KR101819250B1 - 알룸 아쥬반트 및 알룸 아쥬반트를 포함하는 백신의 보존방법 - Google Patents

알룸 아쥬반트 및 알룸 아쥬반트를 포함하는 백신의 보존방법 Download PDF

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Abstract

놀랍게도, 본 발명자들은 알루미늄 솔트 아쥬반트에 발생한 구조적인 손상이 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리학적으로 가능한 솔트 또는 그의 에스테르 가 있을 때 아쥬반트를 냉동 또는 건조함으로써 특히 냉동건조함으로써 감소할 수 있다는 것을 발견하였다. 부가적인 하나 이상의 당의 유무는 냉동 또는 건조하는 동안 아쥬반트에 일어나는 구조적인 손상을 추가적으로 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 알루미늄 솔트 아쥬반트를 냉동 또는 건조하는 동안 보존하기 위해 하기를 포함하는 수성 서스펜션 또는 수용액을 냉동 또는 건조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(a) 알루미늄 솔트 아쥬반트;
(b) 화학식(Ⅰ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르
Figure 112012088591008-pct00038

여기에서:
R1 은 수소 또는 C1 -6의 알킬을 나타낸다; 그리고
R4은 수소를 나타낸다; 또는
R1 및 R4는 피롤리딘 링을 형성하기 위해 원자들이 함께 붙어있다;
R2는 수소, C1 -6 알킬 또는-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3를 나타낸다; 그리고
R3는 C1 -6 알킬을 나타낸다; 또는
화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르
Figure 112012088591008-pct00039

여기에서:
X는 -S(O)2- 또는 -S+(Rc)-,
Ra 및 Rb은 개별적으로 C1 -6를 나타낸다; 그리고
Rc 는 카복실산 음이온 및 아민(-NH2)성분으로 치환된 C1 -6 알킬기를 나타낸다; 그리고
(c) 선택적으로 하나 이상의 당.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
냉동 또는 건조되는 동안 알루미늄 솔트 아쥬반트를 보존하기 위해서 하기를 포함하는 첨가제의 용도 (i)본 발명의 화학식 (Ⅰ）또는(Ⅱ）의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 (ⅱ)선택적으로 하나 이상의 당;
하기를 포함하는 백신 조성물: 알루미늄-솔트 아쥬반트; 하나 이상의 항원, 본 발명의 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르; 및 선택적으로, 하나 이상의 당.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 백신 조성물; 및
백신 조성물을 위한 재부유 물질(resuspension agent)로서 하기를 포함하는 첨가제의 용도 (i)본 발명의 화학식 (Ⅰ）또는（Ⅱ）의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 (ⅱ)선택적으로 하나 이상의 당.
냉동된 또는 건조된 백신 조성물은 적절한 저장을 가능하게 하고 조성물의 보관수명을 극대화한다. 조성물은 장기적인 기간 동안 비축될 수 있다. 따라서 백신의 면역원성, 효능 및 효험이 유지될 수 있다. 화학식 (Ⅰ）또는（Ⅱ）의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 선택적인 당은 동결 방지제 역할을 하고 냉동 중에 접하게 되는 스트레스에 대항하여 알루미늄 솔트 아쥬반트를 보호하며 또한 냉동건조 중에 냉동건조 방지제 역할도 한다.

