CN108635377B

CN108635377B - 增加成骨细胞功能的方法

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Publication number: CN108635377B
Application number: CN201810437581.3A
Authority: CN
Inventors: 西尔维乌·伊泰斯库; 拉维·克里希南
Original assignee: Mesoblast Inc
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2032-09-07
Also published as: KR102009056B1; CN103857401B; TR201809635T4; CA2847575C; JP2014525466A; CA2847575A1; AU2012307086A1; CN108635377A; IL231327A0; SG11201400218YA; EP2753342A1; JP6444448B2; EP2753342B1; CN103857401A; EP2753342A4; US20190343887A1; US11135249B2; HK1259180A1; US20140363404A1; JP6363950B2

Abstract

本公开提供了增加对象的成骨细胞功能的方法，所述方法包括将干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子系统地给予至所述对象。

Description

增加成骨细胞功能的方法

相关申请的交叉引用

本公开要求2011年9月9日递交的、标题为“增加成骨细胞功能的方法(Methodsfor increasing osteoblastic function)”的美国专利申请第 61/532,772号，以及2011年9月16日递交的、标题为“增加成骨细胞功能的方法2(Methods for increasingosteoblastic function 2)”的美国专利申请第61/535,441号的优先权。这些申请的完整内容在此通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及增加有需要的对象中成骨细胞功能的方法。这些方法可用于治疗或预防由成骨细胞功能介导的病症如骨病和雄性不育。

发明背景

成骨细胞为负责骨形成的细胞。这些细胞产生类骨质基质，其主要由1型胶原、硫酸软骨素和骨钙素组成。成骨细胞还能例如，利用锌、铜和钠矿化该基质。

成骨细胞起源于位于骨膜和骨髓内的骨祖细胞。骨祖细胞为表达主要转录调控因子Cbfa1/Runx2的未成熟祖细胞。骨祖细胞由各种生长因子诱导而分化为成骨细胞，所述生长因子包括骨形成蛋白(BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子β (TGF-β)。一旦骨祖细胞开始分化为成骨细胞，它们即开始表达一系列的遗传标记，包括Osterix、Col1、BSP、M-CSF、ALP和骨钙素、骨桥蛋白和骨粘连蛋白。

骨钙素(骨Gla蛋白:BGP)为小的维生素K依赖性钙结合蛋白，其首次由Price等发现((1976)Proc.Natl.Acad.Sci.73:3373-5)。该蛋白主要由成骨细胞和成牙本质细胞合成，并且构成了骨中15％至20％的非胶原蛋白。Posner等((1980)J.Biol.Chem.255:8685-91)已证明，成熟的骨钙素含有3个羧基谷氨酸残基，其通过谷氨酸残基的翻译后维生素K-依赖性修饰形成。已进一步证明这些残基涉及骨钙素结合钙离子的能力(Brozovic etal.(1976)Brit.J Haematol.32:9)。

骨钙素为骨中主要的细胞外基质蛋白，其为正常的骨矿化所必需。正常的骨矿化密度源于蛋白基质内含有细胞外钙和磷酸盐的羟磷灰石晶体。蛋白基质内的钙沉积涉及成骨细胞产生的骨钙素。蛋白基质内的磷酸盐沉积涉及组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)，其调控无机焦磷酸盐 (ppi)——羟磷灰石晶体天然抑制剂的细胞外浓度。TNAP基因的突变导致低磷酸酯酶症，其特征为无机焦磷酸盐的细胞外浓度增加、低矿化的骨质、自发性骨折。

现在已经知道，骨钙素在钙存在下协同活化钙感应受体2(CaR2)。因此，骨钙素表达或活性的改变在与CaR2功能相关的病症中起关键作用。例如，骨钙素和CaR2的互作起作用的病症，包括但不限于精子活动力和生活力，以及代谢性骨病如骨质疏松症。

骨质疏松症为全身性骨骼病，其特征为减少的骨矿化密度和增加的骨折风险。骨质疏松症的这两个主要病因为增加的破骨细胞活性，其破坏并减少成骨细胞活性。这些特征发生于绝经后状态和使用慢性皮质类固醇后,以及先天性情形。多数当前的骨质疏松症治疗策略专注于抗吸收剂如二磷酸盐，其抑制破骨细胞的骨吸收活性。某些策略如使用甲状旁腺素(PTH)，专注于增加成骨细胞活性，其利用生物标记测量增加的成骨细胞活性，如骨钙素和骨特异性碱性磷酸酶。

发明概述

本发明的发明人发现将专能性细胞(multipotential cell)制剂系统地给予至非人的灵长类导致成骨细胞活性的极大增加，例如，如灵长类中循环骨钙素和/或碱性磷酸酶水平增加所表明。例如，本发明的发明人发现，将专能性细胞制剂系统地给予至灵长类导致在给药2周内血浆骨钙素水平增加为约20倍。本发明的发明人还发现，将专能性细胞制剂系统地给予至灵长类导致在给药6周内血浆碱性磷酸酶水平约可检测的增加，例如，增加5％或10％。这表明系统地给予专能性细胞制剂可用于治疗与低水平的成骨细胞活性和/或系统骨钙素和/或碱性磷酸酶相关的或由其引起的疾病，如代谢性骨病和雄性低生育力。

因此，本公开提供了增加对象的成骨细胞功能的方法，所述方法包括将干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子系统地给予至对象。

在一个实例中，所述对象患有与低成骨细胞水平或活性相关的、和/ 或与低骨钙素水平或活性相关的病症。

所述病症可以为代谢性骨病或雄性不育。

所述代谢性骨病可以选自：软骨病、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特氏病和X染色体连锁低磷性佝偻病、肾衰竭相关的骨营养不良、石骨症、囊状纤维性骨炎，以及糖皮质激素诱导的骨质流失。

在一个实例中，所述对象患有骨质疏松症。在一个实例中，所述方法预防或减少患有骨质疏松症对象的骨折风险。

在一个实例中，所述对象患有骨折。在一个实例中，所述方法加速骨折治愈，和/或预防骨折的延迟愈合，和/或预防骨折的不愈合。在这个方面，所述对象可能患有代谢性骨病或雄性不育。可选地，所述对象可能为正常对象，即不患有代谢性骨病或雄性不育。因此，所述对象可以为任何患有骨折的对象。

在一个实例中，给予所述干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子导致对象中血浆骨钙素水平增加。

在一个实例中，给予所述干细胞刺激对象的成骨细胞产生骨钙素。

在一个实例中，给予所述干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子导致在给药2周(或4周或6周)内，血浆骨钙素水平增加为至少5倍，或至少10倍，或至少20倍。

在一个实例中，给予所述干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子导致对象中血浆碱性磷酸酶水平增加。

在一个实例中，给予所述干细胞刺激对象的成骨细胞产生碱性磷酸酶。

在一个实例中，相比给药前的血浆碱性磷酸酶水平，给予所述干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子导致在给药6周内血浆碱性磷酸酶水平增加至少5％，或10％，或20％，或30％，或40％，或50％，或60％。

在一个实例中，所述干细胞为专能性细胞。在另一个实例中，所述专能性细胞为STRO-1⁺细胞。在又一个实例中，所述专能性细胞为 STRO-1^亮细胞。在又一个实例中，所述STRO-1⁺细胞共表达TNAP标记。

在一个实例中，如本文所述的方法包括给予富集STRO-1^亮细胞的细胞群和/或其后代，和/或源自其的可溶性因子。

在一个实例中，如本文所述的方法包括给予富集STRO-1⁺和组织非特异性碱性磷酸酶⁺(TNAP)⁺细胞的细胞群和/或其后代，和/或源自其的可溶性因子。

在一个实例中，将所述干细胞群和/或后代和/或可溶性因子经静脉内给药。

在一个实例中，多次给予所述干细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子。

例如，每4周或更多周给予一次所述干细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子。

例如，每8周或更多周给予一次所述干细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子。

例如，每12周或更多周给予一次所述干细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子。

在一个实例中，本文根据任一实例描述的方法包括每kg给予0.1x 10⁶至5x 10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其后代。

在一个实例中，本文根据任一实例描述的方法包括每kg给予0.3x 10⁶至2x 10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其后代。例如，所述方法包括每kg给予约1x 10⁶或2x 10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其后代。

在一个实例中，本文根据任一实例描述的方法包括给予低剂量的 STRO-1⁺细胞和/或其后代。例如，低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其后代包含每kg给予0.1x 10⁵至0.5x 10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其后代。例如，所述低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其后代包含每kg给予约0.3x 10⁶个 STRO-1⁺细胞和/或其后代。

在一个实例中，本文根据任一实例描述的方法包括给予高剂量的 STRO-1⁺细胞和/或其后代。

在一个实例中，所述干细胞群和/或所述后代细胞为自体型或异体型细胞，和/或所述可溶性因子可以源自自体型或异体型细胞。在一个实例中，所述群体和/或所述后代为异体型细胞，和/或所述可溶性因子来自异体型细胞。

