CN101835479A - 多系祖细胞分化为软骨细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了具有广谱跨分化能力的胎血多系祖细胞，以及将这些祖细胞分化成软骨细胞的方法。

Description

多系祖细胞分化为软骨细胞
相关申请的交叉参考
本申请要求2007年7月25日提交的美国临时申请号60/951,884的权益，在此将其全部内容以引用的方式纳入本文。
技术领域
本文涉及软骨细胞，更具体而言，本文涉及将来自人脐带血的多系祖细胞(MLPC)分化为软骨细胞，并从MLPC克隆系(clonal MLPC line)制备软骨细胞克隆群。
背景
已在多个来源中鉴别到骨髓清除性治疗后能造血重建的祖细胞，这些来源包括骨髓、脐带血和胎盘血，以及用干细胞动员剂量的粒细胞集落刺激因子治疗的对象的外周血。这些细胞通常称为造血干细胞(HSC)，它们是通过细胞表面糖蛋白如CD34和CD133的存在而被鉴定的。作为“骨髓移植”的一部分，HSC仅占总细胞群中非常小的比例，并被认为是该治疗中负责恢复接受清髓剂量的化疗或放疗的患者的造血功能的救命的治疗部分。经由骨髓移植的干细胞治疗已成为大量难治疗的白血病和遗传性血液疾病的标准治疗。
最近的研究提示，骨髓中存在能自我更新和分化成除血细胞以外的多种不同组织类型的更原始的细胞群。发现这些多能细胞在成人骨髓的CD34-塑性-黏附细胞群中为微量组分，并被不同地称为间充质干细胞(MSC)(Pittenger等，Science 284：143-147(1999))、或多能成人祖细胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美国专利公开号20040107453 A1)。MSC细胞不具有单一的特定鉴定标记，但已显示对多个标记呈阳性，包括CD29、CD90、CD105和CD73，并对其它标记呈阴性，包括CD14、CD3和CD34。各个研究组已报道，可将MSC细胞分化成肌细胞、神经元、胰腺β细胞、肝细胞、骨细胞和结缔组织。其它研究组(Wernet等，美国专利公开号20020164794A1)已揭示了来自脐带血内CD45-/CD34-群的具有多能性的未受限制的体干细胞(USSC)。
发明内容
本文基于以下发现：可通过诱导人胎血的多系祖细胞(MLPC)的分化而获得软骨细胞。如本文所述，基于其免疫表型特征、基因表达特征、形态学和不同的生长模式，区分胎血MLPC与来自骨髓的MSC、HSC和USSC。本文提供由个体细胞发育单型克隆细胞系的方法，以及由这些克隆细胞系产生的软骨细胞克隆群。本文还提供低温保存MLPC(如，用于脐带血库)和软骨细胞的方法。
一方面，本文描述了一种组合物，该组合物含有纯化的人胎血多系祖细胞(MLPC)群或克隆的人胎血MLPC系和有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基，其中，所述MLPC为CD9阳性，CD45阴性，CD34阴性，SSEA-4阴性。所述MLPC还可以呈CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性，且还可呈CD10、CD41、Stro-1和SSEA-3阴性。在一些实施方式中，所述MLPC还呈CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。所述分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松、和转化生长因子β3(TGF-β3)。所述组合物还可含有生长基底。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可以是胶原包涂的培养设备或胶原包涂的三维支架(scaffold)。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。
本文还描述了一种制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法。该方法包括提供胶原包涂的二维或三维生长基底，该基底容纳纯化的MLPC群或克隆的MLPC系；和用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培育所述纯化的MLPC群或克隆的MLPC系，其中，所述MLPC呈CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。所述分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松和TGF-β3。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可以是胶原包涂的培养设备或胶原包涂的三维支架。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。所述方法还可包括测试所述具有软骨细胞表型的细胞的胞内SOX9、胞内II型胶原、胞内聚集蛋白聚糖(aggrecan)和TGF-β受体的细胞表面表达。
另一方面，本文描述了一种由人胎血制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法。该方法包括使人胎血样品与含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD15抗体和抗CD9抗体的组合物接触；使所述样品分隔成黏附相和上清相；从上清相中回收细胞；通过与固体基底黏附而从回收的细胞中纯化MLPC，其中，所述MLPC呈CD9阳性和CD45阳性；培育所述MLPC，使其获得成纤维细胞的形态学；将具有成纤维细胞形态学的MLPC或其后代加载到二维或三维的胶原包涂的生长基底上，形成加载的生长基底；和用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培养所述加载的生长基底。该方法还可包括，在加载所述生长基底前，由具有成纤维细胞形态学的所述MLPC制备克隆的MLPC系。
又一方面，本文描述了克隆的软骨细胞群和含有这些克隆的群的组合物。在一个实施例中，组合物含有克隆的成骨细胞群和培养基。克隆的成骨细胞群还可容纳于三维支架(如包涂胶原的三维支架)内。所述三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。这些组合物还可含有低温保存剂(如二甲亚砜(DMSO)，例如1-10％的DMSO)。低温保存剂可以是胎牛血清、人血清、或者人血清白蛋白与一种或多种以下成分的组合：DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，低温保存剂可以是人血清、DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。
本文还描述了一种制品，该制品含有克隆的软骨细胞群。该克隆群可容纳于容器(如小瓶或袋)内。该容器还可含有低温保存剂。该克隆群可以单层生长，并以悬浮方式低温保存，或者可容纳于三维支架内。该三维支架可容纳于多孔板的孔内。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员常规理解的含义相同。虽然可采用与本文所述的方法和材料类似或等价的方法和材料实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全文都以引用的方式纳入本文。出现冲突时，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。
依据下文详细的描述以及权利要求书，本发明的其它特征和优点将更显而易见。
附图说明
图1是从胎血纯化MLPC的细胞分离程序的示意图。
图2A-2D是描述发育的MLPC的形态学的显微照片。图2A显示从脐带血分离的MLPC的早期培养物，证明了所述细胞处于白细胞形态学期。图2B显示开始由白细胞形态学变化为成纤维细胞形态学的MLPC的培养物。图2C显示对数生长期的MLPC晚期培养物。图2D显示MLPC的完全铺满(confluent)培养物。
图3A-3C是分化成软骨细胞的MLPC的显微照片。图3A显示在二维胶原包涂的聚苯乙烯培养板上生长的软骨细胞。图3B显示在三维磷酸三钙支架上生长的软骨细胞。图3C显示在三维二氧化钛支架上生长的软骨细胞。可看到细胞在支架中的孔内和孔周围生长。
图4是分化成软骨细胞并在胶原包涂的烧瓶上形成的软骨材料的MLPC的显微照片。
详细描述
总的来说，本发明提供由人胎血(如脐带血、胎盘血、或胎儿的血)获得的MLPC的纯化群，和衍生自单个MLPC的克隆的MLPC系。胎血提供的细胞源比成人骨髓的细胞更不成熟，且携带有不成熟细胞表面标记的细胞的比例更高。因此，胎血的祖细胞在扩展和分化方面具有优势。如本文所述，MLPC具有不同于骨髓衍生的MSC、骨髓衍生的HSC和脐带血衍生的HSC和USSC的免疫表型特征和基因表达特征。本文所述的细胞具有自我更新和分化成不同细胞和组织类型的能力。例如，MLPC能够分化成软骨细胞，如下文所示。可用MLPC开发细胞治疗，建立低温保存细胞库，用于将来的再生医学程序。还可修饰MLPC，这样，该细胞可产生一种或多种多肽或其它感兴趣的治疗化合物。
细胞分离组合物
可使用美国专利公开号2003-0027233-A1公开的负选择方法和细胞分离组合物从胎血(如脐带血)分离MLPC。这些细胞组合物可含有葡聚糖和一种或多种抗细胞表面抗原的抗体(即，对这些抗原具有结合亲和力)。
葡聚糖是由主要以α(1→6)方式连接的葡萄糖单元组成的多糖。葡聚糖可导致红细胞堆叠(即形成红细胞叠连(rouleau formation))，因而促进红细胞样细胞从溶液中的清除。抗细胞表面抗原的抗体可通过同型凝集(即相同细胞类型的细胞的凝集)和/或异型凝集(即不同细胞类型的细胞的凝集)促进血细胞从溶液中清除。
例如，细胞分离组合物可包括葡聚糖和抗血型糖蛋白A、CD15和CD9的抗体。细胞分离组合物还可含有抗其它血细胞表面抗原(包括例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、I型HLA、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1、表面Ig、及其组合)的抗体。
