KR20140082660A - 조골세포 기능의 향상방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상체에게 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 전신적으로 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상체에서 조골세포의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

조골세포 기능의 향상방법{METHOD FOR INCREASING OSTEOBLASTIC FUNCTION}

관련 출원 데이터

본 발명은 2011년 9월 9일자에 "Methods for increasing osteoblastic function"의 명칭으로 출원된 미국 특허출원 제61/532,772호 및 2011년 9월 16일자에 "Methods for increasing osteoblastic function 2"의 명칭으로 출원된 미국 특허출원 제61/535,441호를 우선권으로 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.

분야

본 발명은 조골세포 기능의 향상을 필요로 하는 대상체에서 상기 조골세포의 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 골질환 및 남성 불임과 같은 조골세포 기능에 의해 매개되는 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하다.

조골세포는 뼈형성에 관여하는 세포이다. 이들 세포는 주로 1형 콜라겐, 황산콘드로이틴 및 오스테오칼신으로 구성된 유골 기질을 생성한다. 조골세포는 또한예를 들면, 아연, 구리 및 나트륨을 이용하여 이 기질을 광물화한다.

조골세포는 골수 및 뼈의 골막에 위치한 골전구 세포에서 발생한다. 골전구체는 마스터 조절 전사 인자 Cbfa1/Runx2를 발현하는 미숙 전구 세포이다. 골전구체는 뼈형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)를 비롯한 다양한 성장 인자에 의해 조골세포로 분화되도록 유도된다. 골전구 세포가 조골세포로 분화를 개시하면, 이들은 오스테릭스, Col1, BSP, M-CSF, ALP, 및 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 및 오스테오넥틴을 포함하는 다양한 유전자 표지를 발현하기 시작한다.

오스테오칼신(BGP: Bone Gla Protein)은 프라이스 등(Price et al.)에 의해 최초로 발견된 소형 비타민 K 의존성 칼슘 결합 단백질이다((1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 73:3373-5). 이 단백질은 주로 골아세포와 상아질아세포에 의해 합성되며, 뼈의 비콜라겐성 단백질의 15 내지 20%를 구성한다. 포스너 등(Posner et al.)((1980) J. Biol. Chem. 255:8685-91)은 성숙 오스테오칼신이 글루탐산 잔기의 번역후 비타민 K-의존성 변형으로 형성된 3개의 카르복시글루탐산 잔기를 함유한다고 밝혀냈다. 이들 잔기가 칼슘 이온에 결합하기 위한 오스테오칼신의 능력에 관여함이 추가로 판명되었다(Brozovic et al. (1976) Brit. J Haematol. 32:9).

오스테오칼신은 정상적인 골광물화에 필요한 뼈의 주요한 세포외 기질 단백질이다. 정상적인 골 광물 밀도는 단백질 기질 내에 인산염과 세포외 칼슘을 함유하는 하이드록시아파타이트 결정에 의한 것이다. 단백질 기질 내에 칼슘 침착은 조골세포에 의해 생성된 오스테오칼신을 포함한다. 단백질 기질 내에 인산염 침착은 하이드록시아파타이트 결정의 천연 저해제인 무기 피로포스페이트(ppi)의 세포외 농도를 조절하는 조직 비특이적 알칼리성 포스파타제(TNAP)를 포함한다. TNAP 유전자의 돌연변이는 무기 피로포스페이트의 상승된 세포외 농도, 저조하게 광물화된 뼈, 특발 골절이 특징인 저인산증을 초래한다.

현재 오스테오칼신은 칼슘의 존재 하에 칼슘 감지 수용체 2(CaR2)를 상승적으로 활성화시킨다고 알려졌다. 따라서, 오스테오칼신 발현 또는 활성의 변경은 CaR2 기능과 관련한 질환에서 주요한 역할을 한다. 예를 들어, 오스테오칼신과 CaR2의 상호작용이 역할을 하는 질환으로는 정자 운동성 및 생존성과, 대사성 골질환, 예컨대 골다공증을 들 수 있으나 이들에만 한정되는 것은 아니다.

골다공증은 골 광물 밀도 감소 및 골절의 위험성 증가가 특징인 전신성 골질환이다. 골다공증의 두가지 주요 병인은 조골세포 활성을 파괴 및 감소시키는 용골 세포 활성의 증가이다. 이러한 특징들은 폐경기 후 상태에서와 만성 코르티코스테로이드 사용 후 뿐만 아니라 특발성 경우에 일어난다. 현재 대부분의 골다공증 치료 전략은 용골 세포의 뼈 재흡수 활성을 저해하는 항-재흡수제, 예컨대 비스포스포네이트에 초점을 맞추고 있다. 특정 전략, 예컨대 파라티로이드 호르몬(PTH)의 사용은 조골세포 활성의 증대에 초점을 두고 있으며, 이 경우 바이오마커를 사용하여 오스테오칼신 및 뼈 특이적-알칼리성 포스파타제와 같은 조골세포 활성 증가가 측정된다.

요약

본 발명자들은, 예를 들면 영장류에서 순환 오스테오칼신 및/또는 알칼리성 포스파타제의 수준 증가로 나타내어지는 바와 같이, 비인간 영장류에 다능성 세포 제제의 전신 투여가 조골세포 활성을 현저히 증가시킨다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 영장류에 다능성 세포 제제를 전신적으로 투여하게 되면 혈장 오스테오칼신 수준이 투여 2주 내에 약 20배 증가한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 영장류에 다능성 세포 제제를 전신적으로 투여하게 되면 투여 6주 내에 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 거의 검출가능한 증가, 예를 들면, 5% 또는 10% 증가한다는 것도 발견하였다. 이는 다능성 세포 제제의 전신 투여가 낮은 수준의 조골세포 활성 및/또는 전신 오스테오칼린 및/또는 알칼리성 포스파타제와 관련되거나 이로 야기되는 질병, 예컨대 대사성 골질환 및 남성의 낮은 생식성을 치료하는 데에 유용할 것임을 제시한다.

따라서, 본 발명은 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 대상체에 전신적으로 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 조골세포의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다.

일례로, 대상체는 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련 및/또는 낮은 오스테오칼신 수준 또는 활성과 관련된 질환을 앓고 있다.

질환은 대사성 골질환 또는 남성 불임일 수 있다.

대사성 골질환은 골연화증, 골다공증, 골석화증, 파제트병 및 X-연관성 저인산혈증 구루병, 신부전-관련 골이영양증, 대리석 골병, 낭성 섬유성 골염 및 글루코코르티코이드-유도 골손실로 구성된 군중에서 선택될 수 있다.

일례로, 대상체는 골다공증을 앓고 있다. 일례로서, 방법은 골다공증을 앓고 있는 대상체에서 골절의 위험을 예방하거나 감소시킨다.

일례로, 대상체는 뼈 골절을 겪고 있다. 일례로서, 방법은 뼈 골절의 치유를 촉진 및/또는 뼈 골절의 지연 유합(unino)을 예방 및/또는 뼈 골절의 유합 불능(non-union)을 예방한다. 이와 관련하여, 대상체는 대사성 골질환 또는 남성 불임을 겪고 있을 수 있다. 대안적으로, 대상체는 정상 대상체, 즉 대사성 골질환 또는 남성 불임을 겪고 있지 않을 수 있다. 따라서, 대상체는 골절로 고통받고 있는 모든 대상체일 수 있다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 대상체에서 혈장 오스테오칼신의 수준이 증가한다.

일례로, 줄기 세포의 투여는 대상체에서 조골세포에 의한 오스테오칼신의 생성을 촉진한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 혈장 오스테오칼신 수준이 투여 2주(또는 4주 또는 6주) 내에 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배 증가한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 대상체에서 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 증가한다.

일례로, 줄기 세포의 투여는 대상체에서 조골세포에 의한 알칼리성 포스파타제의 생성을 촉진한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 투여 전 혈장 알칼리성 포스파타제의 수준에 비해 투여 6주 내에 적어도 5 또는 10 또는 20 또는 30 또는 40 또는 50 또는 60% 증가한다.

일례로, 줄기 세포는 다능성 세포이다. 일례로서, 다능성 세포는 STRO-1⁺ 세포이다. 다른 예로서, 다능성 세포는 STRO-1^bright 세포이다. 또다른 예로서, STRO-1⁺ 세포는 TNAP 마커를 공동-발현한다.

일례로, 본원에 기술된 방법은 STRO-1^bright 세포가 농축된 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여를 포함한다.

일례로, 본원에 기술된 방법은 STRO-1⁺ 및 조직 비특이적 알칼리성 포스파타제⁺(TNAP)⁺ 세포가 농축된 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여를 포함한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자는 정맥내로 투여된다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자는 수 회 투여된다.

예를 들어, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자는 4주 이상마다 한번 투여된다.

예를 들어, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자는 8주 이상마다 한번 투여된다.

예를 들어, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자는 12주 이상마다 한번 투여된다.

일례로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 kg당 0.1 x 10⁶ 내지 5 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함한다.

일례로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 kg당 0.3 x 10⁶ 내지 2 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함한다. 예를 들어, 방법은 kg당 약 1 x 10⁶ 또는 2 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함한다.

일례로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 저용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함한다. 예를 들어, 저용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대는 kg당 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대를 포함한다. 예를 들어, 저용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대는 kg당 약 0.3 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대를 포함한다.

일례로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 고용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포는 자생성 또는 동종이계이고/이거나, 가용성 인자는 자생 또는 동종이계 세포로부터 유래할 수 있다. 일례로서, 집단 및/또는 후대는 동종이계이고/이거나, 가용성 인자는 동종이계 세포 유래이다.

상기 예에 따라, 방법은 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포 및/또는 가용성 인자를 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 가용성 인자를 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대의 분리는 STRO-1 및/또는 TNAP의 발현에 기초한다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포 및/또는 가용성 인자는 치료 대상체로부터 얻는다. 다른 예로, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 가용성 인자는 동종의 상이한 대상체로부터 얻는다.

일례로, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포는 투여 전 및/또는 가용성 인자 수득 전에 배양 확장된다.

상기 예에 따라, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포의 배양을 추가로 포함할 수 있다.

일례로, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자는 상기 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자와 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다.

상기 예에 따라, 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법은 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자를 조성물로 제제화하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 설명서와 함께 포장된 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 포함하는 키트를 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법에서 조성물의 사용을 나타내는 제품 정보와 함께 포장된 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일례로, 대상체는 골다공증을 앓고 있다. 일례로서, 방법은 골다공증을 앓고 있는 대상체에서 골절의 위험을 예방하거나 감소시킨다.

일례로, 대상체는 뼈 골절을 겪고 있다. 일례로서, 방법은 뼈 골절의 치유를 촉진 및/또는 뼈 골절의 지연 유합을 예방 및/또는 뼈 골절의 유합 불능을 예방한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 줄기 세포 집단 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 이의 후대 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 상기로부터 유래한 가용성 인자를 대상체에 투여(예를 들면, 전신 투여) 하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 오스테오칼신 수준(예를 들면, 혈장 오스테오칼신 수준)을 증가시키는 방법을 제공한다.