根据上述实例，所述方法还可以包括获得所述干细胞群和/或后代细胞和/或可溶性因子，或者还可以包括分离所述干细胞群和/或后代细胞和 /或可溶性因子。在一个实例中，基于STRO-1和/或TNAP的表达分离所述干细胞群和/或后代细胞。

在一个实例中，所述干细胞群和/或后代细胞和/或可溶性因子获自接受治疗的对象。在另一个实例中，所述干细胞群和/或后代细胞和/或可溶性因子获自相同物种的不同对象。

在一个实例中，在给予前，和/或在获得可溶性因子前，所述干细胞群和/或后代细胞被培养扩增。

根据上述实例，本文根据任一实例描述的方法还可以包括培养所述干细胞群和/或后代细胞。

在一个实例中，将所述干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子以组合物形式给药，所述组合物包含所述干细胞和/或其后代细胞和/ 或源自其的可溶性因子，以及载体和/或赋形剂。

根据上述实例，本文根据任一实例描述的方法还可以包括将所述群体和/或后代和/或可溶性因子配制在组合物中。

本公开还提供了包含干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子的试剂盒，其包装有用于本文根据任一实例所述方法的说明书。

例如，本公开提供了包含组合物且包装有说明将其用于本文根据任一实施例所述方法的产品信息的试剂盒，所述组合物含有所述群体和/或所述后代和/或所述可溶性因子。

本公开还提供了治疗或预防与对象中低成骨细胞水平或活性相关的病症的方法，所述方法包括将干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子给予至对象。

在一个实例中，所述对象患有骨质疏松症。在一个实例中，所述方法预防或减少患有骨质疏松症的对象的骨折风险。

在一个实例中，所述对象患有骨折。在一个实例中，所述方法加速骨折治愈，和/或预防骨折的延迟愈合，和/或预防骨折的不愈合。

本公开还提供了增加有需要的对象的骨钙素水平(例如，血浆骨钙素水平)的方法，所述方法包括将如本文所述的干细胞群和/或如本文所述的其后代和/或如本文所述的源自其的可溶性因子给予(例如，系统地给予) 至对象。

在一个实例中，所述细胞或因子以足以增加对象的骨钙素水平(例如，血浆骨钙素水平)的量给予。

在一个实例中，例如，相比正常和/或健康群体的水平，有需要的对象具有减少的骨钙素例如血浆骨钙素水平。

本公开还提供了增加有需要的对象中碱性磷酸酶水平(例如，血浆碱性磷酸酶水平)的方法，所述方法包括将如本文所述的干细胞群和/或如本文所述的其后代和/或如本文所述的源自其的可溶性因子给予(例如，系统地给予)至对象。

在一个实例中，所述细胞或因子以足以增加对象中碱性磷酸酶水平 (例如，血浆碱性磷酸酶水平)的量给予。

在一个实例中，例如，相比正常和/或健康群体的水平，有需要的对象具有减少的碱性磷酸酶例如血浆碱性磷酸酶水平。

本公开还提供了用于治疗或预防雄性不育或代谢性骨病的干细胞群，和/或其后代，和/或源自其的可溶性因子。

本公开还提供了干细胞群和/或其后代和/或源自其的可溶性因子在制备用于治疗或预防对象的雄性不育或代谢性骨病的药剂中的用途。

附图说明

图1.成人骨髓多形核细胞(BMMNC)共表达TNAP(STRO-3)和间叶细胞前体细胞标记——STRO-1^亮。按如下进行双色免疫荧光和流式细胞术，孵育STRO-1MACS-挑选的BMMNCS且用结合至FITC的山羊抗- 鼠IgM抗体间接标记(x轴)，以及用结合至PE的山羊抗-鼠IgG间接标记的STRO-3 mAb(鼠IgG1)(y轴)。点状柱型图代表了收集为列表型 (listmode)数据的5x 10⁴个事件。垂直线和水平线设置为反应水平<利用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体——1B5(IgG)和1A6.12(IgM) 获得的平均荧光的1.0％。结果证明，较少的STRO-1^亮细胞群共表达TNAP (右上象限)，而剩余的STRO-1⁺细胞不能与STRO-3 mAb反应。

图2.图示显示了典型的的流式细胞柱状图，其利用培养扩增的源自骨髓的猕猴MPCs的单细胞悬液产生，相对于利用山羊抗-鼠IgM或缀合有IgG的FITC第二抗体检测的同种型(IgM、IgG2a和IgG1)阴性对照(虚线)，所述细胞具有间叶细胞干细胞标记——STRO-1、STRO-4和CD146 的阳性细胞表面表达(实线)。典型的柱状图还表明，猕猴MPCs缺少单核细胞/巨噬细胞(CD14)、造血干/祖细胞(CD34)和成熟白细胞(CD45)标记的细胞表面表达。相比同种型对照，大于1％荧光的水平表示阳性。

图3.图示为在对单个动物IV注射异体型MPC后，6个月内监测到的血液骨钙素(ng/ml)空腹检测图。箭头指示给予单一剂量的MPC的时间。

图4.图示为将两次单剂量的MPC经静脉内给予至肥胖型毛里求斯食蟹猴(ObeseMauritian Cynomolgous Monkeys)后，血浆骨钙素水平的均值图。

图5.图示显示了相比处理前的基线水平，MPC处理后骨钙素水平的百分比变化。

图6.图示显示了相比处理前的基线水平，MPC处理后骨钙素水平的平均百分比变化。

图7.图示显示了MPC处理6个月内，4/5的动物展现血浆总碱性磷酸酶的渐进增加(如通过曲线下面积分析所测定)。

图8.图示显示了MPC处理6个月内，4/5的动物展现血浆总碱性磷酸酶的渐进增加(如在18-24周相对于0-6周之间的曲线下面积分析所测定的％增加)。

图9.图示显示了相比处理前的基线水平，MPC处理后单个动物中碱性磷酸酶水平的百分比变化。

图10.图示显示了给予MPC的时间点以及骨钙素和碱性磷酸酶的测定时间点。在第0周和第12周时给予MPC。骨钙素采样发生在第-4、-2、、2、4、8、12、20和24周。碱性磷酸酶采样发生在第-2、2、4、6、8、 12、14、16、18、20、22和24周。

发明详述

常规技术和所选定义

在本说明书中，除非另有明确说明或者上下文另有要求，提及单一步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物的组应当理解为包括一个和多个(即一个或多个)此类步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物的组。

除非另有明确说明，本文描述的每个实施方案或实例加以适当的修改可适用于每个其他的实施方案。

除了具体描述的那些外，本领域技术人员应当理解，可对本文所述的公开进行变型和修改。应当理解本公开包括所有这类变型和修改。本公开还单独或整体地包括本说明书提及的或说明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合，或任何两个或更多个所述步骤或特征。

本公开不限于本文描述的特定实施方案的范围，其仅试图用于例证目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法明显位于本公开的范围内。

除非另有说明，利用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术实施本公开，不需要过多的实验过程。此类程序描述于，例如，Sambrook,Fritsch& Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York,Second Edition(1989)，整个I、II和III卷；DNACloning:A Practical Approach,Vols.I and II(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,Oxford,整个文本；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach (M.J.Gait,ed,1984)IRL Press,Oxford,整个文本，尤其是其中Gait的文章,ppl-22；Atkinson et al,pp35-81；Sproat et al,pp 83-115；和Wu et al,pp 135-151；4.Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach(B.D.Hames &S.J.Higgins,eds.,1985)IRLPress,Oxford,整个文本；Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press,Oxford,整个文本； Perbal,B.,A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan,eds.,AcademicPress,Inc.),整个系列；J.F.Ramalho Ortigao,"The Chemistry of PeptideSynthesis" Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva, Germany)；Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976). Biochem.Biophys.Res.Commun.73 336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.and Merrifield,R.B.(1979),The Peptides(Gross,E.and Meienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,Academic Press,New York.12.Wünsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden derOrganischen Chemie(Müler,E.,ed.),vol.15,4th edn.,Parts 1and 2,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.&Bodanszky, A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg； Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds., 1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal CellCulture:Practical Approach,Third Edition(John R.W.Masters,ed.,2000),ISBN0199637970, 整个文本。

在本说明书中，除非上下文另有要求，单词“包括(comprise)”或变型如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，应当理解为意指包括所述的步骤或要素或整体(integer)，或者步骤或要素或整体的组，而不排除任何其他步骤或要素或整体，或者要素或整体的组。

如本文所用，术语“源自”应当理解为指示，特定整体(integer)可以获自特定来源，虽然不一定直接来自该来源。在源自干细胞和/或其后代细胞的可溶性因子的情形下，该术语应当理解为指干细胞和/或其后代细胞的体外培养期间产生的一个或多个因子，例如，蛋白、肽、糖类等。

如本文所用，术语“成骨细胞功能”应当理解为包括成骨细胞产生和/ 或分泌细胞外基质例如类骨质的能力。类骨质为未矿化的骨基质，其包含1型胶原、硫酸软骨素和骨钙素。另外或可选地，术语“成骨细胞功能” 指细胞矿化细胞外基质例如类骨质的能力。在一个实例中，术语“成骨细胞功能”应当理解为包括增加对象的骨形成。