通常，细胞分离组合物中抗血型糖蛋白A抗体的浓度为0.1-15mg/L(例如0.1-10mg/L、1-5mg/L、或者1mg/L)。抗血型糖蛋白A抗体可通过至少两种机制促进红细胞从溶液中清除。首先，抗血型糖蛋白A抗体可引起红细胞的同型凝集，因为血型糖蛋白A是血细胞的主要表面糖蛋白。此外，抗血型糖蛋白A抗体还可稳定葡聚糖介导的红细胞叠连。示例性的单克隆抗血型糖蛋白A抗体包括但不限于107FMN(鼠IgG1同种型)、YTH89.1(兔IgG2b同种型)、2.2.2.E7(鼠IgM同种型；生物E公司、圣保罗、MN)和E4(鼠IgM同种型)。见，例如M.Vanderlaan等，Molecular Immunology 20：1353(1983)；Telen M.J.和Bolk、T.A.、Transfusion 27：309(1987)；和Outram S.等、Leukocyte Research.12：651(1988)。
细胞分离组合物中抗CD15抗体的浓度可以为0.1-15mg/L(如0.1-10、1-5、或1mg/L)。抗CD15抗体可通过交联粒细胞表面上存在的CD15分子而引起粒细胞的同型凝集。抗CD15抗体还可通过刺激粒细胞表面上的粘附分子(如L-选择素蛋白和β-2整合蛋白)的表达而引起粒细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞的同型或异型凝集，所述粘附分子与单核细胞、NK细胞和B细胞上的粘附分子相互作用。这些细胞类型的异型凝集可促进这些细胞与红细胞组分从溶液中的清除。示例性的单克隆抗CD15抗体可包括但不限于AHN1.1(鼠IgM同种型)、FMC-10(鼠IgM同种型)、BU-28(鼠IgM同种型)、MEM-157(鼠IgM同种型)、MEM-158(鼠IgM同种型)、324.3.B9(鼠IgM同种型；生物E公司、圣保罗、MN)和MEM-167(鼠IgM同种型)。见例如Leukocyte typing IV(1989)；Leukocyte typing II(1984)；Leukocyte typing VI(1995)；Solter D.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 75：5565(1978)；Kannagi R.等，J.Biol.Chem.257：14865(1982)；Magnani，J.L.等，Arch.Biochem.Biophys 233：501(1984)；Eggens I.等，J. Biol.Chem.264：9476(1989)。
细胞分离组合物中抗CD9抗体的浓度范围可以是0.1-15、0.1-10、1-5或1mg/L。抗CD9抗体可引起血小板同型凝集。抗CD9抗体还可通过粘附于粒细胞和单核细胞表面的血小板引起粒细胞和单核细胞的异型凝集。CD9抗体可促进血小板p-选择蛋白(CD62P)、CD41/61、CD31和CD36的表达，这种表达促进血小板结合于白细胞表面。因此，抗CD9抗体可促进多细胞-细胞联系，并从而促进凝集和从溶液中清除。示例性的单克隆抗CD9抗体包括但不限于MEM-61(鼠IgG1同种型)、MEM-62(鼠IgG1同种型)、MEM-192(鼠IgM同种型)、FMC-8(鼠IgG2a同种型)、SN4(鼠IgG1同种型)、8.10.E7(鼠IgM同种型；生物E公司、圣保罗、MN)、和BU-16(鼠IgG2a同种型)。见例如Leukocyte typing VI(1995)；Leukocyte typing II(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr.和Moderman P.N.(1989)，Leukocyte typing IV(W.Knapp等编辑)、pp.989-92、牛津大学出版社，牛津；Jennings，L.K.等，Leukocyte typing V、S.F.Schlossmann等编辑、pp.1249-51、牛津大学出版社，牛津；Lanza F.等，J.Biol.Chem.266：10638(1991)；Wright等，Immunology Today 15：588(1994)；Rubinstein E.等，Seminars in Thrombosis and Hemostasis 21：10(1995)
在一些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD41的抗体，该抗体可选择性凝集血小板。在一些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD3的抗体，该抗体可选择性凝集T细胞。在一些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD2的抗体，该抗体可选择性凝集T细胞和NK细胞。在一些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD72的抗体，该抗体可选择性凝集B细胞。在一些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD16的抗体，该抗体可选择性凝集NK细胞和嗜中性粒细胞。这些抗体各自的浓度范围可以是0.01-15mg/L。示例性的抗CD41抗体包括但不限于PLT-1(鼠IgM同种型)、CN19(鼠IgG1同种型)、和8.7.C3(鼠IgG1同种型)。抗CD3抗体的非限制性例子包括OKT3(鼠IgG1)、HIT3a(鼠IgG2a同种型)、SK7(鼠IgG1)和BC3(鼠IgG2a)。抗CD2抗体的非限制性例子包括7A9(鼠IgM同种型)、T11(鼠IgG1同种型)、和Leu5b(鼠IgG2a同种型)。抗CD72抗体的非限制性例子包括BU-40(鼠IgG1同种型)和BU-41(鼠IgG1同种型)。抗CD16抗体的非限制性例子包括3G8(鼠IgG)。
如上所述，可将细胞分离组合物配置成选择性凝集特定的血细胞。作为一个例子，含有抗血型糖蛋白A、CD15和CD9的抗体的细胞分离组合物可促进红细胞、粒细胞、NK细胞、B细胞和血小板的凝集。然后，可从溶液中回收T细胞、NK细胞和罕见的前体细胞如MLPC。如果制剂还含有抗CD3的抗体，则T细胞也可被凝集，可从溶液中回收NK细胞和罕见的前体如MLPC。
细胞分离组合物可含有抗其它类型的细胞(如肿瘤细胞的细胞表面蛋白)的表面抗原的抗体。本领域熟练的技术人员可使用常规的方法制备抗血液和人或其它哺乳动物(包括但不限于非人灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、兔和豚鼠)、猪、牛和马)的其它细胞的细胞表面抗原的抗体。
典型地，用于该组合物中的抗体是单克隆抗体，所述单克隆抗体是针对抗原中含有的特定表位的抗体的同质群体。合适的单克隆抗体可从市场上购得，或可采用标准的杂交瘤技术制得。具体而言，可采用通过培养中的连续细胞系生产抗体分子的技术(包括Kohler，G.等，Nature，1975，256：495中所描述的技术)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，”《单克隆抗体和癌症治疗》R.L.阿兰公司(Alan R.Liss、Inc.)，pp.77-96(1983))来获得单克隆抗体。
抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。IgG和IgM同种型的抗体特别适用于本发明的细胞分离组合物。与IgG抗体相比，五聚体的IgM抗体含有更多的抗原结合位点，在一些情况中(如抗血型糖蛋白A和抗CD15)，该IgM抗体特别适于用作细胞分离试剂。在其它情况中(例如抗CD9抗体)，IgG同种型的抗体特别适用于刺激同型和/或异型凝集。
抗细胞表面抗原的抗体可以液相的方式提供，即是可溶的。液相抗体通常以约0.1到约15mg/l(如0.25-10、0.25-1、0.5-2、1-2、4-8、5-10mg/l)的浓度提供于细胞分离组合物中。
抗细胞表面抗原的抗体也可以与固相结合的方式提供，即结合于基底(substrate)。抗不同细胞表面抗原的抗体可共价连接于固相上，以促进细胞表面分子的交联和细胞表面粘附分子的活化。使用基底结合的抗体可促进细胞分离(如，由于有助于凝集细胞的颗粒质量的缘故，或者由于纯化可用的性质的缘故)。
在一些实施方式中，结合基底的抗体结合的固相是颗粒。在一些实施方式中，抗体结合于胶乳微粒，如顺磁珠(如，通过生物素-抗生物素蛋白连接、与聚苯乙烯珠上的COO基团共价连接，或者与修饰珠上的NH2基团共价连接)。在一些实施方式中，抗体结合于酸腐蚀的玻璃颗粒(如，通过生物素-抗生物素蛋白连接)。在一些实施方式中，抗体结合于聚集的多肽，例如，聚集的牛血清白蛋白(如，通过生物素-抗生物素蛋白连接，或者通过与多肽的COO基团或NH2基团共价连接)。在一些实施方式中，抗体共价连接于多糖，如高分子量(如＞1,000,000Mr)硫酸葡聚糖。在一些实施方式中，生物素化的抗体可连接于抗生物素蛋白颗粒，产生每个抗生物素蛋白分子具有四个抗体分子的四聚体复合物。在一些实施方式中，抗体通过生物素-抗生物素蛋白-生物素化抗体连接结合于生物素化的琼脂糖凝胶颗粒(“单细胞系统”，剑桥，MA、U.S.A.)。这些颗粒的大小通常约为300-500微米，且可在超声水浴或快速混合的水浴中产生。
细胞-基底颗粒(即包含细胞和结合基底的抗体的颗粒)可作为凝集物从溶液中沉淀出来。细胞-基底颗粒还可通过例如施加的磁场(当颗粒是顺磁珠时)而从溶液中分离。结合基底的抗体通常以约0.1到约50.0×109个颗粒/l(如0.25-10.0×109、1-20.0×109、2 to-10.0×109、0.5-2×109、2-5×109、5-10×109和10-30×109个颗粒/l)的浓度存在于细胞分离组合物中，其中颗粒指抗体结合于其上的固相颗粒。
细胞分离组合物还可含有二价阳离子(如Ca+2和Mg+2)。二价阳离子可通过例如平衡盐溶液(如汉克氏平衡盐溶液)提供。据报道，Ca+2离子对于选择蛋白介导和整联蛋白介导的细胞-细胞粘附起重要作用。
细胞分离组合物还可含有抗凝集剂，如肝素。肝素可防止凝块和与高钙环境中的凝块相关的非特异性细胞损失。肝素还促进血小板聚块。聚块的血小板可粘附于粒细胞和单核细胞，从而比单一的血小板更能增强异型凝集。肝素可以肝素盐(如肝素钠、肝素锂或肝素钾)的方式提供。
MLPC的群和克隆系
可使用上文所述的细胞分离组合物从人胎血纯化MLPC。本文中，“纯化的”指细胞群中至少90％(如91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的细胞是MLPC。本文中，“MLPC”指CD9阳性且通常展示一群(a constellationof)其它标记如CD13、CD73和CD105的胎血细胞。“MLPC群”指从人胎血及其未克隆的后代获得的原始培养物。“克隆系”指从单个细胞衍生得到的细胞系。本文中，“细胞系”是能在体外在适当的培养条件下长时间自我更新的细胞群。但是，术语“系”不指可无限繁殖的细胞。相反，本文所述的克隆系通常在开始衰老前可进行75到100次倍增(doubling)。