일례로, 세포 또는 인자는 대상체에서 오스테오칼신 수준(예를 들면, 혈장 오스테오칼신 수준)을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.

일례로, 이를 필요로 하는 대상체는 오스테오칼신, 예를 들면, 혈장 오스테오칼신의 수준이, 예를 들면, 정상 및/또는 건강한 집단의 수준에 비해 감소되어 있다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 줄기 세포 집단 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 이의 후대 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 상기로부터 유래한 가용성 인자를 대상체에 투여(예를 들면, 전신 투여) 하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 알칼리성 포스파타제 수준(예를 들면, 혈장 알칼리성 포스파타제 수준)을 증가시키는 방법을 제공한다.

일례로, 세포 또는 인자는 대상체에서 알칼리성 포스파타제 수준(예를 들면, 혈장 알칼리성 포스파타제 수준)을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.

일례로, 이를 필요로 하는 대상체는 알칼리성 포스파타제, 예를 들면, 혈장 알칼리성 포스파타제의 수준이, 예를 들면, 정상 및/또는 건강한 집단의 수준에 비해 감소되어 있다.

본 발명은 또한 남성 불임 또는 대사성 골질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 제공한다.

본 발명은 또한 대상체에서 남성 불임 또는 대사성 골질환의 치료 또는 예방용 의약품을 제조하는 데에 있어서 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 용도를 제공한다.

도 1. 성인 인간 골수형핵세포(BMMNC)에 의한 TNAP(STRO-3)와 간엽 전구 세포 마커, STRO-1^bright의 공동-발현. FITC에 커플링된 염소 항-뮤린 IgM 항체로 간접 표지된 STRO-1 MACS-선별된 BMMNC(x 축) 및 PE에 커플링된 염소 항-뮤린 IgG로 간접 표지된 STRO-3 mAb(뮤린 IgG1)(y 축)의 배양으로 2색 면역형광법 및 유세포 분석법을 수행하였다. 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터(listmode data)로 수집한 5 x 10⁴ 사건(event)을 나타낸다. 수직 및 수평선은 동일한 조건하에 처리된 이소형(isoform)-정합 대조 항체, 1B5(IgG) 및 1A6.12(IgM)로 얻은 <1.0% 평균 형광의 반응 수준으로 설정되었다. 결과는 STRO-1^bright 세포의 소집단이 TNAP를 공동-발현(오른쪽 위 사분면)하는데 반해 나머지 STRO-1⁺ 세포들은 STRO-3 mAb와 반응하지 못했음을 입증한다.
도 2는 간엽 줄기 세포 마커, STRO-1, STRO-4 및 CD146(실선)의 양성 세포 표면 발현을 가지는 배양 확장된 골수 유래 사이노몰거스(cynomolgus) MPC의 단일 세포 현탁액을 사용하여 생성된 대표적인 유세포 분석 히스토그램을 염소 항-뮤린 IgM 또는 IgG 접합-FITC 이차 항체를 사용하여 검출된 이소형(IgM, IgG2a 및 IgG1) 음성 대조군(해시 라인)에 대해 나타낸 그래프 도식이다. 대표적인 히스토그램은 또한 사이노몰거스 MPC가 단핵구/대식 세포(CD14), 조혈 줄기 세포/전구 세포(CD34) 및 성숙 백혈구(CD45)의 마커에 대해 세포 표면 발현이 결여되어 있음을 나타낸다. 이소형 대조군에 비해 1% 초과 형광 수준은 양성을 의미한다.
도 3은 개별 동물에 동종이계 MPC의 IV 주사 후 6개월에 걸친 혈액 오스테오칼신(ng/ml)에 대한 공복시 프로파일의 그래프 도식이다. 화살표는 단회 용량의 MPC 투여 시기를 나타낸다.
도 4는 비만 마우리티안 사이노몰거스 원숭이에 단회 용량의 MPC를 정맥내로 단회 용량을 2회 투여한 후 혈장 오스테오칼신 수준에 대한 평균 프로파일의 그래프 도식이다.
도 5는 치료 전의 기본선 수준과 비교하여 MPC 치료 후 오스테오칼신 수준의 퍼센트 변화율을 나타내는 그래프 도식이다.
도 6은 치료 전의 기본선 수준과 비교하여 MPC 치료 후 오스테오칼신 수준의 평균 퍼센트 변화율을 나타내는 그래프 도식이다.
도 7은 6개월에 걸친 MPC 치료에 있어서 다섯마리중 네마리의 동물이 혈장 총 알칼리성 포스파타제의 점진적 증가를 입증하였음을 나타내는 그래프 도식이다(곡선 아래 면적 분석으로 측정됨).
도 8은 6개월에 걸친 MPC 치료에 있어서 다섯마리중 네마리의 동물이 혈장 총 알칼리성 포스파타제의 점진적 증가를 입증하였음을 나타내는 그래프 도식이다(18-24주 대 0-6주 사이 곡선 아래 면적 분석에서 %증가로 측정됨).
도 9는 개별 동물에서 치료 전의 기본선 수준과 비교하여 MPC 치료 후 알칼리성 포스파타제 수준의 퍼센트 변화율을 나타내는 그래프 도식이다.

상세한 설명

일반적인 기술 및 선택된 정의

본 명세서 전체에서, 달리 구체적으로 기술되지 않거나 문맥에서 달리 언급하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹은 이들 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹 중 하나 및 다수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 고려될 수 있다.

본원에 기술된 각각의 실시양태 또는 예는 달리 구체적으로 기술하지 않는 한 각각 및 매번 다른 실시양태에 필요한 부분만 약간 수정하여(mutatis mutandis) 적용되어야 한다.

당해 분야의 숙련가는, 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것들 외에 다른 변화 및 변형을 허용함을 인지할 것이다. 본 발명이 이러한 변화 및 변형 모두를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 언급되거나 나타낸 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들의 모두를 개별적으로 또는 총체적으로, 및 상기 단계들 또는 특징들 중 임의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.

본 발명은 예시의 목적으로만 의도된, 본원에 기술된 특정 양태로 영역을 한정하여서는 안된다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 명백히 본 발명의 영역내에 있다.

본 발명은 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액내 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성, 및 면역학의 통상의 기술을 사용하여 과도한 실험없이 수행된다. 이러한 공정은 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, ppl-22; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; and Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, whole of text; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, whole of text; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), whole of series; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wuensch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Mueler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 이의 전문]에 기술되어 있다.

본 명세서 전체에서, 내용이 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형된 표현은 기술된 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하는 것을 내포할 뿐 아니라, 특정의 다른 단계 또는 요소 또는, 요소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 할 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "로부터 유래한"은, 명시된 정수가 비록 특수 공급원으로부터 수득될 수 있다고 해도 반드시 이러한 공급원으로부터 직접 수득되지 않음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포로부터 유래한 가용성 인자와 관련하여, 당해 용어는 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포의 시험관내 배양 동안 생산된 하나 이상의 인자, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 탄수화물 등을 의미하기 위해 사용될 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "조골세포 기능"은 세포외 기질, 예를 들면, 오스테오이드를 생성 및/또는 분비하기 위한 조골세포의 능력을 포함하도록 이해하여야 할 것이다. 오스테오이드는 1형 콜라겐, 황산콘드로이틴 및 오스테오칼신을 포함하는 비광물화된 골 기질이다. 용어 "조골세포 기능"은 추가적으로 또는 선택적으로 세포외 기질, 예를 들면, 오스테오이드를 광물화하기 위한 세포의 능력을 의미한다. 일례로서, 용어 "조골세포 기능"은 대상체에서 뼈형성의 증가를 포함하도록 이해하여야 할 것이다.

대상체에서 "조골세포 기능"의 향상은 세포외 기질의 생성 및/또는 분비 및/또는 세포외 기질의 광물화를 위한 조골세포의 능력을 증대시키고/시키거나, 골전구체 증식 및/또는 골전구체의 조골세포로의 분화를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 조골세포 기능의 향상은 대상체 또는 이의 뼈에서 조골세포의 수를 증가시킴으로써 달성될 수 있다

본원에 사용된 것으로서, 용어 "유효량"은 대상체에서 조골세포 기능 및/또는 조골세포 수준 또는 활성 및/또는 전신 오스테오칼신 수준 및/또는 알칼리성 포스파타제 수준의 유의적인 증가를 이루기에 충분한 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 양을 의미하기 위해 사용된다. 조골세포 기능 및/또는 조골세포 수준 또는 활성 및/또는 전신 오스테오칼신 수준 및/또는 알칼리성 포스파타제 수준의 유의적인 증가는, 예를 들어, 적어도 2배 증가, 또는 적어도 5배 증가, 또는 적어도 10배 증가, 적어도 20배 증가, 또는 적어도 25배 증가일 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료학적 유효량"은, 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하는데 충분한 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 양을 의미하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "예방학적 유효량"은 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환의 발생을 예방하거나 억제하거나 지연하기에 충분한 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 양을 의미하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "저용량"은 1x10⁶ 미만이지만, 본원에 정의된 바와 같은 "유효량" 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 "치료학적 유효량" 및/또는 "예방학적 유효량"이 되도록 하기에 충분한 줄기 세포 및/또는 이의 후대의 양을 의미하는 것으로 사용될 것이다. 예를 들어, 저용량은 0.5 x 10⁶ 이하의 세포, 또는 0.4 x 10⁶ 이하의 세포 또는 0.3 x10⁶ 이하의 세포 또는 0.1 x 10⁶ 이하의 세포를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "고용량"은 kg당 1.5x10⁶ 세포 초과를 의미하는 것으로 이해하여야 할 것이다. 예를 들어, 상기 용량은 약 1.5 x 10⁶ 내지 약 4x10⁶ 세포/kg을 포함한다. 예를 들어, 고용량은 약 1.5 x 10⁶ 또는 약 2 x 10⁶/kg을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"은 치료학적 유효량의 가용성 인자 및/또는 세포를 투여하고 대상체가 더 이상 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환으로 임상적으로 진단되지 않도록 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 증상(들)을 감소시키거나 억제함을 의미하는 것으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "예방하다" 또는 "예방하는" 또는 "예방"은 예방학적 유효량의 가용성 인자 및/또는 세포를 투여하여 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환의 발전 또는 진전을 중지하거나 방해하거나 지연하는 것을 의미하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "가용성 인자"는 임의의 분자, 예를 들면, 수용성인 줄기 세포 및/또는 이의 후대에 의해 생산된, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질단백질, 지질펩티드, 탄수화물 등을 의미하기 위해 사용된다. 이러한 가용성 인자는 세포에 의해 세포내에 존재하고/하거나 세포에 의해 분비될 수 있다. 이러한 가용성 인자는 복합체 혼합물(예를 들면, 상등액) 및/또는 이의 단편일 수 있고/있거나 정제된 인자일 수 있다. 본 발명의 일례에서 가용성 인자는 상등액 속에 있거나 상등액에 함유된다. 따라서, 하나 이상의 가용성 인자의 투여와 관련된 본원의 임의 예는 상등액의 투여에 준용하여 적용할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "상등액"은 적합한 배지, 예를 들면 액체 배지 에서 줄기 세포, 및/또는 이의 후대의 시험관내 배양 이후에 생산된 비-세포 물질을 나타낸다. 전형적으로, 상등액은 세포를 배지에서 적합한 조건 및 시간하에 배양한 후, 원심분리와 같은 방법으로 세포 물질을 제거함으로써 생산한다. 상등액은 투여 전에 추가의 정제 단계에 적용되거나 적용되지 않을 수 있다. 일례에서, 상등액은 10⁵ 미만, 예를 들어 10⁴ 미만, 예를 들면 10³ 미만의 살아있는 세포를 포함하고, 가령 살아있는 세포를 포함하지 않는다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "정상 또는 건강한 개체"는 당해 분야에 공지되고/되거나 본원에 기술된 임의 방법으로 평가한 것으로서 낮은 조골세포 기능을 갖는 대상체를 의미한다. 일례로서, "정상 또는 건강한 개체"는 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환의 어떤 증상으로도 고통받지 않고/않거나, 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 어떤 질환으로도 고통받지 않는다.