可以通过增加成骨细胞产生和/或分泌细胞外基质和/或矿化细胞外基质的能力，和/或通过增加骨祖细胞增殖和/或骨祖细胞分化为成骨细胞，实现对象的“成骨细胞功能”的增加。例如，可以通过增加对象或其骨的成骨细胞数，实现对象的成骨细胞功能的增加。

如本文所用，术语“有效量”应当理解为指足够量的干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子，其足以实现对象中成骨细胞功能和/ 或成骨细胞水平或活性和/或全身骨钙素水平和/或碱性磷酸酶水平的显著增加。成骨细胞功能和/或成骨细胞水平或活性和/或全身骨钙素水平和 /或碱性磷酸酶水平的显著增加可以为，例如，增加为至少两倍，或增加为至少5倍，或增加为至少10倍、增加为至少20倍，或增加为至少25 倍。

如本文所用，术语“治疗有效量”应当理解为指足够量的干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子，其足以治疗与低成骨细胞水平或活性相关的病症。

如本文所用，术语“预防有效量”应当理解为指足够量的干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子，其足以预防或抑制或延缓与低成骨细胞水平或活性相关的病症发作。

如本文所用，术语“低剂量”应当理解为指小于1x10⁶个量的干细胞和 /或其后代，然而其仍然足以成为本文定义的“有效量”，和/或本文定义的 “治疗有效量”和/或“预防有效量”。例如，低剂量包含0.5x 10⁶个或更少的细胞，或0.4x 10⁶个或更少的细胞，或0.3x10⁶个或更少的细胞，或 0.1x 10⁶个或更少的细胞。

如本文所用，术语“高剂量”应当理解为大于1.5x10⁶个细胞/kg。例如，剂量包含约1.5x 106个至约4x106个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5x 10⁶个或约2x 10⁶个/kg。

如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)” 应当理解为指，给予治疗有效量的可溶性因子和/或细胞，并减少或抑制与低成骨细胞水平或活性相关的病症症状，以便所述对象不再被临床诊断为患有该病症。

如本文所用，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应当理解为指，给予预防有效量的可溶性因子和/或细胞，并阻止或妨碍或延迟与低成骨细胞水平或活性相关的病症的发展或进展。

如本文所用，术语“可溶性因子”应当理解为指干细胞和/或其后代产生的、水溶性的任何分子，例如，蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、糖类等。此类可溶性因子可以为细胞内的，和/或由细胞分泌。此类可溶性因子可以为复合混合物(例如，上清液)和/或其部分，和/或可以为纯化的因子。在本公开的一个实例中，可溶性因子位于上清液中，或包含在上清液中。因此，本文中涉及给予一种或多种可溶性因子的任何实例都应当理解为，加以必要的修改后适用于给予上清液。

如本文所用，术语“上清液”是指在适当的培养基例如液体培养基中，体外培养干细胞和/或其后代后产生的非细胞物质。通常，上清液通过下述方式产生：于适当的条件和时间下在培养基中培养细胞，然后通过诸如浓缩的过程去除细胞物质。在给药前上清液可以经历或可以不经历进一步的纯化步骤。在一个实例中，上清液包含少于10⁵，例如少于10⁴，如少于10³，例如，没有活细胞。

如本文所用，术语“正常或健康个体”应当理解为指不具有通过本领域已知的和/或本文描述的任何方法评估的低成骨细胞活性的对象。在一个实例中，"正常或健康个体"不患有与低成骨细胞水平或活性相关的任何病症症状，和/或不患有与低成骨细胞水平或活性相关的病症。

干细胞或后代细胞，和上清液或源自其的一种或多种可溶性因子

如本文所用，术语“干细胞”是指自我更新的细胞，其能产生表型和遗传性相同的子代，以及至少一种其他终细胞类型(例如，终末分化的细胞)。术语“干细胞”包括全能性、多能性和专能性细胞，以及源自其分化的祖细胞和/或前体细胞。干细胞可以为成体干细胞或胚胎干细胞，或者可以为诱导的多能干细胞(iPS)。

如本文所用，术语“全能细胞(totipotent cell)”或“全能性细胞(totipotential cell)”是指能形成胚胎(例如，囊胚)的细胞。

如本文所用，术语“多能细胞(pluripotent cell)”或“多能性细胞(pluripotential cell)”是指具有完整的分化多功能性的细胞，即，能成长为哺乳类身体的约260种细胞类型中的任何一种。多能细胞在组织中可以自我更新，并且可以保持休眠或静止。

通过“专能性细胞(multipotential cell)”或“专能细胞(multipotent cell)”，我们是指能产生几种成熟细胞类型中任何一种的细胞。如本文使用，该短语包括成体或胚胎的干细胞和祖细胞，如间叶细胞前体细胞(MPC)和这些细胞的专能性后代。与多能细胞不同，专能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。

如本文所用，术语“祖细胞”是指定型于分化为特定类型细胞或形成特定类型组织的细胞。

如本文所用，短语“STRO-1⁺专能性细胞”应当理解为指能形成专能性细胞集落的STRO-1⁺和/或TNAP⁺祖细胞。

STRO-1⁺专能性细胞为发现于骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾脏、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中的细胞；并且其能分化为胚系如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-1⁺专能性细胞能分化为大量的细胞类型，包括但不限于：脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞进入的具体定型谱系和分化途径，取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子如生长因子、细胞因子和/或宿主组织确立的局部微环境条件的多种影响。在一个实施方案中，STRO-1⁺专能性细胞为非造血祖细胞，其分裂产生的子代细胞为干细胞或前体细胞，它们会适时地不可逆分化而产生表型细胞。

在一个实例中，STRO-1⁺细胞从获自对象的样品富集而来，例如，待治疗的对象或相关的对象或不相关的对象(相同物种或不同物种的对象)。本文所用术语“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或其变型用来描述，当相比未处理的细胞群(例如，处于它们天然环境中的细胞)时，细胞群中一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富集的STRO-1⁺细胞群包含至少约0.1％，或0.5％，或1％，或2％，或5％，或10％，或15％，或20％，或25％，或30％，或50％，或75％的STRO-1⁺细胞。在这个方面，术语“富集的STRO-1⁺细胞的细胞群”应当理解为给术语“包含X％的STRO1⁺细胞的细胞群”提供了明确的支持，其中X％为本文所述的百分比。在一些实例中，STRO-1⁺细胞可以形成无性系集落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如，50％，或60％，或 70％，或70％，或90％，或95％)可以具有该活性。

在一个实例中，细胞群以可选形式从包含STRO-1⁺细胞的细胞制剂富集而来。在这个方面，术语“可选形式”应当理解为指表达允许挑选 STRO-1⁺细胞的标记(例如，细胞表面标记)的细胞。所述标记可以但不必为STRO-1。例如，如本文所述和/或例示，表达STRO-2和/或STRO-3 (TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如， MPCs)，还表达STRO-1(且可以为STRO-1^亮)。因此，指示细胞为STRO-1⁺不意味着该细胞通过STRO-1表达挑选。在一个实例中，所述细胞基于至少STRO-3表达挑选，例如，它们为STRO-3⁺(TNAP⁺)。

提及挑选细胞或其群体不要求从特定组织来源挑选。如本文所述， STRO-1⁺细胞可以从大量不同来源挑选或分离或富集。即，在一些实例中，这些术语为从包含STRO-1⁺细胞(例如，MPCs)的任何组织或血管化组织或包含周细胞(例如，STRO-1⁺周细胞)的组织或任何一种或多种本文所述的组织进行挑选提供支持。

在一个实例中，用于本公开的细胞表达一种或多种标记，其单独或共同选自：TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、STRO-4⁺(HSP-90β)、 CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或它们的任何组合。

通过“单独地(individually)”是指本公开分别包括所述标记或标记的组，并且，虽然本文可能没有单独列出单个标记或标记的组，所附的权利要求可以单独地和彼此分开地定义此类标记或标记的组。

通过“共同地(collectively)”是指本公开包括任何数目的所述标记或肽的组，或者所述标记或肽的组的组合，并且，虽然本文可能没有明确列出此类数目的标记或标记的组或标记或标记的组的组合，所附的权利要求可以单独地和与任何其他标记或标记的组的组合分开地定义此类组合或亚组合。

例如，所述STRO-1⁺细胞为STRO-1^亮(即STRO-1^bri)。在一个实例中，所述Stro-1^bri细胞相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞优先被富集。

例如，所述STRO-1^亮细胞为另外的一种或多种TNAP⁺、VCAM-1⁺、 THY-1⁺、STRO-2⁺、STRO-4⁺(HSP-90β)和/或CD146⁺。例如，所述细胞针对一种或多种前述标记进行挑选，和/或被证明表达一种或多种前述标记。在这个方面，不需要特别测试来证明细胞表达了标记，但可以测试先前富集的或分离的细胞，并且随后使用、分离或富集的细胞可以被合理地假定为也表达相同标记。