典型地，通过使胎血样品与上文所述的细胞分离组合物接触、并使样品分配成凝集相和上清相而获得MLPC群。例如，可通过重力或通过离心沉淀样品。优选地，可从产后48小时内(例如产后24内、12小时内、8小时内或4小时内)的脐带血样品纯化MLPC。凝集后，未凝集的细胞可从上清相中回收。例如，上清相中的细胞可如下所述回收：离心，然后用生理盐水洗涤，并接种于固相基底(如塑料培养设备，如腔室玻片(chambered slide)或培养瓶)上，使用含有10％血清的标准生长培养基(如含有10％血清的DMEM、含有10％血清的RPMI-1640、或含有10％血清的间充质干细胞生长培养基(商品号#PT-3001，龙沙公司，沃克斯维尔(Walkersville)，MD))培养。MLPC粘附到固相基底的表面上，而其它细胞(包括T细胞、NK细胞和CD34+ HSC)不粘附，因此可通过洗涤除去所述其它细胞。开始培养后3天到2周之间，MLPC从白细胞形态学变化为成纤维细胞形态学，之后细胞进入对数生长期，并将继续对数生长，只要培养物中细胞的浓度维持为小于约1.5×105个细胞/cm2。
可如下建立克隆系：收集MLPC，然后稀释，将细胞重新接种到多孔培养板上，使每个孔中有单个细胞。在浓度达到1-5×105个细胞/75cm2后，可将细胞转移到较大的培养瓶中。可以1×105-5×105个细胞/75cm2的浓度维持细胞，使其对数生长。参见，例如美国专利公开号2005-0255592-A。
可采用现有技术已知的技术评估MLPC的生存能力、增殖潜能和寿命。例如，生存能力可使用锥虫蓝排除法、荧光素二乙酸酯摄取法或碘化丙锭摄取法评估。可采用胸苷摄取法或MTT细胞增殖实验评估增殖。可通过测定长时间培养物的种群倍增的最大数量来评估寿命。
可使用已知的技术对MLPC进行免疫表型表征。例如，可从组织培养设备中除去细胞培养基，用平衡盐溶液(如汉克氏平衡盐溶液)和牛血清白蛋白(如2％BSA)洗涤粘附的细胞。可在对细胞表面抗原如CD9、CD45、CD13、C73、CD105或任何其它细胞表面抗原具有结合亲和力的抗体存在下培育细胞。抗体可被可检测地标记(如荧光标记或酶标记)，或者可使用可检测地标记的二抗检测。或者，可使用流式细胞术和荧光标记的抗体表征MLPC上的细胞表面抗原。
如本文所述，MLPC上的细胞表面抗原可根据培养的阶段而改变。在培养早期，当MLPC显示白细胞样形态学时，MLPC呈CD9和CD45、SSEA-4(阶段特异性胚胎抗原-4)，、CD34以及CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、干细胞因子、STRO-1(一种由骨髓基质细胞表达的细胞表面抗原)、SSEA-3(半乳糖苷基红细胞糖苷酯)和CD133阳性，并呈CD15、CD38、血型糖蛋白A(CD235a)、和种系标记物CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR、和CD102阴性。在转变为成纤维细胞形态学后，MLPC呈CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD106阳性，和CD34、CD41、CD45、干细胞因子、STRO-1、SSEA-3、SSEA-4和CD133阴性。在体外培养的所有时候，未分化的MLPC呈CD15、CD38、血型糖蛋白A(CD235a)、和种系标记物CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR和CD102阴性。
已描述骨髓衍生的MSC和MAPC以及脐带血衍生的USSC是从CD45-/CD34-细胞群衍生得到。MLPC作为CD45+/CD34+衍生的细胞而与其它细胞类型区分开来。此外，在熟化的所有阶段，胎血衍生的MLPC上CD9的存在和持续性，进一步使得MLPC与MSC和MAPC区分开来，后者不具有CD9作为标记。CD9是表达在人胚胎干细胞上的标记。在其白细胞形态学阶段具有造血标记物CD45、CD133、CD90和CD34的MLPC，可通过它们的专性塑性粘附和间充质干细胞相关的标记物CD105、CD29、CD73、CD13和胚胎干细胞相关的标记物SSEA-3和SSEA-4的存在而与HSC区分开来。此外，使用当前可获得的技术，HSC无法在体外无分化地培养，而MLPC可扩增许多代而不分化。MLPC与MSC和USSC的不同之处还有，MLPC在体外培养外形上更细长，呈细线样细胞质突出和它们对低密度培养条件的偏好以实现最佳生长。
MLPC还可基于一个或多个基因的表达而表征。检测基因表达的方法可包括例如测量感兴趣的mRNA或蛋白质的水平(如，通过Northern印迹、反转录酶(RT)PCR、微阵列分析、Western印迹、ELISA、或免疫组织化学染色)。MLPC的基因表达特征与其它细胞类型明显不同。微阵列分析指示，MLPC系具有未成熟的表型，该表型不同于例如CD133+HSC、种系阴性细胞(Forraz等，Stem Cells，22(1)：100-108(2004))、和MSC(商品号#PT-2501，龙沙公司，沃克斯维尔，MD，美国专利号5,486,359)的表型，这证明参与(commitmentdown)几个种系途径的显著程度。参见，例如美国专利公开号2006-0040392-A1。
MLPC和MSC之间的基因表达模式的比较证明，MSC更多地参与结缔组织途径。MSC中有80个基因上调，MLPC中有152个基因上调。具体而言，与MSC相比，下述基因在MLPC被上调，即与MLPC相比，它们在MSC中的表达降低：ITGB2、ARHGAP9、CXCR4、INTEGRINB7、PECAM1、PRKCB_1、PRKCB_3、IL7R、AIF1、CD45_EX10-11、PLCG2、CD37、PRKCB_2、TCF2_1、RNF138、EAAT4、EPHA1、RPLP0、PTTG、SERPINA1_2、ITGAX、CD24、F11R、RPL4、ICAM1、LMO2、HMGB2、CD38、RPL7A、BMP3、PTHR2、S100B、OSF、SNCA、GRIK1、HTR4、CHRM1、CDKN2D、HNRPA1、IL6R、MUSLAMR、ICAM2、CSK、ITGA6、MMP9、DNMT1、PAK1、IKKB、TFRC_MIDDLE、CHI3L2、ITGA4、FGF20、NBR2、TNFRSF1B、CEBPA_3、CDO1、NFKB1、GATA2、PDGFRB、ICSBP1、KCNE3、TNNC1、ITGA2B、CCT8、LEFTA、TH、RPS24、HTR1F、TREM1、CCNB2、SELL、CD34、HMGIY、COX7A2、SELE、TNNT2、SEM2、CHEK1、CLCN5、F5、PRKCQ、ITGAL、NCAM2、ZNF257-MGC12518-ZNF92-ZNF43-ZNF273-FLJ90430、CDK1、RPL6、RPL24、IGHA1-IGHA2_M、PUM2、GJA7、HTR7、PTHR1、MAPK14、MSI2_1、KCNJ3、CD133、SYP、TFRC_5PRIME、TDGF1-TDGF3_2、FLT3、HPRT、SEMA4D、ITGAM、KIAA0152_3、ZFP42、SOX20、FLJ21190、CPN2、POU2F2、CASP8_1、CLDN10、TREM2、TERT、OLIG1、EGR2、CD44_EX3-5、CD33、CNTFR、OPN、COL9A1_2、ROBO4、HTR1D_1、IKKA、KIT、NPPA、PRKCH、FGF4、CD68、NUMB、NRG3、SALL2、NOP5、HNF4G、FIBROMODULIN、CD58、CALB1、GJB5、GJA5、POU5F_1、GDF5、POU6F1、CD44_EX16-20、BCAN、PTEN1-PTEN2、AGRIN、ALB、KCNQ4、DPPA5、EPHB2、TGFBR2和ITGA3。参见，例如美国专利公开号2006-0040392-A1。
MLPC表达大量与“干细胞性(stemness)”相关的基因，“干细胞性”指自我更新的未分化的能力，和分化成大量的不同细胞类型的能力。与“干细胞性”相关的基因包括已知在人胚胎干细胞中过表达的基因，包括例如POU5F(Oct4)、TERT和ZFP42。例如，65个与蛋白质合成相关的基因被下调；18个与磷酸酯代谢相关的基因被下调；123个调节增殖和细胞周期的基因被下调；12个与分化表面标记物相关的不同基因簇被下调，如与结缔组织相关的基因，包括整联蛋白α-F、层粘连蛋白和胶原受体、ASPIC、血小板反应素、内皮的内皮素-1和-2前体、表皮CRABP-2，和与脂肪细胞相关的基因，包括例如瘦蛋白受体；以及80个与核酸结合和分化的调节相关的基因被上调。因此，MLPC群的未成熟性可基于一个或多个基因(如，CXCR4、FLT3、TERT、KIT、POU5F、或造血CD标记物如CD9、CD34和CD133中的一个或多个)的表达而被表征。参见，例如美国专利公开号2006-0040392-A1。
可通过将MLPC(如5×106到2×107个细胞/mL)悬浮于低温保存剂如二甲亚砜(DMSO，通常为1-10％)中或于胎牛血清、人血清、或人血清白蛋白与DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一种或多种的组合中低温保存MLPC。例如，可使用以下物质来低温保存MLPC：(1)含有10％DMSO的胎牛血清；(2)含有10％DMSO和1％葡聚糖的人血清；(3)含有1％DMSO和5％海藻糖的人血清；或(4)20％人血清白蛋白、1％DMSO和5％海藻糖。加入低温保存剂后，可冷冻细胞(如冷冻到-90℃)。在一些实施方式中，以受控的速率(例如电子化控制)或通过将细胞悬浮于70％乙醇浴并至于液氮储存罐的气相中而冷冻细胞。当细胞冷冻到-90℃时，可将它们置于液氮储存罐的液相中长时间保存。低温保存允许长时间保存这些细胞以用于治疗用途。
MLPC的分化
MLPC能分化成各种细胞，包括三个胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)中各个胚层的细胞。本文中，“能分化”指给定细胞或其后代在适当的培养条件下能够产生分化的表型。例如，MLPC可分化成具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞/胰腺前体(也已知为卵圆细胞)表型的细胞、具有成熟肝细胞表型的细胞、肺细胞、软骨细胞、以及其它细胞类型。当MLPC的克隆系分化时可获得分化细胞(如软骨细胞)的克隆群。
