TR201809635T4 - Osteoblastik fonksiyonun arttırılmasına yönelik yöntemler. - Google Patents

Abstract

Mevcut tarifname, bir öznedeki osteoblastik fonksiyonun arttırılmasına yönelik yöntemleri sağlar, yöntem kök hücrelerin popülasyonu ve/veya progeni ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörlerin özneye sistemik olarak uygulanmasını içerir.

Description

Tarifnamenin bu tür tüm varyasyonlari ve modifikasyonlari içerdigi anlasilacaktir.

Tarifname ayrica tek tek veya toplu olarak bu spesifikasyonda gösterilen veya refere edilen adimlar, özellikler, bilesimler ve bilesiklerin tümünü ve söz konusu adimlar veya herhangi bir ve tüm kombinasyonlari veya özelliklerin herhangi ikisi veya daha fazlasini içerir.

Mevcut tarifname, sadece örnekleme amacina yönelik tasarlanan burada açiklanan spesifik düzenlemeler ile kapsamda sinirlandirilinayacaktir. Fonksiyonel olarak esdeger ürünler, bilesimler ve yöntemler belirgin sekilde burada açiklanan tarifname kapsami dahilindedir.

Mevcut tarifname, aksi belirtilmedikçe klasik moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, Viroloji teknikleri, rekombinant DNA teknolojisi, solüsyon içerisinde peptit sentezi, kati faza sentezi ve immünoloji kullanilarak gereksiz deneyleme olmaksizin gerçeklestirilmistir. Bu tür prosedürler örnegin sunlarda açiklanir: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, II, ve 111”ün tamami; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. 1 ve 11 (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, metnin tamami; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, metnin tamami ve özellikle Gait, ppl-22 tarafindan buradaki sayfalar; Atkinson et al, pp35-81; A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) lRL Press, Oxford, metnin tamami; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, metnin tamami; Perbal, B., A Practical Guide to 00614-P-0003 Molecular Cloning (1984); Methods ln Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, lnc.), serinin tamami; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (lnteractiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J ., Lien, E.

Land Feniehel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336- Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449- 474; Handbook of Experimental lmmunology, Vols. l-IV (D. M. Weir and C. C.

Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); ve Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN Spesifikasyon boyunca, baglam aksini gerektirmedikçe “içermek” kelimesi veya sayi veya adimlar veya elemanlar veya tam sayilarin grubunun dahil edilmesini belirttigi ancak herhangi bir diger adim veya eleman veya tam sayisinin veya elemanlar veya tam sayilar grubunu hariç tutmadigini belirttigi anlasilacaktir.

Burada kullanildigi üzere “bundan türetilen” terimi, belirli bir tam sayinin yine zorunlu olarak dogrudan bu kaynaktan olinamak üzere belirli bir kaynaktan elde edilebildigini göstermek üzere alinacaktir. Kök hücreler ve/Veya bunun progeni hücrelerinden türetilen çözülebilir faktörler baglaminda bu terim, kök hücreler ve/veya bunun progeni hücrelerinin in vitro kültürlenmesi sirasinda üretilen örnegin proteinler, peptitler, karbohidratlar, Vb. gibi bir veya daha fazla faktörü ifade edecek sekilde alinacaktir. 00614-P-0003 Burada kullanildigi üzere "osteoblastik fonksiyon" terimi, bir osteoblastin Örnegin osteoid gibi hücre disi matriksi üretme ve/veya salgilama kabiliyetini kapsadigi anlasilacaktir. Osteoid, tip 1 kollajen, kondroitin sülfat ve osteokalsin içeren minerallestirilmemis bir kemik matriksidir. "Osteoblastik fonksiyon" terimi ek olarak veya alternatif olarak bir hücrenin örnegin osteoid gibi hücre disi bir matriksi minerallestirme kabiliyetini ifade eder. Bir örnekte "osteoblastik fonksiyon" teriminin, bir öznedeki kemik olusumunun arttirilmasini kapsadigi anlasilacaktir.

Bir öznedeki "osteoblastik fonksiyonun" arttirilmasi, osteoblastlarin hücre disi matriksi üretme ve/veya salgilama ve/veya hücre disi matriksi minerallestirme kabiliyetinin arttirilmasi yoluyla ve/veya osteoprogenitörlerin proliferasyonu ve/veya osteoprogenitörlerin osteoblastlarda farklilasmasin artirilmasi yoluyla gerçeklestirilebilir. Örnegin bir öznedeki osteoblastik fonksiyonun arttirilmasi, bir öznede veya bunun bir kemigindeki osteoblastlar sayisinin arttirilmasi yoluyla gerçeklestirilebilir.

Burada kullanildigi üzere “etkili miktar” terimi, kök hücreler ve/veya bunun progeni hücrelerinin ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörlerin öznedeki osteoblastik fonksiyonu ve/veya osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ve/veya sistemik osteokalsin seviyeleri ve/veya alkalin fosfataz seviyelerinde önemli bir artis elde etmek üzere yeterli bir miktarini ifade etmek üzere alinacaktir.