在一个实例中，间叶细胞前体细胞为WO 2004/85630中定义的血管周间叶细胞前体细胞。例如，所述间叶细胞前体细胞表达血管周细胞的标记，例如，所述细胞为STRO-1⁺或STRO-1^亮和/或3G5⁺。在一个实例中，所述细胞为或先前为从血管化组织或器官或其部分分离的细胞，或为从血管化组织或器官或其部分分离的细胞的后代。

被称为对于给定标记为“阳性”的细胞，其可以表达低(lo或暗)或高 (亮，bri)水平的该标记，这取决于标记在细胞表面上存在的程度，其中该术语与用于所述细胞的分选过程中的荧光或其他标记的强度有关。在将标记用于被分选的特定细胞群的情形下，lo(或者，暗或黯淡)和bri的区别容易理解。被称为对于给定标记为“阴性”的细胞，不一定完全不存在于该细胞中。该术语是指细胞以相对非常低的水平表达标记，并且其在当可检测地标记时产生非常低的信号，或在背景水平例如利用同种型对照抗体检测的水平上不可检测。

当用于本文时，术语“亮”是指当被可检测地标记时，在细胞表面上产生相对高的信号的标记。撇开理论的束缚，人们认为相比样品中的其他细胞，“亮”细胞表达更多的靶标标记蛋白(例如被STRO-1识别的抗原)。例如，相比非亮细胞(STRO-1^黯淡/暗)，标记有FITC-缀合的STRO-1 抗体时STRO-1^bri细胞产生更大的荧光信号，如通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析所测定。在一个实例中，“亮”细胞占起始样品中被最亮标记的骨髓单核细胞中的至少约0.1％。在其它实例中，“亮”细胞占起始样品中被最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，相对于"背景"即STRO-1^-细胞， STRO-1^亮细胞具有是STRO-1表面表达的2log量级的较高表达。通过比较，相比“背景”，STRO-1^暗和/或STRO-1^中间细胞具有小于STRO-1表面表达的2log量级的较高表达，通常约为1log量级或小于背景。

如本文所用，术语“TNAP”旨在包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，该术语包括肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，所述TNAP为BAP。在一个实例中，如本文所用，TNAP是指能结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，所述杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约的条款于2005年12月19日保藏在 ATCC，保藏登录号为PTA-7282。

此外，在一个实例中，所述STRO-1⁺细胞能产生无性系CFU-F。

在一个实例中，显著部分的STRO-1⁺专能性细胞能分化为至少两种不同的胚系。专能性细胞可能所在的谱系的非限制性实例包括：骨前体细胞；祖肝细胞，其能专能分化为胆管上皮细胞和肝细胞；神经受限细胞，其能产生能发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其发展为神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖响应性胰岛素分泌性胰β细胞系的前体。其他谱系包括但不限于，成牙本质细胞、牙质生成细胞(denti-producing cells)和软骨细胞，以及以下细胞的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质细胞、树状细胞、毛囊细胞、肾管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌肉细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱细胞、韧带细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在另一个实例中，所述STRO-1⁺细胞培养后不能产生造血细胞。

在一个实例中，所述细胞采自待治疗的对象，并利用标准技术体外培养以得到作为自体型或异体型组合物的上清液或可溶性因子或扩增细胞，用于给予至所述对象。在可选的实例中，使用了一种或多种现有的人细胞系的细胞。在本公开另一个有用的实例中，使用了非人的动物(或者如果患者不为人，则来自另一物种)的细胞。

本公开还包括获自或源自经体外培养产生的STRO-1⁺细胞和/或其后代细胞(后者也被称为扩增的细胞)的上清液或可溶性因子的用途。根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数目和/或类型)、传代次数等，本公开的扩增的细胞可以具有多种表型。在某些实例中，所述后代细胞在从亲本细胞群传代约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10次后获得。然而，所述后代细胞可以在从亲本细胞群传代任何传代次数后获得。

所述后代细胞可以通过在任何合适的培养基中培养获得。关于细胞培养物，所用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以为固体、液体、气体或相和物质的混合。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶培养基如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。示例性气体培养基包括生长在有盖培养皿(petri dish)或其他固体或半固体支持物上的细胞所暴露于其中的气相。术语“培养基”还指旨在用于细胞培养的物质，即使其还未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的营养富集性液体即为培养基。与水或其他液体混合时变得适于细胞培养的粉末状混合物可以称为“粉末状培养基”。

在一个实例中，通过利用标记有STRO-3抗体的磁珠从骨髓中分离 TNAP⁺STRO-1⁺细胞可以得到用于本公开所述方法的后代细胞，然后培养扩增所述分离的细胞(合适培养条件的实例，参见Gronthos et al.Blood 85:929-940,1995)。

在一个实例中，此类扩增的细胞(后代)(例如，至少5次传代后)可以为TNAP^-、CC9⁺、HLAI⁺类、HLAII^-类、CD14^-、CD19^-、CD3^-、CD11a-c^-、 CD31^-、CD86^-、CD34^-和/或CD80^-。然而，可能在与本文描述的那些不同的培养条件下，不同标记的表达可能存在差异。另外，虽然这些表型的细胞可能在扩增的细胞群中占优，但这不意味着小比例的所述细胞不具有该表型(例如，小百分比的扩增细胞可以为CC9^-)。在一个实例中，扩增的细胞仍然具有分化为不同细胞类型的能力。

在一个实例中，用来得到上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增的细胞群，包含其中至少25％(例如至少50％)的所述细胞为CC9⁺的细胞。

在另一个实例中，用来得到上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增的细胞群，包含其中至少40％(例如至少45％)的所述细胞为STRO-1⁺的细胞。

在其他的实例中，扩增的细胞可以表达一种或多种共同或单独地选自以下的标记：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、 CD 90、CD29、CD18、CD61、整合素β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、Leptin-R(STRO-2 ＝Leptin-R)、RANKL、STRO-4(HSP-90β)、STRO-1^亮和CD146或这些标记的任何组合。

在一个实例中，所述后代细胞为专能性扩增的STRO-1⁺专能性细胞后代(MEMPs)，如WO 2006/032092中所定义和/或描述。制备可由其衍生后代细胞的富集的STRO-1⁺专能性细胞群的方法描述于WO 01/04268 和WO 2004/085630。在体外情形下，STRO-1⁺专能性细胞很少作为完全纯的制剂提供，并且通常与其他细胞即组织特异性定型细胞(TSCCs)一起提供。WO 01/04268涉及以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓收获此类细胞。包含可衍生后代的MPCs的细胞群可以直接从组织源收获，或可选地，其可以为已体外扩增的群体。

例如，所述后代可以获自基本上纯化的STRO-1⁺专能性细胞的收获的、未扩增的群体，其包含所存在的群体总细胞的至少约0.1％、1％、5％、 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或95％。例如，可以通过挑选对至少一个单独或共同地选自以下的标记为阳性的细胞来达到该水平：TNAP、STRO-4(HSP-90β)、STRO-1^亮、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、 CD146和STRO-2。

MEMPS与刚收获的STRO-1⁺专能性细胞的区别在于，它们对标记 STRO-1^bri为阳性，而对标记碱性磷酸酶(ALP)为阴性。相反，刚分离的 STRO-1⁺专能性细胞对STRO-1^bri和ALP均为阳性。在本公开的一个实例中，被给予的细胞中至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或95％具有STRO-1^bri、ALP^-表型。在其他的实例中，MEMPS 对标记Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种为阳性。在又一个实例中，MEMPs不展示TERT活性，和/或对标记CD18 为阴性。

STRO-1⁺细胞起始群体可以源自WO 01/04268或WO 2004/085630中所列的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或者可能更广义地来自：脂肪组织、牙、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾脏、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。

应当理解，在实施本公开所述方法时，对携带任何给定细胞表面标记的细胞进行分离可受到多种不同方法的影响，然而，一些示例性方法依赖于，将结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)结合至相关的标记，然后分离展现所述结合的那些，其为高水平结合，或低水平结合或无结合。最方便的结合剂为抗体或基于抗体的分子，例如单克隆抗体或基于单克隆抗体的(例如，包含其抗原结合片段的蛋白)分子，这是由于这些后述试剂的特异性。抗体可以用于这两个步骤，然而还可以使用其他试剂，因此还可以利用这些标记的配体来富集携带它们或缺少它们的细胞。

可以将抗体或配体结合到固相支持体上，以允许粗分离。在一些实例中，分离技术将收集部分的活力保留最大化。可以利用各种不同效率的技术来获得相对的粗分离。采用的具体技术取决于分离效率、相关的细胞毒性、进行的容易度和速度，以及所需的尖端设备和/或专业技术。分离方案可以包括但不限于：利用包覆有抗体的磁珠的磁力分离、亲和层析和用结合至固相基质的抗体“筛选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。进行FACS的方法对本领域技术人员显而易见。

针对每种本文所述标记的抗体为可商购的(例如，针对STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems,USA商购)，可购自ATCC或其他保藏机构，和/或可以利用领域公认的技术制备。

在一个实例中，用于分离STRO-1⁺细胞的方法包括的第一步骤为固相分选步骤，其利用例如磁力活化的细胞分选(MACS)来识别STRO-1的高水平表达。随后可以进行的第二分选步骤(如需要)导致如专利说明书 WO 01/14268所描述的高水平的前体细胞表达。该第二分选步骤可涉及使用两种或更多种标记。