可使用一种或多种分化试剂诱导分化，所述分化试剂包括但不限于Ca2+，表皮生长因子(EGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，角质细胞生长因子(KGF)，转化生长因子(TGF)如TGFβ3，细胞因子如白介素、干扰素，或肿瘤坏死因子，视黄酸，转铁蛋白，激素(如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、或地塞米松)，抗坏血酸，丁酸钠，TPA，DMSO，NMF(N-甲基甲酰胺)，DMF(二甲基甲酰胺)，或基质元件如胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素。
可采用已知的方法评估确定MLPC已分化成特定细胞类型，所述方法包括测量形态学和细胞表面标记物(如，通过流式细胞术或免疫组织化学法)的变化、通过光学显微镜或共聚焦显微镜检测形态学，或者通过采用诸如聚合酶链式反应(PCR)(如RT-PCR)或基因表达模式测定之类的技术测定基因表达的变化。
例如，可使用含有地塞米松、L-谷氨酰胺、抗坏血酸盐/酯和β-甘油磷酸的诱导培养基(如生骨分化培养基，商品目录号#PT-3002，龙沙公司)诱导MLPC分化成具有骨细胞表型的细胞(Jaiswal等，J.Biol.Chem.64(2)：295-312(1997))。具有骨细胞表型的细胞含有钙晶体的沉积物，该沉积物经例如茜素红染色而可见。
可使用含有胰岛素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的诱导培养基(如生脂分化培养基，商品目录号#PT-3004，龙沙公司(Lonza))诱导MLPC分化为具有脂肪细胞表型的细胞。具有脂肪细胞表型的细胞含有脂质填充的脂质体，该脂质体经油红染料而可见。这类细胞还含有甘油三酯，后者与尼罗红染色而发出绿色荧光(Fowler和Greenspan、Histochem. Cytochem.33：833-836(1985))。
可使用含有EGF、胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和碱性FGF的诱导培养基(如SkGMTM，商品目录号#CC-3160，龙沙公司)诱导MLPC分化成具有肌细胞表型的细胞(Wernet等，美国专利公开号20020164794 A1)。具有肌细胞表型的细胞表达快速骨骼肌肌球蛋白(fast skeletal muscle myosin)和α辅肌动蛋白。
可使用含有人碱性FGF、人EGF、NSF-1和FGF-4的诱导培养基(如NPMMTM-神经祖细胞维持培养基，商品目录号#CC-3209，龙沙公司)和预先包涂有聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的培养设备(如从BD生物科学开发实验室器具公司购得，商品目录号#354688)诱导MLPC分化成具有神经干细胞表型(神经球)的细胞。一旦细胞分化成神经球后，加入脑衍生的神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT-3)可使其进一步分化成运动神经元，加入白血病抑制因子(LIF)、视黄酸和睫状神经营养因子可使其进一步分化成星形胶质细胞，而加入3，3’，5-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)可使它们进一步分化成少突胶质细胞。可通过巢蛋白、III型β微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC)的表达来证实神经细胞的分化。神经球对所有这些标记物呈阳性，但一些分化的细胞类型则不是。可通过髓鞘碱性蛋白(MBP)的阳性染色来证实向少突胶质细胞的分化。
可使用含有肝素、牛脑提取物、表皮生长因子(如人重组表皮生长因子)和氢化可的松的内皮细胞生长培养基(如EGMTM-MV、商品目录号#CC-3125，龙沙公司)诱导MLPC分化成具有内皮细胞表型的细胞。可通过E-选择蛋白(CD62E)、ICAM-2(CD102)、CD34和STRO-1的表达证实内皮细胞分化。
可使用含有抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、EGF(如人EGF)、肝细胞生长因子(如重组人肝细胞生长因子)、碱性成纤维细胞生长因子(如人碱性FGF)、成纤维细胞生长因子-4(如重组人FGF-4)和干细胞因子的分化培养基(如HCMTM-肝细胞培养基，商品目录号#CC-3198，龙沙公司)将MLPC诱导分化成具有肝细胞/胰腺前体细胞表型的细胞。肝脏和胰脏共享相同的祖细胞。肝细胞分化可通过肝细胞生长因子受体和人细胞白蛋白的表达加以证实。胰腺细胞分化可通过胰岛素和胰岛素原的产生加以证实。
可使用二维或三维培养系统将MLPC分化成软骨细胞。在二维培养系统中，在分化培养基(如hMSC分化插塞试剂盒(Bullet kit)——软骨细胞，其添加有10ng/ml TGF-β3，龙沙公司，商品目录号#PT-3003)的存在下，在胶原包涂的培养设备上培养MLPC。合适的培养设备支持细胞培养(即，允许细胞粘附和结合)，包括例如可从市场上购得的标准的组织培养物处理的聚苯乙烯培养设备(如t-75烧瓶)。在三维培养系统中，使用到三维支架，且三维支架可起到支持细胞多层生长的框架的作用。在一些实施方式中，支架可由胶原(如得自牛皮或鼠尾的胶原的混合物)形成。这类支架是生物可降解的。在其它实施方式中，在由一种或多种材料组成的支架上包涂胶原或其它胞外基质蛋白，所述材料例如聚酰胺；聚酯；聚苯乙烯；聚丙烯；聚丙烯酸酯；聚乙烯基化合物；聚碳酸酯；聚四氟乙烯(PTFE，特富龙)；瑟曼诺克斯(thermanox)；硝基纤维素；聚(α-羟基酸)，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(原酸酯)、聚氨酯、磷酸钙，和水凝胶如聚羟乙基甲基丙烯酸酯或聚环氧乙烷/聚氧化丙烯共聚物；透明质酸，纤维素；钛，二氧化钛；和葡聚糖。参见例如美国专利5,624,840。PLA、PGA和透明质酸是可生物降解的。合适的三维支架可从市场上购得。例如，可使用BD科学公司(BD Sciences，圣何塞，加州)的BDTM三维胶原复合物支架、生命核心生物医学公司(Lifecore Biomedical，查斯卡，明尼苏达州)的透明质酸支架、诺瓦基质公司(NovaMatrix，费城，宾夕法尼亚州)的藻酸盐支架、或菲利普斯塑料公司(Phillips Plastic，普莱斯考特(Prescott)，WI)的磷酸三钙或二氧化钛支架。
可由胞外TGF-β受体和胞内II型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9的存在来证实向成熟软骨细胞的分化。软骨细胞的克隆群(即，从MLPC的克隆系获得的多个软骨细胞)在例如修复软骨和椎盘方面特别有用。
如上文就MLPC所述的，软骨细胞群(即克隆群)和位于三维支架内的软骨细胞群可低温保存。例如，可在液氮中使用加有10％DMSO的胎牛血清低温保存软骨细胞的克隆群或容纳有软骨细胞的克隆群的三维支架。
修饰的MLPC群
可修饰MLPC，以使该细胞可生产一种或多种感兴趣的多肽或其它治疗性化合物。为了修饰分离的细胞以生产感兴趣的多肽或其它治疗性化合物，必须将适当的外源核酸送递给该细胞。在一些实施方式中，细胞被瞬时转染，这表明外源核酸是附加的(即未整合到染色体DNA中)。在其它实施方式中，细胞被稳定转染，即外源核酸插入到宿主细胞的染色体DNA中。术语“外源”在本文中，当指核酸和特定细胞时，指不起源于天然发现的特定细胞中的任意核酸。此外，术语“外源”包括天然产生的核酸。例如，编码分离自人细胞的多肽的核酸在被导入第二种人细胞时对于该第二种人细胞而言就是外源的核酸。被送递的外源核酸通常是载体的一部分，在该载体中，调节元件如启动子与该感兴趣的核酸操作性连接。
可使用病毒载体工程化处理细胞，所述载体为例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒载体。参见Kay等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12744-12746，此文献涉及病毒和非病毒载体的综述。还可采用机械方式导入载体，例如通过脂质体或化学介导的DNA摄取。例如，可采用本领域周知的方法将载体导入MLPC中，所述方法包括例如转染、转化、转导、电穿孔、感染、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、LIPOFECTINTM、溶酶体融合、合成的阳离子脂质、使用基因枪或DNA载体输送物。
载体可包括编码可选择标记的核酸。可选择标记的非限制性例子包括嘌呤霉素、腺甙脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(phosphtransferase)、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。这些标记可用于选择培养物中稳定的转化子。
MLPC还可具有靶基因修饰。用于导入靶基因修饰的同源重组方法是本领域周知的。为了产生同源重组MLPC，可制备一同源重组载体，该载体中感兴趣的基因的5’和3’端侧接对于该靶细胞的基因组而言内源的基因序列，以允许在该载体所携带的感兴趣基因和该靶细胞基因组内的该内源基因之间发生同源重组。额外的侧接核酸序列的长度足以与靶细胞基因组内的该内源基因成功同源重组。通常，载体中包含几kb的侧接DNA(均在5’和3’两端)。构建同源重组载体和从重组干细胞获得同源重组动物的方法是本领域周知的(参见，例如Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：503；Bradley，1991，Curr.Opin. Bio/Technol.2：823-29；和PCT公开号WO 90/11354、WO 91/01140、和WO93/04169)。
使用MLPC的方法
