JP5960120B2 - ウイルス粒子の安定化 - Google Patents
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Description
- R1は、水素若しくはC1〜6アルキルを表し;
- R4は、水素を表すか;又は
- R1及びR4は、これらが結合している原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
- R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し;R3は、C1〜6アルキルである);
及び/或いは
式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
- Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
- Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
- Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
の水溶液を提供する工程と、
(b)該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法を提供する。
- 式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物;
- 非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、本発明の組成物を含むワクチン;
- ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)ウイルス粒子、(ii)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程と;
(b)この混合物にアジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程とを含む方法;
- ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、且つ本発明の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末;
- 本発明の組成物を含む、密封バイアル又はアンプル;
- ウイルス粒子を保存するための、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用;
- (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは本発明の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と;(b)該溶液を密封容器中最大5年間貯蔵する工程とを含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法;
- 密封容器で提供され、且つ乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫中で貯蔵される、(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは本発明の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液;
- 乾燥前に、ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を保存するための、本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用;及び
- ウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用
を提供する。
本発明は、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖によるウイルス粒子の保存に関する。ウイルス粒子は、水溶液中で式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖に接触させ、次いでウイルス粒子が存在している、得られた溶液は、乾燥させて、ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する。
本発明で用いられるウイルス粒子は、生ウイルス、死滅ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的に不活化されたウイルスなどの不活化ウイルス又はビルレント若しくは非ビルレントウイルスなどの全てのウイルスであり得る。生ウイルスは、宿主細胞内で感染及び複製することができる。死滅ウイルスは不活化しており、宿主細胞内で複製することができない。該粒子は、ウイルス様粒子(VLP)又はヌクレオカプシドであってもよい。ウイルスは、原核細胞又は真核細胞に感染性であってもよい。ウイルスは、ヒト又は動物ウイルスであってもよい。
- ヒトアデノウイルス又は非ヒトアデノウイルスなどのアデノウイルス科(Adenoviridae)、例えば、ヒトAd5、Ad2、Ad4、Ad6、Ad7、Ad11、Ad14、Ad24、Ad26、Ad35及びAd36血清型を含むヒトアデノウイルスA、B、C、D、E又はF;
- カルシウイルス科(Caliciviridae)、例えば、ノーウォークウイルス;
- コロナウイルス科(Coronaviridae)、例えば、ヒトコロナウイルス299E又はOC43、及びSARS-コロナウイルス;
- フィロウイルス科(Filoviridae)、例えば、エボラウイルス;
- フラビウイルス科(Flaviviridae)、例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス;
- ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、例えば、B型肝炎ウイルス;
- ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、例えば、単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV1又はHSV2、ヒトヘルペスウイルス1、3、4、5又は6;
- オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザAウイルス血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3及びN10N7を含むインフルエンザA、B、C;
- パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、例えば、ヒトパピローマウイルス;
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス1、麻疹ウイルス及び耳下腺炎ウイルス;
- パルボウイルス科(Parvoviridae)、例えば、アデノ関連ウイルス;
- ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、例えば、ヒトポリオウイルス、口蹄疫ウイルス(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む);
- ポックスウイルス科(Poxviridae)、例えば、ワクチニアウイルス、痘瘡ウイルス及びトリポックスウイルス(鶏痘ウイルス);
- レオウイルス科(Reoviridae)、例えば、ブルータングウイルス群;
- レトロウイルス科(Retroviridae)、例えば、ヒト免疫不全ウイルス1及び2を含むレンチウイルス;及び
- トガウイルス科(Togaviridae)、例えば、風疹ウイルス。
式(I)及び式(II)の化合物は、この生理学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。
典型的には、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表す。典型的には、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。より好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2はC1〜6アルキルを表す。