Osteoblastik fonksiyonu ve/veya osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ve/veya sistemik osteokalsin seviyeleri ve/veya alkalin fosfataz seviyelerindeki önemli bir artis, örnegin en az iki katlik bir artis veya en az bes katlik bir artis veya en az on katlik bir artis, en az yirmi katlik bir artis veya en az yirmi bes katlik bir artis olabilir.

Burada kullanildigi üzere terapötik olarak etkili miktar” terimi, kök hücreler ve/veya bunun progeni hücrelerinin ve/veya bundan türetilen çözülebilir 00614-P-0003 faktörlerin düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugu tedavi etmek üzere yeterli bir miktarini ifade etmek üzere alinacaktir.

Burada kullanildigi üzere “profilaktik olarak etkili miktar”, kök hücreler ve/veya bunun progeni hücrelerinin ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörlerin düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun baslangicini önlemek veya inhibe etmek veya geciktirmek üzere yeterli bir miktarini ifade etmek üzere alinacaktir.

Burada kullanildigi üzere “düsük dozu” terimi, kök hücreler ve/veya bunun progeninin 1x106”dan daha az, yine burada tanimlandigi üzere “etkili miktar” ve/veya burada tanimlandigi üzere “terapötik olarak etkili miktar” ve/veya hücre içerir.

Burada kullanildigi üzere “yüksek doz” terimi ile 1.5 x 106 hücre/kg3den daha fazlasi anlasilacaktir. Örnegin bir doz, yaklasik 1.5 x 106 ile yaklasik 4 X 106 hücre/kg arasinda içerir. Örnegin yüksek bir doz, yaklasik 1.5 x 106 veya yaklasik 2 x lOÖ/kg içerir.

Burada kullanildigi üzere “tedavi etmek” veya “tedavi” veya “tedavi etme” teriminin, çözülebilir faktörler ve/veya hücrelerin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasi veya özne bozukluk ile klinik olarak artik teshis edilemeyecek sekilde düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun semptomlarinin azaltilmasi veya inhibe edilmesini ifade ettigi anlasilacaktir.

Burada kullanildigi üzere “önlemek” veya “önleme” veya “önlem” teriminin, çözülebilir faktörler ve/veya hücrelerin profilaktik olarak etkili bir miktarinin 00614-P-0003 uygulanmasi ve düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun gelismesi veya ilerleyisinin durdurulmasi veya engellenmesi veya geciktirilmesini ifade ettigi anlasilacaktir.

Burada kullanildigi sekliyle "çözünebilir faktörler" terimi, kök hücreler ve/veya bunlarin suda çözünür progeni tarafindan üretilen herhangi bir molekül, örnegin protein, peptid, glikoprotein, glikopeptid, lipoprotein, lipopeptid, karbonhidrat vb. anlaminda kullanilacaktir. Bu çözünebilir faktörler hücre içi olabilir ve/veya bir hücre tarafindan salgilanabilir. Bu türlü çözünebilir faktörler kompleks bir karisim (örnegin üst faz) ve/veya bunun bir fraksiyonu olabilir ve/veya saflastirilmis bir faktör olabilir. Mevcut tarifnamenin bir örneginde, çözünebilir faktörler üst fazdir ve bunun içinde bulunur. Buna göre, burada bir veya daha fazla çözünebilir faktörün uygulanmasina yönelik herhangi bir örnek, üst fazin gerekli degisikler yapilarak uygulanmasi olarak alinacaktir.

Burada kullanildigi üzere “üst faz” terimi, örnegin sivi ortam gibi uygun bir ortamda kök hücreler ve/veya bunun progeninin i'n vi'vo kültürlenmesini takiben üretilen hücre disi materyale refere eder. Tipik olarak üst faz, santrifüjasyon gibi bir proses araciligiyla hücresel materyalin uzaklastirilmasini takiben uygun kosullar altinda ve sürede hücrelerin ortam içinde kültürlenmesi ile üretilir. Üst faz uygulama öncesinde ilave saflastirma adimlarina tabi tutulabilir veya tutulmayabilir. Bir örnekte üst faz, 105'ten daha az, örnegin 104”ten daha az, örnegin 103°ten daha az içerir, örnegin canli hücre içermez.

Burada kullanildigi üzere “normal veya saglikli birey” terimi, teknikte bilinen ve/veya burada açiklanan herhangi bir yöntem ile degerlendirildigi üzere düsük osteoblastik aktivitesine sahip olmayan bir özneyi ifade etmek üzere alinacaktir.

Bir örnekte “normal veya saglikli birey”, düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun semptomlarinin herhangi birinden muzdarip degildir ve/Veya düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir 00614-P-0003 Kök Hücreler veya Progeni hücreler ve Üst Faz veva Bundan Türetilen Bir veya Daha Fazla Cözülebilir Faktör Burada kullanildigi üzere “kök hücre” teriini, en az bir diger nihai hücre tipinin (örnegin son olarak farklilasmis hücreler) yani sira fenotipik olarak ve genotipik olarak ayni yavrulari saglayabilen kendi kendini yenileyen hücrelere refere eder. bunun farklilasmasindan türetilen progenitör ve/veya prekürsör hücreleri içerir.