可在酶替代治疗中使用MLPC，以治疗特定的疾病或病症，包括但不限于溶酶体贮积症，如泰-萨氏病(Tay-Sachs)、尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick)、法布里病(Fabry’s)、高雷氏病(Gaucher’s)、亨特氏病(Hunter’s)和Hurler综合征，以及其它神经节苷脂沉积病、粘多糖病(mucopolysaccharidoses)和糖原沉积病(glycogenoses)。
在其它实施方式中，可在基因治疗中使用细胞作为运载体，以校正先天的代谢错误、肾上腺脑白质萎缩症(adrenoleukodystrophy)、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退、镰状细胞贫血、皮尔逊综合征(Pearson syndrome)、庞培氏病(Pompe’s disease)、苯丙酮尿症(PKIJ)、卟啉症、枫糖尿病(maplesyrup urine disease)、高胱氨酸尿症、粘多糖贮积病(mucoplysaccharide nosis)、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症进和泰-萨氏病，或者治疗癌症、肿瘤或其它病理状态。
可使用MLPC修复疾病导致的组织和器官损伤。在这样的实施方式中，可给予患者MLPC群以再生或恢复疾病导致损伤的组织或器官。例如，可给予患者MLPC群以增强化疗或放疗后的免疫系统，修复心肌梗死后的心脏组织，或者修复肺损伤或肺病后的肺组织。
这些细胞还可用于组织再生或替代疗法或方案，包括但不限于角膜上皮缺陷(corneal epithelial defect)、软骨修复、面部皮肤磨削术(facial dermabrasion)、黏膜、鼓膜、肠内壁、神经结构(如视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅觉上皮中的嗅觉神经元)、外伤性损伤皮肤的伤口修复和烧伤修复，或者其它损伤或患病器官或组织的重建。
MLPC还可用于治疗性移植方案，如用于增加或替换肝脏、胰腺、肾脏、肺、神经系统、肌肉系统、骨、骨髓、胸腺、脾、黏膜组织、性腺或头发的干细胞或祖细胞。
组合物和制品
本文还描述了含有MLPC的纯化群或MLPC的克隆系的组合物和制品。在一些实施方式中，所述MLPC的纯化群或克隆系容纳于容器(如小瓶或袋)内。在一些实施方式中，所述克隆系在培养基中经历了至少3次倍增(如至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次倍增)。在其它实施方式中，所述组合物或制品中包含培养基(如MSCGMTM或软骨细胞诱导培养基)。在另外的实施方式中，所述组合物或制品可包括一种或多种低温保存剂或药学上可接受的载体。例如，组合物可含有血清和DMSO，血清、DMSO和海藻糖的混合物，或者人血清白蛋白、DMAO和海藻糖的混合物。其它成分，例如三维支架，也可包含于组合物或制品中。
可将MLPC的纯化群或MLPC克隆系与包装材料组合，并作为试剂盒出售。例如，试剂盒可包括MLPC的纯化群或MLPC克隆系、有效诱导MLPC分化为具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基、和三维支架。分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松和TGFβ3。试剂盒中包含的包装材料通常含有描述如何培育所述MLPC的纯化群或克隆系使其生长、分化或使用的说明书或标签。标签还可指示MLPC与MSC群相比具有增强表达的如CXCR4、FLT3和CD133。制备这类试剂盒的组分和方法是周知的。
在其它实施方式中，制品或试剂盒可包括MLPC的分化后代或MLPC克隆系的分化后代。例如，制品或试剂盒可包括软骨细胞的克隆群和培养基，还可包括一种或多种低温保存剂。在一些实施方式中，软骨细胞的克隆群容纳于三维支架、培育瓶或容器如小瓶或袋内。所述三维支架、培养瓶或容器还可含有一种或多种低温保存剂。在其它实施方式中，制品或试剂盒包括多孔板(如48、96或384孔板)，其中，各孔含有软骨细胞的克隆群。在其它实施方式中，容纳软骨细胞克隆群的三维支架自身容纳于多孔培养板的孔内。例如，制品或试剂盒可包括多孔板，其中多孔板的各孔含有容纳有软骨细胞克隆群的三维支架。
制品或试剂盒还可含有一种或多种用于表征MLPC群、MLPC克隆系、或MLPC的分化后代的试剂。例如，试剂可以是用于检测基因表达的核酸探针或引物，所述基因如CXCR4、FLT3、CD133、CD34、TERT、KIT、POU5F、ICAM2、ITGAX、TFRC、KIT、IL6R、IL7R、ITGAM、FLT3、PDGFRB、SELE、SELL、TFRC、ITGAL、ITGB2、PECAM1、ITGA2B、ITGA3、ITGA4、ITGA6、ICAM1、CD24、CD44、CD45、CD58、CD68、CD33、CD37或CD38。可标记这种核酸探针或引物(如荧光标记，或者放射性同位素标记)，以便于检测。试剂还可以是对细胞表面标记具有特异性结合亲和力的抗体，所述细胞表面标记如CD9、CD45、SSEA-4、CD34、CD13、CD29、CD41、CD44、CD73、CD90、CD105、干细胞因子、STRO-1、SSEA-3、CD133、CD15、CD38、血型糖蛋白A(CD235a)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD29、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、CD73、CD90、HLA-DR、CD102、CD105、CD106或TGF-β受体、或胞内II型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9。抗体可以被可检测地标记(例如，荧光标记或酶学标记)。
下述实施例将进一步描述本发明，这些实施例并不限制权利要求书所描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：血细胞的分离
此实施例描述使用下文所述细胞分离试剂分离细胞的一般方法。在无菌密封容器(如50ml锥形管)中混合等体积的细胞分离试剂(见表1)和柠檬酸葡萄糖(ACD)、CPDA(柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖、腺嘌呤)或肝素化的脐带血样品(各25ml)。含有白细胞计数大于20×106个细胞/ml的样品以每2份细胞分离试剂1份血液的比例混合。室温下在摇动台上轻微混合各试管20-45分钟。将各试管置于试管架上竖直放置30-50分钟，使凝集的细胞与未凝集的细胞分离，后者仍保留在溶液中。使用移液管从上清中回收未凝集的细胞而不干扰到凝集物。用25ml PBS洗涤回收的细胞，以500g离心7分钟。将细胞沉淀物重悬于4ml PBS+2％人血清白蛋白中。
表1
细胞分离试剂
  葡聚糖(平均分子量为413,000)   20g/l
  杜氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲盐溶液(10X)   100ml/l
  肝素钠(10,000单位/ml)   1ml/l
  汉克氏(Hank’s)平衡盐溶液(pH 7.2-7.4)   50ml/l
  抗人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体，2.2.2.E7克隆)   0.1-15mg/L(优选约0.25mg/L)
  抗CD15(鼠IgM单克隆抗体，324.3.B9克隆)   0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
  抗CD9(鼠IgM单克隆抗体，8.10.E7克隆)   0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
使用含有EDTA和乙二醇-双(2-氨乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低渗裂解液从凝集物中回收细胞。用25ml
Figure GPA00001009173400201
(生物E公司，圣保罗，MN)处理凝集的细胞，并涡旋处理。10分钟后，500g离心细胞7分钟，除去上清。用4ml PBS重悬细胞。
采用标准流式细胞术和免疫表型法确定红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、造血干细胞和非造血干细胞的回收。实施流式细胞术前，使用蔻尔特公司(Coulter)Onyx血液学分析仪测定白细胞回收(即白血球细胞计数)。结合血液学分析和流式细胞术分析鉴别和计算细胞类型，基于光散射特性和标记抗体的染色鉴别细胞。
如表2所示，从脐带血中移除了99.9％的红细胞，移除了99.8％的单核细胞和粒细胞、74％的B细胞、64.9％的NK细胞、和99.4％的血小板。
表2
细胞的回收
  分离前   分离后
  红细胞(每ml)   4.41×109   0.006×109
  白细胞(每ml)   5.9×106   1.53×106
  淋巴细胞(％)   28.7   99.0
  单核细胞(％)   8.69   0.12
  分离前   分离后
  粒细胞(％)   62.5   .083
  T细胞(CD3+)   19.7   83.2
  B细胞(CD19+)   4.46   8.10
  NK细胞(CD16+)   3.15   8.43
  血小板(每ml)   226×106   1.4×106
实施例2：MLPC的纯化
使用表3所示的细胞分离试剂从未凝集的上清相中分离MLPC。图1显示了纯化示意图。
表3
细胞分离试剂
  葡聚糖(平均分子量为413,000)   20g/l
  杜氏磷酸缓冲盐溶液(10X)   100ml/l
  肝素钠(10,000单位/ml)   1ml/l
  汉克氏平衡盐溶液(pH 7.2-7.4)   50ml/l
  抗人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体，2.2.2.E7克隆)   0.1-15mg/L(优选约0.25mg/L)
  抗CD15(鼠IgM单克隆抗体，324.3.B9克隆)   0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
  抗CD9(鼠IgM单克隆抗体，8.10.E7克隆)   0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