获得STRO-1⁺细胞的方法还可能包括利用已知的技术在第一富集步骤前收获细胞来源。因此，可手术去除组织。然后，将包含所述组织来源的细胞分离为所称的单细胞悬液。可以通过物理和/或酶促方式达到该分离。

一旦得到合适的STRO-1⁺细胞群，其可以通过任何合适的方式培养或扩增，以获得MEMPs。

在一个实例中，所述细胞采自待治疗的对象，并利用标准技术体外培养以获得作为自体型或异体型组合物的上清液或可溶性因子或扩增的细胞，用于给予至所述对象。在可选的实例中，使用一种或多种现有的人细胞系细胞来获得上清液或可溶性因子。在本公开另一有用的实例中，非人的动物(或如果患者不为人，则来自另一物种)的细胞被用来获得上清液或可溶性因子。

可以利用来自任何非人的动物物种的细胞实施本公开的方法和用途，包括但不限于：非人的灵长类细胞、有蹄类、犬科动物、猫科动物、兔类、啮齿动物、鸟类和鱼类的细胞。本公开可以操作的灵长类细胞包括但不限于：黑猩猩、狒狒、猕猴和任何其他新世界或旧世界猴的细胞。本公开可以操作的有蹄类动物细胞包括但不限于：牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。本公开可以操作的啮齿类动物细胞包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠的细胞。本公开可以操作的兔类动物物种实例包括家兔、长腿大野兔、野兔、白尾灰兔、雪鞋兔和鼠兔。鸡(原鸡)为本公开可以操作的鸟类物种的一个实例。

在一个实例中，所述细胞为人细胞。

在使用前，或在得到上清液或可溶性因子前，可以将用于本公开方法的细胞储存备用。用于保存和储存真核细胞尤其是哺乳动物细胞的方法和方案为本领域已知(参照，例如，Pollard,J.W.and Walker,J.M.(1997) Basic Cell Culture Protocols,SecondEdition,Humana Press,Totowa,N.J.； Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,Fourth Edition,Wiley-Liss, Hoboken,N.J.)。任何保持所分离的干细胞如间叶细胞干/祖细胞或其后代的生物活性的方法都可用于本公开。在一个实例中，所述细胞通过利用冷冻贮藏维持和储存。

遗传修饰的细胞

在一个实例中，所述干细胞和/或其后代细胞被遗传修饰，例如，以表达和/或分泌目标蛋白。例如，所述细胞被改造以表达用于治疗代谢性骨病症或雄性不育的蛋白。

遗传修饰细胞的方法对本领域技术人员显而易见。例如，要在细胞中表达的核酸被可操作地连接至启动子，以诱导细胞内的表达。例如，将核酸连接至在对象的多种细胞中可操作的启动子，例如，病毒启动子，例如，CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其他合适的启动子为本领域已知，且应当理解为加以必要的修改适用于本公开的当前实例。

在一个实例中，核酸以表达构建物的形式提供。如本文所用，术语 “表达构建物”是指细胞内能够使得在与其可操作地连接的核酸(例如报告基因和/或反选择性报告基因)上进行表达的核酸。在本公开的情形中应当理解，表达构建物可以包括或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段，或能够以可表达形式维持和/或复制异源DNA 的其他核酸。

用于执行本公开的、构建合适表达构建物的方法对本领域技术人员显而易见，并且描述于，例如，Ausubel et al(In:Current Protocols in Molecular Biology.WileyInterscience,ISBN 047 150338,1987)或Sambrook et al(In:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork,Third Edition 2001)。例如，利用例如PCR从合适的模板核酸扩增表达构建物的每个组件，随后克隆至合适的表达构建物，例如，质粒或噬菌粒。

适合此类表达构建物的载体为本领域已知，和/或在本文有描述。例如，哺乳动物细胞中适合本公开方法的表达载体为，例如，Invitrogen提供的pcDNA载体组的载体、pCI载体组(Promega)的载体、pCMV载体组 (Clontech)的载体、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体 (Clontech)或pcDNA载体组(Invitrogen)的载体。

技术人员知道其他载体和此类载体的来源，例如，Life TechnologiesCorporation,Clontech or Promega。

将分离的核酸分子或包含其的基因构建物引入至细胞进行表达的方法为本领域技术人员已知。用于给定生物体的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA引入至细胞的方法包括显微注射、DEAE-葡萄糖介导的转染、脂质体介导的转染，如通过利用脂质体(Gibco,MD,USA)和/或 cellfectin(Gibco,MD,USA)、PEG-介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击，如通过利用包覆有DNA的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)等。

可选地，本公开的表达构建物为病毒载体。合适的病毒载体为本领域已知，且可商购。用于递送核酸以及将该核酸整合到宿主细胞基因组的常规基于病毒的系统包括，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关的病毒载体。可选地，腺病毒载体可用于将保持附加体形式的核酸引入至宿主细胞。病毒载体为在靶细胞和组织中进行基因转移的有效和通用的方法。另外，在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，逆转录病毒载体通常包含顺式作用长末端重复(LTRs)，其具有多达6-10kb的外来序列的包装能力。最小的顺式作用LTRs足以复制和包装载体，其随后被用于将表达构建物整合至靶细胞，以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和它们的组合的那些(参见，例如，Buchscher et al.,J Virol.56:2731-2739(1992)；Johann et al,J.Virol.65:1635-1640(1992)；Sommerfelt et al,Virol.76:58-59(1990)；Wilson et al,J.Virol.63:274-2318(1989)；Miller et al.,J.Virol. 65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990,1989；Miller,A.D.Human Gene Therapy 7:5-14,1990；Scarpa et al Virology 75:849-852,1991；Burns et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:8033-8037,1993)。

各种腺相关病毒(AAV)载体系统也被开发用于核酸递送。可以利用本领域已知技术容易地构建AAV载体。参见，例如，美国专利第5,173,414 号和第5,139,941号；国际公开第WO 92/01070号和第WO 93/03769号； Lebkowski et al.Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent et al.(1990) Vaccines 90(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol, and Immunol.158:97-129,1992；Kotin,HumanGene Therapy 5:793-801, 1994；Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169,1994；和Zhou et al.J Exp.Med.179:1867-1875,1994。

用于递送本公开的表达构建物的其他病毒载体包括，例如，源自痘病毒家族的那些，如牛痘病毒和鸟痘病毒，或甲病毒属，或缀合的病毒载体(例如Fisher-Hoch et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 56:317-321,1989中所描述的)。

分析细胞和可溶性因子的治疗性/预防性潜能

确定细胞或可溶性因子治疗或预防或延缓与低成骨细胞水平或活性相关病症的发作或进展的能力的方法对本领域技术人员显而易见。

例如，评估细胞或可溶性因子增加成骨细胞功能的能力。

在一个实例中，使骨祖细胞(例如，表达Cbfe1/RunX2)与细胞和/或可溶性因子接触，并测试它们分化为成骨细胞的能力。例如，评估所述细胞表达osterix和/或Col1和/或BSP和/或M-CSF和/或碱性磷酸酶的发展。

在一个实例中，使所述细胞和/或可溶性因子与成骨细胞接触，并评估了它们对1型胶原和/或骨钙素产生的影响，例如，利用免疫测定和/ 或免疫组织化学或免疫荧光。

在其他的实例中，使所述细胞和/或可溶性因子与细胞外基质上培养的成骨细胞接触，并评估了它们增加基质矿化的能力，例如，通过用茜素红(Alziarin Red)或冯库萨(von Kossa)染色法染色。

还可以利用诸如近红外荧光成像的测定，评估所述细胞和/或可溶性因子在体内对成骨细胞活性的影响，例如，如Zaheer et al.,Nat.Biotechnol., 19:1148-1154,2001中所述。

还可以通过检测它们对骨形成的影响，评估所述细胞和/或可溶性因子在体内对成骨细胞活性的影响，例如，利用x射线和/或双能X射线吸收测定法(DEXA)。

例如，将细胞或可溶性因子(例如，因子混合或单一因子或因子级分 (例如，通过亲和纯化或色谱法获得))给予至代谢性骨病模型，并评估其对一种或多种症状的影响。示例性非人的动物模型包括切除卵巢的啮齿类(例如，大鼠)、固定诱导的骨质流失模型和/或Turner在European Cells and Materials,1:66-91,2001中综述的模型。

