、7.5mM ヒスチジン、1mM TEOA、pH7.6。
A167 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、10mM ヒスチジン、1mM TEOA、pH8.0。
A168 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、7.5mM ヒスチジン、1mM TEOA、1.0% マンニトール、pH7.7。
A169 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、10mM ヒスチジン、1mM TEOA、1% マンニトール、pH8.0。
A170 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、10mM ヒスチジン、pH8.0。
A171 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.1% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、10mM ヒスチジン、1mM TEOA、1% マンニトール、pH8.0。
A172 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、pH8.0。
A173 10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% PS−80、100μM EDTA、0.5% EtOH、10mM ヒスチジン、pH8.0。
【0105】
実施例2
ヒトアデノウイルス5の回収および安定性に対する凍結/融解の効果
Ad5gagの回収/安定性に対する凍結/融解の効果を、まず、製剤A101〜A107において、107および109vp/mLの両方で調べた。図1は、QPAアッセイにより測定した、最初の7つの製剤(初期製剤)におけるAd5gagの回収/安定性に対する凍結/融解1サイクル(−70℃〜5℃)の効果を示す。結果は、凍結保護剤を含有していなかった2つの製剤(A103およびA104)において、Ad5gagが有意な量の感染性を失った又はガラスバイアルに吸着されたことを示している。該結果はまた、該感染性が、A101、A102、A105〜A107におけるAd5gag濃度に関して予想されるレベルであることを示したが、このことは、該ガラスバイアルからの回収の、有意な減少が生じなかったことを示唆している。複数の凍結/融解サイクルも調べた。図2のデータは、該初期製剤におけるAd5gagの回収/安定性に対する凍結/融解1〜3サイクルの効果を示している。該結果は、A103およびA104中のAd5gagに関する感染性における著しい減少または該ガラスバイアルに対する吸着を示し、凍結/融解2〜3サイクル後のA106およびA107に関する感染性の若干の減少を示唆した。
【0106】
凍結/融解後のA103およびA104における感染性の減少を確認し最終容器からのAd5gagの回収の効率を測定するために、凍結/融解1サイクル後のそれらの最初の製剤におけるAd5gagに関してTCID50アッセイを行った。図3に示す結果は、A103およびA104中のAd5gagでは、感染性/回収における大きな減少を示しているが、その他の製剤中のAd5gagでは、感染性の有意な減少は観察されなかった。該結果はまた、該ガラス容器またはその他の製剤からの回収可能なAd5gagの有意な減少を全く示さなかった。なぜなら、ガラスバイアル内に保存しなかったAd5gagの同じロットのTCID50アッセイに基づけば、VP/IUの比は、〜20の予想範囲内であったからである。
【0107】
該初期凍結/融解および安定性データの結果は、Ad5gagが、A105中ではその他の初期製剤中より安定であることを示唆したため、A105中のAd5gagで追加的な凍結/融解研究を行った。図4のデータは、108、1010および1011vp/mLにおけるA105中のAd5gagの安定性に対する12サイクルの凍結/融解の効果を示している。該結果は、A105中のAd5gagが、12サイクルの凍結/融解にわたり並びに4サイクルの凍結/融解およびそれに続く2〜8℃で8.5時間後に安定であったことを示している。
【0108】
また、充填前の臨床的バルクの取り扱いを模擬するために、A105中のAd5gagの大きなアリコートの凍結および融解の効果を判定するために、凍結/融解の研究を行った。この実験のために、108vp/mLにおけるA105中の600mLのAd5gagを−70℃で凍結した。ついで該サンプルを2〜8℃で融解し、QPAにより感染性に関してアッセイした。2〜8℃で51.5時間の融解後、該アリコートを更に15℃で20時間インキュベートして充填操作中の臨床用材料の取り扱いを模擬し、ついで再びアッセイした。図5に示す結果は、該凍結、融解および15℃でのインキュベーションがA105中のAd5gagの感染性に対して有意な影響を及ぼさなかったことを示している。
【0109】
実施例3
短期間安定性に基づくヒトアデノウイルス製剤の評価
該初期安定性研究の1つは、2〜8℃における候補製剤中のAd5gagの短期間安定性を試験するように設計した。GMP臨床供給操作の実施のための安定性基準の1つは、充填操作の全体にわたり安定性を保証することであったため、3mL ガラスバイアル中で107vp/mLおよび109vp/mLの両方でAd5gagを使用し2〜8℃で72時間の保存の後にQPAによる感染性に関してアッセイして、短期間研究を開始した。図6の結果は、製剤A102中のAd5gagが、試験したその他の製剤中より有意に不安定であることを示している。これらのQPAの結果は、−70℃の対照と比較した場合の感染性の減少の対数(log)を測定することにより得た。