典型的には、Rcのカルボキシレート及びアミン置換基は、Rcアルキル部分の同じ炭素原子に結合している。典型的には、Rcは、C2〜4又はC2〜3アルキル部分である。
本発明における使用に適切な糖は、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース;好ましくは非還元糖、例えば、スクロース及びラフィノース、より好ましくはスクロースを含む。糖は、単糖、二糖、三糖、又は他のオリゴ糖であってもよい。「糖」という用語は、糖アルコールを含む。したがって、一つの実施形態において、非還元糖又は糖アルコールの使用が好ましい。
本発明では、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む水溶液を、乾燥させる。任意の適切な水溶液を用いてもよい。この溶液は緩衝化されてもよい。溶液は、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。
- Xが-S(O)2-を表す式(II)の化合物若しくは式(IIA)の化合物、例えば、MSM、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは0.2mMから1M、例えば、0.35mMから1M、3.5mMから0.5M、0.035Mから0.5M又は0.035Mから0.25Mである。
mMから1M若しくは1.5M又は5mMから1Mの範囲である。より好ましい濃度は、0.007Mから0.7M又は1M、例えば、約0.007Mである。特に好ましい範囲は、0.5Mから1.5Mである。
- 乾燥のための水溶液中におけるN-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.1mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから1.5M又は5mMから1Mであってもよい。好ましい濃度は、0.1Mから1.5M又は0.5Mから1.25Mである。
凍結乾燥は、典型的には傷みやすい材料を保存するために又はその材料を輸送にとってより都合よくさせるために使用される脱水工程である。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチン医薬品を製造するための鍵となる工程に相当する。しかし、生物材料は、操作の間に凍結及び乾燥のストレスの両方を受け、これは、タンパク質をアンフォールディング又は変性し得る。さらに、凍結生物材料からの水蒸気拡散の速度は非常に低く、したがって、この過程は、時間がかかる。本発明の保存技術は、生物材料が、凍結乾燥操作の乾燥及び/又は熱ストレスに対して保護されることを可能にする。
ある種の実施形態において、乾燥は、1300Pa付近での真空乾燥を用いて行われる。しかし、真空乾燥は、本発明にとって必須ではなく、他の実施形態において、ウイルス粒子と接触した保存混合物は、回転させられる(すなわち、回転乾燥)か、又は凍結乾燥される(以下にさらに記載されるとおりに)。有利には、本発明の方法は、ウイルス粒子を含む保存混合物を真空にかける工程をさらに含む。都合良くは、真空は、20,000Pa以下、好ましくは10,000Pa以下の圧力でかけられる。有利には、真空は、少なくとも10時間、好ましくは16時間以上の期間かけられる。当業者に公知であるように、真空適用期間は、試料の大きさ、使用される機械及び他のパラメータに依存する。
別の実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥させることによって達成される。これらの技術は、当業者に周知であり、気体、例えば、空気、酸素を含まない気体若しくは窒素、又は噴霧凍結乾燥の場合には、液体窒素によって液体原料を乾燥させる方法を含む。液体原料は、液滴の噴霧中に霧化される。次いで、液滴は、乾燥チャンバー中で気体との又は液体窒素との接触によって乾燥させる。
さらなる実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を流動床乾燥させることによって達成される。この技術は、当業者に周知であり、典型的には、制御された速度条件下で気体(例えば、空気)を生成物層に通して、流動化状態を生じさせる工程を含む。この技術は、粒子状生成物物質の乾燥、冷却、凝集、粒状化及びコーティングの段階を含み得る。熱は、流動気体、及び/又は流動層に埋没された他の加熱面(例えば、パネル又は管)によって供給され得る。冷却は、冷たい気体を用いて及び/又は流動層中に埋没された面を冷却して達成され得る。凝集及び粒状化の工程は、当業者に周知であり、達成されるべき生成物の特性に応じて多様な方法で行われ得る。粉末、顆粒又は板状小片などの粒子状生成物のコーティングは、制御条件下で流動粒子上に液体を噴霧することによって達成され得る。
低い残留含水率を有する組成物を得ることができる。冷蔵温度を超える温度、例えば、4℃から56℃若しくはそれを超える範囲内で、又は冷蔵温度より低い温度、例えば、0から-70℃若しくはそれ未満の範囲内で長期の保存を可能にする残留含水率のレベルが達成される。したがって、乾燥組成物は、重量で10%以下、5%以下、2%以下又は1%以下の残留含水率を有し得る。好ましくは、残留含水率は、0.5%以上又は1%以上である。典型的には、乾燥組成物は、重量で0.5から10%、好ましくは重量で1から5%の残留含水率を有する。
しかし、本発明の方法のさらなる実施形態において、ウイルス粒子を含む混合物は、固体担体上に乾燥させる。固体担体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック製担体、マイクロタイター皿、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコン-ガラス又は金チップ)、又は膜を含み得る。別の実施形態において、本発明の方法によって保存されるウイルス粒子がその上に乾燥又は結合される固体担体が提供される。
ウイルス粒子に関連した保存は、乾燥、凍結、0℃未満又は-25℃未満の温度、凍結乾燥、室温、0℃を超える温度、25℃又は30℃を超える温度の条件への曝露下での、核酸又はタンパク質の劣化、トランスフェクション効率の損失、細胞性又は体液性免疫応答を刺激する能力の損失、ウイルス感染性の損失、免疫原性の損失、ウイルス力価の損失、宿主細胞応答の損失又はワクチン効力の損失などの物理的若しくは化学的劣化及び/又は生物活性の損失に対するウイルス粒子の耐性を指す。好ましくは、本発明による保存は、凍結保護(凍結損傷に対する保護)、溶解保護(凍結乾燥の間の保護)及び/又は熱保護(4℃より高い又は低い温度に対する保護)を含む。
ワクチン
本発明の保存ウイルス粒子は、ワクチンとして使用し得る。例えば、死滅全ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的不活化ウイルス、VLP又は生ウイルスベクターなどの保存ウイルス粒子は、ワクチンとしての使用に適する。ワクチンとして、本発明の保存ウイルス粒子は、ウイルス感染、ウイルス誘発の毒性を含むがこれに限定されないウイルス感染の続発症、癌及びアレルギーを含むがこれらに限定されない多くの状態の治療又は予防のために、抗原として又はウイルスタンパク質などの抗原をコードするために使用され得る。このような抗原は、宿主の免疫系を刺激して、体液性及び/又は細胞性抗原特異的応答を生じる一つ又は複数のエピトープを含む。
本発明の方法に従って保存されたウイルス又はウイルスベクターは、標的細胞に異種遺伝子又は他の核酸配列を移入するために使用され得る。適切には、異種配列(すなわち、導入遺伝子)は、標的細胞で発現され得るタンパク質又は遺伝子産物をコードする。適切な導入遺伝子は、望ましいレポーター遺伝子、治療用遺伝子及び免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子(ワクチンとして使用するために)を含む。遺伝子発現不全に関連する疾患の治療又は予防のための手法である遺伝子治療は、細胞内への治療用遺伝子の挿入、続いて必要なタンパク質の発現及び産生を含む。この手法により、損傷遺伝子の置換え又は望ましくない遺伝子の発現の阻止が可能になる。特に、保存ウイルス又はウイルスベクターは、治療用導入遺伝子又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に移入するために、遺伝子治療に使用され得る。