从前述内容对本领域技术人员显而易见的是，本公开还提供了识别或分离用于治疗、预防或延缓与低成骨细胞水平或活性相关的病症的细胞或可溶性因子的方法，所述方法包括：

(i)将细胞或可溶性因子给予至患有与低成骨细胞水平或活性相关病症的测试对象，并评估所述对象的病症症状；

(ii)将与(i)所述对象的低成骨细胞水平或活性相关的病症症状和与未给予所述细胞或可溶性因子且患有该病症的对照对象的低成骨细胞水平或活性相关的病症症状比较，

其中相比对照对象，测试对象症状的改善表明该细胞或可溶性因子可治疗该病症。

所述细胞可以为本文根据任一实例描述的任何细胞。

细胞组合物

在本公开的一个实例中，干细胞和/或其后代细胞以组合物形式给药。在一个实例中，此类组合物包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”是指本领域常规使用，以促进活性化合物的储存、给药和/或生物活性的物质组合物(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16thEd.,Mac Publishing Company(1980)。载体还可以减少活性化合物任何不需要的副作用。合适的载体为，例如，稳定的，例如，不能与载体内的其他成分反应。在一个实例中，所述载体在治疗采用的剂量和浓度下对接受者不产生明显的局部或全身性不利影响。

本公开的合适载体包括常规使用的那些，例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质酸和乙二醇为示例性液体载体，尤其是对于溶液(等渗时)。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实例中，载体为培养基组合物，例如，其中生长或悬浮有细胞。例如，此类培养基组合物对于给药对象不产生任何不利的影响。

示例性载体和赋形剂不对细胞存活力和/或细胞减少、预防或延缓代谢性症状和/或肥胖的能力产生不利影响。

在一个实例中，所述载体或赋形剂提供了缓冲活性，以维持细胞和/ 或可溶性因子处于合适的pH，从而发挥生物活性，例如，所述载体或赋形剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表了有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子最小相互作用，并允许细胞和因子的快速释放，在这种情形下，本公开的组合物可以作为液体制备，以直接应用于血流或组织或组织周围或邻近区域，例如，通过注射。

还可以将干细胞和/或其后代细胞整合或嵌入到支架内，所述支架与接受者相容并降解为对接受者无害的产物。这些支架为要移植到接受对象中的细胞提供了支撑和保护。天然和/或合成的可生物降解支架即为此类支架的实例。

多种不同的支架可以成功用于实施本公开。示例性支架包括但不限于生物可降解的支架。天然的生物可降解支架包括胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白支架。适用于细胞移植支架的合成材料应当能够支撑大量的细胞生长和细胞功能。此类支架还可以为可吸收的。合适的支架包括聚乙醇酸支架，例如，如Vacanti,et al.J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima,et al. Biotechnol.Bioeng.38:145 1991；Vacanti,et al.Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所描述；或合成聚合物如聚酸酐、聚原酸酯(polyorthoesters) 和聚乳酸。

在另一个实例中，所述细胞可以在凝胶支架(如来自Upjohn公司的 Gelfoam)内给予。

可用于本文所述方法的细胞组合物可以单独或作为外加剂与其他细胞一起给予。可以与本公开的组合物共同给予的细胞包括但不限于其他专能或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可以在给予前即刻或不久与本公开的组合物混合，或者可以将它们在给予前一起共培养一段时间。

在一个实例中，所述组合物包含有效量或者治疗或预防有效量的细胞。例如，所述组合物包含约1x10⁵个干细胞(如STRO-1⁺细胞)/kg至约 1x10⁷个干细胞(如STRO-1⁺细胞)/kg，或约1x10⁶个干细胞(如STRO-1⁺细胞)/kg至约5x10⁶个干细胞(如STRO-1⁺细胞)/kg。给予细胞的精确量取决于多种因子，包括患者年龄、体重和性别，以及与低成骨细胞水平或活性相关病症的程度和严重性。

在一个实例中，将低剂量的细胞给予至对象。示例性剂量包括每kg 约0.1x 10⁴至0.5x 10⁶个细胞，例如，每kg约0.1x 10⁵至0.5x 10⁶个细胞，如每kg约0.5x 10⁵至0.5x 10⁶个细胞，例如，每kg约0.1x 10⁶至 0.5x 10⁶个细胞，例如，每kg约0.2x 10⁶或0.3x 10⁶或0.4x 10⁶个细胞。

在一些实例中，细胞被控制在不允许细胞逸出而进入对象的循环的腔室内，然而其允许该细胞分泌的因子进入循环。以这种方式，通过允许细胞分泌因子进入对象的循环中，可将可溶性因子给予至对象。此类腔室可以等量地植入对象的位点，以增加可溶性因子的局部水平，例如，植入胰腺内或胰腺附近。

在本公开的一些实例中，在启动细胞组合物治疗前抑制患者的免疫反应可能是不需要的或不合适的。因此，移植异体型或甚至异种型干细胞或其后代在一些情形下可能是可耐受的。

然而，在其他情形下，在启动细胞治疗前通过药理学方式抑制患者的免疫反应和/或减少对象针对所述细胞组合物的免疫反应可能是可取的或合适的。这可以通过应用系统性或局部性免疫抑制剂完成，或其可以通过在密封装置内递送所述细胞完成。所述细胞可以封装在胶囊内，所述胶囊对细胞所需的营养盐和氧以及细胞的治疗因子具有通透性，然而对免疫体液因子和细胞不具有通透性。在一个实例中，胶囊密封材料为低敏感性的，容易并稳定置入靶组织，并为植入的结构提供额外防护。减少或消除对被移植细胞的免疫反应的这些和其他方式为本领域已知。作为可选选择，可以对所述细胞进行遗传修饰，以减少它们的免疫原性。

可溶性因子组合物

在本公开的一个实例中，源自干细胞的和/或源自后代细胞的上清液或可溶性因子以组合物形式给予，例如，包含合适的载体和/或赋形剂。在一个实例中，所述载体或赋形剂不对可溶性因子或上清液的生物效应产生不利影响。

在一个实例中，所述组合物包含物质组合物，以稳定可溶性因子或上清液成分，例如，蛋白酶抑制剂。在一个实例中，包含的蛋白酶抑制剂不以足以给对象带来不利影响的量存在。

可以将包含源自干细胞的和/或源自后代细胞的上清液或可溶性因子的组合物制备为合适的液体悬液，例如，在培养基或稳定的载体或缓冲溶液中，例如，磷酸盐缓冲盐水。合适的载体在上文有描述。在另一个实例中，包含源自干细胞的和/或源自后代细胞的上清液或可溶性因子的悬液为用于注射的油性悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括：脂肪油如芝麻油；或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。用于注射的悬液还可以含有增加悬液粘性的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性的试剂，以允许制备高浓缩的溶液。

可以根据需要，通过以所需量将所述上清液或可溶性因子与上述成分的一种或其组合掺入至合适的溶剂中，然后过滤灭菌，制备无菌的可注射的溶液。

通常，通过将上清液或可溶性因子掺入至含有基础分散介质和来自以上所列举那些的所需其他成分的无菌载体中制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末情形下，示例性制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。根据本公开的可选方面，可以将所述上清液或可溶性因子与一种或多种增加其溶解性的其他化合物一起配制。

其他示例性载体或赋形剂描述于，例如，Hardman,et al.(2001) Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.； Avis,et al.(eds.)(1993)PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y。

治疗性组合物在生产条件和存储下通常应当为无菌和稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇液体等)，以及它们的合适混合物。例如，通过使用包衣层如卵磷脂、通过维持分散情形下所需粒径，以及通过使用表面活性剂，可以维持合适的流动性。在一些情形下，所述组合物中包含有等渗剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶包含在组合物中，达到可注射组合物的延长吸收。此外，可以在延时释放制剂中给予可溶性因子，例如在包含有缓释性聚合物的组合物中。可以将活性化合物与防止化合物快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括埋植剂和微胶囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利，或为本领域技术人员熟知。

所述上清液或可溶性因子可以结合合适的基质给予，例如，以提供可溶性因子的缓慢释放。

组合物的其他组分

源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代可以与其他有利的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起给予。当与其他试剂一起给予时，它们可以按单一药物组合物或分别的药物组合物，与其他药剂同时或依次(在给予其他试剂之前或之后)给予。可以共给予的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，EPO、EPO模拟体(mimetibody)、TPO、IGF-I和 IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制剂)；抗炎剂(例如，p38MAPK抑制剂、 TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANILAST、 REMICADE、SIROLIMUS和NSAIDs(非甾族抗炎药；例如， TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制剂/免疫调节剂(例如，钙调神经磷酸酶抑制剂如环孢霉素、他克莫司；mTOR抑制剂(例如， SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗-增生剂(例如，咪唑硫嘌呤 (azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))；皮质类固醇(例如，强的松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone))；抗体如单克隆抗 -IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗、达利珠单抗(daclizumab))、多克隆抗-T-细胞抗体(例如，抗-胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗-淋巴细胞球蛋白 (ALG)；单克隆抗-T细胞抗体OKT3))；抗-血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗-凝血酶抗体、抗-血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；及抗-氧化剂(例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉剂。

在一个实例中，本文根据任一实例所述的组合物包含用于治疗或预防与低成骨细胞水平或活性相关病症的其他因子。

可选地，或另外，本文根据任一实例所述的细胞、分泌的因子和/或组合物与低成骨细胞水平或活性相关的病症的已知治疗组合。

在一个实例中，本文根据任一实例所述的药物组合物包含用于与低成骨细胞水平或活性相关病症的化合物。可选地，本文根据任一实施方案所述的治疗/预防方法还包括给予用于治疗与低成骨细胞水平或活性相关病症的化合物。示例性化合物本文有描述，并且应当理解为加以必要的修改适用于本公开的这些实例。