【0110】
また、A102、A105、A106およびA107中のAd5gagの安定性を、−15℃で6ヶ月間の保存の後にQPAにより107vp/mLおよび109vp/mLの両方で測定した。該結果は、−70℃の対照と比較した場合、各濃度で製剤A105、A106およびA107中では感染性の減少の対数0.1未満を示したが、A102中のAd5gagでは減少の対数0.27を示した。−15℃で6ヶ月の保存(109vp/mL)の後に行ったTCID50アッセイでは、製剤A102中のAd5gagは感染性の対数0.6の減少を示したが、製剤A105、A106およびA107では減少の対数は0.1未満であった。A105、A106およびA107中のAd5gagの安定性を比較するために、追加的な短期間安定性研究を2〜8、15、25および37℃で行った(−70℃の対照と比較した)。これらの研究は、2〜8、15および25℃で1、2、3および4週の時点で107vp/mLのAd5gagで行った。37℃での安定性を3、7、10および14日の時点で測定した。図7に示す2〜8℃のデータは、A105中のAd5gagがA106またはA107のいずれにおけるよりも安定であることを示唆した。
【0111】
15、25および37℃での安定性データを、それぞれ図8、9および10に示す。これらの結果は、A105中のAd5gagがA106またはA107のいずれにおけるよりも有意に安定であることを明らかに示している。
【0112】
実施例4
ヒトアデノウイルス5の安定性に対するpHの効果
Ad5gagの安定性に対するpHの効果を幾つかの実験において調べた。1つの実験は、2つの異なるpH値におけるAd5gagの不活性化のための活性化エネルギーを測定するように設計した。この実験のために、75mM NaC、5% スクロース、1mM MgCl2、0.005% PS−80と20mM トリスまたは20mM Bis−トリス−プロパン(緩衝液として)とを含有する緩衝液中でAd5gagを製剤化した。該トリス緩衝溶液を各温度(37、30、25および15℃)でpH8.6に調節し、一方、該Bis−トリス−プロパン緩衝製剤をpH7.4に調節した。図11に示す結果は、pH7.4およびpH8.6で優勢な異なる不活性化メカニズムが存在したことを示唆している。さらに、該結果は、主要な不活性化経路が15℃より上および下で異なること、ならびにAd5gagの安定性のための最適pHが15℃より上および下で異なることを予備的に示唆している。これらのデータによると、pH8.6およびpH7.4の不活性化経路の活性化エネルギーは、それぞれ34および19kcal/molである。
【0113】
図11に示すデータは、15℃未満では、pH7.4の経路が主要不活性化経路であることを示唆している。したがって、15℃未満では、pH8.6の製剤でさえも、pH7.4の経路に一致した速度で不活性化される可能性があるらしい。15℃および5℃の両方でのA105中のAd5gagの不活性化の速度を示すもう1つの実験からのデータが図11に含まれている。該結果は、A105(それは5℃でpH8.6である)中のAd5gagの不活性化の速度が、15℃未満で優勢なpH7.4の経路に一致していることを示唆している。これらのデータは、2〜8℃でA105より安定なAd5gag製剤を開発するためには、pH7.4の不活性化経路の速度を減少させる必要であることが示唆している。
【0114】
もう1つの実験においては、2〜8、15および25℃で3ヶ月間の保存の後にAd5gagの安定性に対するpHの効果を調べた。図12に示す結果は、安定性に適したpHが15℃より上下で異なることを示す図11におけるアレニウスのデータと一致している。2〜8℃では、該最適pHは8.0〜9.0の範囲内にありpH8.5で最高となるらしい。25℃では、最適な安定性のためのpHは7.0〜7.5の範囲内にある。この実験においても、2〜8℃でのpH7.0の製剤に関する感染性の極端な減少が示されている。2〜8℃のサンプルに関する−70℃の対照も感染性の対数〜2の減少を示した、2〜8℃での保存が感染性の減少の原因であると完全には決められないことが明らかであった。さらに、15℃で保存したpH7.0の製剤に関する−70℃の対照も、感染性の減少(対数〜0.3)を示した。感染性の減少は、pH7.0の製剤が25℃付近にあった時間中に、7.0より低いpHに短時間さらされたことによるものであった可能性があるらしい。これらの製剤はトリスを含有するため、温度と共に比較的大きなpH変化が生じる。したがって、2〜8℃および15℃での保存用に調製したpH7.0の製剤を、25℃でそれぞれpH6.5および6.75に調節した。これらのデータは、Ad5gagがpH7.0未満では不安定であることを示唆している。
【0115】
また、15℃および25℃での12ヶ月間の保存の後、Ad5gagの長期安定性に対するpHの効果を調べた。図13に示す結果は、図12に示すデータと一致しており、Ad5gagの最適な安定性のpHが、15℃では〜pH7.5であり、25℃では〜pH7.0〜7.5であることを示している。
【0116】