简要地说，将50-150ml的CPDA抗凝结脐带血(产后＜48小时)轻柔地与等体积的表3所示的细胞分离组合物混合30分钟。混合结束后，将容纳所述血液/细胞分离组合物的容器竖直放置，在常规1g重力下30分钟，使其中的内容物沉积。沉积结束后，从上清收集未凝集的细胞。通过离心从上清回收细胞，然后用PBS洗涤。将细胞重悬于完全MSCGMTM(间充质干细胞生长培养基，货号#PT-3001，龙沙公司，沃克斯维尔，MD)中，并使用完全MSCGMTM调整为2-9×106个细胞/ml。将细胞接种到标准塑料组织培养瓶(如，康宁)、腔室玻片、或其它培养设备中，在37℃、5％CO2的润湿气氛中过夜孵育。除非另有说明，接下来所有的孵育都在37℃、5％CO2的润湿气氛中进行。在此初始孵育过程中，MLPC粘附到该塑料上。通过用完全MSCGMTM剧烈清洗培养瓶或孔而除去未粘附的细胞(T细胞、NK细胞和CD34+造血干细胞)。
通过定期除去完全MSCGMTM、加入新鲜的完全MSCGMTM，从而给MLPC培养物加料。采用此方法，将细胞浓度维持在1×105-1×106个细胞/75cm2。当细胞培养物达到8×105-1×106个细胞/75cm2的浓度时，使用10％DMSO和90％血清低温保存细胞，或者将细胞扩展至新的培养瓶中。通过除去完全MSCGMTM并用PBS+0.1％EGTA替换而从粘附的培养物中回收细胞。将细胞于37℃孵育15-60分钟，然后从培养瓶中收集细胞，并用完全MSCGM洗涤。然后以1×105个细胞/mL的浓度重新接种细胞。发现允许反复铺满的培养物其增殖和分化能力减弱。基于这一发现，不允许培养物达到高于1×106个细胞/75cm2的密度。
实施例3：MLPC的形态学和发育成成纤维细胞形态学
在标准MSCGM中培养根据实施例1和2分化和培养的脐带血衍生的MLPC直至铺满。根据供体的不同，MLPC培养物在2-8周内铺满。这些细胞在生长和培养成熟期间的形态学显示于图2A-2D中。
在图2A所示的早期阶段，细胞非常缓慢地分裂，类似于循环(circulating)白细胞，但具有树突状的胞质延伸。许多细胞仍具有其在循环中所显示的小的圆的细胞形态学。随着培养的继续进行，白细胞样细胞开始改变其形态学，由白细胞样外形变成更平坦、更暗、更成纤维细胞样的外形(见图2B)。当细胞分裂时，它们圆鼓起来，分裂，然后再粘附到培养容器表面，并在此扩展。这种情况缓慢进行，直到细胞填满可填的表面。图2C显示对数生长期间细胞培养物的形态学。图2D显示MLPC的完全铺满物的形态学。除了在图的左下角看到的处于活跃分裂的两个细胞外，所有其它细胞都具有成纤维细胞样形态学。
总之，在培养早期，细胞表现为小而圆、但具有胞质凸起的形态，为手指状和高度伸长的凸起，这有助于将其与其它血细胞区分开。开始培养后不久，细胞开始扩展、变平，具有与成纤维细胞一致的形态。最终，铺满后，细胞以基本上平行的取向生长。反复使培养物生长至铺满导致它们的增殖和分化能力减弱。
实施例4：使用免疫荧光显微镜对细胞进行免疫表型分析
为了确定MLPC上存在的表面标记物，将刚分离的细胞接种到16孔的腔室玻片，并使其生长至铺满。在培养的各时间点(接种后3天至铺满)，收集细胞，针对以下标记物染色：CD45-FITC(BD法明更公司(BD/Pharmingen))、CD34-PE(BD/法明更公司)、CD4-PE(生物E公司(BioE))、CD8-PE(生物E公司)、抗HLA-DR-PE(生物E公司)、CD41-PE(生物E公司)、CD9-PE(安细胞公司)、CD105-PE(安细胞公司(Ancell))、CD29-PE(蔻尔特公司(Coulter))、CD73-PE(BD/法明更公司)、CD90-PE(BD/法明更公司)、抗人干细胞因子-FITC(R&D系统公司)、CD14-PE(BD/法明更公司)、CD15-FITC(安细胞公司)、CD38-PE(BD/法明更公司)、CD2-PE(BD/法明更公司)、CD3-FITC(BD/法明更公司)、CD5-PE(BD/法明更公司)、CD7-PE(BD/法明更公司)、CD16-PE(BD/法明更公司)、CD20-FITC(BD/法明更公司)、CD22-FITC(BD/法明更公司)、CD19-PE(BD/法明更公司)、CD33-PE(BD/法明更公司)、CD10-FITC(BD/法明更公司)、CD61-FITC(BD/法明更公司)、CD133-PE(R&D系统公司)、抗STRO-1(R&D系统公司(R&D Systems))和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(生物E公司)、SSEA-3(R&D系统公司)和羊抗兔IgG(H+L)-PE(生物E公司)、SSEA-4(R&D系统公司)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(生物E公司)。还评估了骨髓MSC(龙沙公司，沃克斯维尔，MD)和脐带血HSC(获自上文所述的未粘附细胞)的细胞表面标记物。
简言之，从各孔中除去细胞培养基，汉克氏平衡盐溶液+2％BSA洗涤细胞3次。然后在室温下在黑暗的情况下用抗体染色细胞20分钟。孵育后，用汉克氏平衡盐溶液+2％BSA洗涤细胞3次，然后使用荧光显微镜直接观察细胞的荧光。比较了脐带血衍生的MLPC与骨髓衍生的MSC和脐带血衍生的造血干细胞(HSC)的结果，见表4。
表4
 细胞标记   早期MLPC(白细胞形态)   成熟MLPC(成纤维细胞形态)   脐带血HSC   骨髓MSC
 CD2   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD3   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD4   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD5   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD7   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD8   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD9   阳性   阳性   阴性   阴性
 CD10   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD13   阳性   阳性   阴性   阳性
 CD14   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD15   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD16   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD19   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD20   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD22   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD29   阳性   阳性   阳性   阳性
 CD33   阴性   阴性   可变   阴性
 细胞标记   早期MLPC(白细胞形态)   成熟MLPC(成纤维细胞形态)   脐带血HSC   骨髓MSC
 CD34   阳性   阴性   阳性   阴性
 CD36   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD38   阴性   阴性   可变   阴性
 CD41   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD45   阳性   阴性   阳性   阴性
 CD61   阴性   阴性   可变   阴性
 CD73   阳性   阳性   阴性   阳性
 抗HLA-DR   阴性   阴性   可变   阴性
 CD90   阳性   两种情况都存在   阳性   阳性
 CD105   阳性   阳性   阴性   阳性
 CD106   ND   阳性   阴性   阴性
 STRO-1   阳性   阴性   阴性   阴性
 SSEA-3   阳性   阴性   阴性   阴性
 SSEA-4   阳性   阴性   阴性   阴性
 SCF   阳性   阴性   阴性   阴性
 血型糖蛋白A   阴性   阴性   阴性   阴性
 CD133   阳性   阴性   阳性   阴性
实施例5：克隆的MLPC细胞系
在实施例2获得的MLPC培养物第二次传代后，用含有0.1％EGTA(pH7.3)的PBS替换细胞培养基，从而从培养容器的塑料表面上分离细胞。用完全MSCGM将细胞稀释到1.3个细胞/ml的浓度，并以0.2ml/孔的体积分配到96孔培养板中，产生平均每3个孔约1个细胞的分布。37℃过夜孵育，使细胞粘附到平板，然后计算平板的实际分布。仅用具有1个细胞/孔的孔进行生长。随着细胞繁殖并获得1-5×105个细胞/75cm2的浓度，将细胞转移至更大的培养容器，以维持细胞浓度在1×105到5×105个细胞/75cm2之间，以维持对数生长。在37℃、5％CO2气氛中培养细胞。
采用这种方法，已建立了至少52个克隆的细胞系，具体命名如下：
UM081704-1-E2、UM081704-1-B6、UM081704-1-G11、UM081704-1-G9、
UM081704-1-E9、UM081704-1-E11、UM081704-1-G8、UM081704-1-H3、
UM081704-1-D6、UM081704-1-H11、UM081704-1-B4、UM081704-1-H4、
UM081704-1-C2、UM081704-1-G1、UM081704-1-E10、UM081704-1-B7、
UM081704-1-G4、UM081704-1-F12、UM081704-1-H1、UM081704-1-D3、
UM081704-1-A2、UM081704-1-B11、UM081704-1-D5、UM081704-1-E4、
UM081704-1-C10、UM081704-1-A5、UM081704-1-E8、UM081704-1-C12、
UM081704-1-E5、UM081704-1-A12、UM081704-1-C5、UM081704-1-A4、