Description

알룸 아쥬반트 및 알룸 아쥬반트를 포함하는 백신의 보존방법{METHOD FOR PRESERVING ALUM ADJUVANTS AND ALUM-ADJUVANTED VACCINES}
본 발명은 알루미늄 솔트 아쥬반트를 냉동 또는 건조하는 동안, 전형적으로는 알루미늄 솔트 아쥬반트 및 하나 이상의 백신 항원을 포함하는 백신제제를 냉동 또는 건조하는 동안 보존하는 방법에 관한 것이다.
알루미늄 솔트 아쥬반트는 현재 인간 및 동물용 백신에 가장 광범위하게 사용되는 아쥬반트이다. 알루미늄 아주반트 화합물은 백신 아쥬반트 분야에서 총칭적으로 "알룸"(alum)으로 부르는 알루미늄 포스페이트(AlPO4) 및 알루미늄 하이드록사이드 (Al(OH)3)같은 알루미늄 솔트를 포함한다. 적절한 면역원성을 제공하기 위해서 항원은 아쥬반트의 표면에 흡착되어야만 한다. 알룸 아쥬반트는 면역계의 자극제 역할을 할 뿐 아니라 (예를 들어 주사에 의한)투여지점에서 항원 저장고를 제공하고 그렇게 함으로써 항체 생산을 자극하기 위한 점차적이고 지속적인 항원의 방출을 제공한다고 믿어진다. 자연 형태의 알루미늄 아쥬반트는 흔히 겔로 알려져 있으나 물용매에서는 입자의 서스펜션이다.
알룸-아쥬반트를 포함하는 백신의 저장 및 운송은 문제가 많다. 냉동건조법(lyophilisation)은 여러 단백질 제제의 장기적인 안정성을 향상시키는데 빈번히 사용되는 과정이다. 그럼에도 불구하고 알루미늄 솔트 아쥬반트를 함유한 상업적인 백신 조성물은 아쥬반트 구조의 손상을 유발하지 않고는 냉동건조될 수 없다. 냉동건조법은 아쥬반트의 겔 구조 붕괴를 일으키고 그 결과 물에서 재부유시에 아쥬반트 솔트의 응집과 침전이 일어난다. 그 결과 백신의 면역원성을 상당히 감소시킨다.
ＷＯ01/93829는 하기를 포함하는 수용액을 분무 건조 또는 분무 냉동건조하는 것을 포함하는 아쥬반트를 포함한 백신을 제조하는 방법을 설명하고 있다:
(a) 그 안에 흡착된 항원을 가지고 있는 알루미늄 솔트 또는 칼슘 솔트 아쥬반트 0.1 내지 0.95 중량％
(b) 단당류 0.5 내지 6 중량％
(c) 아미노산 또는 그의 솔트 0.1 내지 2 중량％; 및
(d) 콜로이드 물질 0.02 내지 1 중량％.
ＷＯ2008/118691 은 (a)액상 백신제제를 만들기 위해 적어도 하나의 알루미늄-솔트 아쥬반트, 적어도 하나의 버퍼 시스템, 적어도 하나의 유리성형물질 및 적어도 하나의 항원을 결합시키는 것; (b)냉동된 백신제제를 만들기 위해 액상 백신제제를 냉동시키는 것; 및 (c)건조된 백신 조성물을 만들기 위해 냉동된 백신제제를 냉동건조하는 것을 포함하는 면역학적으로 활성화된 아쥬반트와 결합한 건조된 백신 조성물을 제조하는 방법을 설명하고 있다 . 유리성형물질은 트레할로즈가 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 알루미늄 솔트 아쥬반트 백신을 저장 및 운송을 위해 냉동 또는 건조하는 동안 구조적인 손상을 감소시키고 보존하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 알루미늄 솔트 아쥬반트, 화학식(Ⅰ）또는（Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 선택적인 당을 수성 서스펜션 또는 수용액에 용해시키고 상온의 액체상태의 샘플 및 냉동건조된 샘플 및 동결융해된 샘플의 항체와의 응집결과를 비교분석함으로써 달성한다.
냉동 또는 건조된 백신 조성물은 적절한 저장을 가능하게 하고 조성물의 보존수명을 극대화한다. 조성물은 장기적인 기간 동안 비축될 수 있다. 따라서 백신의 면역원성, 효능 및 효험이 유지될 수 있다. 화학식(Ⅰ）또는（Ⅱ의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 선택적인 당은 동결 방지제 역할을 하고 냉동 중에 접하게 되는 스트레스에 대항하여 알루미늄 솔트 아쥬반트를 보호하며 또한 냉동건조 중에 냉동건조 방지제 역할을 하는데 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 알루미늄 하이드록사이드 겔을 냉동한 후의 참조 예에서 현미경으로 아쥬반트를 분석한 결과들을 보여준다. 패널 A는 정상적이고 손상되지 않은 구조의 예를 보여주고 패널 B는 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트의 냉동 후의 손상되고 응집된 결정구조를 보여준다.
도 2는 실시 예1에서 다양한 농도의 수크로스 및 디메틸글리신(DMG)의 존재시 알루미늄 하이드록사이드 겔을 냉동 후에 아쥬반트 응집분석의 결과들을 보여준다.
도 3은 응집분석을 사용하여 평가된 대로 수크로스 및/또는 트리메틸글리신(TMG)을 함유하는 실시 예2에서 설명한 제제를 냉동-해동한 후에 아쥬반트 (Al(OH)3)의 회복을 보여준다.
도 4는 응집분석을 사용하여 평가된 대로 수크로스 및/또는 S-메틸-L-메티오닌(SMM) 또는 메틸술포닐메탄(MSM)을 함유하는 실시 예2에서 설명한 제제를 냉동-해동한 후에 아쥬반트 (Al(OH)3)의 회복을 보여준다.
도 5는 실시 예3에서 다양한 농도의 수크로스 및 디메틸글리신(DMG), 트리메틸글리신(TMG), S-메틸 메티오닌(SMM) 또는 사르코신의 존재시 알루미늄 하이드록사이드 겔을 냉동건조한 후에 아쥬반트 응집분석의 결과들을 보여준다.
도 6은 컨트롤과 비교하여 실시 예6에서 아쥬반트에 결합한 BSA의 백분율을 보여준다.
도 7은 실시 예6에서 아쥬반트에 결합한 BSA의 농도를 보여준다.
도 8은 실시 예7로부터 도출된 점블릿 결과들을 보여준다. 도 8A는 4℃에 저장한 표 19에 제시한 샘플들의 점블릿을 보여준다. 도 8B는 -80℃에 저장한 표 19에 제시한 샘플들의 점블릿을 보여준다.
도 9는 실시 예7로부터 더 많은 점블릿 결과들을 보여준다. 도 9A는 4℃에 저장한 표 20에 제시한 샘플들의 점블릿을 보여준다. 도 8B는 -80℃에서 저장한 표 20에 제시한 샘플들의 점블릿을 보여준다.
요약
본 발명은 알루미늄 솔트 백신 아쥬반트의 냉동 또는 건조시, 특시 냉동건조시 구조적인 손상의 감소 및/또는 예방에 관한 것이다. 이러한 구조적 손상은 화학식 (Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 선택적으로 (ⅱ)하나 이상의 당이 존재시에 아쥬반트를 냉동 또는 건조함으로써 감소되거나 예방된다.
알루미늄 솔트 아쥬반트에 전형적으로는 적어도 하나의 항원이 흡착되어서 화학식 (Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 수용액에 접촉한다. 그 결과 수성 조성물은 하나 이상의 당이 또한 존재시에 냉동 또는 건조된다. 항원이 존재할 때 방법은 알루미늄 솔트 아쥬반트 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법이다. 알루미늄 아쥬반트를 포함하는 백신 제제는 냉동 또는 건조된 후에 각각 환자에게 백신제제를 투여하기에 앞서 해동되거나 복원될 수 있다.
본 발명은 알루미늄 아쥬반트의 구조 및 기능을 냉동 또는 건조단계 동안 보존할 수 있다. 냉동 또는 건조에 뒤이어 알루미늄 아쥬반트 백신의 면역원성은 지속적으로 유지될 수 있다.
알루미늄 솔트 아쥬반트
아쥬반트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트라도 본 발명에 사용될 수 있다. 알루미늄 솔트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3), 알루미늄 포스페이트(AlPO4), 알루미늄 하이드로클로라이드, 알루미늄 설페이트, 암모늄 알룸, 포타슘 알룸 또는 알루미늄 실리케이트가 될 수 있다. 바람직하게는, 사용된 알루미늄 솔트 아쥬반트는 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트이다. 가장 바람직하게는, 알루미늄 솔트 아쥬반트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3)이다.
전형적으로, 알루미늄 솔트 아쥬반트는 알루미늄 솔트로 만든 수화겔 형태를 취하고, 수화겔은 물 용매에서 입자의 서스펜션이다. 알루미늄-솔트 아쥬반트의 제조는 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트는 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 알려져 있다시피, 일반적으로 알루미늄 이온 수용액을(전형적으로 설페이트 또는 클로라이드를) 명확하고 세심히 통제된 화학적 환경에서 알칼리성 조건에 노출시킴으로써 제조된다. 이러한 방법들은 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트 수화겔을 제조하는데 사용될 수 있다.
항원
본 발명에 사용하기 적합한 항원은 백신의 어떤 면역성 구성요소라도 포함한다. 따라서 항원은 단백질, 박테리아에 특이적인 단백질, 무코 단백질, 당 단백질, 펩티드, 지질 단백질, 다당류, 펩티도글리칸, 핵단백질 또는 융합 단백질이 될 수 있다.
항원은 세균, 바이러스 또는 균류같은 미생물, 원생동물, 종양, 악성 세포, 식물, 동물, 인간 또는 알러젠으로부터 파생될 수 있다. 한 실시 예에서 항원은 단백질이지만 온전한 바이러스 또는 비리온은 제외시킨다.
항원은 예를 들어 재조합 DNA기술을 사용하여 파생되어 합성될 수 있다. 항원은 병원체관련항원, 종양관련항원, 알레르기관련항원, 신경결함관련항원, 심혈관계질환항원, 류마티스관절염관련항원 같은 질환관련항원일 수 있다. 항원은 비활성화된 또는 약화된/해독된 독소(변성독소)일 수 있다.