本発明では、ウイルス粒子の保存のための添加剤も提供される。添加剤は、(a)場合によって1種若しくは複数種の糖(スクロース、ラフィノース、スタキオース、トレハロース、若しくは糖アルコール、又はこれらの任意の組合せなど);並びに(b)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む。好ましくは1種又は複数種の糖が存在する。好ましくは、添加剤は、これらの成分からなるか、又は本質的になる。
固体担体上に貯蔵された保存ウイルス粒子は、診断目的に、又はワクチン接種計画をモニターするために使用され得る。例えば、体液(血液、尿、唾液、痰、胃液など)などの患者試料は、患者試料及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。次いで、保存された患者試料は、抗ウイルス抗体を用いて(例えば、ELISAを用いて)試料中のウイルス抗原/エピトープの存在について試験され得る。代替として、対象のウイルス粒子は、ウイルス粒子及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。患者試料は、患者試料と、対象のウイルス粒子がその上に結合している固体担体とを接触させることによって、抗ウイルス抗体の存在について試験され得る。抗原-抗体複合体の形成は、測定可能なシグナルを誘発させ得る。試料中のウイルス粒子抗原-抗体複合体の存在及び/又は量は、ウイルス感染の存在又は患者におけるワクチン接種計画の進行を示すために用いることができる。
本発明による保存ワクチン又はウイルス粒子は、様々な公知の経路及び技術を用いてインビボで被験者に、一部の場合に乾燥又は凍結乾燥生成物の再構成後に、投与され得る。例えば、保存ワクチンは、注射剤、懸濁製剤又はエマルション製剤として提供され、従来の針及び注射器を用いて非経口的、皮下、経口、表皮、皮内、筋内、動脈内、腹腔内、静脈内注射によって、又は液体噴流注入システムを用いて投与され得る。保存ワクチンは、皮膚若しくは粘膜組織に局所的に、例えば、経鼻、髄腔内、腸内、舌下、経直腸若しくは経膣的に投与され、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微粉化噴霧として提供され得る。
材料
HEK-293細胞(ECACC 85120602)
ジメチルグリシンDMG(Sigma D1156、ロット077K1856)
ジメチルスルホン(MSM)(Sigma M81705、ロット0001452516)
スクロース(Sigma 16104、ロット70040)
ラフィノース(Sigma R0250、ロット039K0016)
PBS(Sigma D8662、ロット118K2339)
水(Sigma W3500、ロット8M0411及びRNBB1139)
Hydranalメタノール(Fluka、37817、ロット8331D)
Hydranal Composite(Fluka、34805、ロット8287A)
5ml ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCD005)
14ml 凍結乾燥栓(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)
14mm キャップ(Adelphi Tubes CWPP14)
アデノウイルスGFP(Vector Biolabs カタログ1060)
麻疹ウイルス株3A及び1A(NIBSCにてP.Christianによって提供される好意)
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma D5796、ロットRNBB1139)
ウシ胎仔血清(FBS)(Sigma F7524、ロット109K3395)
ペニシリン ストレプトマイシン(PS)(Sigma P4458、ロット0409M00393)
生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)(Sigma S6639、ロット020M8404)
BHK-21細胞系(ECCAC CB2857)
HEK 293(ECACC 85120602)
MVA(ATCC-VR-1508)
2ml ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCDIN2R)
13mm 凍結乾燥用栓(Adelphi Tubes FDW13)
クリンプ(Adelphi Tubes COTW13)
装置
Advantage凍結乾燥機(VirTis)
HERA安全クラスIIキャビネット(Thermofisher)
VirTis Advantage凍結乾燥機(Biopharma Process Systems)
Binder CO2インキュベータ(Binder)
Binder APT line TM MK熱サイクル試験チャンバー(Binder)
Thermo Scientific MaxQ 4450インキュベータ(Thermofiser)
KERN EW220-3NM天秤(VWR)
Elcold -45℃冷凍庫(VWR)
Forma 900シリーズ -80℃冷凍庫(Thermofisher)
カールフィッシャー容量滴定器(Mettler Toldeo)
DMIL LEDインバータ顕微鏡(Leica、EQP#062)
ATL-84-1 Atlion天秤(Acculab、EQP#088)
IP250 37℃インキュベータ(LTE、EQP#016)
凍結乾燥プロトコル
約3日間継続する事前にプログラム化されたプロトコルを用いて、試料をVirTis Advantage凍結乾燥機により凍結乾燥した。試料を-40℃で1時間凍結させ、その後、Themo Savant VLPポンプ(Thermofisher、英国)によって、最初に200ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は-80℃に維持した。工程8は、真空を開放する前に試料に栓をするまで、延長した。用いた乾燥サイクルを以下に示す:
PRISM Graphpadソフトウェア バージョン4.00を用いて、異なる添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析(ANOVA)検定、続いてテューキー対比較(turkey pair wise comparison)を行った。p値摘要は、*=p<0.10;**=P<0.05;***=P<0.005である。
- R2=決定係数。あてはまりの良さの尺度。R2<0.5=低いモデル有意性。
凍結乾燥
添加剤のそれぞれの種類(以下の表1参照)を原液として作製し、250μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。次いで、50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、上記一般実験技術の項で示したプロトコルに従って凍結乾燥させた。
凍結乾燥に続いて、試料を、Binder APTラインTMMK温度試験チャンバーにおいてインキュベートした。37℃の温度で12時間、-20℃に1時間の傾斜、-20℃で10時間、続いて37℃に1時間の傾斜によってサイクルさせた。それぞれのサイクルは合計で24時間になり、2週間の期間繰り返し、その後、以下に記載するとおりにアデノウイルスアッセイを行った。
96平底細胞培養皿(Jencons、英国)に、HEK293細胞(ECACC 85120602)を1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlPBSで再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取って、180μlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。この10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈(元の試料の)を行った。次いで、得られた希釈液(10分の1及び100分の1)のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。さらに、添加剤処理液で用いた同じ供給源由来で、同じ力価(-80℃で貯蔵後)を有する、アデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1希釈シリーズ(DMEM中)を作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP(緑色蛍光タンパク質)細胞の数を数え、その後に、これを適用した容量及び接種材料の希釈を考慮に入れて、処理試料のpfu/mlに換算した。