줄기 세포 또는 이의 후대 세포, 및 상등액 또는 이로부터 유래한 하나 이상의 가용성 인자

본원에 사용된 것으로서, 용어 "줄기 세포"는 표현형으로 및 유전형으로 동일한 딸세포뿐 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포형(예를 들면, 종국에 분화된 세포)을 생기게 할 수 있는 자기재생 세포를 가리킨다. 용어 "줄기 세포"는 분화전능성, 다분화성 및 다능성 세포뿐 아니라 이의 분화로 유래된 전구체 및/또는 전구 세포를 포함한다. 줄기 세포는 성인 또는 배아 줄기 세포일 수 있거나, 또는 유도된 다분화성 줄기(iPS)일 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "분화전능 세포" 또는 "분화전능성 세포"는 완전 배아(예를 들면, 배반포)를 형성할 수 있는 세포를 가리킨다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "다분화 세포" 또는 "다분화성 세포"는 완전한 분화 다능성, 즉 임의 포유동물체의 약 260개 세포형으로 성장할 수 있는 능력을 가지는 세포를 가리킨다. 다분화 세포는 자기재생성일 수 있고, 조직 내에서 휴면 또는 휴지상태일 수 있다.

"다능 세포" 또는 "다능성 세포" 는 임의적인 수개의 성숙 세포형을 발생할 수 있는 세포를 의미한다. 본원에 사용된 이 어구는 성인 또는 배아 줄기 세포 및 전구 세포, 예컨대 간엽 전구 세포(MPC) 및 이들 세포의 다능성 전구체를 포함한다. 다분화 세포와 달리, 다능 세포는 모든 세포형을 형성할 능력을 갖지 않는다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "전구 세포"는 특이적 세포형으로 분화하거나 특이적 조직 형태를 형성하도록 위임하는 세포를 가리킨다.

본원에 사용된 것으로서, 어구 "STRO-1⁺ 다능성 세포"는 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 STRO-1⁺ 및/또는 TNAP⁺ 전구 세포를 의미하는 것이다.

STRO-1⁺ 다능성 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 가슴샘, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피, 및 골막에서 발견되고; 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽과 같은 생식 계열로 분화할 수 있는 세포이다. 따라서, STRO-1⁺ 다능성 세포는 지방 조직, 골 조직, 연골 조직, 탄성 조직, 근 조직 및 섬유성 결합 조직을 포함하는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 상기 세포들이 도입되는 특수 계통-결정(lineage-commitment) 및 분화 경로는 성장 인자, 사이토킨 및/또는, 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건과 같은 내인성 생체활성 인자 및/또는, 기계적 영향으로부터의 각종 영향에 의존한다. 일 실시양태로, STRO-1⁺ 다능성 세포는 적시에 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 생성할 줄기 세포이거나 전구 세포인 딸 세포를 생산하기 위해 분할하는 비-조혈 후대세포이다.

일례로, STRO-1⁺ 세포는 대상체, 예를 들면, 치료될 대상체 또는 관련 대상체 또는 비관련 대상체(동일한 종 또는 상이한 종에 상관없이)로부터 수득한 샘플로부터 농축된다. 용어 "농축된", "농축" 또는 이의 변형은 본원에서 하나의 특수 세포형의 비율 또는 특수 세포형의 수의 비율이 처리되지 않은 세포 집단(예를 들면 그의 천연 환경의 세포)과 비교하여 증가된 세포의 집단을 기술하기 위해 사용된다. 일례로서, STRO-1⁺ 세포가 농축된 집단은 적어도 약 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75% STRO-1⁺ 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "STRO-1⁺ 세포가 농축된 세포 집단"은 용어 "X% STRO1⁺ 세포를 포함하는 세포 집단"(여기서, X%는 본원에 인용된 바와 같은 퍼센트이다)을 명백히 지원하도록 취해질 것이다. STRO-1⁺ 세포는 특정 예로서, 클론원성 콜로니, 예를 들면 CFU-F(섬유아세포)를 형성할 수 있거나 또는 이의 부분집단(예를 들면, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 70% 또는 90% 또는 95%)이 이러한 활성을 가질 수 있다.

일례로, 세포 집단은 선택가능한 형태의 STRO-1⁺ 세포를 포함하는 세포 제제로부터 농축된다. 이와 관련하여, 용어 "선택가능한 형태"는 세포가 STRO-1⁺ 세포의 선택을 허용하는 마커(예를 들면, 세포 표면 마커)를 발현하는 의미로 이해하여야 할 것이다. 마커는 STRO-1일 수 있으나, 반드시 그일 필요는 없다. 예를 들어, 본원에 기술되고 및/또는 예시된 바와 같이, STRO-2 및/또는 STRO-3(TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현하는 세포(예를 들면, MPC)가 또한 STRO-1을 발현한다(STRO-1^bright일 수 있다). 따라서, 세포가 STRO-1⁺라는 표현은 세포가 STRO-1 발현에 의해 선택되는 것을 의미하지는 않는다. 일례로서, 세포는 적어도 STRO-3 발현에 준해 선택되며, 예를 들면, 이들은 STRO-3⁺(TNAP⁺)이다.

세포 또는 이의 집단의 선택은 특이적 조직원으로부터의 선택을 필요로 하지 않는다. 본원에 기술된 바와 같은 STRO-1⁺ 세포는 각종 공급원으로부터 선택되거나, 분리되거나, 농축될 수 있다. 그렇긴 하지만, 일부 예로서, 이들 용어는 STRO-1⁺ 세포를 포함하는 임의 조직(예를 들면, MPC) 또는 혈관성 조직 또는 혈관주위세포(예를 들면, STRO-1⁺ 혈관주위세포)를 포함하는 조직 또는 본원에 인용된 임의의 하나 이상의 조직으로부터의 선택을 지원한다.

일례에서, 본 발명에 사용된 세포는 TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1⁺, STRO-2⁺, STRO-4⁺(HSP-90β), CD45⁺, CD146⁺, 3G5⁺ 또는 그의 임의 조합으로 구성된 군중에서 개별적으로 또는 총체적으로 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.

"개별적으로"는, 본 발명이 인용된 마커 또는 마커의 그룹을 별도로 포함하고, 개개 마커 또는 마커의 그룹이 본원에 별도로 존재하지 않을 수 있음에도 불구하고 특허청구범위가 이러한 마커 또는 마커의 그룹을 서로 독립적으로 분리하여 정의할 수 있음을 의미한다.

"총체적으로"는, 본 발명이 인용된 마커 또는 펩티드 그룹의 임의 수 또는 조합을 포함하며, 마커 또는 마커의 그룹의 이러한 수 또는 조합이 본원에 상세하게 설명되어 있지 않을 수 있음에도 불구하고, 특허청구범위가 이러한 조합 또는 소-조합을 마커 또는 마커의 그룹의 어떠한 다른 조합으로부터 별도로 분리하여 이러한 조합 또는 소-조합을 정의할 수 있음을 의미한다.

예를 들어, STRO-1⁺ 세포는 STRO-1^bright(동의어: STRO-1^bri)이다. 일례로서, STRO-1^bri 세포는 STRO-1^dim 또는 STRO-1^intermediate 세포보다 우선하여 농축된다.

예를 들어, STRO-1^bright 세포는 추가적으로 TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1^+, STRO-2⁺, STRO-4⁺(HSP-90β) 및/또는 CD146⁺의 하나 이상이다. 예를 들어, 세포는 상술된 마커의 하나 이상에서 선택되고/되거나, 하나 이상의 상술된 마커를 발현하는 것으로 입증되었다. 이와 관련하여, 마커를 발현하는 것으로 입증된 세포가 특별히 시험될 필요는 없으며, 오히려 사전 농축되거나 분리된 세포가 시험되고, 이어 사용될 수 있으며, 분리 또는 농축된 세포는 또한 마땅히 동일한 마커를 발현할 것으로 추정될 수 있다.

일례로, 간엽 전구 세포는 WO 2004/85630호에 정의된 바와 같은 혈관주위 간엽 전구체 세포이다. 예를 들어, 간엽 전구 세포는 혈관주위 세포의 마커를 발현하며, 예를 들면, 세포는 STRO-1⁺ 또는 STRO-1^bright 및/또는 3G5⁺이다. 일례로서, 세포는 혈관성 조직 또는 기관 또는 이의 일부로부터 분리된 것이거나 사전에 분리되었거나, 그로부터 분리된 세포의 전구체이다.

제공된 마커에 대해 "양성"인 것으로 언급된 세포는, 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 마커의 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 수준을 표현할 수 있으며, 여기서, 상기 용어들은 세포의 분류 방법에 사용된 다른 마커 또는 형광성의 강도에 관한 것이다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 분류되는 특수 세포 집단에 사용된 마커의 내용에서 이해될 것이다. 제공된 마커에 대해 "음성"으로 언급된 세포는 반드시 이러한 세포로부터 완전히 부재하지는 않는다. 당해 용어는, 마커가 이러한 세포에 의해 비교적 매우 낮은 수준에서 발현되며, 검출가능하게 표지되거나 또는 배경 수준, 예를 들면 이소형 대조 항체를 사용하여 검출된 수준을 초과하여 검출불가능하게 표지되는 경우 매우 낮은 신호를 생성함을 의미한다.