Kök hücre bir yetiskin veya embriyonik kök hücre olabilir veya indüklenmis bir pluripotent kök (iPS) olabilir.

Burada kullanildigi üzere "totipotent hücre" veya "totipotensiyel hücre", tam bir embriyo (örnegin bir blastosist) olusturabilen bir hücreye refere eder.

Burada kullanildigi üzere "pluripotent hücre" veya "pluripotansiyel hücre", tam farklilasma degiskenligine, diger bir ifadeyle memeli gövdesinin yaklasik olarak 260 hücre tipinin herhangi birine büyüme kapasitesine sahip bir hücreye refere eder. Bir pluripotent hücre, kendi kendini yenileyici olabilir ve bir doku içerisinde hareketsiz veya pasif kalabilir. herhangi birine sebebiyet verebilen bir hücre ifade edilir. Burada kullanildigi üzere bu ifade, yetiskin veya embriyonik kök hücreler ve progenitör hücreler, örnegin mezenkimal prekürsör hücreler (MPC) ve bu hücrelerin multipotansiyel progenini içerir. Bir pluripotent hücrenin aksine bir multipotent hücre, tüm hücre tiplerini olusturma kapasitesine sahip degildir.

Burada kullanildigi üzere “progenitör hücre” terimi, spesifik bir hücre tipine farklilasmak veya spesifik bir hücre tipi olusturmak saglanan bir hücreye refere 00614-P-0003 Burada kullanildigi üzere "STRO-1+ multipotent hücreler" terimi, multipotent hücre kolonilerini olusturabilen STRO-l+ve/veya TNAP+ progenitör hücreleri STRO-l+ multipotent hücreler kemik iligi, kan, dis pulpa hücreleri, yag dokusu, deri, dalak, pankreas, beyin, böbrek, karaciger, kalp, retina, beyin, kil folikülleri, bagirsak, akciger, lenf dügümü, timus, kemik, ligament, tendon, iskelet kasi, dermis ve periostta bulunan hücrelerdir; ve tipik olarak mezoderm ve/veya endoderm ve/veya ektoderm gibi germ hatlarina farklilasabilmektedir. Böylece, STRO-IJr multipotent hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, adipoz, osseöz, kikirdakli, elastik, kasli ve lifli bag dokulari dahil olmak üzere çok sayida hücre tipine farklilasabilmektedir. Bu hücrelerin girdigi spesifik soy-baglilik ve farklilasma yolu, konakçi dokular tarafindan olusturulan büyüme faktörleri, sitokinler ve/veya lokal mikro çevre kosullari gibi mekanik etkilerden ve/veya endojen biyoaktif faktörlerden kaynaklanan çesitli etkilere baglidir. Bir düzenlemede STRO- l+ multipotent hücreler hem kök hücreler olan hem de zaman içinde bir fenotipik hücre elde etmek için geri dönüsümsüz olarak farklilasacak olan prekürsör hücreler olan yavru hücreleri vermek üzere bölünen hematopoietik olmayan progenitör hücrelerdir.

Bir örnekte STRO-1+ hücreleri, bir özneden, örnegin tedavi edilecek bir özne veya iliskili bir özne veya iliskili olmayan bir özneden (ayni türden veya farkli) elde edilen bir numuneden zenginlestirilir. “Zenginlestirilmis”, “zenginlestirme” terimleri veya varyasyonlari, burada belirli bir hücre tipi orani veya birkaç belirli hücre tipi oraninin, hücrelerin (örnegin natif çevrelerindeki hücrelerin) tedavi edilmemis bir popülasyonu ile karsilastirildiginda arttirildigi bir hücre popülasyonunu açiklamak üzere kullanilir. Bir örnekte STRO-l+ hücreleri için zenginlestirilmis bir popülasyon en az yaklasik %0.1 veya %0.5 veya %1 veya %2 STRO-1+hücresi içerir. Bu baglamda “STRO-IJr hücreleri için zenginlestirilmis hücrelerin popülasyonu” terimi, “%X STROl+hücresi içeren hücrelerin 00614-P-0003 popülasyonu” terimine açik destek saplamak üzere alinacaktir, burada %X burada belirtilen bir yüzdedir. STRO-l+ hücreleri, bazi örneklerde, klonojenik kolonilerini olusturur, örnegin CFU-F (fibroblastlar) veya bunun bir alt kümesi sahip olabilir.