この実験は、貯蔵の間に添加剤の存在下でウイルス回復に対する冷却及び加熱の影響を評価するために設計した。結果は、糖のみ又はPBSを含む添加剤において回復不良を示す(図1)。糖に加えてジメチルスルホンを含む添加剤において、回復は有意により高かった。
ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類(表2参照)を、PBS中原液として作製し、適切に標識した5mlガラスバイアルに250μlを添加した。バイアルすべてを3連で調製した。50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、バイアルをVirTis advantageに積載し、上記一般実験技術の項に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた(FD)。凍結乾燥に続いて、試料をウイルス力価について、実施例1に記載したアデノウイルスアッセイを用いて評価した。
残留水分測定のために一部のバイアルを取った(以下の表3参照)。容量カールフィッシャー滴定器を用いて、残留水分の評価を行った。滴定器(Mettler Toledo)は、1モルのI2が、それぞれのモルのH2Oに対して消費される原理で作動する。滴定器は、10mg/mlの水標準(Sigma、英国)を用いて検証した。
添加剤にウイルスを加えた混合物を調製し、実施例2で記載したとおりに処理した。添加剤は、TMG及び場合によって糖を含んだ。乾燥前の添加剤中それぞれの成分の最終濃度を以下の表4に示す。バイアルはすべて3連で調製した。
実施例4は、アデノウイルスの凍結乾燥配合物中添加剤としてのS-メチル-L-メチオニン(SMM)、スクロース及びラフィノース間の相互作用を明らかにするための実験を記載する。
2×106pfu/mlの力価(凍結前)を有する、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中で300μlに希釈した。試験した添加剤配合物の完全一覧は、表5に見ることができる。
凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、それぞれの処理液の3連を熱負荷のために37℃で置く一方、他の3連を凍結乾燥後対照として4℃で貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで、すべてを4℃で維持した。
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、HEK293(ECACC 85120602)細胞を1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlのPBSで再構成した。再構成した試料を、DMEMに加えて5%FBS中1:10及び1:100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
試料を凍結33日後に、及び熱負荷をかけた試料の場合、37℃で7日、続いて4℃でさらに26日貯蔵後にアッセイした。結果を図6Aに示す。
配合物中いずれの糖も非存在下で、S-メチル-L-メチオニンは、凍結乾燥及びその後の熱負荷の間のウイルス感染性の非常に限られた保持を与えただけであった(図6B)。この限定された保護でさえも、0.07M及びそれを超える濃度で見られるだけである。低濃度の糖(0.1Mスクロース、10mMラフィノース)との共配合は、同様にあまり保護を示さないが、有効性は、低いS-メチル-L-メチオニン濃度で増強させ得る。
凍結乾燥後に、感染性アデノウイルスの回復レベルを容易にアッセイすることができるように、CMVプロモーター下で強化GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、添加剤混合物と配合した。ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類(以下の表6参照)をPBS中原液として作製し、300μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、上に示した凍結乾燥プロトコルに従って、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した(FD)。凍結乾燥後、試料のウイルス力価を以下に記載されるとおりのアデノウイルスアッセイで評価した。
この実施例における実験は、熱負荷の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力を調査することによって、ラフィノース及びスクロースとともに凍結乾燥の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力についてさらに詳しく説明する。互いに固定比率の糖のそれぞれの2種類の濃度を試験した(高い糖=1Mスクロースと100mMラフィノース、低い糖=0.1Mスクロースと10mMラフィノース)一方、DMGの5種類の濃度を調べた(0.007M、0.023M、0.070M、0.230M、0.700M)。
配合ウイルスの調製及び凍結乾燥
2×106pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中300μlに希釈した。試験した添加剤配合の完全一覧は、以下の表7に見ることができる。それぞれの処理液は、6連の5mlバイアルで作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後に、VirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、プログラム10で凍結乾燥させた(図8参照)。
凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、3連のそれぞれの処理液を熱負荷のために+37℃で置いた一方、他の3連は、凍結乾燥後の対照として+4℃で貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルまで戻し、それらを実際にアッセイするまで+4℃で保持した。
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)でHEK 293(ECACC 85120602)細胞を播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300mlのPBSで再構成した。再構成した試料を、5%FBSを加えたDMEM中1:10及び1:100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100mlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いてウェル当たりGFP細胞の数を数えた。結果を図9A及び図9Bに示す。
凍結乾燥の間のアデノウイルス感染性の保護(図9A参照)
凍結乾燥後の試験期間の継続の間に4℃で貯蔵した試料を、凍結乾燥後の対照の代わりとして及びまた熱負荷の負の対照としてアッセイした。いずれの添加剤も非存在下で、この実験の間のアデノウイルスの凍結乾燥は、試料の感染性を1.5×106pfu/mlから1.0×104pfu/ml未満に低下させた。
ウイルス感染性の検出可能な回復は、+37℃での熱負荷後に、添加剤を含まないバイアル(PBS中アデノウイルス)から観察されなかった。これは、+4℃で保持された同等の配合物の試料を上回るウイルス感染性の非常に有意な損失を示す。
凍結乾燥後に、感染性アデノウイルス回復のレベルを容易にアッセイし得るように、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)に、添加剤混合物を配合した。添加剤のそれぞれの種類(以下の表8参照)は、原液として作製し、250μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。原液から50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した。