특히 백신 면역원이 생긴 병원체는 휴먼 인유두종 바이러스(human papilloma viruses, HPV), 인간면역결핍바이러스(HIV), 단순포진바이러스2(HSV2)/단순포진바이러스1(HSV1), 인플루엔자 바이러스(A,B 및 C 타입), 파라 인플루엔자 바이러스 (para influenza virus), 폴리오바이러스(polio virus), 호흡기세포융합바이러스 (RSV), 라이노바이러스(rhinoviruses), 로타바이러스(rotaviruses), 헤파타이티스 A 바이러스(hepaptitis A virus), 노르왁 바이러스(norwalk virus), 엔테로바이러스(enteroviruses), 아스트로바이러스(astroviruses), 미즐즈바이러스(measles virus), 멈프스바이러스(mumps virus), 베리셀라-조스터바이러스(varicella-zoster virus), 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus), 엡스테인바 바이러스 (epstein-barr virus), 아데노바이러스(adenoviruses), 루벨라바이러스(rubella virus), 사람T세포 림프종타입 Ⅰ바이러스(human T-cell lymphoma type Ⅰ virus: HTLV-Ⅰ), 헤파타이티스 B 바이러스(hepatitis B virus: HBV), 헤파타이티스 C 바이러스(hepatitis C virus: HCV), 헤파타이티스 D 바이러스(hepatitis D virus), 폭스바이러스(poxvirus), 백시니아바이러스(vaccinia virus), 살모넬라 (Salmonella), 나이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아 (Chlamydia), C.디피실레(C.difficile) 및 C.테타니(C.tetani)같은 클로스트리디움 (Clostridium), 보르데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis)같은 보르데텔라 (Bordetella), C.디프테리아(C.difficile)같은 코리네박테리움(Corynebacterium), 플라스모듐(Plasmodium), 콕소플라즈마(Coxoplasma), 뉴머코쿠스(Pneumococcus), 메닝거코쿠스(Meningococcus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 비브리오콜레라Vibriocholerae), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 헤모필루스(Haemophilus), 바실러스 앤스라시스(앤스라스) (Bacillus anthracis(anthrax))같은 바실러스, 에세리키아(Escherichia), 칸디다(Candida), 아스페르길루스(Aspergillus), 엔트아메바(Entamoeba), 지아르디아(Giardia) 및 트리파나조마(Trypanasoma)를 포함한다.
백신은 더 나아가 많은 가축병에 대항하여 적절한 면역반응을 자극하도록 사용될 수 있다. 따라서 백신항원은 (Ｏ,Ａ,Ｃ,SAT-1,SAT-2,SAT-3 및 Asia-1 항원형을 포함하는)구제역바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 청설병바이러스 (bluetongue virus), 고양이백혈병바이러스(feline leukaemia virus), 조류독감바이러스(avian influenza virus), 헨드라(hendra) 및 니파 (nipah) 바이러스, 소바이러스성설사증바이러스(bovine viral diarrhoea virus)같은 페스티바이러스 (pestivirus), 개파보바이러스(canine parvovirus)에서 파생될 수 있다.
종양관련항원은 예를 들어 흑색종관련항원(melanoma-associated antigens), 유방암관련항원(mammary cancer-associated antigens), 대장암관련항원(colorectal cancer-associated antigens) 또는 전립선암관련항원(prostate cancer-associated antigens)을 포함한다.
알러젠관련항원은 백신이 투여된 개체 안에서 알레르기 반응의 억제를 자극하기 위한 백신에 사용하기 적합한 어떤 알러젠이든지 포함한다(예를 들어 꽃가루, 먼지진드기, 곤충, 음식알러젠, 먼지, 독, 독소, 뱀독 및 기생충에서 파생된 항원들).
화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테 르
화학식(Ⅰ)또는(Ⅱ)의 화합물은 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르로서 존재할 수 있다.
전형적으로 그 솔트는 생리적으로 허용가능한 산을 포함하는 솔트이고 따라서 염산(hydrochloric acid) 또는 황산(sulphuric acid)같은 무기산을 가지고 형성되거나 시트르산(citric acid), 타르타르산(tartaric acid), 말산(malic acid), 말레산(maleic acid), 만델산(mandelic acid), 푸마르산(fumaric acid) 또는 메탄술폰산(methanesulphonic acid)같은 유기산을 가지고 형성된 솔트를 포함한다. 염산 솔트가 바람직하다.
전형적으로 그 에스테르는 C1 -6 알킬 에스테르, 바람직하게는 C1 -4 알킬 에스테르이다. 그러므로 에스테르는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 터셔리-부틸 에스테르일 수 있다. 에틸 에스테르가 바람직하다.
여기서 사용한 대로 C1 -6 알킬그룹은 바람직하게는 C1-4 알킬그룹이다. 바람직한 알킬그룹은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 터셔리-부틸에서 선택된다. 메틸 및 에틸이 특히 바람직하다.
의심의 소지를 없애기 위해, 화학식(Ⅰ) 및(Ⅱ) 화합물의 정의는 또한 카복시산 음이온이 -COOH가 되기 위해 양자가 더해지고 암모늄 또는 설포늄 양이온이 약학적으로 허용가능한 음이온과 연관이 되는 화합물을 포함한다. 더 나아가 의심의 소지를 없애기 위해 상기 정의된 화합물은 토토머형(tautomeric form) 또는 거울상이성질체형(enantiomeric form)으로 사용될 수 있다.
화학식(Ⅰ)의 화합물들
전형적으로 R1은 수소 또는 C1 - 6알킬을 나타내고 R4는 수소를 나타낸다. 전형적으로 R2는 수소 또는 C1 - 6알킬을 나타낸다. 바람직하게는 R1은 수소 또는 C1 - 6알킬을 나타내고 R4는 수소를 나타내고 R2는 수소 또는 C1 - 6알킬을 나타낸다.
바람직하게는 화학식(Ⅰ)의 화합물은 N-C1 - 6알킬-, N,N-디(C1 - 6알킬)- 또는 N,N,N-트리(C1 - 6알킬)-글리신 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다. 알킬그룹은 전형적으로 C1 - 4알킬그룹이다. 바람직한 알킬그룹은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 터셔리-부틸에서 선택된다. 메틸 및 에틸이 특히 바람직하다.
화학식(Ⅰ)의 바람직한 화합물은 N-메틸글리신, N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다. N-메틸글리신은 또한 사르코신(sarcosine)으로 불린다. N,N-디메틸글리신은 또한 디메틸글리신(DMG) 또는 2-(디메틸아미노)-아세트산으로 칭한다. N,N,N-트리메틸글리신은 트리메틸글리신(TMG)으로 칭한다.
그렇지 않으면, 화학식(Ⅰ)의 화합물은 전형적으로 화학식(IA)의 글리신 파생물(glycine derivative) 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르:
Figure 112012088591008-pct00001
여기서 R5와 R6은 개별적으로 C1 - 6알킬을 나타낸다. 예를 들면 메틸 또는 에틸 같은 C1-4알킬이다; 그리고 R7은 C1 - 6알킬을 나타낸다. 예를 들면 메틸 또는 에틸 또는 -(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3같은 C1 -4이다. 화학식(IA)의 바람직한 화합물은 트리메틸글리신(TMG) 및 코카미도프로필베타인(cocamidopropyl betaine, CAPB) 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다.
그렇지 않으면 화학식(I)의 화합물은 전형적으로 화학식(IB)의 프롤린 파생물(proline derivative) 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다:
Figure 112012088591008-pct00002
여기서 R8 및 R9는 개별적으로 C1 - 6알킬을 나타낸다. 예를 들면 메틸 또는 에틸 같은 C1-4알킬이다. 바람직하게는 화학식(IB)화합물은 S-프롤린 파생물이다. 바람직하게는 R8 및 R9는 둘다 메틸을 나타낸다; 이 화합물은 프롤린 베타인(proline betaine)으로 알려져 있다. S-프롤린 베타인 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르가 특히 바람직하다:
Figure 112012088591008-pct00003