Bir örnekte hücrelerin popülasyonu, seçilebilir bir formda STRO-l+ hücrelerini içeren bir hücre preparatindan zenginlestirilir. Bu baglamda “seçilebilir form” terimi, hücrelerin STRO-l+ hücrelerinin seçilmesine izin veren bir markörü (örnegin bir hücre yüzey markörü) ifade ettigini belirttigi anlasilacaktir. Markör, STRO-l olabilir ancak bu olmasi gerekmez. Örnegin açiklandigi ve/Veya burada Ömeklendirildigi üzere STRO-2 ve/Veya STRO-3 (TNAP) ve/Veya STRO-4 ve/veya VCAM-l ve/veya CD146 ve/veya 3G5,i ifade eden hücreler (örnegin MPC”ler) ayrica STRO-Pyi ifade eder (ve STRO-lb"ight olabilir). Buna uygun olarak hücrelerin STRO-1+ olduguna dair bir belirti, hücrelerin STRO-l ifadesi yoluyla seçildigini belirtmez. Bir örnekte hücreler, en azindan STRO-3 ifadesine dayanarak seçilir, örnegin bunlar STRO-3+°dir (TNAP+).

Bir hücre veya popülasyonunun seçimine referans, spesifik bir doku kaynagindan seçimi gerektirmez. Burada açiklandigi üzere STRO-l+ hücreleri, çok çesitli kaynaklardan seçilebilir veya izole edilebilir veya zenginlestirilebilir. Bununla birlikte bazi Örneklerde bu terimler, STRO-l+ hücrelerini (örnegin MPC”ler) içeren herhangi bir doku veya vaskülarize doku veya perisitleri (örnegin STRO- l+ perisitler) içeren doku veya burada belirtilen dokularin herhangi biri veya daha fazlasindan seçim için destek saglar.

Bir örnekte, mevcut tarifnamede kullanilan hücreler, TNAP+, VCAM-1+, THY-l+, STRO-T, STR, CD45*, CD146, 305+ veya bunlarin herhangi bir kombinasyonundan olusan gruptan tek tek veya toplu olarak seçilmis bir veya 00614-P-0003 ayri kapsadigi ve buradaki tek tek markörlerin veya markör gruplarinin burada ayri ayri listelenmemesine ragmen, ekli istemler, bu markörü veya markör gruplarini birbirinden ayri ve bölünebilir olarak tanimlayabilmektedir. herhangi bir sayisini veya kombinasyonunu kapsadigi ve bu gibi markör adetlerinin veya markör gruplarin kombinasyonlarinin, burada özel olarak burada listelenmemesine ragmen ekli istemler, bu tür kombinasyonlari veya alt kombinasyonlari birbirinden ayri ve bölünebilir olarak tanimlayabilmektedir. Örnegin STRO-lJr hücreleri, STRO-lbright”dir (es anlami STRO-lbri). Bir örnekte Stro-lbri hücreleri, tercihen STRO-ldim veya STRO-lintcrmCdiatc hücrelerine göre zenginlestirilir. Örnegin srRo-ibright hücreleri ek olarak TNAP+, VCAM-Ü, THY-14”, STRO-2+, STRO-4+ (HSP-90ß) ve/Veya CD146+7dan biri veya daha fazlasidir. Örnegin hücreler, önceki markörlerin birinden veya daha fazlasindan seçilir ve/veya önceki markörlerin birini veya daha fazlasini ifade ettigi gösterilir. Bu baglamda bir markörü ifade ettigi gösterilen bir hücrenin spesifik olarak test edilmesine gerek yoktur, bunun yerinde daha önceden zenginlestirilmis veya izole edilmis hücreler test edilebilir ve daha sonra kullanilabilir, izole edilen veya zenginlestirilen hücrelerin makul sekilde ayni markörü ifade ettigi varsayilir. perivasküler mezenkimal prekürsör hücrelerdir. Örnegin mezenkimal prekürsör hücreler, bir perivasküler hücrenin bir markörünü ifade eder, örnegin hücreler STRO-l+ veya STRO-lbrigmve/Veya 3G5+”tir. Bir örnekte hücreler daha önceden veya vaskülarize edilmis dokudan veya organlardan veya bunlarin parçalarindan izole edilen hücrelerin progenidir. 00614-P-0003 Belirli bir markör için "pozitif" olarak adlandirilan bir hücre, hücre yüzeyinde mevcut olan markörün derecesine bagli olarak bu markörün düsük (lo veya dim) veya yüksek (bright, bri) bir seviyesini ifade edebilir, burada terimler hücrelerin siralama isleminde kullanilan floresan yogunlugunun veya baska bir markörün yogunluguna iliskindir. Lo (veya dim veya dull) ve bri ayrimi, siralanan belirli bir hücre popülasyonunda kullanilan markör baglaminda anlasilacaktir. Belirli bir markör için "negatif" olarak adlandirilan bir hücre, mutlaka bu hücrede tamamen bulunmuyor anlami tasimaz. Bu terim, markörün, bu hücre tarafindan nispeten çok düsük bir seviyede ifade edildigi ve algilanabilir sekilde etiketlendigi veya arka plan seviyelerinin, örnegin bir izotip kontrol antikoru kullanilarak tespit edilen seviyelerinde üzerinde algilanamadigi çok düsük bir sinyal olusturdugu anlamina gelir.