2〜8℃でのAd5gagの長期安定性に対するpHの効果を図14に示す。12ヶ月間の安定性データによれば、Ad5gagの安定性の最適pHは2〜8℃で8.0〜8.5であることが判明した。
【0117】
実施例5
ヒトアデノウイルス5の安定性に対するMgCl2の効果
Ad5gagの安定性に対するMgCl2の効果を2つの実験で調べた。最初の実験では、Ad5gagの安定性にMgCl2が必要であるか否かを判定するために、Ad5gagの安定性をA105およびA108の場合と比較した。図15に示す結果は、A105においては最適なAd5gagの安定性にMgCl2が必要であることを明らかに示している。
【0118】
第2の実験では、Ad5gagの安定性に対する1、2および5mM MgCl2の効果を30℃で比較した。図16に示す結果は、最高のAd5gagの安定性のための最適なMgCl2濃度が、このpHおよび温度においては2mMであることを示唆している。
【0119】
実施例6
ヒトアデノウイルス5の安定性に対するポリソルベートの効果
Ad5gagの安定性に対するポリソルベート(PS−80)の効果を図17に示す。広範囲の温度にわたる最適なAd5gagの安定性のためにはポリソルベートが必要であることが、該データから明らかである。
【0120】
Ad5gagの安定性に対するPS−80の濃度の効果を調べるための第1の実験の結果を、前記図18に示す。該結果は、0.005%より高いPS−80の濃度がA105中のAd5gagの最適な安定性に必要であることを強く示唆している。
【0121】
PS−80の効果を調べるためのもう1つの実験においては、該濃度を、前記図19に示すとおり、0.005%から0.15%まで変化させた。25および30℃での加速安定性研究からの結果は、0.1% PS−80が最高の安定性のための最適な濃度であることを示唆した。しかし、該最適PS−80濃度は、より低温では異なるかもしれない(継続中の研究)。
【0122】
Ad5gagの安定性に対するポリソルベート型の効果も調べた。前記図20に示すデータは、PS−80またはPS−40のいずれかを2種類の濃度で含有する製剤中のAd5gagの安定性の比較を示している。PS−40を選択したのは、それが不飽和性を欠き酸化に対してPS−80より安定だからである。25℃での結果は、Ad5gagが、PS−40含有製剤においては、同等のPS−80製剤におけるよりも安定であったことを示している。30℃での結果は、Ad5gagが、0.005%のPS−40で、より安定であるが、0.1%では、より不安定であることを示した。これらのデータは、PS−40が、25℃以下で、PS−80より優れた何らかの安定性上の利点を付与することを示唆している。
【0123】
実施例7
A105における37℃での保存安定性に対するアデノウイルスの濃度の効果
Ad5gagを、A105中で109および1011vp/mLで製剤化し、37℃の安定状態で配置した。3、7、10、14および21日後に感染性を測定した。図21に示す結果は、Ad5gagの濃度が37℃での安定性に有意な影響を及ぼさないことを明らかに示している。
【0124】
また、図24〜26のデータ(後記実施例10で考察する)は、Ad5gagの濃度が107〜1011vp/mLでの−70℃および−15℃での安定性に影響を及ぼさないことを示している。
【0125】
実施例8
フリーラジカル酸化の阻害剤によるアデノウイルスの安定性の増強
A105に加えたアスコルビン酸および微量のFe+2およびFe+3の効果を調べるために、フリーラジカル酸化に対するAd5gagの感受性を試験するための第1の実験を設計した。アスコルビン酸は、微量金属イオンにより触媒されるフリーラジカル酸化の強力な促進剤であるため、本発明者らは、Ad5gagがフリーラジカル酸化に感受性であればアスコルビン酸がAd5gagを迅速に不活性化すると推論した。また、本発明者らは、加えたおよびFe+3の効果を試験した。なぜなら、それらはまた、フリーラジカル酸化の速度を増加させると予想されうるからである。特にFe+2は、過酸化水素からのヒドロキシルラジカルの生成の非常に強力な促進剤である。図22に示す結果は、アスコルビン酸(A125中)および鉄の両方により誘発されるフリーラジカル酸化にAd5gagが非常に感受性であることを明らかに示している。また、これらの結果は、フリーラジカル酸化がA105中のAd5gagの不活性化の主要メカニズムでありうると考えられることを示唆した。
【0126】
フリーラジカル酸化がAd5gagの不活性化の主要経路であるか否かを確認するために、フリーラジカル酸化の4つの異なる阻害剤を3つの異なる保存温度で試験した。図23に示す結果は、各フリーラジカル阻害剤が各保存温度でのAd5gagの安定性を増強したことを示している。これらの結果は、フリーラジカル酸化が広範囲の温度にわたるAd5gagの不活性化の主要経路であることを強く示唆している。
【0127】
実施例9
Ad5gagの安定性におけるロット間のばらつきに対する製剤の効果
8つの異なるロットおよび3つの異なる製剤(A105、A111およびA113)において、30℃で1ヶ月間の保存の後、Ad5gagの安定性を評価した。以下の表1に示すデータは、製剤A105およびA111においては種々のロットからのAd5gagの安定性に有意なばらつきがあったことを示している。しかし、該データはまた、Ad5gagの各ロットの安定性が、A105またはA111と比較してA113においては改善されたこと、および該ばらつきも減少したことを示している。これらのデータは、フリーラジカル酸化の速度のばらつきが、Ad5gagのロット間で認められる安定性のばらつきの主要原因であることを示唆している。