約3日間継続する予めプログラム化したプロトコルを用いて、VirTis Advantage凍結乾燥機によって、試料を凍結乾燥させた。試料を-40℃で1時間凍結し、その後、Thermo Savant VLPポンプ(Thermofisher、英国)を用いて最初は300ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は-80℃で維持した。工程9は、真空の開放前に試料に栓をするまで延長した。用いた乾燥サイクルは、以下の表9に示す。
96平底細胞培養皿(Jencons、英国)に、1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)でHEK293細胞(ECACC 85120602)を播種し、37℃、5%CO2に維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、5%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたダルベッコ最小必須培地(DMEM)1mlで再構成した。再構成したバイアルから100μlを取り、900μlのDMEMに添加することによって、1:10希釈工程を行った。次いで、得られた希釈ウイルス100μlを、プレート上の第一列に添加し、1:2希釈をプレートで実行した。この過程を次の添加剤で繰り返した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
PRISM Graphpadソフトウェアバーション4.00を用いて種々の添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析検定、続いてボンフェローニ事後検定を行った。p値摘要は、*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001である。
図11は、凍結乾燥後のアデノウイルス力価の保存についてのマンニトールとDMGとの組合せの利点を示す。凍結乾燥後、DMGをそのままで添加剤として用いた場合、ウイルス力価のほぼ対数の半分の降下(half a log drop)があった。マンニトールが唯一の添加剤であった場合、力価の損失は、DMGより著しく、ウイルス力価は、2対数桁(2 logs)だけ低下した。しかしマンニトールとDMG両方を使用すると、力価に有意な損失は無く、凍結乾燥ケーキの外観は改善された。
この実施例における実験の目的は、ケーキ形成を評価することであった。より広範なパネルの添加剤ミックスを用いた以外は実施例7と同様に、実施例8を行った。添加剤のそれぞれの種類(下記の表10参照)を原液として作製し、300μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、これを表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って運転した。凍結乾燥後に、試料を写真に撮り、ケーキ形成を評価した。
2種類の添加剤だけを調製したことを除いて実施例7と同様に、実施例9を行った。第1の添加剤は、最終容量300μlに作製したPBS中アデノウイルスであった。第2の添加剤は、2mlガラスバイアル中アデノウイルスと一緒のマンニトール(0.58M)及びDMG(0.7M)であった。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料は、ウイルス力価をアッセイしたか、又は+37℃で1週間熱処理し、次いでアッセイした。
アデノウイルスの安定化
ウイルスの調製及び凍結乾燥
CMVプロモーター下で増強GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現し、SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有する組換えヒトアデノウイルスAd5(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらの50μlのウイルス試料に、DMG、MSM及び場合によってスクロースから構成される配合物混合物250μlを添加した。それぞれの配合物混合物をSSC中で作製した。ウイルス試料に添加後のそれぞれの配合物中のDMG、MSM及びスクロースの濃度を、表11に示す:
凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であって、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)でHEK293(E
CACC 85120602)細胞を播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、細胞を接種した。
結果を図14に示す。MODDE9.0プログラム(Umetrics、Sweden)を用いて重回帰(MLR)分析によってデータを分析したときに、MSM及びDMGを組み合わせて用いた場合並びにDMG及びスクロースを組み合わせて用いた場合、相乗作用が見られた。
MVAの安定化
ウイルスの調製及び凍結乾燥
MVAを-80℃での貯蔵から取り出し、解凍した。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらのバイアル試料に、上の表11に記載した配合物混合物250μlを添加した。ゴム栓を部分的に挿入した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage Plus EL85冷凍乾燥機に積載し、実施例10で記載したとおりにプログラム4で凍結乾燥させた。
凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために+37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
添加剤を加えたMVAを300mlのSSC中で再構成した。再構成した試料を希釈し、アッセイした。
結果を図15に示す。このスクリーニング試験での応答の範囲は、開始力価の0.6〜60.5%であった(図15参照)。これを、アッセイまで-80℃で保持したウイルスの第2のアリコートに対して評価した。図15は、正の対照のパーセントとしてのそれぞれの配合処理液の応答を示す。最良の実行性配合物は、0.15Mのスクロース、1MのDMG、1MのMSMを含んだ。全体として、結果は、添加剤のこの組合せが、凍結乾燥環境におけるウイルスの安定化にかなりの可能性を有することを強く示唆する。
実験設計
MODDE 9.0を用いて、3因子、2レベルの完全多元スクリーニング設計を作成した(コード化された値を示す図16、及び適用された実濃度を示す表13参照)。この設計は、試験した範囲の高及び低レベルでの添加剤の組合せ、並びに反復中心点を検定することを含む。反復中心点は、実験における誤差の指標を与える。
凍結乾燥環境における配合されたアデノウイルスの調製及び熱負荷
生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、室温で解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の個々の2mlガラス凍結乾燥バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと一度混合した添加剤ブレンド配合物を表13に記載し、SSC中で作製した。
1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)で播種することによって、HEK293を接種のために96ウェル平底細胞培養皿に調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
このデータセットで、応答の良好な分散(0.36〜32.84%回復)が見られ、特に最も低い応答は、検出限界を超えている(表14参照)。データ点の一つ(試料ID11)(表13参照)は、モデルの微調整の間に明らかな外れ値として印を付したのち、分析から削除した。この外れ値の理由は知られていないが、オペレータエラーであると推定される。モデル強度の四つの指標すべてが高く(表14参照)、データ中に曲率は見られなかった(図19参照)。このモデルで、重要因子二つのみが特定され、DMG及びスクロースは、それぞれ有意な正の一次効果であることがわかった(表16及び図20参照)。その他の効果又は相互作用は見られなかった。ラフィノースは、モデルに、したがって、試験した範囲でのウイルス回復に影響を与えないと示された。