Burada kullanildiginda "bright" terimi, algilanabilir sekilde etiketlendiginde nispeten yüksek bir sinyal üreten bir hücre yüzeyi üzerindeki bir markör ile ilgilidir. Teori ile sinirlandirilmak istenmemekle birlikte, "bright" hücrelerin, numunedeki diger hücrelerden daha fazla hedef markör proteini (örnegin STRO-l tarafindan taninan antijen) daha fazla ekprese ettigi önerilmistir. Örnegin, STRO- 1bri hücreleri, bright olmayan hücrelerden (STRO-lduu/dim) floresan aktive edilmis hücre siralama (FACS) analizi ile belirlenen bir FITC-konjuge STRO-l antikoru ile etiketlendiginde daha büyük bir floresan sinyali üretir. Bir örnekte, "bright" hücreler, baslangiç numunesinde bulunan en bright sekilde etiketlenmis kemik iligi mononükleer hücrelerinin en az yaklasik %0. l'ini olusturur. Diger örneklerde kemik iligi mononükleer hücrelerinin en az yaklasik %0,1, en az yaklasik %0,5, en az yaklasik %1, en az yaklasik %1.5 veya en az yaklasik %2'sini olusturur. Bir örnekte, STRO-lbright hücreleri, STRO-l yüzey ekpresyonuna göre "arka plan", diger bir deyisle STRO-1` olan hücrelerin 2 log büyüklügüne sahiptir.

Karsilastirma olarak, STRO-ldim ve/veya STRO-limermediêIte hücreler, yüksek STRO-l yüzey ekspresyonunun, tipik olarak yaklasik 1 log veya "arka plan" dan daha az olan, 2 log büyüklügünden daha az ekspresyona sahiptir. 00614-P-0003 Burada kullanildigi sekliyle "TNAP" teriminin, doku spesifik olmayan alkalin fosfatazin tüin izoformlarini kapsamasi amaçlanmistir. Örnegin, terim karaciger izoformu (LAP), kemik izoforinu (BAP) ve böbrek izoformunu (KAP) kapsar. Bir örnekte, TNAP, BAP'dir. Bir örnekte, bu tarifnamede kullanildigi haliyle, TNAP, Budapeste Antlasmasi hükümleri uyarinca 19 Aralik 2005 tarihinde ATCC ile tescillenen FTA-7282 tescil erisim numarasi altinda hibridoma hücre çizgisi tarafindan üretilen STRO-3 antikorunu, baglayabilen bir molekül anlamina gelir.

Ayrica, bir örnekte, STRO-lJr hücreleri klonojenik CFU-F olusturma kabiliyetine sahiptir.

Bir örnekte STRO-1+multipotent hücreler önemli bir oraninin, en az iki farkli germ hattina farklilasabilir. Multipotent hücrelerin islenebilecegi soylarin sinirlayici olmayan örnekleri, kemik prekürsör hücreleri; safra kanali epitel hücreleri ve hepatositler için multipotent olan hepatosit progenitörleri; oligodendrositlere ve astrositlere ilerleyen glial hücre prekürsörleri olusturabilen nöral kisitli hücreler; nöronlara ilerleyen nöronal prekürsörler; kardiyak kas ve kardiyomiyositler için prekürsörler, glukoza duyarli insülin salgilayan pankreas beta hücre hatlarini içerir. Diger soylar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, odontoblastlar, dentin üreten hücreler ve kondrositler ve asagidakilerin prekürsör hücreleri bulunur: retinal pigment epitel hücreleri, fibroblastlar, keratinositler, dendritik hücreler, kil folikül hücreleri, renal kanal epitel hücreleri gibi cilt hücreleri pürüzsüz ve iskelet kas hücreleri, testiküler progenitörler, vasküler endotel hücreleri, tendon, ligament, kikirdak, adiposit, fibroblast, ilik stromasi, kalp kasi, düz kas, iskelet kasi, perisit, vasküler, epitelyal, glial, nöronal, astrosit ve oligodendrosit hücreleri.

Baska bir örnekte STRO-l+ hücreleri, kültürleme üzerine hematopoietik hücreleri olusturma kabiliyetine sahip degildir. 00614-P-0003 Bir örnekte hücreler, tedavi edilecek olan kisiden alinir, standart teknikler kullanilarak in vitro kültürlenir ve özneye otolog veya allojenik bir bilesim olarak uygulanmasi için üst faz veya çözünebilir faktörler veya genisletilmis hücreler elde etmek için kullanilir. Alternatif bir örnekte, yerlesik insan hücre hatlarinin bir veya daha fazla hücresi kullanilir. Tarifnameye ait baska bir faydali örnekte, insan olmayan bir hayvanin hücreleri (veya hasta bir insan degilse, baska bir türden) kullanilir.