화학식(IA)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르가 바람직하다.
가장 바람직하게는 화학식(I)의 화합물이 N,N-디메틸글리신 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다.
화학식(Ⅱ)의 화합물들
전형적으로, Rc의 카복시산염 및 아민 치환기는 Rc알킬부분의 동일한 탄소원자에 붙어있다. 전형적으로 Rc는 C2 -4 또는 C2 -3 알킬부분이다.
화학식(Ⅱ) 화합물은 전형적으로 화학식(ⅡA)의 술폰화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르:
Figure 112012088591008-pct00004

여기서 Rc 및 Rd는 개별적으로 C1 - 6알킬을 나타낸다. 예를 들면 메틸 또는 에틸같은 C1 - 4알킬이다. 바람직한 술폰화합물은 메틸술포닐메탄 (methylsulfonylmethane, MSM)이고, 디메틸술폰(dimethylsulfone, DMSO2)으로 역시 알려져 있다.
화학식(Ⅱ)의 화합물은 전형적으로 화학식(ⅡB)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르:
Figure 112012088591008-pct00005

여기서 Re 및 Rf는 개별적으로 C1 - 6알킬을 나타낸다, 예를 들면 메틸 또는 에틸 같은 C1 - 4알킬이다. 그리고 Rg는 카복시산염 음이온 및 아민(-NH2)부분으로 치환된 C1 - 6알킬을 나타낸다. 예를 들면 메틸 또는 에틸 같은 C1 - 4알킬이다. 화학식(ⅡB)의 바람직한 화합물은 S-메틸-L-메티오닌(S-methyl-L-methionine, SMM) 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르이다.
당(Sugars)
본 발명에 사용하기 적합한 당은 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 글리세르알데히드(glyceraldehyde), 락토오스(lactose), 아라비노스(arabinose) 및 말토오스(maltose) 같은 환원당; 및 바람직하게는 수크로스(sucrose) 및 라피노스 (raffinose)같은 비환원당을 포함한다. 당은 단당류, 이당류, 삼당류 또는 다른 올리고당이 될 수 있다. "당"은 당알코올(sugar alcohol)을 포함한다.
갈락토스(galactose) 및 만노오스(mannose)같은 단당류; 수크로스, 락토오스 및 말토오스같은 이당류; 라피노스같은 삼당류 및 스타키오스(stachyose)같은 사당류가 예상된다. 트레할로스(trehalose), 움벨리페로스(umbelliferose), 베르바스코스(verbascose), 이소말토오스(isomaltose), 셀로비오스(cellobiose), 말튜로오스 (maltulose), 튜라노스(turanose), 멜레치토오스(melezitose) 및 멜리비오스 (melibiose) 또한 본 발명에 사용하기 적합하다. 적합한 당알코올은 만니톨 (mannitol)이다.
둘 이상의 당이 존재할 수 있다. 두 개, 세 개 또는 네 개의 당이 사용될 수 있다. 냉동되거나 냉동건조된 수성 서스펜션에서 하나 이상의 당이 존재할 때, 바람직하게는 수크로스 또는 수크로스와 라피노스가 존재한다. 수크로스는 글루코스 및 프럭토스의 이당류이다. 라피노스는 갈락토스, 프럭토오스 및 글루코스로 구성되는 삼당류이다.
냉동 또는 건조될 수성 서스펜션
냉동 또는 건조될 수성 서스펜션 또는 수용액은 알루미늄 솔트 아쥬반트를 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 수용액과 혼합함으로서 제조할 수 있다. 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르는 실제로 디메틸글리신, S-메틸-L -메티오닌, 메틸술포닐메탄, 사르코신 및 트리메틸글리신에서 선택될 수 있고 예를 들면 디메틸글리신, S-메틸-L-메티오닌, 메틸술포닐메탄 또는 트리메틸글리신일 수 있다. 어떤 적합한 수용액이든지 사용될 수 있다. 상기 수용액은 완충될 수 있다. 상기 수용액은 헤페스(HEPES), 트리스-버퍼액, 인산완충액 또는 정제수가 될 수 있다.
선택적으로 하나 이상의 당은 아쥬반트 혼합물보다 먼저 수용액에 용해된다. 그렇지 않으면, 당은 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 혼합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 수용액에서 아쥬반트의 서스펜션과 혼합될 수 있다.
항원 존재할 때 일반적으로 그 항원은 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 수용액에서 아쥬반트 혼합물보다 먼저 아쥬반트 표면에 흡착된다. 아쥬반트는 수화겔 형태로 제조될 수 있고 항원은 수화겔 속으로 흡수될 수 있다. 항원흡착(Antigen adsorption)은 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 잘 알려진 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 어떤 단백질 항원에 대하여 흡착은 아쥬반트와 항원이 정전기적 인력 및 흡착을 가능하게 하면서 반대의 전하를 가질 위치의 pH 범위에서 최고로 수행될 수 있다. 특정한 항원-아쥬반트 결합에 대한 단백질 흡착은 항원의 유형 및 화학적 환경(pH, 이온 세기, 계면활성제의 유무 등)에 따라 달라질 것이다.
냉동될 수성 서스펜션 또는 수용액에서 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도 및 각기 당의 농도는 일상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 따라서 최대로 적합한 농도가 선택될 수 있다. 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르는 안정성을 증진하기 위해 당과 공동으로 작용할 수 있다.
수성 서스펜션 또는 수용액에서 화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 전형적으로 0.001M 이상의 범위에서, 바람직하게는 0.01M 이상의 범위에서 또 더욱 바람직하게는 0.1M 이상의 범위에서 예를 들면 0.1M 부터 5.0M까지의 범위내에 있다. 사용되는 특정 농도는 존재하는 항원의 유형; 사용중인 화학식(Ⅰ) 또는(Ⅱ)의 특정 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르; 하나 이상의 당이 사용되는지 아닌지의 여부 그리고 만약 그렇다면 당의 아이덴티티; 및 채택된 특정 냉동 또는 건조 공정을 포함하는 여러 요소들에 따라 달라질 것이다. 따라서:
화학식(Ⅰ)의 화합물, 또는 TMG같은 화학식(IA) 또는 화학식(IB)의 화합물, 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.01M부터 5M까지, 0.1M부터 5M까지, 0.2M부터 5M까지 또는 0.1M부터 1M까지이다.
X가 S(O)2-를 나타낼 때 화학식(Ⅱ)의 화합물, 또는 MSM같은 화학식(ⅡA)의 화합물, 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.01M부터 4M까지, 0.05M부터 2M까지, 0.07M부터 1M까지 또는 더욱 정확하게는 0.53M까지이다.
X가 S+(Rc)-을 나타낼 때 화학식(Ⅱ)의 화합물, 또는 S-메틸-L-메티오닌같은 화학식(ⅡB)의 화합물, 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.01M부터 5M까지, 0.1M부터 5M까지, 0.2M부터 3M까지 또는 0.1M부터 1M까지이다.
N,N-디메틸글리신, N,N,N-트리메틸글리신, 또는 N-메틸글리신같은 N,N-디(C1 - 6알킬)-, N,N,N-트리(C1 - 6알킬)-, N-C1 - 6알킬-글리신인 화학식(Ⅰ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 전형적으로 0.01M이상이고 바람직하게는 0.1M이상, 예를 들면 0.1M부터 5.0M까지, 0.33M부터 5.0M까지, 0.5M부터 4M까지 또는 0.5M부터 3M까지이다.
N,N-디메틸글리신(DMG)인 화학식(Ⅰ)의 화합물, 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 전형적으로 0.01M이상 그리고 바람직하게는 0.1M이상 예를 들면 0.1M부터 5.0M까지, 0.33M부터 5.0M까지, 0.5M부터 4M까지 또는 0.5M부터 3M까지이다. 더 적은 분량의 DMG 또는 DMG의 솔트 또는 에스테르는 하나 이상의 당이 존재할 때 사용될 수 있다.
하나 이상의 당이 사용된다면, 냉동되거나 건조될 수성 서스펜션 또는 수용액의 당 농도 또는 당의 총 농도는 전형적으로 1M이하 또는 0.7M이하, 예를 들면 0.5M이하 또는 0.29M이하이다. 10％ w/v 수크로스 용액은 0.29M의 수크로스 농도를 가진다. 당 농도 또는 총 농도는 0.1mM까지, 0.5mM까지, 0.073mM까지 또는 0.146mM까지 내려갈 수 있다.
화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르가 DMG이거나 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르일 때, 냉동 또는 건조하기 위한 수성 서스펜션 또는 수용액에서 당 존재시 그의 농도는 전형적으로 1M이하, 또는 0.7M이하, 예를 들면 0.5M이하 또는 0.29M이하이다. 10％ w/v 수크로스 용액은 0.29M의 수크로스 농도를 가진다. 바람직하게는, 하나 이상의 당이 존재한다면 수크로스 또는 라피노스같은 당 농도 또는 당의 총 농도는 0.5M이하, 0.2M이하, 0.1M이하, 또는 10mM이하이다. 하나 이상의 당이 존재한다면 당의 최소농도 또는 전체 최소농도는 0.01M, 0.1M 또는 0.2M이다. 당의 농도, 예를 들어 하나 이상의 당 존재시 수크로스 또는 라피노스의 농도 또는 총 농도는 따라서 0.01M부터 0.7M까지, 0.029M부터 0.5M까지, 0.058M부터 0.3M까지 또는 0.1M부터 0.3M까지이다. 당이 수크로스일 때, 수크로스의 농도는 바람직하게는 0.01M부터 0.2M까지 그리고 DMG 또는 그의 솔트 또는 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.2M부터 2M까지이다.
사용되는 특정 농도는 항원의 유형, 사용중인 화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 특정 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 채택된 특정 냉동 또는 건조공정을 포함하는 여러 요소들에 따라 달라질 것이다. 당 농도 또는 총 농도는 0.1mM부터 0.7M까지, 5mM부터 0.7M까지, 0.073M부터 0.5M까지, 또는 0.146M부터 0.389M까지일 수 있다.
당이 만니톨일 때, 만니톨 농도는 전형적으로 0.2내지 1M, 또는 0.2내지 0.8M, 바람직하게는 0.25내지 0.6M, 또는 0.4내지 0.8M, 예를 들면 0.5내지 0.6M이다.
화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르의 가장 효율적인 농도는 사용되는 화합물의 특정한 타입, 당과 결합하여 사용되는지 아닌지의 여부 그리고 사용되는 알루미늄 솔트 아쥬반트 타입 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트 아쥬반트가 사용되는지 아닌지의 여부에 의존할 것이다. 화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르와 당의 혼합물을 사용하여 본 발명자는 각 구성요소의 낮은 농도가 각기 구성요소를 개별적으로 사용했을 때 얻었던 것과 동일한 수준으로 아쥬반트 보호를 달성하는데 사용될 수 있다고 증명하였다.
당의 고 농축액은 농축된 당을 함유한 백신제제가 환자에게 주입될 때 장소에 특이적인 반응을 나타내는 것으로 알려져왔다. 그러므로, 본 발명은 낮은 농도의 당이 화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르와 결합할 때 사용될 수 있다는 장점을 가진다. 결과적으로, 상기 백신제제가 복원되거나 해동될 때, 당의 농도는 감소되고 장소 특이적인 반응의 가능성은 최소화된다.
냉동/건조
냉동법( Freeing )