このデータセットで、応答の良好な範囲(0.09〜40.30%回復)が見られたが(表14参照)、この範囲での最低値は、検出閾値未満であった。モデル微調整の間に、データ点の一つ(試料ID7)を、明らかな外れ値として分析から削除した(表13参照)。作成した一次モデルは、重要因子としてスクロースのみを特定したが(図21参照)、何らかの意味ある有意性を得るために、このモデル内で非有意な因子(SMM、ラフィノース、及びSMM*スクロース)を保持することが必要であった。
このデータセットで、応答の良好な分散(0.72〜46.27%)が見られ、データ点のすべては、検出可能閾値を超えていた(表13参照)。四つのモデル評価パラメータのすべてについて、許容できるスコアを生成した(表14参照)。このモデルは、TMGの一次効果、並びにTMGとスクロースの間の相互作用を特定する(表16参照)。ラフィノース及びスクロースは、非有意な因子と特定されるが、スクロースは、階層モデルを保存するためにモデル中に保持される(図25参照)。図26は、モデル中の曲率を示唆する;しかし、モデルは、二次相互作用を含めることによって改善されず、曲率の他の何らかの原因を示唆した。
実験の設計
MODDE 9.0(Umetrics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図27参照)。Doehlert設計は、通常のシンプレックスから構築した応答面モデリング設計である。それらは、異なる方向に容易に拡張でき、新たな因子を既存の設計に加えることができる。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は、分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。さらに、設計内の異なる因子は、異なる数のレベルで検定され、したがって、より重要であると疑われる因子に対してより多くの検定レベルを割り当てることが可能である。したがって、添加剤は7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、及びラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
凍結乾燥環境における配合アデノウイルスの調製及び熱負荷
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15の2mlガラス凍結乾燥用バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表18に記載し、SSC中で作製した。
1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
四つの指標すべてが、良好な有意性を示唆する強いモデルが生じた(R2=0.93、Q2=0.79、モデル妥当性=0.98、再現性=0.68)(図29参照)。これらの中で、再現性の図は、唯一わずかに低いが、0.5を十分超えている。通例よりもわずかに低いこの値についての理由は、反復中心点間のわずかに高い変動である得るか、又はむしろ、これらの間の変動のレベルが、アッセイにおける全体の変動と比較して比例的により大きいからである。
DMG、スクロース及びラフィノースの配合物は、凍結乾燥及び熱負荷を通してアデノウイルスの保存に有意な可能性を有すると特定された。データに基づくモデルは、ウイルス活性の100%の回復が可能であることを予測する。このモデルにより、0.5と1.5Mの間の最適DMG濃度が特定された。最適スクロース濃度は、試験範囲を超えており、スクロース濃度の他の制約も超えているように思われる。ラフィノースは、このモデルにおける重要因子ではないと思われる。
凍結乾燥環境におけるアデノウイルスのためのDMG、スクロース及びラフィノースの推定最適配合を検定するために、長期安定性試験を計画した。3種類の配合物を検定した:
- SSC緩衝剤単独中アデノウイルス;
- SSC中0.5Mのスクロース及び150mMのラフィノースにおけるアデノウイルス;及び
- SSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース及び1MのDMGにおけるアデノウイルス。
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを2ml凍結乾燥用ガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。用いた添加剤ブレンド配合物は、上に記載したとおり、すなわち、(i)緩衝剤単独(SSC)、(ii)糖(SSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース)、及び(iii)推定最適配合物(やはりSSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース、1MのDMG)であった。
1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
0分の1、及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。
15週目で、(図35参照)緩衝剤単独(SSC)中で配合した試料から、ウイルス活性はまったく回復されなかった。糖との配合は、この損失の一部を防止する。しかし、+4℃で貯蔵された試料においてのみ、損失は、完全な対数降下未満の損失、すなわち、開始力価の10%を超える回復活性である。この処理では、この時点で、損失は、温度の増加とともに漸進的に悪化する。高温は、比較的長い熱安定性試験(促進安定性)をシミュレートする標準モードであるので、糖での損失は、+4℃で終点に達していないこと、及び時間経過とともにさらなる損失が予想され得ることが示唆される。
実験設計
実施例13に記載したとおりに、MODDE9.0(Umetics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図38参照)。したがって、TMGを7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、ラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
MVAを-80℃の貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを、凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加し、その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表19に記載し、SSC中で作製した。
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS及び1%PSを補給したDMEMに細胞を希釈した。プレートを+37℃、5%CO2で1から2時間置いた。
この試験からのデータを表19に示す。応答は、開始力価の6%から92%に変化した。分析の間に、配合番号14は、明らかな外れ値として特定し、この分析から排除した。これは、モデル評価パラメータを強めた。
MODDE 9.0を用いて、中心複合面心(Central Composite Face-centred)(CCF)設計を作成した(図43参照)。CCF設計は、それぞれの因子の3レベルのみを検定する応答面モデリング(RSM)設計の方式であるが、二次のモデルを依然として支持する。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。
MVAを-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加した。その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合された後の添加剤ブレンド配合物は、表20に記載し、SSC中で作製した。
アッセイプレート(96ウェル)にBHK-21細胞(ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS、及び1%PSで補給したDMEM中で細胞を希釈した。プレートを、+37℃、+5%CO2で1〜2時間置いた。
これらの試料のアッセイ(LOG間隔=1)の最初の通過(pass)は、五つだけの応答レベルを生じさせたが、これらの一つは、検出閾値未満であった。より重要なことに、十一の処理の六つが、最大検出閾値を超えていた。これらの試料を再アッセイした(LOG間隔=0.3)。試料は、これらの二つのアッセイ間で+4℃で液体として保持した。一部の試料は、両方のアッセイで意味ある値(最大閾値と最少閾値の間)を示した。これは、二つのアッセイ間の損失の決定を可能にした。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