【0128】
【表1】
【0129】
実施例10
加速およびリアルタイム安定性データに基づくリード(leading)ヒトアデノウイルス5製剤
6ヶ月間の安定性データによれば、A105中のAd5gagは、−70℃または−15℃での保存のための許容しうる凍結液体製剤である(図24を参照されたい)。さらに、A105中のAd5gagの安定性は、A105においては、その他の初期候補製剤(A102〜A104、A106、A107)のいずれの場合よりも高かった。2〜8℃におけるA105中のAd5gagの感染性の減少は約0.37〜0.44 log/年であり、このことは、組換えアデノウイルスの安定性における更なる改良が保証されることを示唆している。
【0130】
表1は、例示しているアデノウイルス製剤の感染性の減少の推定速度を示す。2〜8℃および15℃の両方での6ヶ月間の安定性データに基づき、種々の製剤の感染性の減少の速度が示されている。2〜8℃の安定性データは、意図された保存条件で得たが、感染性の減少は非常に小さく、それを正確に測定するのは困難であった。したがって、感染性の減少の速度は、pH7.4の経路を用いるAd5gagの不活性化のための活性化エネルギーおよび15℃の安定性データの外挿からも推定した(最も伝統的な外挿)。pH7.4の不活性化経路に関するアレニウスプロットの傾きは(図11を参照されたい)、Ad5gagが、5℃では15℃より3.3倍長い貯蔵寿命を有するはずであることを示唆している。
【0131】
【表2】
【0132】
実施例11
ヒトアデノウイルス5の安定性に対するEDTA/EtOHおよびPS−80濃度の効果
フリーラジカル酸化が保存中のAd5gagの不活性化の主要メカニズムであるという観察は、A105中のAd5gagよりはるかに安定な追加的なAd5gag製剤の設計の道を開いた。前記のとおり、A105ベース中に100μM EDTAおよび0.5% エタノールを含有する製剤(A113)は、2〜8℃での安定性の増強を示し、本発明の特に好ましい製剤である。
【0133】
フリーラジカル酸化阻害剤を欠く1つの製剤だけが、該阻害剤を含有する製剤とほぼ同程度のAd5gag安定性をもたらしたことは、注目すべきことである。この製剤(A111)は、0.1% PS−80を含有するが、その他の点ではA105と同じである。これらの結果は、該ポリソルベート型および濃度の最適化も、Ad5gag安定性を最高にするのに非常に重要であることを示唆しており、また、ポリソルベートが、該酸化阻害剤とは異なる不活性化経路に影響を及ぼしうることを示唆している。したがって、単一製剤(A136)において0.1% PS−80とEDTA/EtOHとを組合せると、おそらく、2つの異なる不活性化経路が抑制されうるであろう。図27の結果は、この仮定を確認するためのデータを示している。該結果は、0.1% PS−80およびEDTA/EtOHの安定性増強効果が25℃では付加的であるが、30℃ではそうではないことを示している。高いポリソルベート濃度は、30℃以上では、Ad5gagの安定性にはそれほど有益でない可能性があることが、他の実験のデータから示唆されているため(図20)、25℃で得たデータは、2〜8℃での安定性の増強の良好な予測因子となりうる。要約すると、0.1% ポリソルベートおよびEDTA/EtOHの組合せを含有する製剤(A136)中のAd5gagは、EDTA/EtOH(A113)または0.1% ポリソルベート(A111)の一方のみを含有する製剤中より安定であった。
【0134】
実施例12
フリーラジカル酸化阻害剤を含有する追加的製剤
図23および27に示すとおり、EDTAとエタノールとの組合せは、Ad5gagの安定性を著しく増強することが判明した。図28のデータは、アデノウイルスの安定性に対する種々の濃度のエタノールの効果ならびにEDTA単独およびエタノール単独の効果を示している。該結果は、100μM EDTAおよび0.5% エタノールの組合せ(A113におけるもの)が、A105中のアデノウイルスと比較して、30℃で2ヶ月後のアデノウイルスの安定性の最大の増強をもたらしたことを示している。該結果はまた、EDTA単独およびエタノール単独のそれぞれがアデノウイルスの安定性を増強することを示した。しかし、該エタノール濃度を0.5%から1%へ増加させると(A132をA134と比較されたい)、この温度でのアデノウイルスの安定性の追加的な増強は何らもたらされなかった。高PS−80(0.1%)とEDTA/エタノールとの組合せ(A136におけるもの)は、30℃において、0.005% PS−80の存在下のEDTA/エタノール(A113におけるもの)とほぼ同程度の安定性の増強をもたらした。しかし、アデノウイルスは、25℃において、A136中ではA113中より安定であることが判明した。図27を参照されたい。もう1つの製剤A137においては、1mg/mL プラスミドDNAの添加は、A105中のアデノウイルスと比較してアデノウイルスの安定性を増強することが判明した。
【0135】
実施例13
選択した製剤におけるAd5gagの長期安定性