UM081704-1-A3、MH091404-2 #1-1.G10、UM093004-1-A3、UM093004-1-B7、
UM093004-1-F2、UM093004-1-A12、UM093004-1-G11、UM093004-1-G4、
UM093004-1-B12、UM093004-2-A6、UM093004-2-A9、UM093004-2-B9、
UM093004-2-C5、UM093004-2-D12、UM093004-2-H3、UM093004-2-H11、
UM093004-2-H4、UM093004-2-A5、UM093004-2-C3、和UM093004-2-C10。
根据实施例4所述的方法评估克隆的细胞系UM081704-1-E8的表面标记物，发现其表面标记物与表4所示的具有成纤维细胞形态的“成熟MLPC”相同。
实施例6：MLPC的骨细胞分化
如上文所示，在完全MSCGM中分别培养MLPC群和克隆细胞系UM081704-1-E8，并使它们在对数生长条件下生长。用PBS+0.1％ EGTA处理，从而收集细胞，并在完全MSCGM中以5×103 to 2×104个细胞/ml重新接种。允许细胞过夜粘附，然后用由添加有地塞米松、L-谷氨酰胺、抗坏血酸盐和β-甘油磷酸的完全MSCGM组成的骨细胞分化培养基(货号#PT-3002，龙沙公司)替换培养基。在37℃、5％CO2气氛中培养细胞，每3-4天加料，持续2-3周。使用茜素红方法的改进方法证明钙晶体的沉积，通过相差和荧光显微镜观察钙矿化的红色染色。
实施例7：MLPC的脂肪细胞分化
以1×104到2×105个细胞/mL培养基的浓度分别将MLPC群和克隆细胞系UM081704-1-E8接种到完全MSCGM中，在37℃、5％CO2气氛中培养。允许细胞再粘附到培养板上，每3-4天加料，直到培养物铺满。在100％铺满时，通过在由添加有人胰岛素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的完全MSCGMTM组成的生脂分化培养基(货号#PT-3004，龙沙公司)中培养至少14天而分化所述细胞。
为了评价分化，用对脂质特异的油红染料染色细胞。如油红染色所证明，铺满的MLPC培养物显示出成纤维细胞样形态，而没有任何生成脂质体的证据。相反，用生脂培养基分化3周的MLPC显示了作为脂肪细胞的特征的脂质体(即胞质中有亮白色的脉管)，该脂质体经油红染色被染成红色。用生脂培养基分化的MLPC在用对甘油三酯(trigyceride)特异的尼罗红染色时，还发出绿色荧光。
实施例8：MLPC的肌细胞分化
以1.9×104个细胞/孔的浓度将MLPC(其群和克隆细胞系UM081704-1-E8)接种在4-室的经纤维连接蛋白预包涂的玻片上的完全MSCGM中，在37℃、5％CO2气氛中允许细胞粘附到平板24-48小时。除去培养基，用10μM 5-氮胞苷(货号#A1287，西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.))替换培养基，并孵育24小时。用PBS洗涤细胞2次，用含有重组人表皮生长因子(huEGF)、人胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和重组人碱性成纤维细胞生长因子(100ng/ml)(huEGF-碱性，货号#F0291，西格玛化学公司，圣路易斯，MO)的SkGM骨骼肌细胞培养基(货号#CC-3160，龙沙公司)饲养。每2-3天给细胞加料，持续约21天。对照孔加MSCGM，而实验孔加SkGM(如上文所述)。
开始肌细胞培养后7天收集培养物。除去培养上清，用2％的缓冲的福尔马林固定细胞2小时。用PermaCyte(生物E公司，圣保罗，MN)渗透细胞，用人快速骨骼肌球蛋白的特异性小鼠单克隆抗体(MY-32、货号#ab7784，阿布坎公司(Abcam)，剑桥，MA)或α辅肌动蛋白的特异性小鼠单克隆抗体(BM 75.2，货号#ab11008，阿布坎公司)染色。用一抗孵育细胞20分钟，PBS洗涤，用羊抗鼠IgG(H+L)-PE(生物E公司，圣保罗，MN)染色计数。肌细胞培养物含有快速骨骼肌肌球蛋白和α辅肌动蛋白，这提示了MLPC跨转化为骨骼肌细胞。
实施例9：MLPC的神经细胞分化
在上文所述的对数生长条件下，使骨髓衍生的hMSC(龙沙公司)、脐带血MLPC和MLPC克隆细胞系生长。如上所述收集细胞，以0.8×104个细胞每室的浓度重新接种到4腔室玻片中的0.5mL含huFGF-碱性、huEGF、脑衍生的神经营养因子、神经存活因子-1、成纤维细胞生长因子-4(20ng/mL)和200mMGlutaMax I添加剂(货号#35050-061、英外提根公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利弗尼亚)的NPMMTM(货号#CC-3209，龙沙公司)中，该玻片预先用聚D-赖氨酸和层粘连蛋白(BD生物科学开发实验室器具公司，货号#354688)包涂。
每2-3天更换培养基，持续21天。4-20天后产生神经球。通过巢蛋白(nestin)(单克隆抗人巢蛋白抗体，MAB1259，196908克隆，R&D系统公司)、III型β-微管蛋白(单克隆抗神经元特异性III型β微管蛋白抗体，MAB1195、TuJ-1克隆、R&D系统公司)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(单克隆抗人GFAP、HG2b-GF5、GF5克隆、先进免疫化学公司(Advanced Immunochemical、Inc.))和半乳糖脑苷脂(GalC)(鼠抗人GalC单克隆抗体MAB342、mGalC克隆、化学子公司(Chemicon))的阳性染色证实MLPC转化成神经细胞种系。
将10ng/mL BDNF(货号#B3795，西格玛化学公司)和10ng/mL NT3(货号#N1905，西格玛化学公司)加到神经祖细胞维持培养基中，并继续培养10-14天，将细胞进一步分化成神经元。将10-6M视黄酸(货号#R2625，西格玛化学公司)、10ng/mL LIF(货号#L5158，西格玛化学公司)和10ng/mL CNTF(货号#C3710，西格玛化学公司)加到神经祖细胞维持培养基，进一步培养10-14天，将神经球进一步分化成星形细胞。将10-6M T3(货号#T5516，西格玛化学公司)加到神经祖细胞维持培养基，进一步培养10-14天，将神经球进一步分化成少突胶质细胞。通过髓鞘碱性蛋白(MBP)(单克隆抗MBP，货号#ab8764，B505克隆，阿布坎公司)的阳性染色证实向少突胶质细胞的分化。
实施例10：MLPC的内皮细胞分化
以1.9×104个细胞/孔将MLPC接种到4腔室玻片(2cm2)中。用1ml含有肝素、牛脑提取物、人重组表皮生长因子和氢化可的松的内皮细胞生长培养基-微脉管系统(EGM-MV，货号#CC-3125，龙沙公司)饲养细胞。通过每2-3天更换培养基、持续约21天来饲养细胞。在7-10天内发生形态变化。通过针对CD62E(E-选择蛋白，鼠抗人CD62E单克隆抗体，货号#551145，68-5H11克隆，BD法明更公司)和CD102(ICAM-2，单克隆抗人ICAM-2抗体、MAB244，86911克隆，R&D系统公司)、CD34(BD法明更公司)和STRO-1(R&D系统公司)的染色评估MLPC向内皮细胞种系的分化。于MSCGM中生长14天的对照MLPC培养物对CD62E染色和CD102、CD34和STRO-1呈阴性，而分化的培养物对CD62E、CD102、CD34和STRO-1均呈阳性。
实施例11：MLPC分化成肝细胞/胰腺前体细胞
以1×105个细胞/cm2的浓度将MLPC接种在胶原包涂的玻璃上的HCM培养基(货号#CC-3198，龙沙公司)中，该培养基含有抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、huEGF、重组人肝细胞生长因子(40ng/mL)、huFGF-碱性(20ng/mL)、重组人FGF-4(20ng/mL)和干细胞因子(40ng/mL)。培养细胞29天或更多天，以诱导其分化成肝细胞和胰腺细胞种系的前体细胞。MLPC由成纤维细胞形态转变为肝细胞形态，表达肝细胞生长因子的细胞表面受体，产生人血清白蛋白(肝细胞的一种细胞产物)和胰岛素(胰岛细胞的一种细胞产物)，这两种产物都在第30天通过胞内抗体染色得被证实。
实施例12：MLPC分化成肝细胞
将100μl MSCGMTM中19000个MLPC的UM081704-1-C3克隆系加载到三维的胶原复合物支架(BD生物科学公司，货号#354613)中，然后在MSCGMTM中生长。于MSCGMTM中7天后，用HCMTM(货号#CC-3198，龙沙公司)替换该培养基。该HCMTM含有抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、huEGF、重组人肝细胞生长因子(40ng/mL)、huFGF-碱性(20ng/mL)、重组人FGF-4(20ng/mL)和干细胞因子(40ng/mL)。使细胞继续生长40天。胶原支架内的细胞和那些长到培养容器的孔中细胞的形态学与成熟肝细胞的一致，表达肝细胞生长因子的细胞表面受体和高水平的胞内血清白蛋白。胞内胰岛素和胰岛素原的表达缺乏证明该MLPC的分化已越过了肝细胞和胰腺β细胞的共同前体。
通过用含10％DMSO的胎牛血清(冷冻培养基)替换生长培养基而低温保存负载有发育的肝细胞的支架。含有一个支架和0.5mL冷冻培养基的冷冻小瓶在-85℃的醇浴中冷冻过夜，之后将该小瓶转移到液氮中，进行长时间保存。通过快速解冻该冷冻的小瓶并将肝细胞加载的支架转移到孔或组织培养瓶中，从低温保存状态中恢复细胞。可加入足量的肝细胞生长培养基(例如，如上文所述的)以将支架完全浸没，然后在标准条件下(即，37℃、5％CO2气氛)中培养细胞。通过在37℃在1mL胶原酶(300U/ml，西格玛公司，货号#C-0773)的无血清培养基(SFPF，西格玛公司，货号#S-2897)中培养1小时而从胶原支架上回收细胞。然后将细胞转移到另一组织培养容器中，或加载到新的支架上。此形式的细胞可用于移植到动物模型中以进行功能研究、体外再培养或在P450实验(如CYP3A4/BQ实验，BD生物科学公司，圣何塞，加利弗尼亚、货号#459110)中直接使用。
实施例13：MLPC在二维培养中分化成肝细胞