냉동법은 어떤 적합한 방법에 의해서든지 수행된다. 따라서 냉동법은 액체질소 또는 액체질소기체 속에 담금으로써, 냉동고를 -4℃ 내지 -80℃에 맞추거나, 드라이아이스 및 알콜 냉동 바쓰(alcohol freezing bath)를 사용함으로써 수행될 수 있다. 대기압 조건, 온도 -4℃ 미만, -10℃미만, -15℃미만, -20℃미만, -25℃미만에서 사용될 수 있다.
건조법( Drying )
전형적으로, 건조법은 냉동건조법, 진공 건조법, 분무 건조법, 분무 냉동건조법 또는 유동층 건조법에 의해 달성된다. 냉동건조법이 바람직하다. 물질에서 수분을 줄이고 바이얼로 물질을 밀봉함으로써 상기 물질은 쉽게 저장되고, 운송되며 후에 본래 형태로 복원될 수 있다. 건조 조건은 일상적인 실험을 통해 적절히 최적화될 수 있다.
건조 중에 바이러스 입자를 포함하는 조성물이 형성된다. 따라서 바이러스 입자를 포함하는 매트릭스가 제조된다. 조성물은 전형적으로 무정형의 고체이다. 따라서 고체형의 매트릭스, 일반적으로 무정형의 고체형 매트릭스가 형성된다. "무정형"은 비구조성 및 관찰할 수 없는 규칙성 또는 반복성 분자(즉, 비결정체)구조를 의미한다. 건조공정은 무정형 케이크를 예를 들어 냉동건조를 통해 형성하는데 영향을 줄 수 있다.
동결건조법(Freeze-drying)
냉동건조법는 표준공정에 따라 수행될 수 있다. 주요한 세 단계가 있다: 냉동(freezing), 초건(primary drying) 및 재건(secondary drying). 냉동은 전형적으로 냉동건조 기계를 이용하여 수행된다. 상기 단계에서 물질의 고체상 및 액체상이 동시에 존재하는 가장 낮은 온도인 그의 공융점(eutectic point)아래로 생물학적 물질을 차가워지게 하는 것이 중요하다. 하기 단계에서는 융해보다 승화가 일어날 것이 확실하다. 그렇지 않으면, 무정형 물질은 공융점을 가지지 않되, 임계점을 가지는데 임계점 아래에서 제품이 초건 및 재건 중에 다시 용해되거나 무너지지 않도록 유지되어야 한다.
초건(primary drying)동안 압력은 적절한 레벨의 진공을 적용하여 조절되고, 물이 승화할 수 있을 정도의 충분한 열이 공급된다. 상기 단계에서 적어도 50%, 전형적으로는 60 내지 70%의 물이 물질 안에서 승화된다. 너무 많은 열은 생물학적 물질의 구조를 분해하거나 변경할 수 있기 때문에 초건은 천천히 일어날 수 있다. 차가운 콘덴서 체임버 및/또는 콘덴서 플레이트의 표면에 수분증기가 재응고되어 모인다.
재건과정(secondary drying)에서 수화수(water of hydration)는 추가의 열을 적용함으로써 제거된다. 전형적으로 건조를 더 촉진하기 위해 압력은 또한 낮추어진다. 냉동건조과정이 완료된 후에, 밀봉되기 전에 질소같은 불활성기체로 인해 진공이 깨지거나 진공하에서 물질이 밀봉될 수 있다.
진공건조법( Vaccum drying )
어떤 실시 예에서, 건조는 약 1300파스칼(Pa)에서 진공건조를 이용하여 수행된다. 그러나 진공건조는 본 발명에 반드시 필수적이진 않고 다른 실시 예에서는 바이러스성 분자에 접촉한 보존혼합물이 회전(즉, 회전건조)되거나 (하기 추가 설명된 것처럼)냉동건조된다. 유리하게도, 본 발명의 제조방법은 진공으로 바이러스 입자를 함유하는 보존혼합물을 다루는 것을 추가로 포함한다. 편리하게도, 진공은 압력 20,000파스칼 이하, 바람직하게는 1,000파스칼 이하에서 적용된다. 유리하게도 진공은 적어도 10시간동안, 바람직하게는 16시간 이상 적용된다. 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 알려졌다시피, 진공적용 시간은 샘플의 크기, 사용하는 기계 및 다른 파라미터에 의존할 것이다.
분무건조법( Spray - drying ) 및 분무냉동건조법( spray freeze - drying )
또 다른 실시 예에서, 건조는 본 발명의 보존혼합물과 혼합한 바이러스 입자를 분무건조 또는 분무냉동건조함으로써 달성된다. 이러한 기술들은 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있고 예를 들어 공기, 무산소기체 또는 질소같은 기체를 통해 액상사료를 건조시키는 방법이, 또는 분무냉동건조시키는 경우에는 액체질소를 이용하는 방법이 수반된다. 액상사료는 작은 방울들의 분무로 원자화된다. 방울들은 그 다음에 건조챔버(drying chamber) 안에서 가스와 접촉함으로써 또는 액체질소로 건조된다.
유동층 건조법( Fluid bed drying )
더 나아가 실시 예에서, 건조는 본 발명의 보존혼합물과 혼합한 바이러스 입자를 유동층 건조함으로써 달성된다. 상기 기술은 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있고 유동화된 상태를 만들기 위해 통제된 속도조건에서 산물층을 통과하여 전형적으로 (예로 공기같은) 가스를 통과시키는 것을 수반한다. 기술은 입자 생성물의 건조, 냉각, 응집, 과립화 및 코팅단계를 수반할 수 있다.
열은 유동화 가스 및/또는 유동화층에 담긴 (예로 패널 또는 튜브같은) 다른 열표면을 통해 공급될 수 있다. 냉각은 차가운 가스 및/또는 유동화층에 담긴 냉각된 표면을 사용하여 달성될 수 있다. 응집 및 과립화는 이 기술분야에서 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있고 달성되는 산물의 특성에 의존하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 분말, 과립 또는 정제같은 입자 산물의 코팅은 통제된 조건하에서 유동화된 입자 위에 액체를 분무함으로써 달성될 수 있다.
냉동법 또는 건조법에 의해 제조되는 조성물은 전형적으로 낮은 잔류 수분량을 가지는 고체형 매트릭스이다. 백신활성의 장기적인 보존을 제공하는 잔류 수분량의 수준은 예를 들어 4℃부터 56℃까지 또는 그 이상의 냉장온도 이상의 온도, 또는 예를 들어 0℃부터 -70℃까지 또는 그 이하의 냉장온도 이하의 온도에서 달성된다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 조성물은 5중량％미만, 2중량％미만 또는 1중량％미만의 잔류 수분량을 포함한다. 전형적으로 조성물은 0.1부터 5％까지 또는 0.5부터 5％까지의 잔류 수분량을 포함한다.
조성물은 건조분말 형태로 얻을 수 있다. 건조결과 예를 들어 냉동건조단계결과물인 케이크는 분말형태로 으깨어질 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 고체형 조성물은 자유롭게 흐르는 입자 형태를 취할 수 있다. 고체형 조성물은 전형적으로 밀봉된 바이러스, 앰플 또는 주사기에 담겨 분말로 제공된다. 흡입을 위해서라면 분말이 건조한 분말 흡입기 안에 담겨 제공될 수 있다. 고체형 매트릭스는 또한 패치로 제공될 수 있다. 분말은 정제형태로 압축될 수 있다.
조성물은 하기를 포함하거나, 필수적으로 포함할 수 있다: 알루미늄 솔트 아쥬반트; 하나 이상의 항원; 화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르; 및 선택적으로 하나 이상의 당.
본 발명 조성물의 용도
냉동 또는 건조된 백신 조성물은 환자에게 투여하기 전에 액체형태(수용액)로 전환된다. 냉동된 조성물은 필요한 만큼 예를 들어 인산완충식염수 또는 주사용증류수로 해동되고 희석된다. 건조된 조성물은 수용액으로, 예를 들어 인산완충식염수 또는 주사용증류수에 의해 복원된다. 그 다음에 상기 결과의 수용액은 예를 들어 주사를 통해 백신접종이 필요한 환자에게 투여될 수 있다.
화학식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 솔트 또는 에스테르 및 선택적으로 하나 이상의 당은 예를 들어 백신조성물이 환자에게 투여되기 전 액체형태(수용액)로 전환될 때 전형적으로 백신조성물을 위한 재부유 물질(resuspension agent)역할을 한다.
냉동법 또는 건조법의 역효과에 대한 보호
자연형태의 알루미늄 솔트 아쥬반트는 흔히 물 용매에서 입자 서스펜션인 겔형태이다. 냉동법 또는 건조법은 증가된 침전율 및 침전된 고체형 화합물의 더욱 빽빽한 충전에 상응하는 증가된 입자 크기에 의해 대표되는 구조적인 변화를 종종 야기한다. 그러나 본 발명을 이용하여 증가된 입자 크기, 증가된 침전율 및/또는 침전된 고체의 더욱 빽빽한 충전형태의 손상은 냉동법 또는 냉동건조법의 결과로써 감소될 수 있다.
증가된 침전율 및 침전된 고체형 화합물의 더욱 빽빽한 충전에 상응하는 증가된 입자 크기형태의 구조적인 손상은 실시 예1에서 설명하는 아쥬반트 응집분석실험을 사용하여 평가될 수 있다. 냉동 또는 냉동건조 전,후에 알루미늄 아쥬반트의 생리화학적 특성을 평가하는 다른 분석방법도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 알루미늄 겔입자의 입자 크기분포는 레이저광 회절분석(laser diffraction analysis), 엑스레이 회절(X-ray diffraction) 또는 적외선 분광법(infrared spectroscopy)을 사용하여 얻을 수 있다. 현미경검사도 구조적인 변화를 시각화하기 위해 사용될 수 있다.
하기 실시 예들은 본 발명을 설명하였다. 참조 예도 또한 제공한다.
참조 예
아쥬반트
알루미늄 하이드록사이드 겔(Al(OH)3)은 13mg/mL 용액(pH 6.8)으로 시그마(A8222)로부터 얻었다.
아쥬반트의 냉동
아쥬반트는 -20℃의 실험실 냉동고 안에 밤새 방치함으로써 냉동되었다. 그 다음 해동되어 상온(약 20℃)에 평형하게 되었다.
현미경 분석
아쥬반트는 100x의 배율의 현미경으로 조사되었다. 정상적이고, 손상되지 않은 무정형의 구조의 예 및 알루미늄 하이드록사이드의 냉동 후의 손상되고 응집된 결정조직은 도 1에서 나타내었다. 사진 A는 손상되지 않은 아쥬반트의 고르게 분포된 입자 서스펜션을 나타내고, 냉동-손상된 전형적인 아쥬반트의 크고 응집된 평면적 결정 구조 형태를 나타내고 있는 사진B와 비교가 된다.
실시 예1
방법
알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 pH 6.8의 13mg/mL 용액으로 시그마(A8222)로부터 얻었다. 처음에는 알루미늄 하이드록사이드 부피 50㎕를 96웰 플랫 바텀 마이크로플레이트의 웰에서 둘베코의 인산완충식염수(PBS)에 희석된 수크로스 및/또는 추가 첨가제 100㎕에 첨가하였다. 상기 추가 첨가제는 DMG였다. 냉동되기 이전의 DMG 및 수크로스의 최종농도 목록은 하기 표 1에서 볼 수 있다.
아쥬반트는 -20℃에서 냉동되었다. 약 18시간 후 Al(OH)3를 함유한 샘플이 해동되었고 하기 설명된 아쥬반트 응집분석을 사용하여 설명한 침전레벨로 평가되었다.
Figure 112012088591008-pct00006
아쥬반트 응집분석실험
응집량은 각 웰에서 샘플을 수확하여 100㎕ 마이크로피펫으로 넣고, 1시간동안 상온에서 재침전하도록 방치하고, 그 다음 침전된 겔의 높이를 측정하여 피펫에서 용액 총 높이의 백분율로써 평가되었다. 피펫에서 용액 총 높이의 백분율로써 침전된 겔 높이는 겔 부피％로 표현되었다. 겔 부피％가 클수록, 아쥬반트는 구조적으로 더욱 온전하다.
결과 및 논의
상기 연구의 결과는 도 2에서 두 형태로 나타내었다. 첫째로 단순한 XY 산포도를 나타냈고 이는 3D 도표에 의해 보완되었다.
어떤 DMG 또는 수크로스도 없을 때, 아쥬반트 구조에서 동결융해동안 매우 중요한 손실이 일어났다는 것을 나타내면서(∼70％손실) 오직 아쥬반트의 30％ 회복만 측정되었다. 제제에서 수크로스의 농도를 증가시키는 것은 테스트된 최고 농도에서(234mM, 대략 8％w/v) 최대 ∼70％까지 아쥬반트 회복을 증가시켰다.
DMG 단독의 농도를 증가시키는 것은 아쥬반트 회복을 증가시켰다. 좋은 용량 의존적 반응이 관찰되었고 DMG 단독으로 100％ 가까운 회복을 달성하는 것이 가능하였다.
DMG 및 수크로스와 아쥬반트의 공조는 100％ 가까운 회복을 달성하는데 필요한 DMG의 양을 크게 감소시켰다.
실시 예2
방법
알루미늄 솔트 아쥬반트는 pH 6.8의 13mg/mL 용액으로 시그마(A8222)로부터 얻었다. 처음에 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트 부피 50㎕를 96웰 플랫 바텀 마이크로플레이트의 웰에서 둘베코의 인산완충식염수에 희석된 수크로스 및/또는 추가의 첨가제 100㎕에 추가하였다. 상기 추가 첨가제는 S-메틸-L-메티오닌 (S-methyl-L-methionine), MSM 및 TMG 였다. 아쥬반트는 -20℃에서 냉동되었다. 냉동되기 이전에 수크로스 및 추가 첨가제의 최종 농도목록은 하기 표 2에서 볼 수 있다.
18시간 후에 Al(OH)3을 함유한 샘플이 해동되고 실시 예1에서 아쥬반트 응집분석을 사용하여 설명한 침전레벨로 평가되었다.
Figure 112012088591008-pct00007