용어 "bright"는, 본원에서 사용되는 경우, 검출가능하게 표지된 경우 비교적 높은 신호를 생성하는 세포 표면상의 마커를 나타낸다. 이론에 한정되는 것을 원하지는 않지만, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 더 많은 표적 마커 단백질(예를 들면, STRO-1에 의해 인지된 항원)을 발현하는 것으로 제안된다. 예를 들어, STRO-1^bri 세포는 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석기에 의해 측정된 것으로서 FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지된 경우 비-bright 세포(STRO-1^dull/dim) 보다 더 큰 형광 신호를 생성한다. 일례로, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 환하게 표지된 골수 단핵 세포중 적어도 약 0.1%를 차지한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 환하게 표지된 골수 단핵 세포를 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 차지한다. 일례에서, STRO-1^bright 세포는 "배경", 즉 STRO-1^-인 세포에 비해 STRO-1 표면 발현의 2 log 크기의 보다 높은 발현을 갖는다. 비교시, STRO-1^dim 및/또는 STRO-1^intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현의 2 log 크기 미만의 보다 높은 발현, 통상적으로 "배경"보다 약 1 log 또는 미만을 갖는다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적인 알칼리성 포스파타제의 모든 이소형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 당해 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 일례에서, TNAP는 BAP이다. 일례에서, 본원에 사용된 것으로서 TNAP는 기탁에 관한 부다페스트 조약하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 수탁 번호 제PTA-7282호로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 말한다.

또한, 일례에서, STRO-1⁺ 세포는 클론원성 CFU-F를 생성할 수 있다.

일례로, 현저한 비율의 STRO-1⁺ 다능성 세포가 적어도 2개의 상이한 배아주로 분화될 수 있다. 다능성 세포가 기여할 수 있는 계통의 비-제한적 예는 골 전구체 세포; 담즙관 상피 세포 및 간세포에 대해 다능성인, 간세포 후대세포; 희소돌기아교세포 및 별아교세포로 진행되는 신경아교 세포 전구체를 생성할 수 있는 신경 제한된 세포; 신경으로 진행하는 신경 전구체; 심장 근육 및 심근세포, 당-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체를 포함한다. 다른 계통은 상아질모세포, 상아질-생산 세포 및 연골세포, 및 망막 색소 내피 세포, 섬유아세포, 각질세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포, 모낭 세포, 신관 내피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 전구 세포, 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수버팀질(marrow stroma), 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위세포, 혈관, 내피, 아교세포, 신경, 별아교세포 및 희소돌기아교세포의 전구 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 예에서, STRO-1⁺ 세포는 배양시 조혈 세포를 생성할 수 없다.

일례에서, 세포는 치료될 대상체로부터 취하여, 시험관내에서 표준 기술을 사용하여 배양하고 대상체에게 자가 또는 동종이계 조성물로서 투여하기 위한 상등액 또는 가용성 인자 또는 확장된 세포를 수득하기 위해 사용된다. 대안적인 예에서, 하나 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 사용된다. 본 발명의 또다른 유용한 예에서, 비-인간 동물(또는 환자가 인간이 아닌 경우, 다른 종으로부터)의 세포가 사용된다.

본 발명은 또한 시험관내 배양으로부터 생산된 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대 세포(이는 확장된 세포로 언급되고 있다)로부터 수득되거나 이로부터 유래한 가용성 인자 또는 상등액의 사용을 고려한다. 본 발명의 확장된 세포는 배양 조건(배양 배지에서의 자극성 인자의 수 및/또는 유형을 포함), 계대배양의 횟수 등에 따라 광범위한 표현형을 가질 수 있다. 특정 예에서, 후대 세포는 모체 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회의 계대배양 후 수득된다. 그러나, 후대 세포는 모체 집단으로부터 특정 수의 계대배양 후 수득될 수 있다.

후대 세포는 어떠한 적합한 배지에서도 배양하여 수득할 수 있다. 세포 배양에 대한 참조로 사용된 것으로서, 용어 "배지"는 세포 주변 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스, 또는 상(phase)과 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 세포 성장을 지속하지 않는 액체 배지 뿐만 아니라 액체 성장 배지도 포함한다. 배지는 또한 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스와 같은 젤라틴성 배지를 포함한다. 예시적인 가스성 배지는 페트리 접시 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체상에서 성장하는 세포가 노출되는 가스 상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한, 심지어 세포와 접촉되어 있지 않는 경우에서 조차 세포 배양에 사용하기 위해 의도된 물질을 말한다. 다시 말해서, 세균 배양을 위해 제조된 영양소가 농축된 액체가 배지이다. 물 또는 기타 액체와 혼합하는 경우 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물은 "분말화된 배지"로 언급할 수 있다.

일례에서, 본 발명의 방법에 유용한 후대 세포는 STRO-3 항체로 표지한 자기 비드를 사용하여 골수로부터 TNAP⁺ STRO-1⁺ 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 배양 확장함으로써 수득된다(참조: 적합한 배양 조건의 예에 관한 Gronthos et al.. Blood 85: 929-940, 1995).

일례에서, 이러한 확장된 세포(후대)(예를 들면, 적어도 5회 계대배양 후)는 TNAP^-, CC9⁺, HLA class I⁺, HLA class II^-, CD14^-, CD19^-, CD3^-, CD11a^-c^-, CD31^-, CD86^-, CD34^- 및/또는 CD80^-일 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 것과 상이한 배양 조건하에서, 상이한 마커의 표현이 변할 수 있는 것이 가능하다. 또한, 이들 표현형의 세포가 확장된 세포 집단에서 우세할 수 있다고 해도, 소수의 세포 집단이 당해 표현형(들)을 갖지 않음을 의미하지는 않는다(예를 들면, 확장된 세포중 소 비율은 CC9^-일 수 있다). 일례에서, 확장된 세포는 여전히 상이한 세포형으로 분화되는 능력을 가진다.

일례에서, 상등액 또는 가용성 인자, 또는 세포 자체를 수득하기 위해 사용된 확장된 세포 집단은, 세포 중 적어도 25%, 예를 들면 적어도 50%가 CC9⁺인 세포를 포함한다.

다른 예에서, 상등액 또는 가용성 인자, 또는 세포 자체를 수득하기 위해 사용된 확장된 세포 집단은, 세포 중 적어도 40%, 예를 들어 적어도 45%가 STRO-1⁺인 세포를 포함한다.

추가의 예에서, 확장된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R(STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-4(HSP-90β), STRO-1^bright 및 CD146로 구성된 군중에서 개별적으로 또는 총체적으로 선택된 하나 이상의 마커 또는 이들 마커의 특정 조합을 발현할 수 있다.

일례에서, 후대 세포는 WO 2006/032092호에 정의되고/되거나 기술된 다능성 확장된 STRO-1⁺ 다능성 세포 후대(MEMP)이다. 후대 세포의 유래일 수 있는 STRO-1⁺ 다능성 세포가 농축된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268호 및 WO 2004/085630호에 기술되어 있다. 시험관내에서 STRO-1⁺ 다능성 세포는 절대적으로 순수한 제제로서 거의 존재하지 않을 것이며 일반적으로 조직 특이적인 위임 세포(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268호는 골수로부터 이러한 세포를 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준으로 수확하는 것을 언급한다. 후대의 유래인 MPC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접 수확할 수 있거나, 이와는 달리 이미 생체외에서 확장된 집단일 수 있다.

예를 들면, 후대는 STRO-1⁺ 다능성 세포가, 존재하는 집단의 총 세포중 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 실질적으로 정제된 STRO-1⁺ 다능성 세포의 수확된 비확장 집단으로부터 수득될 수 있다. 당해 수준은, 예를 들면, TNAP, STRO-4(HSP-90β), STRO-1^bright, 3G5⁺, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 구성된 군으로부터 개별적으로 또는 총체적으로 선택된 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선택함으로써 달성할 수 있다.

MEMPS는, 이들이 마커 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대해 음성이고 마커 STRO-1^bri에 대해 양성이라는 점에서 새로이 수확된 STRO-1⁺ 다능성 세포와는 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로이 분리된 STRO-1⁺ 다능성 세포는 STRO-1^bri 및 ALP 둘다에 대해 양성이다. 본 발명의 일례에서, 투여된 세포중 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 표현형 STRO-1^bri, ALP^-을 가진다. 추가의 예에서, MEMPS는 하나 이상의 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1에 대해 양성이다. 또다른 예에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않고/않거나 마커 CD18에 대해 음성이다.

STRO-1⁺ 세포 출발 집단은 WO 01/04268호 또는 WO 2004/085630호에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 유형, 즉, 골수, 치아속질 세포, 지방 조직 및 피부로부터, 또는 아마도 보다 더 광범위하게는 지방 조직, 치아, 치아속질, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 전립샘, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래할 수 있다.

본 발명에 기술된 방법을 수행하는데 있어서, 임의의 주어진 세포 표면 마커를 수반하는 세포의 분리는 다수의 상이한 방법으로 수행할 수 있으나, 일부 예시적인 방법은 높은 수준 결합 또는, 낮은 수준 결합 또는 비결합으로서, 결합을 나타내는 것들의 분리가 이어지는 관련 마커에 대한 결합제(예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합에 의존함이 이해될 것이다. 가장 편리한 결합제는 예를 들면 항체 또는 항체-기반 물질, 예를 들면 단일클론 항체이거나 또는 단일클론 항체에 기반한 것(예를 들면, 그의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질)인데, 이는 상기 후자 제제의 특이성 때문이다. 항체는 양 단계에 대해 사용될 수 있으나, 다른 제제도 사용할 수 있으므로, 이들 마커에 대한 리간드를 사용하여 이들을 수반하거나, 이들이 결여된 세포를 농축시킬 수도 있다.

항체 또는 리간드는 조 분리(crude separation)를 위해 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 일부 예에서, 분리 기술은 수집될 분획의 생존력 보유를 최대화한다. 효능이 상이한 각종 기술을 사용하여 상대적인 조 분리물을 수득할 수 있다. 사용된 특수 기술은 분리 효능, 관련된 세포독성, 수행의 용이성 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 기교에 대한 필요성에 좌우될 것이다. 분리 과정은 항체-피복된 자기 비드를 사용하는 자기 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고체 매트릭스에 부착된 항체와의 "패닝(panning)"을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 정밀한 분리를 제공하는 기술은 FACS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. FACS를 수행하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이다.

본원에 기술된 각각의 마커에 대한 항체는 상업적으로 시판되거나[예를 들면, STRO-1에 대한 단일클론 항체는 미국의 알 앤드 디 시스템스(R&D Systems, USA)로부터 시판된다], ATCC 또는 다른 기탁 기관으로부터 이용가능하고/하거나 당해 분야에 인지된 기술을 사용하여 생산할 수 있다.