在另一个实例中，本文根据任一实例所述的组合物还包含诱导或促进祖细分化为血管细胞的因子。示例性因子包括血管内皮生长因子 (VEGF)、源自血小板的生长因子(PDGF；例如，PDGF-BB)和FGF。

在另一个实例中，本文根据任一实例所述的组合物还包含组织特异性定型细胞(TSCC)。在这个方面，国际专利申请第PCT/AU2005/001445 号证明，给予TSCC和STRO-1⁺细胞可以导致TSCC增殖的增加。在一个实例中，TSCC为血管细胞。将此类组合物给予至对象可以导致血管生成的增加，例如，导致递送至受影响组织的营养物增加。

医疗器械

本公开还提供了用于或当被使用于本文根据任一实例所述的方法的医疗器械。例如，本公开提供了注射器或导管或其他合适的递送装置，其包含干细胞和/或其后代细胞，和/或源自于其的可溶性因子，和/或本文根据任一实例所述的组合物。任选地，所述注射器或导管包装有说明书，以用于本文根据任一实例所述的方法。

在另一个实例中，本公开提供了植入物，其包含干细胞和/或其后代细胞，和/或源自其的可溶性因子，和/或本文根据任一实例所述的组合物。任选地，所述植入物包装有说明书，以用于本文根据任一实例所述的方法。合适的植入物可以由例如，如上文所述的支架以及干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子组成。

给予模式

在一个实例中，源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代被递送至对象的血流。例如，所述源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代被经肠胃外递送。示例性肠胃外给药途径包括但不限于腹膜内、心室内、脑室内、囊内或静脉内。在一个实例中，所述源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代被经动脉内递送至主动脉、心脏的心房或心室中或例如，经静脉内递送至血管内。

在递送细胞至心脏的心房或心室情形下，可以将细胞给予至左心房或左心室，以避免可能由快速递送细胞至肺引起的并发症。

在一个实例中，所述源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代经静脉内递送。

在一个实例中，所述源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代被注射入递送位点，例如，利用注射器或通过导管或中心导管 (central line)。

治疗剂给予方案的挑选取决于几种因子，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。在一个实例中，给予方案将递送至患者的治疗化合物的量最大化，并符合可接受水平的副作用。因此，所递送制剂的量部分取决于具体实体和所治疗病症的严重性。

在一个实例中，源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代作为单次快速灌注剂量递送。可选地，源自干细胞的上清液或可溶性因子、干细胞或其后代通过连续输注给予，或通过以间隔例如一天、一周或每周1-7次的剂量给予。示例性剂量方案涉及避免明显的不良副作用的最大剂量或剂量频率。总的每周剂量取决于所用化合物/细胞的类型和活性。合适剂量的确定由临床医生进行，例如，利用本领域已知的或者怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因素。通常，剂量以稍微低于最佳剂量的量开始，并在其后以小的增量增加，直到相对于任何消极副作用达到所需的或最佳的效应。

本发明的发明人证明，由干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子提供的疗效在对象内至少观察到4周。因此，在一些实例中，将所述细胞每周、每两周、每三周一次或每四周一次给药。

根据本公开的涉及治疗或延缓与低成骨细胞水平或活性相关病症进展的实例，在病症诊断后以干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子给药，例如，利用本领域已知的和/或本文描述的标准方法。

对于涉及预防或延缓与低成骨细胞水平或活性相关病症发作的那些实例，可以在该病症的临床诊断前以所述干细胞和/或其后代细胞和/或源自其的可溶性因子给药。

本公开包括以下非限制性实施例。

实施例

实施例1：通过挑选STRO-3⁺细胞对MPCs进行免疫选择

骨髓(BM)获自健康正常成年志愿者(20-35岁)。简单地说，从臀部髂后嵴吸取40ml BM至含肝素锂抗凝剂的管中。

利用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC，如先前所述(Zannettino,A.C.et al.(1998)Blood 92: 2613-2628)。4℃下400x g离心30分钟后，用移液管去除淡黄色层，并在“HHF”中洗涤3次，所述“HHF”由Hank’s平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)组成，含有5％的胎牛血清(FCS,CSLLimited,Victoria,Australia)。

随后按照先前所述(Gronthos et al.(2003)Journal of Cell Science 116:1827-1835；Gronthos,S.and Simmons,P.J.(1995)Blood 85:929-940)，通过磁力活化的细胞分选分离STRO-3⁺(或TNAP⁺)细胞。简单地说，将约1-3 x 10⁸个BMMNC在封闭缓冲液中于冰上孵育20分钟，所述缓冲液由溶于HHF的10％(v/v)的正常兔血清组成。将所述细胞与200μl的10μg/ml STRO-3 mAb溶液一起在封闭缓冲液中于冰上孵育1小时。随后通过400 xg离心，将置于HHF中的所述细胞洗涤两次。加入溶于HHF缓冲液的、1/50稀释的山羊抗-小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates, Birmingham,UK)，并将所述细胞在冰上孵育1小时。按如上所述将细胞在MACS缓冲液(无Ca²⁺和Mn²⁺的PBS，补充有1％BSA、5mMEDTA 和0.01％叠氮化钠)中洗涤两次，并重悬在0.9ml终体积的MACS缓冲液中。

将100μl链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach, Germany)加入至细胞悬液中，并在冰上孵育15分钟。将所述细胞悬液洗涤两次，并重悬在0.5ml MACS缓冲液中，然后载入到小型MACS柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤3次，以回收未结合STRO-3 mAb的所述细胞(于2005年12月19日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-7282——参见国际公开第WO 2006/108229号)。加入另外的1ml MACS缓冲液后，从磁体移走柱子，并通过正压分离TNAP⁺细胞。可以用链霉亲和素-FITC对来自每个级分的细胞小份染色，并通过流式细胞术评估纯度。

实施例2：通过STRO-3 mAb挑选的细胞为STRO-1^亮细胞

设计了实验以确认利用STRO-3 mAb作为单一试剂用于分离 STRO-1^亮细胞的潜能。

考虑到STRO-3(IgG1)与STRO-1(IgM)是不同类型的同种型，基于其与分离的STRO-1⁺细胞的共表达，利用MACS方案通过双色FACS分析评估了STRO-3识别形成无性系的CFU-F的能力(图1)。点状柱形图代表了采集为列表型数据的5x 10⁴个事件。垂直线和水平线设置为反应水平<利用在相同条件下处理的同种型匹配的对照抗体——1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0％。结果证明，较少的STRO-1^亮细胞群共表达TNAP(右上象限)，而剩余的STRO-1⁺细胞不能与STRO-3 mAb 反应。随后分析了通过FACS从所有4个象限分离的细胞的CFU-F发生率(表1)。

表1：基于细胞表面标记STRO-1和TNAP的共表达，通过双色FACS 分析富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞于标准的无性系形成条件下，培养在补充有20％FCS的αMEM中。数据表示第14天时每接种10⁵个细胞生成的集落形成细胞(CFU-F)的均数±SE(n＝3种不同的骨髓吸取)。这些数据表明，人MPC只局限于共表达STRO-1^亮抗原的BM 的TNAP阳性部分。

骨髓部分	CFU-F频率/10<sup>5</sup>个细胞	富集(倍数增加)
			未分离的BMMNC	11.0±2.2	1.0
TNAP<sup>+</sup>/STRO-1<sup>亮</sup>	4,511±185	410
			TNAP<sup>+</sup>/STRO-1<sup>黯淡</sup>	0.0	0.0

实施例3：猕猴STRO-3⁺MPCs的定征

从～15ml采集自雌性食蟹猴(Macaca fascicularis)的骨髓吸取物分离猿猴骨髓祖细胞(来自猕猴；cyno-MPC)。利用Ficoll梯度分离骨髓吸取物悬液，并洗涤以去除无核细胞(红细胞)。对有核细胞计数，然后通过结合CA12抗体(抗-STRO-3)和Dynalbeads磁珠分离。通过MPC-1磁铁的磁场对结合有抗体和磁珠的细胞进行阳性挑选。对阳性挑选的细胞计数，并在(p.)0代时接种到T-烧瓶的生长培养基中。将预选、阳性和阴性细胞用于集落形成测定(CFU-F)。

用生长培养基喂养cyno-MPC细胞。每2至4天喂养所有的培养物(p.0 –p.5)，直到它们达到所需的聚集度。然后将细胞传代或利用HBSS洗涤液和随后的胶原酶，以及随后的胰蛋白酶/维尔烯(Versene)，收获所述细胞。对p.1细胞计数，并接种至T-烧瓶中。当p.1cyno-MPC达到所需的聚集度时，收获细胞并利用控速冰箱冷冻保存。

将1代冷冻保存的cyno-MPC解冻，并接种至T-烧瓶(p.2)。将p.2细胞在细胞工厂(Cell Factory)内传代至p.3。收获p.3细胞并在细胞工厂内传代至p.4。将额外的p.3细胞冷冻保存。将p.4细胞在6x的细胞工厂内传代至p.5。当p.5cyno-MPC达到所需的聚集度时，收获细胞并利用控速冰箱冷冻保存。细胞冷冻保存在50％αMEM、42.5％Profreeze和7.5％DMSO中。测定了样品的CFU-F检测、FACS、无菌性、支原体和内毒素。