Figure 112012088591008-pct00008

결과 및 논의
상기 연구의 결과는 도 3 및 4에서 두 형태로 나타냈다. 첫째로 단순한 XY 산포도를 나타냈고 이는 3D 도표에 의해 보완되었다.
어떤 수크로스 및 추가 첨가제도 없을 때 동결융해동안 아쥬반트 구조에서 매우 중요한 손실이 일어났다는 것을 나타내면서(∼70℃손실) 오직 아쥬반트의 30％회복이 측정되었다. 제제에서 수크로스 농도를 증가시키는 것은 테스트된 최고 농도에서(234mM, 약 8％ w/v) 아쥬반트의 회복을 최대 ∼70％까지 증가시켰다.
추가 첨가제 단독(TMG 및 S-메틸-L-메티오닌)의 농도를 증가시키는 것은 아쥬반트의 회복을 증가시켰다. 각각의 경우, 좋은 용량 의존적인 반응이 관찰되었고 추가 첨가제 단독으로 거의 100％ 회복을 달성하는 것이 가능하였다.
수크로스 및 추가 첨가제(TMG 또는 S-메틸-L-메티오닌)중 하나와 아쥬반트의 공조는 거의 100％ 회복을 달성하는데 필요한 추가 첨가제의 양을 상당히 감소시켰다.
실시 예3
방법
알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 pH 6.8에서 13mg/mL 용액으로 시그마(A8222)로부터 얻었다. 다량의 아쥬반트를 원심분리해서 후에 pH 7.9에서(두번) 40mM HEPES + 23mM 염화나트륨으로 세척되었던 펠릿을 형성하기 위해 다량의 아쥬반트를 원심분리하였고 본래 용적의 반에서 재부유해서 그 결과 대략 26mg/mL 용액이 되었다. 농도 6.5mg/mL의 최종 아쥬반트를 함유하는 각 유리병의 적절한 농도로 균등하게 하기 위해 26mg/mL의 아쥬반트용액 75㎕와 (추가된 아쥬반트 부피에 대해 농도로 조정하는) 관련된 첨가제 225㎕가 각각의 병에 첨가되었다. 첨가제의 최종 농도목록은 하기 표 4에 제시하였다.
샘플은 대략 3일간 지속되는, 하기 표 3에서 보여준 건조 싸이클을 사용해서 VirTis Advantage freeze dryer에 의해 냉동건조되었다. 샘플은 처음에 Thermo Savant VLP pump(Thermofisher, UK)을 이용해서 300 밀리토르(milliTorre)에서 진공이 적용되기 전에 -40℃에서 2시간 동안 냉동되었다. 유통온도 및 진공은 과정 동안 내내 조절되었고 콘덴서는 -80℃에서 유지되었다. 진공이 해지되기 전에 샘플이 마개로 막힐 때까지 11단계는 연장되었다.
초건단계에서 유통온도는 -45℃로 떨어졌다. 재건단계는 건조가 완료될 때까지 온도를 30℃까지 상승시키는 일련의 홀드단계를 포함했다. 프로브(probe)는 유통온도 및 콘덴서 온도를 기록하였다.
Figure 112012088591008-pct00009

아쥬반트 응집분석실험
냉동건조된 아쥬반트를 담은 유리병은 정제수 300㎕에서 복원되었고 와류(vortex)되었다. 응집량은 각 웰에서 샘플을 채취하여 100㎕ 마이크로피펫에 넣고, 90분간 상온에서 재침전하게 하고 그 다음에 침전된 겔 높이를 측정하여 피펫에서 수용액의 총 높이의 백분율로써 평가하였다. 피펫에서 용액의 총 높이의 백분율로써 침전된 겔 높이는 겔 부피％로 표현되었다. 겔 부피％가 클수록 아쥬반트는 더욱 구조적으로 온전하다.
Figure 112012088591008-pct00010
Figure 112012088591008-pct00011
Figure 112012088591008-pct00012
결과 및 논의
결과는 상기 표 4 및 도 5에 도표로 제시되었다. 상기 표로써 아쥬반트 구조는 (i)DMG, TMG, S-메틸 메티오닌 또는 사르코신, 및 (ⅱ)수크로스의 농도범위에서 존재시에 아쥬반트 수용액을 냉동건조하는 동안 유지할 수 있음을 확증한다. 일반적으로 케이크 퀄리티는 추가 첨가제의 낮은 농도 및 수크로스의 고농도에서 더욱 바람직하다.
실시 예4
재료 및 실험기구
만니톨: 시그마 Lot #:077K0166
DMG: 시그마 Lot # 077K0166
TMG 시그마 Lot # 049K1529
SMM 시그마 Lot # 001425374
사르코신 시그마 Lot # 078K3727
알루미늄 하이드록사이드 겔 시그마 Lot # 018K0761
Virtis Advantage Plus Freeze-Dryer: Virtis EQP # 084
정제수: 시그마 Lot # RNBB2958
마이크로피펫(모세관) Blaubrand, Lot # 7091 44
냉동건조 유리병: Adelphi 2mM VCDIN2R
스토퍼: Adelphi FDW13 13mm
방법
300㎕ 냉동건조 유리병마다 추가된 75㎕ 아쥬반트를 고려하여(1/4 용량, 따라서 25% 더 농축됨) 하기 첨가제 믹스가 10mL 마스터 믹스로써 헤페스(HEPES) 버퍼에서 제조되었다:
Figure 112012088591008-pct00013
각 유리병에 26mg/mL 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트 75㎕(13mg/mL 알루미늄 하이드록사이드 겔을 원심분리하고 본래의 반 용량에서 피펫으로 펠릿을 재부유함으로써 제조된) 및 상기 목록대로 제조된 적절한 첨가제 믹스 225㎕를 첨가하였다. 그 다음에 유리병들은 하기 표 6에 나타낸 건조 싸이클을 사용하여 VirTis Advantage freeze dryer에 들어가기 전에 마개를 막았다.
Figure 112012088591008-pct00014
냉동건조한 후에 유리병은 진공하에서 마개로 막고 뚜껑을 덮고 사진을 찍었다. 아쥬반트 응집이 실시 예3에서 제시한 것처럼 평가되었다.
결과 및 논의
결과는 하기 표 7 내지 10에서 제시하였다.
Figure 112012088591008-pct00015
Figure 112012088591008-pct00016
Figure 112012088591008-pct00017
Figure 112012088591008-pct00018
Figure 112012088591008-pct00019