Mevcut tarifname ayrica, in vitro kültürden üretilen STRO-l+ hücrelerinden ve/veya progen hücrelerinden (genisletilmis hücreler olarak da adlandirilir) elde edilen veya türetilen üst faz veya çözünür faktörlerin kullanimini da kapsamaktadir. Bulusa ait genisletilmis hücreler, kültür kosullarina (kültür ortamindaki uyarici faktörlerin sayisi ve/veya türü dahil), geçislerin sayisina ve benzerlerine bagli olarak çok çesitli fenotiplere sahip olabilir. Bazi örneklerde progen hücreleri, ana popülasyondan yaklasik 2, yaklasik 3, yaklasik 4, yaklasik , yaklasik 6, yaklasik 7, yaklasik 8, yaklasik 9 veya yaklasik 10 geçisten sonra elde edilir. Bununla birlikte, progen hücreleri, parent popülasyonundan herhangi bir sayida geçisten sonra elde edilebilir.

Progen hücreleri, herhangi bir uygun ortamda kültürlenerek elde edilebilir. Bir hücre kültürüne referans olarak kullanilan "ortam" terimi, hücreleri çevreleyen ortamin bilesenlerini içerir. Ortam kati, sivi, gaz halinde veya faz ve malzeme karisimi olabilir. Ortam, sivi büyüme ortaminin yani sira hücre büyümesini askiya alan sivi ortamlari içerir. Ortam ayrica agar, agaroz, jelatin ve kolajen matrisleri gibi jelatinimsi ortamlari içerir. Örnek niteligindeki gazli ortam, bir petri kabi veya baska bir kati veya yari kati destek üzerinde büyüyen hücrelerin maruz kaldigi gaz fazini içerir. "Ortam" terimi ayrica, hücre ile henüz temas ettirilmemis olsa bile, bir hücre kültüründe kullanilmasi amaçlanan malzemeye de atif yapmaktadir. Baska bir deyisle, bakteri kültürü için hazirlanan besin açisindan zengin bir sivi bir ortamdir. Su veya baska bir sivi ile karistirildiginda hücre 00614-P-0003 kültürü için uygun hale gelen bir toz karisimi, bir "tozlu ortam" olarak adlandirilabilir.

Bir örnekte, tarifnameye ait yöntemler için yararli olan progen hücreleri, STRO-3 antikoru ile etiketlenmis manyetik boncuklar kullanilarak TNAP+ STRO- 1+hücrelerinin kemik iliginden izole edilmesi ve daha sonra kültürün izole hücreleri genisletmesiyle elde edilir (uygun bir kültürleme kosullari örnegi için Bir örnekte, bu tür genisletilmis hücreler (progen) (örnegin en az 5 geçisten sonra), TNAPÇ CC9+, HLA sinif l+, HLA sinif ll`, CD14`, CDl9`, CD3`, CDI 13-0- edilenlere farkli kültürleine kosullarinda farkli markörlerin ekspresyonunun degismesi mümkündür. Ayrica, bu fenotiplerin hücrelerinin ifade edilen hücre popülasyonunda baskin olmasi, bu fenotip(ler)e sahip olmayan hücrelerin küçük bir orani oldugu anlamina gelmez (örnegin, genisletilmis hücrelerin küçük bir yüzdesi CC9` olabilir). Bir örnekte, genisletilmis hücreler halen farkli hücre tiplerine farklilasma kapasitesine sahiptir.

Bir örnekte, üst faz veya çözünebilir faktörler veya hücreler elde etmek için kullanilan bir genisletilmis hücre popülasyonu, hücrelerin en az %25, daha tercihen en az %50'sinin CC9+ oldugu hücreleri içerir.

Baska bir örnekte, üst faz veya çözünür faktörler veya hücreler elde etmek için kullanilan genisletilmis bir hücre popülasyonu, hücrelerin en az %40, örnegin en az %45'inin STRO-l+ oldugu hücreleri içerir.

Bir baska örnekte, genisletilmis hücreler, LFA-3, THY-1, VCAM-l, ICAM-l, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, [GF l-R, NGF-R, FGF-R, Leptin-R (STRO- 00614-P-0003 2 = Leptin-R), RANKL, STRO-4 (HSP-90ß), srRo-ibright ve CD146 veya bu markörlerin herhangi bir kombinasyonunu içeren bir gruptan toplu olarak veya tek tek seçilen bir veya daha fazla markörü ekprese edebilir. edildigi gibi Multipotent Genisletilmis STRO-1+ Multipotent hücreleri Progendir (MEMP'ler). Progenin türetilebildigi STRO-l+ multipotent hücrelerin zenginlestirilmis popülasyonlarinin hazirlanmasi için yöntemler WO 01/04268 ve hücreler nadiren tamamen saf bir preparat olarak bulunur ve genellikle dokuya spesifik olarak islenmis hücreler (TSCC'ler) olan diger hücrelerle mevcut arasinda satlik seviyelerinde toplanmasi anlamina gelir. Progeninin türetildigi MPC'leri içeren popülasyon, dogrudan bir doku kaynagindan toplanabilir veya alternatif olarak, hali hazirda ex vivo olarak genisletilmis bir popülasyon olabilir. Örnegin, progen, mevcut olduklari popülasyonun toplam hücrelerinin en az saflastirilmis bir STRO-IJr multipotent hücrelerden olusan, toplanmis, genislememis bir popülasyondan elde edilebilir. Bu seviyeye, TNAP, STRO-4 gruptan tek tek veya topluca seçilen en az bir inarkör için pozitif olan hücrelerin seçimi ile ulasilabilir.