所培养cyno-MPCs的免疫表型的典型流式细胞术分析结果显示在图 2中。如同所示，这些细胞为STRO-1⁺、STRO-4⁺和CD146⁺。

将p5的Cyno MPC解冻，并用于糖尿病和非糖尿病食蟹猴的静脉内注射，如实施例4所述。

实施例4：全身性给予MPCs对肥胖猴的血骨钙素水平的影响

基于以下标准挑选了五(5)只食蟹猴用于处理：(i)年龄>14岁，(ii)高空腹血糖(>105mg/dL)，空腹血液胰岛素水平(<60mU/L)，(iii)高BMI(雄性>46，雌性>24))，(iv)雄性体重>8kg，以及雌性体重>3.5kg，(v)高空腹甘油三酯；和(vi)基于IVGTT，钝化的(blunted)1期胰岛素反应。

所述猴被分配至组1、2或3。动物以下述剂量(剂量调整为记录的最近体重)接受了异体型MPC(按实施例2所述分离)注入头静脉或合适外周静脉的单次缓慢静脉内(IV)输注：

表3.处理组概述

组	剂量水平	剂量MPC/kg	途径
				1(#2875,#1880)	低	0.3x10<sup>6</sup>	IV
2(#1624,#3351)	中	1x 10<sup>6</sup>	IV
				3(#7581)	高	2x 10<sup>6</sup>	IV

每只猴都在第0周时接受MPC的第一次输注，并在第12周时接受第二次输注，如图10所示。

结果

在对单只动物IV注射异体型MPC后，监测6个月期间内的空腹血骨钙素(ng/ml)的略图。结果显示在图3中，其中箭头指示给予单次剂量 MPC的时间。

在用1.4(+/-1.5,SEM)ng/ml的平均基线值MPC处理前，所有5只动物均显示低血浆水平的骨钙素。

数据表明，骨钙素反应发生在每次注射后2周内，并且效应具有12 周的持续时间。数据还表明，重复注射MPCs至少与初次注射一样有效。骨钙素峰值范围为10-30ng/ml。在检测的最低细胞剂量时观察到最大骨钙素诱导。

图4展示了在肥胖型毛里求斯食蟹猴的第一次MPC注射后2周内观察到骨钙素反应。在2-8周的峰值反应后，到12周时值回复至基线。有趣的是，第二次MPC注射展现与第一次注射相似的动力学，维持相同的骨钙素反应水平。

图5展示了相对于第0周时的基线，6个月期间骨钙素反应的百分比变化。使用低剂量的MPC注射(30万MPC/kg)观察到最大的反应。

图6显示了相比处理前的基线水平，MPC处理后骨钙素水平的平均百分比变化。骨钙素相比基线的平均百分比增加在第2周时达到峰值 1134％(+/-202)。第二次注射后的反应幅度显得类似于第一次MPC注射的反应幅度。

图7显示了MPC处理6个月内，血浆碱性磷酸酶的渐进增加(如通过曲线下面积分析所测定)。

图8显示了MPC处理6个月内，血浆总碱性磷酸酶的渐进增加(如通过18-24周和0-6周之间曲线下面积的％增加分析所测定)。

Claims

1.富集STRO-1⁺,TNAP⁺专能性细胞的细胞群在制备用于全身性给药至对象以治疗对象的代谢性骨病或骨折的包含所述细胞群的药物中的应用，其中全身性给药的所述细胞群中STRO-1⁺,TNAP⁺专能性细胞导致所述对象的血浆骨钙素水平增加。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述对象患有与低成骨细胞水平或活性相关的病症。

3.如权利要求2所述的应用，其中所述药物用于治疗代谢性骨病。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述代谢性骨病选自：软骨病、骨质疏松症、骨硬化病、佩吉特氏病和X染色体连锁低磷性佝偻病、肾衰竭相关的骨营养不良、石骨症、囊状纤维性骨炎，以及糖皮质激素诱导的骨质流失。

5.如权利要求2所述的应用，其中所述对象患有骨质疏松症，并且所述药物预防或减少骨折风险。

6.如权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述对象患有骨折。

7.如权利要求6所述的应用，其中给予所述药物加速骨折治愈，和/或预防骨折延迟愈合，和/或预防骨折的不愈合。

8.如权利要求1-5和7中任一项所述的应用，其中给予所述药物导致在给药2周内血浆骨钙素水平增加为至少5倍。

9.如权利要求8所述的应用，其中给予所述药物导致在给药2周内血浆骨钙素水平增加为至少10倍。

10.如权利要求8所述的应用，其中给予所述药物导致在给药2周内血浆骨钙素水平增加为至少20倍。

11.如权利要求1至5,7和9-10中任一项所述的应用，其中给予所述药物导致所述对象的血浆碱性磷酸酶水平增加。

12.如权利要求6所述的应用，其中给予所述药物导致所述对象的血浆碱性磷酸酶水平增加。

13.如权利要求8所述的应用，其中给予所述药物导致所述对象的血浆碱性磷酸酶水平增加。

14.如权利要求11所述的应用，其中相比给药前的血浆碱性磷酸酶水平，给予所述药物导致在给药6周内血浆碱性磷酸酶水平增加至少5％。

15.如权利要求11所述的应用，其中相比给药前的血浆碱性磷酸酶水平，给予所述药物导致在给药6周内血浆碱性磷酸酶水平增加至少10％。

16.如权利要求1至5,7,9-10和12-15中任一项所述的应用，其中所述药物被制备成多次给予至对象。

17.如权利要求6所述的应用，其中所述药物被制备成多次给予至对象。

18.如权利要求8所述的应用，其中所述药物被制备成多次给予至对象。

19.如权利要求11所述的应用，其中所述药物被制备成多次给予至对象。

20.如权利要求16所述的应用，其中所述药物被制备成每12周或更多周给予一次。

21.如权利要求1至5,7,9-10,12-15和17-20中任一项所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.1x10⁶至5x10⁶个所述细胞群的细胞。

22.如权利要求6所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.1x10⁶至5x10⁶个所述细胞群的细胞。

23.如权利要求8所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.1x10⁶至5x10⁶个所述细胞群的细胞。

24.如权利要求11所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.1x10⁶至5x10⁶个所述细胞群的细胞。

25.如权利要求16所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.1x10⁶至5x10⁶个所述细胞群的细胞。

26.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20和22-25中任一项所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

27.如权利要求6所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

28.如权利要求8所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

29.如权利要求11所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

30.如权利要求16所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

31.如权利要求21所述的应用，其中所述药物被制备成每kg给予0.3x10⁶至2x10⁶个所述细胞群的细胞。

32.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20,22-25和27-31中任一项所述的应用，其中所述药物被制备成给予低剂量的所述细胞群的细胞，其中所述低剂量包含每kg0.1x10⁵至0.5x10⁶个所述细胞群的细胞。

33.如权利要求32所述的应用，其中所述低剂量包含每kg0.3x10⁶个所述细胞群的细胞。

34.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20,22-25,27-31和33中任一项所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

35.如权利要求6所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

36.如权利要求8所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

37.如权利要求11所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

38.如权利要求16所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

39.如权利要求21所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

40.如权利要求26所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

41.如权利要求32所述的应用，其中所述细胞群为自体型或异体型。

42.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20,22-25,27-31,33和35-41中任一项所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

43.如权利要求6所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

44.如权利要求8所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

45.如权利要求11所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

46.如权利要求16所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

47.如权利要求21所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

48.如权利要求26所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

49.如权利要求32所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

50.如权利要求34所述的应用，其中在制备所述药物前，所述细胞群已被培养扩增。

51.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20,22-25,27-31,33,35-41和43-50中任一项所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

52.如权利要求6所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

53.如权利要求8所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

54.如权利要求11所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

55.如权利要求16所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

56.如权利要求21所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

57.如权利要求26所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

58.如权利要求32所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

59.如权利要求34所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

60.如权利要求42所述的应用，其中将所述药物被制备成经静脉内给药。

61.如权利要求1至5,7,9-10,12-15,17-20,22-25,27-31,33,35-41,43-50和52-60中任一项所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

62.如权利要求6所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

63.如权利要求8所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

64.如权利要求11所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

65.如权利要求16所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

66.如权利要求21所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

67.如权利要求26所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

68.如权利要求32所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

69.如权利要求34所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

70.如权利要求42所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

71.如权利要求51所述的应用，其中所述药物被制备成以组合物形式给药，所述组合物包含所述细胞群，以及载体和/或赋形剂。

72.如权利要求4所述的应用，其中所述代谢性骨病选自：骨质疏松症、软骨病、肾衰竭相关的骨营养不良、囊状纤维性骨炎，以及糖皮质激素诱导的骨质流失。

73.如权利要求72所述的应用，其中所述代谢性骨病是骨质疏松症。