일례로, STRO-1⁺ 세포를 분리하는 방법은, STRO-1의 고 수준 발현을 인지하는 자기 활성화된 세포 분류(MACS)를 이용하는 고체 상 분류 단계인 제 1 단계를 포함한다. 이후에, 제2 분류 단계를 수행하여 WO 01/14268호에 기술된 바와 같은 보다 높은 수준의 전구체 세포 확장을 수득할 수 있다. 당해 제2 분류 단계는 2개 이상의 마커의 사용을 포함할 수 있다.

STRO-1⁺ 세포를 수득하는 방법은 또한 공지된 기술을 사용하는 제1의 농축 단계(enrichment step) 전에 세포의 공급원을 수확하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 조직은 외과적으로 제거될 것이다. 이후에, 공급원 조직을 포함하는 세포가 소위 단일 세포 현탁액으로 분리될 것이다. 당해 분리는 물리적 및/또는 효소적 수단으로 달성할 수 있다.

일단 적합한 STRO-1⁺ 세포 집단이 수득되면, 이를 임의의 적합한 수단으로 배양하거나 확장시켜 MEMP를 수득할 수 있다.

일례에서, 세포를 치료할 대상체로부터 입수하여, 시험관내에서 표준 기술을 사용하여 배양하고 이를 사용하여 대상체에게 자가 또는 동종이계 조성물로서 투여하기 위한 상등액 또는 가용성 인자 또는 확장된 인자를 수득한다. 대안적인 예에서, 하나 이상의 확립된 인간 세포주의 세포를 사용하여 상등액 또는 가용성 인자를 수득한다. 본 발명의 또다른 유용한 예에서, 비-인간 동물(또는 환자가 인간이 아닌 경우, 또다른 종으로부터)의 세포를 사용하여 상등액 또는 가용성 인자를 수득한다.

본 발명은 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개과, 고양이과, 토끼목, 설치류, 조류, 및 어류 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터의 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명이 수행될 수 있는 영장류 세포는 침팬지, 개코원숭이, 사이노몰거스 원숭이, 및 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행될 수 있는 유제류 세포는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버펄로(buffalo) 및 들소의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행될 수 있는 설치류 세포는 마우스, 랫트, 기니아 피그, 햄스터 및 저빌(gerbil) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행될 수 있는 토끼목 종의 예는 집토끼, 산토끼, 토끼, 솜꼬리토끼, 스노우슈 토끼(snowshoe rabbit), 및 새앙토끼(pika)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 닭[갈루스 갈루스(Gallus gallus)]은 본 발명이 수행될 수 있는 조류 종의 일례이다.

일례로, 세포는 인간 세포이다.

본 발명의 방법에 유용한 세포는 사용 전에, 또는 상등액 또는 가용성 인자를 수득하기 전에 저장될 수 있다. 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포를 보존하고 저장하는 방법 및 프로토콜은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.]. 간엽 줄기/전구 세포, 또는 이의 후대 세포와 같은 분리된 줄기 세포의 생물학적 활성을 유지하는 어떤 방법도 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 일례에서, 세포는 냉동-보존(cryo-preservation)을 사용함으로써 유지하고 보존된다.

유전적으로 변형된 세포

일례에서, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포는 예를 들면, 해당 단백질을 발현하고/하거나 분비하도록 유전적으로 변형된다. 예를 들어, 세포는 대사성 골질환 또는 남성 불임의 치료에 유용한 단백질을 발현하도록 조작된다.

세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 세포내에서 발현될 핵산은 세포내에서 발현을 유도하기 위해 프로모터에 작동적으로-연결된다. 예를 들면, 핵산은 대상체의 각종 세포에서 작동가능한 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터(예를 들면, CMV-1E 프로모터) 또는 SV-40 프로모터에 연결된다. 추가의 적합한 프로모터는 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명의 본 예에 준용하여 적용될 것이다.

일례로, 핵산은 발현 작제물의 형태로 제공된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "발현 작제물"은, 세포내에서, 이것이 작동적으로 연결된 핵산 상에 발현을 부여하는 능력을 가진 핵산(예를 들면, 리포터 유전자 및/또는 역-선택가능한 리포터 유전자)를 말한다. 본 발명의 문맥에서, 발현 작제물은 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 소-게놈성(sub-genomic) 또는 게놈성 단편, 또는 발현가능한 포맷으로 이종 DNA를 유지하고/하거나 복제할 수 있는 다른 핵산을 포함할 수 있거나, 이들일 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명을 수행하기에 적합한 발현 작제물의 작제 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이며, 예를 들면, 문헌[참조: Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)] 또는 문헌[참조: Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001]에 기술되어 있다. 예를 들면, 발현 작제물의 각각의 성분들은 예를 들면, PCR을 사용하여 적합한 주형 핵산(template nucleic acid)으로부터 증폭되고, 후속적으로 예를 들면, 플라스미드 또는 파지미드와 같은 적합한 발현 작제물로 클로닝된다.

이러한 발현 작제물에 적합한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는 예를 들면, 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 공급되는 pcDNA 벡터 세트(suite)의 벡터, pCI 벡터 세트[프로메가(Promega) 제품]의 벡터, pCMV 벡터 세트의 벡터[클론테크(Clontech) 제품], pM 벡터(클론테크 제품), pSI 벡터(프로메가 제품), VP 16 벡터(클론테크 제품) 또는 pcDNA 벡터 세트의 벡터(인비트로겐 제품)이다.

당해 분야의 숙련가들은 추가의 벡터 및 예를 들면, 라이프 테크롤로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation), 클론테크 또는 프로메가와 같은 이러한 벡터의 공급처를 잘 알 것이다.

분리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 작제물을 발현을 위해 세포내로 도입하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 제공된 유기체에 사용된 기술은 공지된 성공적인 기술에 의존한다. 재조합 DNA를 세포내로 도입하는 수단은 미세주사, DEAE-덱스트란에 의해 매개된 형질감염, 리포펙타민(미국 메릴랜드에 소재하는 기브코(Gibco) 제품) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(미국 메릴랜드에 소재하는 기브코 제품)을 사용함에 의한 것과 같은 리포좀에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개 DNA 흡수, 전기영동 및, 다른 것들 중에서도 DNA-피복된 텅스텐 또는 금 입자(미국 위스콘신에 소재하는 아그라세투스 인코포레이티드((Agracetus Inc.) 제품)를 사용하는 것과 같은 미세입자 충격을 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 발현 작제물은 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 당해 분야에 공지되었으며 시판되고 있다. 핵산의 전달 및 이러한 핵산의 숙주 세포 게놈내로의 통합을 위한 통상의 바이러스-계 시스템은 예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함한다. 대안적으로, 아데노바이러스 벡터가 에피솜에 남아있는 핵산을 숙주 세포내로 도입시키는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직내 유전자 전달의 효율적이고 다목적인 방법이다. 또한, 고 형질도입 효능이 많은 상이한 세포형 및 표적 조직에서 관측되어져 왔다.

예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 외부 서열의 6 내지 10kb까지 에 대해 포장 능력을 지닌 시스-작용성의 긴 말단 반복단위(LTR)를 포함한다. 최소 시스-작용성 LTR은 발현 작제물을 표적 세포내로 통합하여 장기간 발현을 제공하는데 사용되는 벡터의 복제 및 포장에 충분하다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이의 조합을 기초로 한 것들을 포함한다[참조: 예를 들면, Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman Biotechnology 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993].

각종 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 또한 핵산 전달용으로 개발되어 왔다. AAV 벡터는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 작제할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국특허 제5,173,414호 및 제5,139,941호; 국제 공보 제WO 92/01070호 및 제WO 93/03769호; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; 및 Zhou et al. J Exp. Med. 179:1867-1875, 1994].

본 발명의 발현 작제물을 전달하는데 유용한 추가의 바이러스 벡터는, 예를 들면, 백시니아(vaccinia) 바이러스 및 아비안 폭스바이러스 또는 알파바이러스 또는 접합 바이러스 벡터와 같은, 폭스(pox) 바이러스 계열로부터 유래한 것[예를 들면, 문헌(Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989)에 기술된 것]을 포함한다.

세포 및 가용성 인자의 치료학적/예방학적 잠재능의 검정

낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하거나, 또는 그의 개시 또는 진행을 예방 또는 지연시키기 위한 세포 또는 가용성 인자의 능력을 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.

예를 들어, 세포 또는 가용성 인자는 조골세포 기능의 향상 능력에 대해 평가된다.

일례로, (예를 들면, Cbfe1/RunX2를 발현하는) 골전구 세포를 세포 및/또는 가용성 인자와 접촉시키고, 조골세포로의 이의 분화능에 대해 시험한다. 예를 들어, 세포를 오스테릭스 및/또는 Col1 및/또는 BSP 및/또는 M-CSF 및/또는 알칼리성 포스파타제의 발현 발생에 대해 평가한다.

일례에서, 세포 및/또는 가용성 인자를 조골세포와 접촉시키고, 예를 들면, 면역학적 검정 및/또는 면역조직 화학법 또는 면역형광법을 사용하여 1형 콜라겐 및/또는 오스테오칼신의 생성에 대한 이의 효과를 평가한다.

추가 예에서, 세포 및/또는 가용성 인자를 세포외 기질 상에서 배양된 조골세포와 접촉시키고, 예를 들면, 알지아린 레드(Alziarin Red)로 염색하거나 또는 폰 코사 염색(von Kossa stain)에 의해 기질의 광물화 증가를 평가한다.

세포 및/또는 가용성 인자는 또한, 예를 들면, [Zaheer et al., Nat. Biotechnol., 19: 1148-1154, 2001]에 기술된 바와 같이 근적외선 형광 이미징과 같은 검정을 이용하여 생체 내에서 조골세포 활성에 대한 이의 효과에 대해 평가될 수 있다.

세포 및/또는 가용성 인자는 또한 예를 들면, x-선 및/또는 이중 에너지 X-선 흡수계측법(DEXA)을 이용하여 생체 내에서 뼈형성에 대한 이의 효과에 대해 평가될 수 있다.

예를 들어, 세포 또는 가용성 인자, 예를 들면, 인자의 혼합물 또는 단일 인자 또는 인자 분획(예를 들면, 친화성 정제 또는 크로마토그래피에 의해 유도)을 대사성 골질환 모델에 투여하고, 하나 이상의 증상에 대한 효과를 평가한다. 예시적인 비인간 동물 모델은 난소 적출된 설치류(예를 들면, 랫트), 고정-유도된 골손실 모델 및/또는 모델을 포함하며, 이는 [Turner European Cell and Materials, 1: 66-91, 2001]에 기술되어 있다.

전술한 내용으로부터 당해 분야의 숙련가에게는, 본 발명이 또한:

(i) 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 앓고 있는 피검자에게 세포 또는 가용성 인자를 투여하고 피검자의 질환 증상을 평가하는 단계; 및

(ii) 단계 (i)의 피검자의 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환 증상을 세포 또는 가용성 인자가 투여되지 않은 상기 질환을 앓고 있는 대조군 피검자의 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환 증상과 비교하는 단계를 포함하며,

여기서, 대조군 피검자와 비교하여 피검자내 증상 개선은, 세포 또는 가용성 인자가 상기 질환을 치료함을 나타내는, 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료, 예방 또는 지연하기 위한 세포 또는 가용성 인자를 확인하거나 분리하는 방법을 제공하는 것이 분명해질 것이다.