(1) (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
- R1は、水素若しくはC1〜6アルキルを表し;
- R4は、水素を表すか;又は
- R1及びR4は、これらが結合している原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
- R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し;
- R3は、C1〜6アルキルである);
及び/或いは
式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
- Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
- Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
- Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
の水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法。
(2) 前記水溶液が、式(I)の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩、又は式(II)の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩を含む、実施形態(1)に記載の方法。
(3) 前記式(I)の化合物が、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン、N,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN-C1〜6アルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記式(I)の化合物が、(a)N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン、若しくはN-メチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは(b)N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの塩酸塩である、実施形態(3)に記載の方法。
(5) 前記式(I)の化合物が、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態(4)に記載の方法。
(6) 前記式(I)の化合物が、
- 式(IA)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;
- 前記式(I)の化合物が、式(IB)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;
- 前記式(II)の化合物が、式(IIA)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;又は
- 前記式(II)の化合物が、式(IIB)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態(1)又は(2)に記載の方法。
(7) 前記式(I)又は式(II)の化合物が、ジメチルスルホン、トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタイン、プロリンベタイン若しくはS-メチル-L-メチオニン、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態(1)、(2)又は(6)のいずれかに記載の方法。
(8) (a)前記水溶液が、1種又は複数種の糖を含み、前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mMから2.5Mであり、糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合の合計糖濃度が少なくとも0.01Mであるか、或いは(b)前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、0.1mMから3Mである、実施形態(2)から(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 式(I)若しくは式(II)の化合物又は生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、(a)0.001Mから2.5M、0.01Mから2.5M若しくは0.1Mから2M、又は(b)7mMから1.5M若しくは0.07Mから0.7M、又は(c)7mMから1.5M若しくは0.07Mから1M、又は(d)0.05Mから2M、0.02Mから2M若しくは0.07Mから1Mである、実施形態(2)から(7)のいずれかに記載の方法。
(10) 前記水溶液が、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩を含む、実施形態(1)に記載の方法。
(11) 前記水溶液が、実施形態(3)から(5)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式(IIC):
のスルホン化合物である式(II)の化合物を含む、実施形態(10)に記載の方法。
(12) 前記水溶液中における前記式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩の濃度が、0.1Mから1.5Mである、実施形態(11)に記載の方法。
(13) 前記式(IIC)のスルホン化合物が、メチルスルホニルメタンである、実施形態(11)又は(12)に記載の方法。
(14) 前記水溶液中における前記式(IIC)のスルホン化合物の濃度が、0.1Mから1.5Mである、実施形態(11)から(13)のいずれかに記載の方法。
(15) (a)前記糖濃度、又は合計糖濃度が、0.1Mから3M又は0.2Mから2Mであり、(b)前記乾燥のための溶液が、1種又は複数種の糖を、少なくとも0.1Mの濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度で含み、或いは(c)前記水溶液の糖濃度が、0.05Mから1Mである、実施形態(1)から(14)のいずれかに記載の方法。
(16) 前記水溶液が、非還元糖又は糖アルコールを含む、実施形態(1)から(15)のいずれかに記載の方法。
(17) 2種以上の糖が用いられ、且つ前記糖の1種がスクロースである、実施形態(1)から(16)のいずれかに記載の方法。
(18) スクロースとその他の糖(複数可)との濃度の比が、1:1から20:1である、実施形態(17)に記載の方法。
(19) 前記他の糖が、ラフィノースである、実施形態(17)又は(18)に記載の方法。
(20) 前記乾燥のための溶液が、マンニトールを含む、実施形態(1)から(18)のいずれかに記載の方法。
(21) マンニトールである1種の糖が存在するか、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、実施形態(1)から(16)のいずれかに記載の方法。
(22) 前記水溶液が、スクロース又はマンニトールを含む、実施形態(16)に記載の方法。
(23) (a)前記水溶液が、凍結乾燥されるか、又は(b)前記水溶液が、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥されるか、又は(c)前記水溶液が、バイアル若しくはアンプル中で凍結乾燥され、次いで前記バイアル若しくはアンプルが密封される、実施形態(1)から(22)のいずれかに記載の方法。
(24) 前記ウイルス粒子が、生ウイルス又は死滅ウイルスから構成される、実施形態(1)から(23)のいずれかに記載の方法。
(25) 前記生ウイルスが、全ウイルス又は弱毒化生ウイルスである、実施形態(24)に記載の方法。
(26) 前記水溶液が、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルスを含む、実施形態(1)から(25)のいずれかに記載の方法。