MEMPS, taze toplanmis STRO-1+multip0tent hücrelerden ayirt edilebilir söyle ki, markör srRo-ibri için pozitiftir ve markör Alkalin fosfataz (ALP) için negatiftir.

Buna karsilik, taze izole edilmis STRO-1+multipotent hücreler hem STRO-lbri hem de ALP için pozitiftir. Mevcut tarifnameye ait bir örnekte, uygulanan fenotip srRo-ib”, ALP' ye sahiptir. Bir örnekte MEMPS; Ki67, CD44 ve/veya CD49c/CD29, VLA-3, a3ß1 markörlerinden biri veya daha fazlasi için pozitiftir. 00614-P-0003 Yine baska bir örnekte, MEMP'ler TERT aktivitesi gösterinez ve/veya CD18 için negatiftir. belirtilen, kisaca kemik iligi, dis pulpasi hücreleri, yag dokusu ve deri dahil olmak ya da muhtemelen daha genis olarak adipoz dokusu, disler, dis pulpasi, deri, karaciger, böbrek, kalp, retina, beyin, saç folikülleri, bagirsak, akciger, dalak, lenf nodu, timüs, pankreas, kemik, ligament, kemik iligi, tendon ve iskelet kasi olmak üzere herhangi bir veya daha fazla doku tipinden türetilebilir.

Mevcut tarifnamede açiklanan yönteinlerin gerçeklestirilmesinde, herhangi bir belirli hücre yüzey markörü tasiyan hücrelerin ayrilmasinin bir dizi farkli yöntemle gerçeklestirilebilecegi anlasilmissa da, bazi örnek niteliginde yöntemler bir baglayici maddenin (örnegin, bir antikor veya antijen baglanma fragmanina) ilgili marköre baglanmasina bunu takiben baglanma sergileyenlerin ayrilmasina dayanmaktadir, bu baglanma yüksek düzeyde baglanma veya düsük düzeyde baglanma veya baglanamama anlamina gelir. En uygun baglayici maddeler, örnegin bu ikinci ajanlarin spesifitesi nedeniyle monoklonal antikorlar veya monoklonal antikorlara dayanan (örnegin antijen baglama parçasi içeren proteinler) antikorlar veya antikor bazli moleküllerdir. Antikorlar, her iki adimda da kullanilabilir, ancak baska maddeler de kullanilabilir, bu nedenle bu markörler için olan ligandlar, bunlari tasiyan veya bunlari tasimayan hücreleri zenginlestirmek için kullanilabilir.

Antikorlar veya ligandlar, ham bir ayrismaya olanak saglamak için kati bir destege baglanabilir. Bazi örneklerde ayirma teknikleri, toplanacak fraksiyonun canliligini muhafaza etmeyi en üst düzeye çikarir. Nispeten ham ayinnalar elde etmek için farkli etkililik teknikleri kullanilabilir. Kullanilan özel teknik, ayirmanin verimliligine, iliskili sitotoksisiteye, kolaylik ve performans hizina ve karmasik ekipman gereklilige ve/veya teknik beceriye bagli olacaktir. Ayirma prosedürleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, manyetik ayirma, antikorla 00614-P-0003 kaplanmis manyetik boncuklar, afinite kromatografisi ve bir kati matrise eklenmis antikor ile "kaydirma" kullanimi sayilabilir. Dogru ayirmayi saglayan teknikler, FACS'i içerir, ancak bununla sinirli degildir. FACS°i gerçeklestirmek için yöntemler, teknikte uzman kisilerce anlasilacaktir.

Burada tarif edilen markörlerin her birine karsi antikorlar, ticari olarak temin edilebilir (örnegin, STRO-l'e karsi monoklonal antikorlar, R & D Systems, ABD'den ticari olarak temin edilebilir), ATCC'den veya baska bir depolama organizasyonundan temin edilebilir ve/veya teknikte bilinen teknikler kullanilarak üretilebilir.

Bir örnekte STRO-l+ hücrelerin izole edilmesine yönelik yöntemin, STRO-l'in yüksek seviyeli ekspresyonunu taniyan örnegin manyetik aktive edilmis hücre siniflandirmasini (MACS) kullanan bir kati faz siralama adimi olan bir birinci adimi içermesi tercih edilir. Daha sonra WO 01/ 14268 patent spesifikasyonunda açiklandigi üzere daha yüksek bir prekürsör hücre ekspresyonu seviyesine yol açmak için arzu edilen bir sekilde bir ikinci siralama adimi takip edebilir. Bu ikinci siralama adimi iki veya daha fazla markörün kullanimini içerebilir.