세포는 임의 예에 따라 본원에 기술된 임의 세포일 수 있다.

세포 조성물

본 발명의 일례에서, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 일례로, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.

용어 "담체" 및 "부형제"는 활성 화합물의 저장, 투여, 및/또는 생물학적 활성을 촉진시키기 위해 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 물질의 조성물을 말한다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)]. 담체는 또한 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용도 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는 예를 들어, 안정하며, 예를 들면, 담체중 다른 성분들과 반응할 수 없다. 일례에서, 담체는 치료를 위해 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 상당한 국소적 또는 전신적 부작용을 발생하지 않는다.

본 발명에 적합한 담체는 통상적으로 사용되는 것들을 포함하며, 예를 들면, 특히(등장성인 경우) 용액에서는 물, 염수, 수성 덱스트로스, 락토스, 링거액(Ringer's solution), 완충 용액, 하이알루로난 및 글리콜이 예시적인 액체 담체이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 전분, 셀룰로스, 당, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.

또다른 예에서, 담체는 예를 들면, 세포가 성장하거나 현탁되는 매질 조성물이다. 예를 들어, 이러한 매질 조성물은, 이것이 투여되는 대상체에서 어떠한 부작용도 유발하지 않는다.

예시적인 담체 및 부형제는 대사 증후군 및/또는 비만을 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키는 세포의 능력 및/또는 세포의 생존력에 부정적으로 영향을 미치지 않는다.

일례에서, 담체 또는 부형제는 세포 및/또는 가용성 인자를 적합한 pH에서 유지시킴으로써 생물학적 활성을 발휘하기 위한 완충 활성을 제공하며, 예를 들면, 담체 또는 부형제는 인산염 완충 염수(PBS)이다. PBS는 세포 및 인자들과 최소한으로 상호작용하며 세포 및 인자의 신속한 방출을 허용하기 때문에 매력적인 담체 또는 부형제이며, 이 경우, 본 발명의 조성물은 혈류로 또는 조직내로 또는, 조직 주변 또는 그의 근접한 영역으로, 예를 들면, 주사에 의해 직접 적용하기 위한 액체로서 제공될 수 있다.

줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포는 또한 수용체-상용성이고 수용체에 해롭지 않은 산물로 분해되는 스캐폴드(scaffold) 내에 혼입되거나 포매(embed)될 수 있다. 상기 스캐폴드는 수용체 대상체내로 이식될 세포에 대한 지지 및 보호를 제공한다. 천연 및/또는 합성의 생분해성 스캐폴드가 이러한 스캐폴드의 예이다.

각종의 상이한 스캐폴드가 본 발명의 실시에 성공적으로 사용될 수 있다. 예시적인 스캐폴드는 생물학적 분해성 스캐폴드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연의 생분해성 스캐폴드는 콜라겐, 피브로넥틴, 및 라미닌 스캐폴드를 포함한다. 세포 이식 스캐폴드용으로 적합한 합성 물질은 집중적인 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 이러한 스캐폴드는 또한 재흡수성일 수 있다. 적합한 스캐폴드는 예를 들면, 문헌(Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991)에 기술된 바와 같은 폴리글리콜산 스캐폴드; 또는 다가무수물, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 합성 중합체를 포함한다.

또다른 예에서, 세포는 겔 스캐폴드[예컨대 업존 컴퍼니(Upjohn Company)로부터의 겔 발포체]로 투여될 수 있다.

본원에 기술된 방법에 유용한 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와의 혼합물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 세포는 다른 다능성 또는 다분화성 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상이한 유형의 세포는 투여 즉시 또는 투여 직전에 본 발명의 조성물과 함께 혼합하거나, 또는 투여 전 일정 시기 동안 함께 공동-배양될 수 있다.

일례에서, 조성물은 유효량 또는 치료학적 또는 예방학적으로 유효한 양의 세포를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 약 1x10⁵ 줄기 세포(예컨대 STRO-1⁺ 세포)/kg 내지 약 1x10⁷ 줄기 세포(예컨대 STRO-1⁺ 세포)/kg 또는 약 1x10⁶ 줄기 세포(예컨대 STRO-1⁺ 세포)/kg 내지 약 5x10⁶ 줄기 세포(예컨대 STRO-1⁺ 세포)/kg을 포함한다. 투여될 세포의 정확한 양은 환자의 연령, 체중, 및 성별, 및 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환의 정도 및 중증도를 포함하는 각종 인자에 의존한다.

일례로, 저용량의 세포가 대상체에 투여된다. 예시적인 용량은 약 0.1 x 10⁴ 내지 0.5 x 10⁶ 세포/kg, 예를 들어, 약 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ 세포/kg, 예컨대, 약 0.5 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ 세포/kg, 예를 들어, 약 0.1 x 10⁶ 내지 0.5 x 10⁶ 세포/kg, 예를 들면, 약 0.2 x 10⁶ 또는 0.3 x 10⁶ 또는 0.4 x 10⁶ 세포/kg을 포함한다.

일부 예에서, 세포를 대상체의 순환내로 배출되지 않도록 하지만, 세포에 의해 분비된 인자가 순환으로 유입되도록 허용하는 챔버내에 함유된다. 이러한 방식으로 가용성 인자들은 세포가 대상체의 순환내로 인자들을 분비하도록 함으로써 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 챔버는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 대상체 부위에 동등하게 이식될 수 있으며, 예를 들면, 췌장 내 또는 그 근처에 이식될 수 있다.

본 발명의 일부 예에서, 세포 조성물을 사용한 치료법의 개시 전에 환자를 면역억제하는 것이 필요하지 않거나 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 동종이계, 또는 심지어 이종발생성 줄기 세포 또는 이의 후대를 사용한 이식이 일부 예에서 허용될 수 있다.

그러나, 다른 경우, 세포 치료법을 개시하기 전에 환자를 약리학적으로 면역억제하고/하거나 세포 조성물에 대한 대상체의 면역반응을 감소시키는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신 또는 국소 면역억제제의 사용을 통해 달성하거나, 봉입된 장치중의 세포를 전달하여 달성할 수 있다. 세포는, 세포가 여전히 불투과성이어서 체액성 인자 및 세포를 면역화하는 치료 인자 및 세포에 의해 요구되는 영양소 및 산소에 대해 투과성인 캡슐에 봉입시킬 수 있다. 일례에서, 캡슐화제(encapsulant)는 저알레르기성이며, 표적 조직내에서 용이하고 안정하게 위치하고, 이식된 구조에 부가된 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위한 이들 및 다른 수단은 당해 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 세포는 유전적으로 변형되어 이들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

가용성 인자의 조성물

본 발명의 일례에서, 줄기 세포-유래이고/이거나 후대 세포-유래인 상등액 또는 가용성 인자는 예를 들면, 적합한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 일례로, 담체 또는 부형제는 가용성 인자 또는 상등액의 생물학적 효과에 부정적으로 영향을 미치지 않는다.

일례에서, 조성물은 가용성 인자 또는 상등액의 성분, 예를 들면, 프로테아제 억제제를 안정화시키기 위한 물질의 조성물을 포함한다. 일례로, 프로테아제 억제제는 대상체에서 부정적인 영향을 나타내기에 충분한 양으로 포함되지 않는다.

줄기 세포-유래이고/이거나 후대 세포-유래인 상등액 또는 가용성 인자를 포함하는 조성물은 예를 들면, 배양 배지에서 또는 안정한 담체 또는 완충액 용액 예를 들면, 인산염 완충 염수에서 적절한 액체 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 담체는 위에서 기술한 바와 같다. 또다른 예에서, 줄기 세포-유래이고/이거나 후대 세포-유래인 상등액 또는 가용성 인자를 포함하는 현탁액은 주사용 유성 현탁액이다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 참깨 오일과 같은 지방 오일; 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르; 또는 리포좀을 포함한다. 주사용으로 사용될 현탁액은 또한 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 용해성을 증가시켜 고 농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 경우에 따라, 위에서 기술한 성분들 중 하나 또는 이의 조합물과 함께 필요량의 상등액 또는 가용성 인자를 적절한 용매에 도입한 후, 멸균 여과함으로써 제조할 수 있다.

일반적으로, 분산액은 상등액 또는 가용성 인자를 기본 분산 배지 및 위에 열거한 것중에서 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클로 도입하여 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법은 이의 사전 멸균-여과시킨 용액으로부터 임의의 추가의 바람직한 성분과 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결-건조이다. 본 발명의 대안적 측면에 따라서, 상등액 또는 가용성 인자는 그의 용해성을 향상시키는 하나 이상의 추가의 화합물과 함께 제형화될 수 있다.

다른 예시적인 담체 또는 부형제는 예를 들면, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) 약제학적 Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y]에 기술되어 있다.

치료학적 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 한다. 조성물은 액제, 미세유제, 리포좀 또는 다른 주문된 구조물로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물을 사용하고, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 표면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 일부 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 만니톨, 또는 소르비톨과 같은 다가알코올, 또는 염화나트륨이 조성물에 포함된다. 주사가능한 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이룰 수 있다. 또한, 가용성 인자는 지속 방출형 제형으로, 예를 들면, 서방성 중합체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 활성 화합물은 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리아세트산 및 폴리락트산, 폴리글리콜성 공중합체(PLG)와 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법들이 특허되었거나 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지되어 있다.

상등액 또는 가용성 인자는 예를 들면, 가용성 인자의 서방성을 제공하기에 적절한 매트릭스와 함께 투여될 수 있다.

조성물의 추가 성분

줄기 세포-유래의 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는 다른 유익한 약물 또는 생물학적 분자(성장 인자, 영양 인자)와 함께 투여될 수 있다. 다른 제제와 함께 투여되는 경우, 이들은 단일 약제학적 조성물로서 함께, 또는 별개의 약제학적 조성물로서, 동시에 또는 다른 제제와 연속적으로(다른 제제의 투여 전 또는 후에) 투여될 수 있다. 공동-투여될 수 있는 생체활성 인자는 항-세포사멸제[예를 들면, EPO, EPO 미메티보디(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 억제제]; 소염제(예를 들면, p38 MAPK 억제제, TGF-베타 억제제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 억제제, 페미로라스트(PEMIROLAST), 트라니라스트(TRANILAST), 레미케이드(REMICADE), 시롤리무스(SIROLIMUS), 및 NSAID(비-스테로이드성 소염 약물; 예를 들면, 테폭살린(TEPOXALIN), 톨메틴(TOLMETIN), 수프로펜(SUPROFEN)); 면역억제제/면역조절제(예를 들면, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린 억제제; mTOR 억제제(예를 들면, 시롤리무스, 에버롤리무스); 항-증식제(예를 들면, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 코르티코스테로이드(예를 들면, 프레드니솔론, 하이드로코르티손); 단일클론 항-IL-2R알파 수용체 항체(예를 들면, 바실릭시마브, 다클리주마브), 다클론 항-T-세포 항체(예를 들면, 항-전립샘 글로불린(ATG); 항-림프구 글로불린(ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)]와 같은 항체; 항-혈전형성제(예를 들면, 헤파린, 헤파린 유도체, 우로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 수용체 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 수용체 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제, 및 혈소판 억제제); 및 항-산화제(예를 들면, 프로부콜, 비타민 A, 아스코르브산, 토코페롤, 조효소 Q-10, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 및 또한 국소 마취제를 포함한다.