상기 결과들은 DMG, TMG, SMM 및 사르코신의 존재가 아쥬반트 보호를 감소시키지 않고 당 농도를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 상기는 아쥬반트 안정화에서 첨가제의 역할을 명확히 증명한다.
실시 예5
재료 및 실험기구
만니톨: 시그마 Lot #: 077K0166
DMG: 시그마 Lot # 077K0166
TMG 시그마 Lot # 049K1529
SMM 시그마 Lot # 001425374
사르코신 시그마 Lot # 078K3727
알루미늄 하이드록사이드 겔 시그마 Lot # 018K0761
Virtis Advantage Plus Freeze-Dryer: Virtis EQP # 084
정제수: 시그마 Lot # RNBB2958
마이크로피펫(모세관): Blaubrand Lot # 7091 44
냉동건조 유리병: Adelphi 2mM VCDIN2R
스토퍼: Adelphi FDW13 13mm
방법
300㎕ 냉동건조 유리병마다 추가된 75㎕ 아쥬반트를 고려하여(1/4 부피, 따라서 25% 더 농축됨) 하기 첨가제 믹스가 10mL 마스터 믹스로써 헤페스(HEPES) 버퍼에서 제조되었다:
Figure 112012088591008-pct00020

각 유리병에 26mg/mL 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트 75㎕(13mg/mL 알루미늄 하이드록사이드 겔을 원심분리하고 본래의 반 용량에서 펠릿을 재부유함으로써 제조된) 및 상기 목록대로 제조된 적절한 첨가제 믹스 225㎕를 첨가하였다. 그 다음에 유리병들은 냉동건조기에 들어가기 전에 마개로 끝을 막고 표 12에 제시된 싸이클에 따라 진행되었다.
Figure 112012088591008-pct00021

냉동건조한 후 유리병은 진공하에서 마개를 닫았고 뚜껑을 덮었으며 사진을 찍었다. 아쥬반트 응집은 실시 예3에서 제시된 대로 평가되었다.
결과 및 논의
결과는 하기 표 13 및 14에 제시하였다.
Figure 112012088591008-pct00022
Figure 112012088591008-pct00023

Figure 112012088591008-pct00024
상기 결과들은 DMG, TMG 및 SMM의 존재가 아쥬반트 보호를 감소시키지 않고 당 농도를 감소시킬 수 있음을 나타냈다. 상기는 아쥬반트 안정화에서 첨가제의 역할을 명확히 증명하였다.
실시 예6
도입
소 혈청 알부민(BSA)은 예를 들어 아쥬반트 표면에 단백질 흡착이 측정되어야하는 실험에서 모델로 흔히 사용된다.
재료 및 실험기구
소 혈청 알부민(BSA): 시그마 P5369 Lot 058K6061
알하이드로겔: 2 ％ Brenntag Lot 4420
만니톨: 시그마 Lot #: 077K0166
DMG: 시그마 Lot # 077K0166
TMG: 시그마 Lot # 049K1529
SMM: 시그마 Lot # 001425374
DPBS: 시그마 RNBB1286
Virtis Advantage Plus Freeze-Dryer: Virtis EQP # 084
정제수: 시그마 Lot # RNBB2958
냉동건조 유리병: Adelphi 2mL VCDIN2R
스토퍼: Adelphi FDW13 13mm
-20℃ 냉동고: Stabilitech EQP #
Nunc 96-well ELISA plate
브래드포드 시약: 시그마 B6916-500ML Batch 080M4359
BioTek Plate Reader: Stabilitech EQP: 027
단백질 흡착
농도 0.52％ 알하이드로겔 및 BSA 200㎍/mL을 포함한 최종 10mL 부피와 같게하기 위해 알하이드로겔(2％스톡(w/v)으로 공급된)이 BSA를 함유한 PBS에 첨가되었다. 단백질 흡착단계는 +4℃에서 밤새 두기 전에 상온에서 부드럽게 흔들어서 배양하였다.
하기 첨가제 믹스는 5mL부피로 제조되었다:
1.315M(24％)만니톨
1.315M(24％) + 1.6M DMG
1.315M(24％) + 1.6M TMG
1.315M(24％) + 1.6M SMM
1.096M(20％)만니톨 + 1.2M DMG
1.096M(20％) + 1.2M TMG
1.096M(20％) + 1.2M SMM
0.877M(16％)만니톨 + 0.8M DMG
0.877M(16％) + 0.8M TMG
0.877M(16％) + 0.8M SMM
PBS
아쥬반트 -첨가제 가공
아쥬반트는 상기 첨가제의 1/2 농도, 0.26％ 알하이드로겔 및 100㎍/mL BSA를 만들기 위해 첨가제 농도와 1:1비율로(2mL+2mL) 혼합되었다. 상기는 (a)냉동되거나 (-80℃), (b)하기 표 15에 제시된 대로 냉동건조되거나 또는 (c) +4℃에서 액상으로 고정되었던 부피 300㎕ 으로 분리되기 전에 +4℃에서 12시간 동안 배양되었다.
상응하는 부피의 블랭크가 만들어지고 단백질 분석에서 블랭크는 포함되는 단백질이 없는 것으로 논의된 대로 처리되었다.
Figure 112012088591008-pct00025
Figure 112012088591008-pct00026
냉동건조한 후에 유리병이 진공하에 마개를 막았고, 뚜껑을 덮었으며 사진을 찍었고 실시 예3에서 설명한 대로 케이크 퀄리티에 따라 케이크에 점수를 매겼다.
액상의, 냉동된 그리고 냉동건조된 병은 그 다음에 평형되거나 해동되도록 상온에 두는 동안 냉동건조되었던 병은 300㎕의 정제수에서 복원되었고 완전한 복원이 관찰될 때까지 와류하였다.
각 300㎕의 부피는 아쥬반트를 펠릿화 하기 위해 원심분리기(microfuge)에서 1분간 돌려졌고, 상청액은 버렸으며 펠릿을 동일한 부피의 PBS에서 재부유되었다.상기 과정은 아쥬반트로부터 잔여 첨가제를 완전히 제거하기 위해 3번 반복되었다.
단백질 분석실험( 브래드포드 )
각 첨가제 결합물은 중복 대응 블랭크(즉, 단백질 없음)에 중복으로 실행되었다. 액상의, 냉동건조된 그리고 냉동된 샘플은 분리된 플레이트에서 실행되었다. 단백질 농도를 표준화하기 위해 각 플레이트는 BSA 200㎍/mL에서 시작하는 표준곡선으로 실행되어 연속으로 6.25㎍/mL까지 희석되었다. 50㎕부피의 아쥬반트 샘플은 브래드포드 용액(상온과 평형됨) 125㎕를 첨가하기 전에 각 웰에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 각 플레이트를 595nm에서 흡광도를 측정하기 전에 플레이트 쉐이크 모드(아쥬반트를 서스펜션 상태로 유지하기 위해)로 맞춘 플레이트 리더기로 5분간 옮겨졌다.
결과
각 플레이트에 대한 표준곡선이 만들어졌고(블랭크는 제외) 상기 표준 곡선(y=mx+c 등식으로)은 각 블랭크를 제외시킨 아쥬반트 샘플의 단백질 농도를 알아내기 위해 사용되었다. 데이터는 아쥬반트 샘플/mL의 총 단백질 농도로서 또한 PBS 컨트롤의 백분율로써 표시되었다.
결과는 하기 표 16 내지 18 및 도 6 및 7에 제시되었다.
Figure 112012088591008-pct00027