(27) 前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス又は麻疹ウイルスから選択されるウイルスである、実施形態(26)に記載の方法。
(28) 実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物。
(29) (a)固体であり、及び/又は(b)1種若しくは複数種の糖を含み、及び/又は(c)凍結乾燥されており、及び/又は(d)非還元糖若しくは糖アルコールを含む、実施形態(28)に記載の組成物。
(30) スクロース若しくはマンニトールである1種の糖が存在し、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、実施形態(28)又は(29)に記載の組成物。
(31) ウイルス誘発の毒性、ウイルス感染、ウイルス感染の続発症、癌若しくはアレルギーの予防若しくは治療における;又は遺伝子治療若しくは自己免疫疾患の治療における、ワクチンとしての使用のための、実施形態(28)から(30)のいずれかに記載の組成物。
(32) 非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、実施形態(28)から(30)のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
(33) ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)ウイルス粒子、(ii)実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに(iii)場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程と;
(b)この混合物に、アジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程と
を含む方法。
(34) (a)1種又は複数種の糖を含み、前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mMから2.5Mであり、前記糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度が、少なくとも0.01Mであるか、或いは(b)前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、0.1mMから3Mである、実施形態(33)に記載の方法。
(35) 前記ワクチンが、多価ワクチンである、実施形態(28)から(31)のいずれかに記載の組成物、実施形態(32)に記載のワクチン、又は実施形態(33)若しくは(34)に記載の方法。
(36) ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、実施形態(1)から(27)、(33)又は(34)のいずれかに記載の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末。
(37) 実施形態(28)から(31)及び(36)のいずれかに記載の組成物を含有する密封されたバイアル又はアンプル。
(38) ウイルス粒子を保存するための、実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
(39) (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と;
(b)前記溶液を最大5年間密封容器に貯蔵する工程と
を含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法。
(40) (c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を含む非晶質固体マトリックスを形成する工程をさらに含む、実施形態(39)に記載の方法。
(41) (a)前記溶液が、冷蔵庫に貯蔵されるか、又は(b)前記溶液が、冷凍庫に貯蔵される、実施形態(39)又は(40)に記載の方法。
(42) 密封容器で提供され、乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫で貯蔵される、(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液。
(43) 前記バルク水溶液が、0.1から100リットルの容量を有する、実施形態(42)に記載の溶液。
(44) ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を乾燥前に保存するための、実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれか一項に記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
(45) ウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、
実施形態(1)又は(3)から(7)のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態(1)、(3)から(7)、(11)又は(13)のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
(46) 前記組成物が、実施形態(28)から(31)、及び(36)のいずれかに記載されるとおりである、実施形態(45)に記載の使用。
Claims (15)
- (a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、並びに
(iii) 0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法。 - 前記化合物(iii)が、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの塩酸塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物(iii)が、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記式(IIC)のスルホン化合物がメチルスルホニルメタンである、
請求項5に記載の方法。 - 前記水溶液中における前記式(IIC)のスルホン化合物の濃度が、0.1Mから1.5Mである、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記水溶液が、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶液が、凍結乾燥される、請求項8に記載の方法。
- 前記水溶液が、バイアル若しくはアンプル中で凍結乾燥され、次いで前記バイアル若しくはアンプルが密封される、請求項9に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子が、生ウイルス又は死滅ウイルスから構成される、
請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記生ウイルスが、全ウイルス又は弱毒化生ウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス又は麻疹ウイルスから選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、
(iii)0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、
を提供する工程と;
(b)この混合物に、アジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程と
を含む方法。 - アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含む組成物又は乾燥粉末を製造する方法であって、
(a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、並びに
(iii) 0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、上記方法。
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