12個の異なる製剤におけるAd5gagの長期安定性を図29に示す。これらのデータは、2〜8℃で18ヶ月の保存の後のAd5gagの感染性の減少の対数を示している。これらのデータによれば、A105におけるAd5gagの感染性の減少は0.33 log/年であり、これは、図23からのデータを用いて前記実施例10で得た推定値に近かった。これらのデータは、フリーラジカル酸化阻害剤の添加(製剤A113、A114、A116〜A121)が2〜8℃で保存中のアデノウイルスの安定性を増強することを明らかに示している。この実験では、最も安定な製剤はA111、A113、A114、A117およびA120であり、これらは、EDTA/EtOH、DTPA、TEOAおよびマンニトールがフリーラジカル酸化を抑制しうること、およびより高いポリソルベート80濃度(A111における0.1%)の安定化効果を示している。
【0136】
もう1つの実験では、2〜8℃で1年間の保存後の15個の製剤においてAd5gagの長期安定性を評価した。図30に示す結果は、最も安定な製剤がA136(これは、ポリソルベート濃度が0.1%である以外はA113に類似している)であったことを示している。A135中のAd5gagも、A105およびA113中より安定であることが判明し、このことは、A113中のエタノールの最適濃度が1%付近でありうることを示唆している。しかし、該QPAアッセイのばらつきが〜0.15 logであるため、その他の被検製剤がA105より安定なのかどうかは明らかでない。これらのデータはまた、A111中のAd5gagの安定性がA105中より低いこと示しており、この結果は、図29および32のデータと矛盾している。
【0137】
第3の長期研究においては、8個の製剤において2〜8℃および15℃で9ヶ月後にAd5gagの安定性を調べた。図31に示す結果は、図27〜29に示す結果と一致しており、A113中のAd5gagが、2〜8℃および15℃ではA105中より安定であることを示している。この実験の主目的は、フリーラジカル酸化阻害剤の組合せが、A113中のAd5gagと比較してAd5gagの安定性を改善するか否かを確認することであった。15℃の安定性データは、この実験における最も安定な製剤がA149、A151b、A152およびA153であることを示しており、マンニトール(A149中)、ヒスチジン(A151b中)、ヒスチジンおよびTEOA(A152中)またはヒスチジン、TEOAおよびグリセロール(A153中)のいずれかとEDTA/EtOHとの組合せが、A113と比較してAd5gagの安定性を増強しうることを示唆している。時間ゼロ(0)におけるAd5gagの感染性の研究は、A149に関する感染性の減少を示した。このことは、この製剤が凍結/融解サイクルに完全には安定でない可能性があること、および凍結/融解サイクルの全体にわたるその安定性を増強するためにはスクロースまたは幾つかの他の糖を加えるべきであることを示唆している。図29に示すデータは、この仮定を支持している。なぜなら、製剤A121は、3% マンニトールに加えて5% スクロースを含有し、−70℃から2〜8℃までの少なくとも1サイクルの凍結/融解サイクルにわたり安定であったからである。
【0138】
実施例14
第三者のアデノウイルス製剤と比較した場合のリードAd5gag製剤の安定性
アデノウイルス製剤が最近、PCT公開番号WO 98/02522(Transgene)およびWO 99/41416(Schering−Plough)に開示された。本発明の製剤中のAd5gagの安定性をこれらの製剤と比較するために、後記のとおり、A105、A111、A113、A136、WO 98/02522からの1つの製剤(TG#2)およびWO 99/41416からの5つの製剤(SP#1〜SP#5)中の108vp/mLのAd5gagで安定性研究を行った。
【0139】
・TG#2 10mM トリス、150mM NaCl、1M スクロース、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、pH8.5;
・SP#1 1.7mg/ml リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、1.7mg/ml トリス、0.4mg/ml MgCl2、20mg/ml スクロース、0.15mg/ml PS−80、100mg/ml グリセロール、pH7.53;
・SP#2 1.7mg/ml リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、1.7mg/ml トリス、0.4mg/ml MgCl2、20mg/ml スクロース、0.15mg/ml PS−80、100mg/ml グリセロール、pH7.36;
・SP#3 1.7mg/ml リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、1.7mg/ml トリス、0.4mg/ml MgCl2、20mg/ml スクロース、0.15mg/ml グリセロール、pH7.6;
・SP#4 1.7mg/ml リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、1.7mg/ml トリス、0.4mg/ml MgCl2、20mg/ml スクロース、100mg/ml グリセロール、pH7.37;
・SP#5 1.7mg/ml リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、1.7mg/ml トリス、0.4mg/ml MgCl2、20mg/ml スクロース、5.8mg/ml NaCl、100mg/ml グリセロール、pH7.53。