일례에서, 임의 예에 따라 본원에 기술된 조성물은 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 추가적인 인자를 포함한다.

대안적으로, 또는 추가로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 세포, 분비 인자 및/또는 조성물은 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환의 알려진 치료와 병용된다.

일례로, 임의 예에 따라 본원에 기술된 약제학적 조성물은 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하기 위해 사용되는 화합물을 포함한다. 대안적으로, 임의 예에 따른 본원에 기술된 치료/예방 방법은 추가로 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하기 위해 사용되는 화합물의 투여를 포함한다. 예시적인 화합물은 본원에 기술된 바와 같고, 본 발명의 이들 예에 필요한 부분만 수정하여 적용되어야 한다.

또다른 예에서, 임의 예에 따라 본원에 기술된 조성물은 혈관 세포내로 후대 세포의 분화를 유도하거나 향상시키는 인자를 추가로 포함한다. 예시적인 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF; 예를 들면, PDGF-BB), 및 FGF를 포함한다.

또다른 예에서, 임의 예에 따라 본원에 기술된 조성물은 조직 특이적인 위임 세포(TSCC)를 추가로 포함한다. 이와 관련하여, 국제특허공보 제PCT/AU2005/001445호에서는 TSCC 및 STRO-1⁺ 세포의 투여가 TSCC의 증식을 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 일례에서, TSCC는 혈관 세포이다. 이러한 조성물을 대상체에게 투여하면, 예를 들면, 혈관구조의 생성을 증가시켜, 예를 들면, 감염된 조직으로 전달되는 영양소의 증가에 이르게 할 수 있다.

의료 장치

본 발명은 또한 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 것이거나 또는 그의 사용시의 의료 장치를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 임의 예에 따라 본원에 기술된 바와 같은 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자 및/또는 조성물을 포함하는 주사기 또는 카테터 또는 다른 적합한 전달 장치를 제공한다. 임의로, 주사기 또는 카테터는 임의 예에 따라 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 설명서와 함께 포장된다.

또다른 예에서, 본 발명은 임의 예에 따라 본원에 기술된 바와 같은 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자 및/또는 조성물을 포함하는 이식물(implant)을 제공한다. 임의로, 이식물은 임의 예에 따라 본원에 기술된 바와 같은 방법에 사용하기 위한 설명서와 함께 포장된다. 적합한 이식물은, 예를 들면, 상기의 본원에 기술된 바와 같은 스캐폴드 및 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자와 함께 형성될 수 있다.

투여 방식

일례로, 줄기 세포-유래 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는 대상체의 혈류에 전달된다. 예를 들어, 줄기 세포-유래 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는 비경구적으로 전달된다. 비경구 투여의 예시적인 경로로는 복강내, 심실내, 뇌실내, 척추강내 또는 정맥내를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일례로서, 줄기 세포-유래 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는 동맥내에 의해 대동맥, 심장의 심방 또는 심실에, 또는 혈관에, 예를 들면, 정맥내로 전달된다.

세포를 심장의 심방 또는 심실에 전달하는 경우, 세포가 폐로 급속 전달됨으로써 생길 수 있는 장애를 피하기 위해 세포는 좌심방 또는 심실에 투여될 수 있다.

일례로, 줄기 세포-유래 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는 정맥내로 전달된다.

일례로, 줄기 세포-유래 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대는, 예를 들면, 주사기를 사용하거나 또는 카테터 또는 중심선을 통해 전달 부위로 주사된다.

치료학적 제형을 위한 투여법의 선택은 실체의 혈청 또는 조직 전환률, 증상의 정도, 및 실체의 면역원성을 포함하는 여러 인자에 좌우된다. 일례로, 투여법은 허용가능한 부작용 수준에 따라서 환자에게 전달되는 치료학적 화합물의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 제형의 양은 부분적으로는 특정 실체 및 치료되는 상태의 중증도에 의존한다.

일례에서, 줄기 세포-유래의 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대 세포는 단회 볼러스 용량으로 전달된다. 대안적으로, 줄기 세포-유래의 상등액 또는 가용성 인자, 줄기 세포 또는 이의 후대 세포는 연속 주입에 의해, 또는 예를 들면, 1일, 1주, 또는 주당 1 내지 7회 간격의 용량으로 투여된다. 예시적인 용량 프로토콜은 상당한 원치 않는 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투여 횟수를 포함하는 것이다. 총 주당 용량은 사용되는 화합물/세포의 유형 및 활성에 따라 달라진다. 적절한 용량은 예를 들면, 치료에 영향을 주거나, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 당해 분야에서 공지되거나 예상되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의가 결정한다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량 보다 다소 적은 양으로 시작되고, 이 후 임의의 부정적인 부작용에 대해 바람직하거나 최적의 효과가 달성될 때까지 소량 증분으로 증가된다.

본 발명자들은 줄기 세포 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자에 의해 제공되는 치료학적 유용성이 대상체에서 적어도 4주 동안 관찰됨을 입증하였다. 따라서, 일부 예에서 세포는 주 1회, 2주 1회, 3주 1회 또는 4주 1회로 투여된다.

낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하거나, 그의 진행을 지연시키는 것에 관한 본 발명의 예에 따라, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자는 예를 들면, 당해 분야에 공지되고/되거나 본원에 기술된 표준 방법을 사용하여, 질환의 진단 후 투여된다.

낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 치료하거나, 그의 진행을 지연시키는 것과 관련된 예에서, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자는 질환의 임상 진단 전에 투여될 수 있다.

본 발명은 다음 비-제한적인 실시예를 포함한다.

실시예

실시예 1: STRO-3 ⁺ 세포 선별에 의한 MPC의 면역학적 선택

골수(BM)는 건강한 정상 성인 지원자(20-35세)에게서 채취되었다. 간단히 설명하자면, 40 ml의 BM이 후장골능(posterior iliac crest)으로부터 리튬-헤파린 항혈액응고제-함유관으로 흡입되었다.

BMMNC는 문헌(Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628)에 기술된 바와 같이, Lymphoprep^TM(노르웨이 오슬로에 소재하는 나이코메드 파마(Nycomed Pharma) 제품)을 사용하여 밀도 구배 분리로 제조되었다. 4 ℃에서 400 x g으로 30분 동안 원심분리한 후, 연층(buffy layer)을 전용 피펫으로 제거하고, 5% 우태아혈청(FCS, 호주 빅토리아에 소재하는 씨에스엘 리미티드(CSL Limited) 제품)을 함유하는 행크(Hank) 평형 염 용액(HBSS; 미들랜드 게이더스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 제품)으로 이루어진 "HHF"로 3회 세척하였다.

이어, STRO-3⁺(또는 TNAP⁺) 세포를 기존에 기술된 바와 같이(Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940), 자기 활성화 세포 분류에 의해 분리하였다. 간단히 설명하자면, 약 1-3 x 10⁸ BMMNC를 얼음 위에 HHF 중의 10% (v/v) 정상 토끼 혈청으로 이루어진 블록킹 완충액에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 블록킹 완충액중에 STRO-3 mAb의 10 ㎍/ml 용액 200 ㎕와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 HHF에서 400 x g으로의 원심분리로 2회 세척하였다. HHF 완충액중 염소 항-마우스 γ-비오틴(영국 버밍햄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠(Southern Biotechnology Associates) 제품)의 1/50 희석액을 첨가하고, 세포 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 상술된 바와 같이 MACS 완충액(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 소듐 아지드가 보충된 Ca²⁺ - 및 Mn²⁺ -가 없는 PBS)으로 2회 세척하고, 0.9 ml MACS 완충액의 최종 부피에 재현탁시켰다.

100 ㎕ 스트렙타비딘 마이크로비드(독일 버기쉬 글라드바흐에 소재하는 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 제품)를 세포 현탁액에 첨가하고, 얼음 위에서 15분 동안 배양하였다. 세포 현탁액을 2회 세척하고, 0.5 ml의 MACS 완충액에 재현탁한 뒤, 미니 MACS 컬럼(MS Columns, 밀테니이 바이오텍)에 로딩하고, 0.5 ml MACS 완충액으로 3회 세척하여 STRO-3 mAb(2005년 12월 19일 ATCC에 수탁 번호 PTA-7282로 기탁됨 - 국제출원공개 제WO 2006/108229호 참조)에 결합되지 않은 세포를 회수하였다. 추가의 1 ml MACS 완충액을 첨가한 후, 컬럼을 자석에서 제거하고, TNAP⁺ 세포를 정압하에 분리하였다. 각 분획으로부터의 세포 분취액을 스트렙타비딘-FITC로 염색하고, 유세포 분석법으로 순도를 측정할 수 있다.

실시예 2: STRO-3 mAb에 의해 선별된 세포는 STRO-1 ^bright 세포이다

세포 STRO-1^bright 세포를 분리하기 위한 단일 시약으로서 STRO-3 mAb의 이용 가능성을 확인하기 위한 실험이 설계되었다.

STRO-3(IgG1)이 STRO-1(IgM)의 것과 상이한 이소형이라는 것을 고려하여, 클론원성 CFU-F를 확인하기 위한 STRO-3의 능력을 MACS 절차를 사용하여 분리된 STRO-1⁺ 세포와의 공동-발현에 기초해 2색 FACS 분석으로 평가하였다(도 1). 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터로 수집한 5 x 10⁴ 사건을 나타낸다. 수직 및 수평선은 동일한 조건하에 처리된 이소형-정합된 대조 항체, 1B5(IgG) 및 1A6.12(IgM)로 얻은 <1.0% 평균 형광의 반응 수준으로 설정되었다. 결과는 STRO-1^bright 세포의 소집단이 TNAP를 공동-발현(오른쪽 위 사분면)하는데 반해 나머지 STRO-1⁺ 세포들은 STRO-3 mAb와 반응하지 못했음을 입증한다. 네개 전체의 사분면으로부터 FACS에 의해 분리된 세포를 CFU-F의 발생에 대해 분석하였다(표 1).