将聚苯乙烯培养瓶(690cm2，康宁，货号#3268)用0.5mg/mL的I型胶原溶液于室温预处理4小时，然后除去胶原溶液，使该培养瓶于4℃过夜干燥，然后接种MLPC。将100mL MSCGM培养基中的UM081704-1-C3克隆系的500万个MLPC接种到经胶原预处理的聚苯乙烯培养瓶(即，浓度为7.2×104个细胞/cm2)中，并在MSCGMTM中生长。细胞每周加料3次，直到培养物铺满。一旦铺满，用HCM(货号#CC-3198，龙沙公司)替换培养基(如实施例11和12所述)。允许细胞进一步生长30天，在培养期间(交换培养基后11-30天)在各个时间点分析细胞，以确定与分化成肝细胞相关的细胞表面和胞内蛋白质的表达。通过用胰蛋白酶孵育而在第30天收获细胞。收获到13500000个肝细胞。细胞具有统一的细胞表面肝细胞生长因子受体和胞内白蛋白、C-反应蛋白、碱性磷酸酶阳性染色，和低水平的α胎蛋白，与分化成成熟肝细胞表型相符。胞内胰岛素和胰岛素原的表达的缺乏证明MLPC的分化已越过了肝细胞和胰腺β细胞的共同前体。
通过将1-10×106个细胞悬浮于1mL加有10％DMSO的胎牛血清(冷冻培养基)内而低温保存在2维培养物中生长的肝细胞悬浮液。含有细胞的冷冻小瓶在-85℃的醇浴中过夜冷冻，之后，将该小瓶转移到液氮中长时间保存。此形式的细胞可用于移植到动物模型中以进行功能研究、体外重培养或者直接在P450实验(如CYP3A4/BQ实验，BD生物科学公司，圣何塞，加利弗尼亚，货号#459110)中直接使用。
实施例14：MLPC分化成软骨细胞
用I型胶原(0.5mg/mL，BD生物科学公司)预处理6孔聚苯乙烯培养皿(康宁，货号#3506)24小时，然后接种MLPC。将1×105个UM081704-C3或UM081704-E8克隆MLPC加到每个孔的3mL MSCGMTM中。允许细胞过夜粘附到平板基底上。24小时后，用3mL不完全软骨细胞诱导培养基(hMSC分化插塞试剂盒-软骨细胞，货号#PT-3003，龙沙公司，沃克斯维尔，MD)替换MSCGMTM。在不完全培养基中培养细胞2天，然后用完全软骨细胞诱导培养基(含有10ng/mL TGF-β3的不完全培养基，R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，货号#243-B3)替换该培养基。在完全培养基中继续培养细胞14天。培养14天后，通过免疫荧光分析细胞与软骨相关的胞内蛋白质聚集蛋白聚糖、II型胶原和SOX9的表达，以及TGF-β的受体的细胞表面表达。在两个克隆细胞系中都观察到这些抗原各自的强免疫荧光染色。通过rtPCT证实了聚集蛋白聚糖、II型胶原和SOX9的表达。此外，从这些细胞观察到胞外胶原的沉积。图3A显示了采用该方法培养的细胞和针对聚集蛋白聚糖的染色和用DAPI进行的复染。在一个试验中，将107个MLPC接种到胶原包涂的t-75瓶的MSCGMTM中。过夜孵育，以允许MLPC粘附，将培养基更换成如上所述的软骨细胞培养基，然后培养细胞15天。图4所示的软骨材料是15天里生长的材料。
软骨细胞分化也可在采用磷酸三钙(TCP)和二氧化钛三维支架的三维培养系统中进行。简言之，用0.5mg/mL I型胶原的PBS溶液(pH 7.3)过夜包涂TCP和二氧化钛支架(菲利普斯塑料公司，普雷斯科特，威斯康星州)。每个支架置于4孔Permanox玻片的单个孔内。将MLPC(5×104个细胞)和1mL的MSCGMTM加到各支架上，允许细胞粘附24小时。24小时后，用1mL不完全软骨细胞诱导培养基((hMSC分化插塞试剂盒-软骨细胞，龙沙公司，沃克斯维尔、MD)替换MSCGMTM。在不完全培养基中培养细胞2天，然后用1mL完全软骨细胞诱导培养基(加有10ng/ml TGF-β3的不完全培养基，R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，货号#243-B3)替换该培养基。细胞在完全培养基中继续培养14天。培养14天后，通过免疫荧光法分析细胞与软骨相关的胞内蛋白聚集蛋白聚糖、II型胶原和SOX9的表达，以及TGF-β的受体的细胞表面表达。两个克隆细胞系都观察到这些抗原各自的强免疫荧光染色。磷酸三钙支架上生长的软骨细胞显示在图3B中，二氧化钛支架上生长的软骨细胞显示在图3C中。在图3B和3C中，针对聚集蛋白聚糖染色细胞，并使用DAPI进行复染。
其它实施方式
虽然已结合前述详细描述和实施例描述了本发明，但是前述描述和实施例仅仅是阐述性的，而非限制本发明的范围，本发明的范围由附带的权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改都在权利要求书的范围之内。

Claims (28)

1.软骨细胞的克隆群。
2.一种组合物，该组合物含有权利要求1所述的软骨细胞克隆群和培养基。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有低温保存剂。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是二甲亚砜(DMSO)。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是1-10％DMSO。
6.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是胎牛血清，人血清，或人血清白蛋白与DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一种或多种的组合。
7.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是人血清、DMSO和海藻糖；或者是胎牛血清和DMSO。
8.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述软骨细胞的克隆群容纳于胶原包涂的培养设备内。
9.一种制品，其含有权利要求1所述的克隆群。
10.如权利要求9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容纳于容器内。
11.如权利要求10所述的制品，其特征在于，所述容器是小瓶或袋。
12.如权利要求10所述的制品，其特征在于，所述容器还含有低温保存剂。
13.如权利要求9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容纳于胶原包涂的培养设备内。
14.一种组合物，其含有人胎血多系祖细胞(MLPC)的纯化群或人胎血MLPC克隆系和有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基，其中所述MLPC呈CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述分化培养基含有抗坏血酸、地塞米松和TGF-β3。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有生长基底。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述生长基底包涂有胶原。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述生长基底是胶原包涂的培养设备。
19.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述MLPC还呈CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性，和呈CD10、CD41、Stro-1和SSEA-3阴性。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述MLPC还呈CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。
21.一种制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法，所述方法包括：a)提供胶原包涂的二维生长基底，该基底容纳纯化的MLPC群或MLPC克隆系；和用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培育所述纯化的MLPC群或MLPC克隆系，其中，所述MLPC呈CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述分化培养基含有抗坏血酸、地塞米松和TGF-β3。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生长基底是胶原包涂的培养设备。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测试所述具有软骨细胞表型的细胞的胞内聚集蛋白聚糖、胞内II型胶原、胞内SOX9或细胞表面的TGF-β受体。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述MLPC还呈CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性，和呈CD10、CD41、Stro-1和SSEA-3阴性。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述MLPC还呈CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。
27.一种从人胎血制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法，该方法包括：
a)使人胎血样品与一组合物接触，所述组合物含有：
i)葡聚糖；
ii)抗血型糖蛋白A抗体；
iii)抗CD15抗体；和
iv)抗CD9抗体；
b)使所述样品分配成凝集相和上清相；
c)从所述上清相中回收细胞；
d)通过粘附到固相基底上而从回收的细胞中纯化MLPC，其中，所述MLPC呈CD9阳性和CD45阳性；
e)培养所述MLPC细胞，使其获得成纤维细胞表型；
f)将所述具有成纤维细胞表型的MLPC或其后代加载到二维胶原包涂的生长基底上，形成加载的生长基底；和
g)用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的分化培养基培养所述加载的生长基底。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在加载所述生长基底前，从所述具有成纤维细胞形态的MLPC中制备MLPC的克隆系。
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