【0140】
図32は、2〜8℃および15℃で9ヶ月間の保存の後のデータを示す。これらの結果は、Ad5gagが、本発明の製剤のそれぞれにおいては、TG#2中またはSP#1もしくはSP#2中より安定であったことを明らかに示している。15℃で1ヶ月の保存の後で得たデータは、SP#3、SP#4およびSP#5中のAd5gagが、感染の対数1を超える減少引き起こしたことを示したため、これらの製剤については9ヶ月の時点では調査しなかった。図18〜20および29のデータと一致して、A111中のAd5gagはA105中より安定であった。同様に図23、27〜29および31に示すデータと一致して、Ad5gagはA113中ではA105中より安定であった。
【0141】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の説明から当業者に明らかとなろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 製剤A101〜A107におけるAd5gagの回収/安定性に対する1サイクルの凍結/融解(−70℃〜5℃)の効果を示す。
【図2】 製剤A101〜A107におけるAd5gagの回収/安定性に対する1〜3サイクルの凍結融解の効果を示す。
【図3】 製剤A101〜A107におけるAd5gagの感染性の減少を示す。
【図4】 108、1010および1011vp/mLのA105中のAd5gagの安定性に対する12サイクルの凍結/融解の効果を示す。
【図5】 凍結、融解および15℃でのインキュベーションがA105中のAd5gagの感染性に与える効果を示す。
【図6】 1×107vp/mLおよび1×109vp/mLの製剤A102、A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(72時間)を示す。
【図7】 2〜8℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日まで)を示す。
【図8】 15℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【図9】 25℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【図10】 37℃における製剤A105、A106およびA107中のAd5gagの短期安定性(28日間まで)を示す。
【図11】 pH7.4およびpH8.6におけるAd5gagの不活性化のアレニウスプロットを示す。
【図12】 2〜8℃、15℃および25℃におけるAd5gagの感染性に対するpHの効果を示す。
【図13】 15℃および25℃におけるAd5gagの長期安定性(12ヶ月間まで)に対するpHの効果を示す。
【図14】 図14は、2〜8℃におけるAd5gagの長期安定性(12ヶ月間まで)に対するpHの効果を示す。
【図15】 2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するMgCl2の効果を示す。
【図16】 30℃におけるAd5gagの安定性に対するMgCl2濃度の効果を示す。
【図17】 2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)の効果を示す。
【図18】 2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)濃度の効果を示す。
【図19】 1ヶ月間にわたる25℃および30℃でのAd5gagの安定性に対するポリソルベート−80(PS−80)濃度の効果を示す。
【図20】 25℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対するポリソルベート型(PS−80およびPS−40)の効果を示す。
【図21】 37℃における安定性に対するウイルス濃度の効果を示す。
【図22】 Ad5gagの安定性に対するアスコルビン酸および鉄の効果を示す。
【図23】 2〜8℃、15℃および30℃におけるAd5gagの安定性に対する酸化阻害剤の効果を示す。
【図24】 107および109vp/mLにおける−70℃および−15℃でのAd5gagの安定性を示す。
【図25】 109vp/mLおよび1011vp/mLにおける−70℃でのA105中のAd5gagの安定性を示す。
【図26】 109vp/mLおよび1011vp/mLにおける−15℃でのA105中のAd5gagの安定性を示す。
【図27】 1ヶ月間にわたる25℃および30℃でのAd5gagの安定性に対するPS−80およびEDTA/エタノールの組合せの効果を示す。
【図28】 製剤A113、A132、A133、A134、A135、A136およびA137で示された1ヶ月間および2ヶ月間にわたる30℃でのAd5gagの安定性に対する種々の酸化阻害剤の効果を示す。
【図29】 2〜8℃での18ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの長期安定性を示す。
【図30】 2〜8℃での1ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの長期安定性を示す。
【図31】 2〜8℃および15℃での9ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のAd5gagの安定性を示す。