논의
상기 만니톨 및 DMG, TMG 및 SMM 농도는 아쥬반트 구조의 완벽한 구조적 보존에 가까운 결과를 나타냈다.
총 단백질 결과는 아쥬반트에 흡착된 BSA의 레벨이 만니톨-첨가제 범위에서, 그리고 확실히 만니톨 단독(0.66M/12%) 및 PBS에 비교할만 하다는 것을 증명하였다. 상기는 알하이드로겔의 전흡착을 유도했을 때 첨가제에 의해 야기된 단백질의 용리(elution)가 없음을 암시했다. 상기는 또한 PBS 및 만니톨의 경우이기도 했다. 액체 홀드, 냉동건조 및 동결융해의 사건들은 어떤 용리도 악화시키지 않았다.
본 실험은 냉동건조동안에 아쥬반트의 구조가 보존되는 조건하에서 단백질이 여전히 아쥬반트에 흡착됨을 보여준다.
실시 예7
도입
본 실험은 만니톨 염기를 아쥬반트 구조를 보호하기 위해 이전에 보여준 레벨에서의 DMG, TMG 및 SMM와 비교한다. 알룸 항체가 4℃를 유지했을 때와 냉동 해동되었을 때 두 저장방법에서 항체의 활성을 조사하기 위해 점블릿을 사용하여 알룸에 결합한 항체의 항원성을 비교한다.
재료
Figure 112012088591008-pct00028
Figure 112012088591008-pct00029

방법
알룸에 흡착한 쥐 항체는 동결융해되었고 다양한 첨가제의 존재하에 4℃에서 유지되었다. 쥐 항체가 그 항원성을 유지시키는지 확인하기 위해 점 블릿을 사용하여 평가하였다.
2％알하이드로겔 용액은 PBS로 0.52％까지 희석되었고 쥐 항체는 농도 200㎍/mL에 첨가되었다. 상기는 1시간 동안 상온에서 교반하며 혼합된 후 밤새 4℃에 두었다. 알룸-항체 용액은 그 다음에 하기 리스트대로 최종 첨가제 농도를 만들기 위해 첨가제 용액으로 1:1로 희석되었다:
0.657M 만니톨
0.657M 만니톨 + 0.8M DMG
0.657M 만니톨 + 0.8M TMG
0.657M 만니톨 + 0.8M SMM
PBS
상기 용액들은 그 다음에 두 부분표본으로 분리되었다. 각 첨가제 중 하나는 4℃에서 유지되었고 다른 하나는 필요시까지 -80℃에서 저장되었다.
유지된 쥐 항체 활성의 점 블릿
니트로셀룰로오스 막을 필요한 크기로 잘라 2㎕의 샘플을 점으로 찍었다. 이는 건조된 후 10mL PBS + 0.05% Tween 20 + 5% 밀크에서 1시간동안 상온의 록커(Rocker)위에서 배양되게 하였다. 상기 용액이 제거된 후 막은 PBS + 0.05% Tween20 + 5%밀크에서 1:5000으로 희석된 10mL의 항-쥐-HRP(겨자무과산화효소)에서 1시간동안 상온의 록커위에서 배양되었다. 막은 그 다음 3×10 분간 PBS + 0.05% Tween 20으로 세척되었다. 막은 초과된 버퍼를 제거하기 위해 티슈 페이퍼 위에 블럿한 다음 10mL의 TMB(테트라메틸벤지딘)을 막 위에 5분간 입혔다. TMB는 그 다음에 두드려서 없애서 블럿 컬러 스캐닝을 하였다.
결과
도 8(표 19는 도 8에서 테스트된 샘플의 레이아웃을 보여준다)은 액체의(도 8A) 및 냉동건조(도 8B) 샘플에서, 항체를 함유하지 않는 모든 샘플이 기대한 것처럼 네거티브하고, 항체 단독의 포지티브 컨트롤은 매우 포지티브하다는 것을 보여준다. 액체 샘플에서 모든 점은 동일한 희석도에서 비슷하다. 냉동된 샘플은 특히 첨가제의 샘플과 PBS 컨트롤 샘플 사이에 일관성이 적다. PBS 샘플은 1:500 희석액에서 보다 약하고 그 다음이 다양한 첨가제에서의 샘플들이다.
도 9(표 20은 도 9에서 테스트된 샘플의 레이아웃을 보여준다)는 이와 일치하는 결과를 보여준다. 첨가제들은 실험을 저해하지 않음을 보여주는 첨가제 단독 컨트롤을 포함하여, 항체를 제외한 모든 네거티브 컨트롤은 네거티브하다. PBS 샘플은 냉동된 액체샘플보다 특히 1:300 및 1:500의 첨가제에서의 샘플에 비교했을 때, 또 보다 약하다.
Figure 112012088591008-pct00030
Figure 112012088591008-pct00031
결론
두 테스트결과는 냉동된 첨가제를 함유하는 샘플에 비교하여 PBS단독 샘플에 대한 약한 포지티브 결과를 보여준다. 이는 항체가 그의 항원성을 더욱 효율적으로 유지하고 있기 때문에 샘플이 동결융해될 때, 첨가제는 알룸단독으로 항체에 결합된 것에 비교하여 알룸에 결합한 항체를 보호한다는 것을 보여준다.

Claims (25)

  1. 알루미늄 솔트 아쥬반트를 냉동 또는 동결건조하는 동안 알루미늄 솔트 아쥬반트를 보존하기 위해 하기를 포함하는 수성 서스펜션 또는 수용액의 냉동 또는 동결건조를 포함하는 것이 특징인 알루미늄 솔트 아쥬반트의 보존방법:
    (a) 알루미늄 솔트 아쥬반트;
    (b) N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염;
    (c) 하나 이상의 당.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알루미늄 솔트 아쥬반트는 알루미늄 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수성 서스펜션 또는 수용액은 적어도 하나의 항원을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항원 또는 각 항원은 아쥬반트 표면에 흡착되어 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신 또는 생리적으로 허용가능한 그의 염의 농도는 0.1 M인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 당은 1개가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 당은 수크로스이며 수크로스의 농도는 0.01 내지 0.5 M 또는 0.01 내지 0.2 M 그리고 N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염의 농도는 0.2 내지 5 M 이거나 (a),
    또는 상기 당이 수크로스이며 수크로스의 농도는 0.01 내지 0.5 M 또는 0.01 내지 0.2 M 그리고 N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염의 농도는 0.2 내지 2 M 이거나 (b),
    또는 상기 당이 만니톨이며 만니톨의 농도는 0.2 내지 0.8 M 그리고 N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염의 농도는 0.5 내지 1 M 이거나 (c),
    또는 상기 당이 수크로스이며 수크로스의 농도는 0.01 내지 0.7 M 또는 0.01 내지 0.6 M 또는 0.01 내지 0.5 M인 것 (d)을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 당이 2개의 당인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 당이 수크로스이고 또 다른 당과 함께 존재하고 그 당이 라피노스, 스타키오스 또는 당알콜이거나(a) 또는 수크로스가 또 다른 당과 함께 존재하고 그 당이 라피노스인 것(b)을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 수성 서스펜션 또는 수용액이 동결건조된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수성 서스펜션 또는 수용액이 무정형의 고체 매트릭스를 형성하기 위해 동결건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 동결건조된 무정형의 고체 매트릭스가 형성되고 그 고체 매트릭스를 밀봉된 유리병, 앰플 또는 주사기 안에 분말형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 무정형의 고체 매트릭스는 분말을 형성하기 위하여 가공되고 그 분말은 밀봉된 유리병, 앰플 또는 주사기 안에 담겨 제공되거나(a) 또는 상기 무정형의 고체 매트릭스가 정제 또는 캡슐의 일부분을 형성하는 것(b)을 특징으로 하는 방법.
  14. 알루미늄 솔트 아쥬반트; 하나 이상의 항원; N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염; 및 하나 또는 두 개의 당을 포함하는 백신 조성물.
  15. 제3항 또는 제13항의 방법에 따라 제조된 백신 조성물.
  16. 바이러스 입자를 동결건조하는 동안 바이러스 입자를 보존하기 위해 하기 (a)바이러스 입자; (b) N,N-디메틸글리신 또는 N,N,N-트리메틸글리신, 또는 생리학적으로 허용가능한 그의 염; 및 (c) 1 내지 4개의 당이 포함된 수성 서스펜션 또는 수용액의 동결건조를 포함하는 것이 특징인 바이러스 입자의 보존방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 HPV, HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, RSV, 라이노바이러스, 로타바이러스, 헤파타이티스 A 바이러스, 노르왁바이러스, 엔테로바이러스, 아스트로바이러스, 미즐즈바이러스, 멈프스바이러스, 배리셀라-조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스테인 바 바이러스, 아데노바이러스, 루벨라 바이러스, 사람 T 세포 림프종타입 I 바이러스, HBV, HCV, 헤파타이티스 D 바이러스, 폭스바이러스, 백시니아바이러스, 구제역 바이러스, 코로나바이러스, 청설병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 조류독감 바이러스, 헨드라 및 니파 바이러스, 소바이러스성설사증바이러스, 페스티바이러스, 개파보바이러스 중에서 선택되는 어느 하나의 바이러스인 것이 특징인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 당은 만니톨 또는 수크로스 중 어느 하나의 당 또는 수크로스 및 라피노스 두개의 당이 사용되는 것이 특징인 방법.
  19. 제16항의 방법에 따라 제조된 바이러스 입자를 함유하는 조성물.
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