[표 1]

세포 표면 마커 STRO-1 및 TNAP의 공동-발현에 기초하여 2색 FACS 분석에 의한 인간 골수 세포의 농축(도 1 참조). FACS 분류 세포를 20% FCS가 보충된 알파 MEM에서 표준 클론원성 조건하에 배양하였다. 데이터는 도말된 10⁵ 세포당 14일 콜로니-형성 세포(CFU-F)의 평균수±SE(n=3 상이한 골수 흡입물)를 나타낸다. 이들 데이터는 인간 MPC가 STRO-1 항원을 밝게 공동-발현하는 BM의 TNAP 양성 분획으로만 한정됨을 제시한다.

실시예 3: 사이노몰거스 원숭이 STRO-3 ⁺ MPC의 특성화

유인원의 골수 전구 세포(사이노몰거스 원숭이 유래; cyno-MPC)를 암컷 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)로부터 수집한 약 15 ml의 골수 흡입물로부터 분리하였다. 골수 흡입 현탁액을 피콜(Ficoll) 구배를 이용하여 분리한 뒤, 세척하여 비유핵 세포(적혈수 세포)를 제거하였다. CA12 항체(항-STRO-3) 및 다이날비드(Dynalbead) 부착으로 분리된 유핵 세포를 계수하였다. 항체 및 비드가 부착된 세포를 MPC-1 자석의 자기장에 의해 양성적으로 선택하였다. 양성 선택된 세포를 계수하고, T-플라스크중 성장 배지에서 계대(p.) 0으로 씨딩(seed)하였다. 예비-선택, 양성, 및 음성 세포를 콜로니 형성 분석(CFU-F)에 사용하였다.

cyno-MPC 세포에 성장 배지를 공급하였다. 목적하는 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 모든 배양물(p.0 - p.5)에 2 내지 4일 마다 공급하였다. 이어, 세포를 계대배양하거나, 또는 HBSS 세척 후, 콜라게나제, 이어 트립신/베르센을 사용하여 수확하였다. p.1 세포를 계수하고, T-플라스크에 시딩하였다. p.1 cyno-MPC가 목적하는 컨플루언스에 도달하면, 세포를 수확하고, 프로그램화된 냉동고(controlled rate freezer)를 사용하여 냉동보존하였다.

계대배양 1 냉동보존 cyno-MPC를 해동하고, T-플라스크에 시딩하였다(p.2). p.2 세포를 세포 공장에서 p.3으로 계대배양하였다. p.3 세포를 수확하고, 세포 공장에서 p.4로 계대배양하였다. 추가의 p.3 세포를 냉동보존하였다. p.4 세포를 6 x 세포 공장에서 p.5로 계대배양하였다. p.5 cyno-MPC가 목적하는 컨플루언스에 도달하면, 세포를 수확하고, 프로그램화된 냉동고를 사용하여 냉동보존하였다. 세포를 50% 알파MEM, 42.5% Profreeze 및 7.5% DMSO에서 냉동보존하였다. 샘플을 CFU-F 검정, FACS, 불임, 마이코플라즈마 및 엔도톡신에 대해 시험하였다.

배양한 cyno-MPC에 대한 면역표현형의 대표적인 유세포 분석법의 분석 결과를 도 2에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 이들 세포는 STRO-1⁺, STRO-4⁺ 및 CD146⁺이다.

p5의 Cyno MPC를 해동하고, 실시예 4에 기술된 바와 같이 당뇨 및 비당뇨 사이노몰거스 원숭이의 정맥내 주사에 사용하였다.

실시예 4: 비만 원숭이에서 혈액 오스테오칼신 수준에 대한 MPC의 전신 투여 효과

하기 기준에 준해 다섯마리(5)의 사이노몰거스 원숭이를 치료용으로 선별하였다: (i) 14년 령 초과, (ii) 높은 공복 혈당(>105 mg/dL), 공복 혈중 인슐린 수준(<60 mU/L) (iii) 높은 BMI(수컷 >46, 암컷 >24), (iv) 체중: 수컷 8 kg 초과, 암컷 3.5 kg 초과, (v) 높은 공복 트리글리세라이드; 및 (vi) IVGTT에 기초한 무딘(blunted) 1기 인슐린 반응.

원숭이를 1, 2 또는 3군으로 할당하였다. 동물에 (실시예 2에 기술된 바와 같이 분리된) 동종이계 MPC를 다음과 같은 용량으로 요측피정맥 또는 적당한 말초 정맥으로 단일 저속 정맥내 (IV) 주입하였다 (용량은 최근 기록된 체중에 맞추어 조절되었다):

[표 2]

치료군 요약

각 원숭이에 MPC를 다음에 나타내는 바와 같이 0주에 최초 주입하고 12주에 이차 주입하였다:

오스테오칼신의 샘플링은 -4, -2, 0, 2, 4, 8, 12, 20, 24주에 행하였다.

알칼리성 포스파타제의 샘플링은 -2, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24주에 행하였다.

결과

혈액 오스테오칼신에 대한 공복시 프로파일(ng/ml)을 개별 동물에 대해 동종이계 MPC의 IV 주사 후 6개월의 기간에 걸쳐 추적하였다. 결과는 도 3에 나타내었으며, 여기서 화살표는 단회 용량의 MPC 투여 시기를 나타낸다.

5마리 동물 모두 MPC 치료 전에 평균 기본선 값이 1.4(+/- 1.5,SEM) ng/ml로서, 낮은 오스테오칼신 혈장 수준을 나타내었다.

데이터는 오스테오칼신 반응이 각각의 주사 후 2주 내에 일어나고, 효과가 12주 지속됨을 나타낸다. 데이터는 또한 MPC의 반복 주사가 적어도 최초 주사만큼 효과적임을 나타낸다. 오스테오칼신 피크값은 10 내지 30 ng/ml 범위였다. 최대 오스테오칼신 유도는 시험한 최저 세포 용량에서 관찰되었다.

도 4는 비만 마우리티안 사이노몰거스 원숭이에서 최초 MPC 주사 후 2주 내에 오스테오칼신 반응이 관찰됨을 보여준다. 2-8주 에서의 피크 반응 후, 값은 12주 까지 기본선으로 되돌아간다. 흥미롭게도, 이차 MPC 주사는 동일 수준의 오스테오칼신 반응을 유지하는 최초 주사와 유사한 동태를 보여준다.

도 5는 0주 기본선에 대한 6개월 기간에 걸친 오스테오칼신 수준의 퍼센트 변화율을 나타낸다. 저용량의 MPC 주사(0.3 ×10⁶ MPC/kg)로 가장 현저한 반응이 나타났다

도 6은 치료 전의 기본선 수준과 비교하여 MPC 치료 후 오스테오칼신 수준의 평균 퍼센트 변화율을 나타낸다. 기본선으로부터 오스테오칼신의 평균 퍼센트 증가율은 2주에 1134%(+/- 202)의 수치로 피크였다. 이차 주사 후 반응폭은 최초 MPC 주사의 것과 유사하였다.

도 7은 6개월의 MPC 치료에 걸쳐 혈장 알칼리성 포스파타제의 점진적 증가를 나타낸다(곡선 아래 면적 분석으로 측정됨).

도 8은 6개월의 MPC 치료에 걸쳐 혈장 총 알칼리성 포스파타제의 점진적 증가를 나타낸다(18-24주와 0-6주 사이 곡선 아래 면적 분석에서 %증가로 측정됨).

Claims (30)

1. 대상체에게 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자를 전신적으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 조골세포의 기능을 향상시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 줄기 세포가 다능성 세포인 방법.
3. 제2항에 있어서, 다능성 세포가 STRO-1⁺ 세포인 방법.
4. 제2항에 있어서, 다능성 세포가 STRO-1^bright 세포인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포가 대상체에서 조골세포에 의한 오스테오칼신의 생성을 촉진하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 낮은 조골세포 수준 또는 활성과 관련된 질환을 앓고 있는 방법.
7. 제6항에 있어서, 질환이 대사성 골질환 또는 남성 불임인 방법.
8. 제7항에 있어서, 대사성 골질환이 골연화증, 골다공증, 골석화증, 파제트병 및 X-연관성 저인산혈증 구루병, 신부전-관련 골이영양증, 대리석 골병, 낭성 섬유성 골염 및 글루코코르티코이드-유도 골손실로 구성된 군중에서 선택되는 방법.
9. 제6항에 있어서, 대상체가 골다공증을 앓고 있고, 방법이 골절의 위험을 예방 또는 감소하는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 뼈 골절로 고통받고 있는 방법.
11. 제10항에 있어서, 뼈 골절의 치유를 촉진하고/하거나, 뼈 골절의 지연 유합을 예방하고/하거나, 뼈 골절의 유합 불능을 예방하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 대상체에서 혈장 오스테오칼신 수준이 증가되는 방법.
13. 제12항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 투여 2주 내에 혈장 오스테오칼신 수준이 적어도 5배 증가하는 방법.
14. 제12항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 투여 2주 내에 혈장 오스테오칼신 수준이 적어도 10배 증가하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 투여 2주 내에 혈장 오스테오칼신 수준이 적어도 20배 증가하는 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 대상체에서 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 증가하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 투여 6주 내에 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 투여 전 혈장 알칼리성 포스파타제의 수준과 비교해 적어도 5% 증가하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 이의 후대 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자의 투여로 투여 6주 내에 혈장 알칼리성 포스파타제 수준이 투여 전 혈장 알칼리성 포스파타제의 수준과 비교해 적어도 10% 증가하는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자가 대상체에 수 회 투여되는 방법.
20. 제19항에 있어서, 집단 및/또는 후대 및/또는 가용성 인자가 12주 이상마다 한 번 투여되는 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, kg당 0.1 x 10⁶ 내지 5 x 10⁶ STRO-1⁺ 다능성 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함하는 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, kg당 0.3 x 10⁶ 내지 2 x 10⁶ 다능성 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함하는 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 저용량의 다능성 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대의 투여를 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 저용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대가 kg당 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대를 포함하는 방법.
25. 제23항에 있어서, 저용량의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대가 kg당 약 0.3 x 10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 이의 후대를 포함하는 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 집단 및/또는 후대 세포가 자생성 또는 동종이계이고/이거나, 가용성 인자는 자생성 또는 동종이계 세포로부터 유래될 수 있는 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 세포 집단 및/또는 후대 세포가 투여 전 및/또는 가용성 인자의 수득 전에 배양 확장되는 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 세포 집단이 STRO-1^bright이고/이거나, 조직 비특이적 알칼리성 포스파타제(TNAP)를 발현하고/하거나, 후대 세포 및/또는 가용성 인자가 STRO-1^bright이고/이거나 TNAP를 발현하는 STRO-1⁺ 세포로부터 유래되는 방법.
29. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자가 정맥내로 투여되는 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자가 상기 줄기 세포 및/또는 이의 후대 세포 및/또는 이로부터 유래한 가용성 인자와 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여되는 방법.

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