【図32】 2〜8℃および15℃での9ヶ月間の保存の後の、TransgeneおよびSchering−Ploughにより開示されている製剤中のAd5gagの安定性と比較した場合の、本発明の選択された製剤中のAd5gagの安定性を示す。
Claims (20)
- a)精製アデノウイルス、
b)7.0〜9.0のpHのヒトへの非経口的使用に関して許容される緩衝液群から選ばれる緩衝液、
c)2%〜8%の重量対容量%のスクロース、
d)25mM〜250mMの塩化ナトリウム、
e)0.1mM〜5mMの量のMgCl2およびCaCl2からなる群から選ばれる二価陽イオン、
f)0.001%〜2%の範囲の濃度のポリソルベート−80およびポリソルベート−40からなる群から選ばれる非イオン性界面活性剤、および
g)0.1%〜5.0%のエタノール、1μM〜500μMのEDTA、1mM〜100mMのクエン酸ナトリウム、1μM〜500μMのジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、およびそれらの組合せからなる群から選ばれるフリーラジカル酸化の阻害剤、
を含む、アデノウイルス製剤。 - 1×107vp/mL〜1×1013vp/mLの範囲のアデノウイルス濃度および200mOs/L〜800mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度を有する、請求項1に記載のアデノウイルス製剤。
- 前記緩衝液がトリス緩衝液である、請求項1または2に記載のアデノウイルス製剤。
- 前記塩化ナトリウムが50mM〜100mMである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- 前記二価陽イオンが、0.5mM〜2.5mMの量のMgCl2である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤が、0.001%〜1%の範囲の濃度のポリソルベート−80である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- フリーラジカル酸化の阻害剤が、EDTA/エタノールの組合せである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- 1×107vp/mL〜1×1013vp/mLの範囲のウイルス濃度および200mOs/L〜800mOs/Lの範囲の全浸透圧モル濃度を有し、
1mM〜10mMのトリス、
2%〜8%の重量対容量のスクロース、
25mM〜250mMのNaCl、
0.1mM〜5mMのMgCl2、
0.001%〜0.25%の濃度のポリソルベート−80またはポリソルベート−40のいずれか、
1μM〜500μMのEDTA、および
0.1%〜5.0%のエタノール、
を含む、請求項1に記載のアデノウイルス製剤。 - ヒスチジンを更に含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- 0.01mg/mL〜10mg/mLの濃度のプラスミドDNAを更に含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアデノウイルス製剤。
- 1mg/mLのプラスミドDNAを含む、請求項10に記載のアデノウイルス製剤。
- アデノウイルスを含み、
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μm DTPA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、10mM クエン酸ナトリウム、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、1mM CaCl2、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、1.0% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、1.0% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、HIV−1 gag配列を含む1mg/ml プラスミドDNA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、5mM トリエタノールアミン、30℃でpH7.5;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、5mM トリエタノールアミン、5%(v/v)グリセロール、30℃でpH7.5;
15mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、7.5mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、pH7.6;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、pH8.0;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、7.5mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、1.0% マンニトール、pH7.7;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、1% マンニトール、pH8.0;および
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、pH8.0からなる群から選ばれる製剤である、請求項2に記載のアデノウイルス製剤。 - 精製アデノウイルス、7.0〜9.0のpHのヒトへの非経口的使用に関して許容される緩衝液群から選ばれる緩衝液、2%〜8%の重量対容量%のスクロース、25mM〜250mMの塩化ナトリウム、0.1mM〜5mMの量のMgCl2およびCaCl2からなる群から選ばれる二価陽イオン、0.001%〜2%の範囲の濃度のポリソルベート−80およびポリソルベート−40からなる群から選ばれる非イオン性界面活性剤、並びに0.1%〜5.0%のエタノール、1μM〜500μMのEDTA、1mM〜100mMのクエン酸ナトリウムおよび1μM〜500μMのジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)からなる群から選ばれる少なくとも1つのフリーラジカル酸化の阻害剤を含む製剤を製造すること含む、精製アデノウイルスを保存する方法。
- 前記ウイルスが、1×107vp/mL〜1×1013vp/mLの範囲の濃度を有し、前記緩衝液がトリス緩衝液である、請求項13に記載の方法。
- 前記塩化ナトリウムが50mM〜100mMである、請求項13または14に記載の方法。
- フリーラジカル酸化の阻害剤が、EDTA/エタノールの組合せである、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記製剤がヒスチジンを更に含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス製剤が、0.01mg/mL〜10mg/mLの濃度のプラスミドDNAを更に含む、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス製剤が、
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μm DTPA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、10mM クエン酸ナトリウム、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、1mM CaCl2、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、1.0% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、1.0% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、HIV−1 gag配列を含む1mg/ml プラスミドDNA、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、5mM トリエタノールアミン、30℃でpH7.5;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、5mM トリエタノールアミン、5%(v/v)グリセロール、30℃でpH7.5;
15mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.005% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、pH8.0;
5mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、2mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、5mM ヒスチジン、30℃でpH7.5;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、7.5mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、pH7.6;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、pH8.0;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、7.5mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、1.0% マンニトール、pH7.7;
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、1mM トリエタノールアミン、1% マンニトール、pH8.0;および
10mM トリス、75mM NaCl、5% スクロース(w/v)、1mM MgCl2、0.1% ポリソルベート−80、100μM EDTA、0.5% エタノール、10mM ヒスチジン、pH8.0からなる群から選ばれる、請求項13に記載の方法。 - 前記アデノウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項13〜19のいずれか1項に記載の方法。
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