STRO-l+hücrelerini elde etme yöntemi ayrica bilinen teknikler kullanilarak birinci zenginlestirme adimindan Önce bir hücre kaynaginin toplanmasini da içerebilir. Böylece doku cerrahi olarak çikarilacaktir. Kaynak dokuyu içeren hücreler daha sonra adi geçen tek hücre süspansiyonuna ayrilacaktir. Bu ayrilma fiziksel ve/veya enzimatik yollarla saglanabilir.

Uygun bir STRO-l+ hücre popülasyonu elde edildikten sonra, MEMP'lerin elde edilmesi için herhangi bir uygun araç ile kültürlenebilir veya genisletilebilir.

Bir örnekte hücreler, tedavi edilecek olan kisiden alinir, standart teknikler kullanilarak in vitro kültürlenir ve özneye otolog veya allojenik bir bilesim olarak uygulanmasi için üst faz veya çözünebilir faktörler veya genisletilmis hücreler 00614-P-0003 elde etmek için kullanilir. Alternatif bir örnekte, bir veya daha fazla yerlesik insan hücre dizisinin hücreleri, üst faz veya çözünür faktörleri elde etmek için kullanilir.

Tarifnaineye ait baska bir yararli örnekte, insan olinayan bir hayvanin hücreleri (veya hasta bir insan degilse, baska bir türden) üst faz veya çözünür faktörler elde etmek için kullanilir.

Mevcut bulusa ait yöntemler ve kullanimlar, bunlarla sinirli olmamak üzere insan disi primat hücreleri, toynakli hayvan, köpek, kedi, lagamorf, kemirgen, kuslar veya balik hücreleri dahil olmak insan disi herhangi bir hayvan türünden alinan hücreler kullanilarak gerçeklestirilebilir. Tarifnamenin gerçeklestirilebildigi primat hücreleri bunlarla sinirli olmamak üzere sempanze, babunlar, sinamolgus maymunlari ve diger herhangi bir Yeni veya Eski Dünya maymunlarina ait hücreleri içerir. Tarifnamenin gerçeklestirilebildigi toynakli hayvan hücreleri bunlarla sinirli olmamak üzere sigir, domuz, keçi, at, bufalo ve bizon hücrelerini içerir. Tarifnamenin gerçeklestirilebildigi kemirgen hücreler bunlarla sinirli olmamak üzere fare, siçan, kobay, hamster ve çöl faresi hücrelerini içerir.

Tarifnamenin gerçeklestirilebildigi lagomorf örnekleri evcil tavsanlar, büyük Amerikan tavsanlari, yaban tavsanlari, pamuk kuyruklu tavsanlar, kar tavsanlari ve islikli tavsanlari içerir. Tavuklar (Gallus gallus), tarifnamenin gerçeklestirebildigi bir kus türünün bir örnegidir.

Bir örnekte hücreler insan hücreleridir.

Tarifnameye ait yöntemler için faydali hücreler kullanimdan önce veya üst faz veya çözülebilir faktörlerin elde edilmesinden önce saklanabilir. Ökaryotik hücreler ve özellikle memeli hücrelerin korunmasi ve saklanmasina yönelik yöntemler ve protokoller teknikte bilinir (karsilastiriniz örnegin Pollard, J. W. and Walker, I. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.;Freshney, R. 1. (2000) Culture of Anima] Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). Mezankimal kök/progenitör hücreler gibi izole edilmis kök hücreler veya bunun progeninin biyolojik aktivitesini sürdüren 00614-P-0003 herhangi bir yöntem, mevcut tarifname ile baglantili olarak kullanilabilir. Bir örnekte hücreler, dondurarak saklama islemi kullanilarak muhafaza edilir ve saklanir.

Genetik Olarak Modifiye Edilmis Hücreler Bir örnekte kök hücreler ve/veya bunun progeni hücreleri, örnegin ilgili bir proteini ifade etmek ve/veya bunu salgilamak üzere genetik olarak modifiye edilir. Örnegin hücreler, bir metabolik kemik bozuklugu veya erkek infertilitesi tedavisinde faydali bir proteini ifade etmek üzere tasarlanir.

Bir hücrenin genetik olarak degistirilmesine yönelik yöntemler, teknikte uzman kisilerce anlasilacaktir. Örnegin, bir hücrede ifade edilecek olan bir nükleik asit, hücrede ekspresyonun uyarilmasi için bir promotere islevsel olarak baglidir. Örnegin, nükleik asit, örnegin, bir CMV promoteri (örnegin, Bir CMV-IE promoteri) veya bir SV-40 gibi bir viral promoter gibi bir öznenin çesitli hücrelerinde çalisabilen bir promotere baglanir. Ek uygun promoterler teknikte bilinmektedir ve tarifnameye ait mevcut örnekte geregince degistirilerek uygulamak için alinacaktir.

Bir örnekte nükleik asit bir ekspresyon yapisi formunda saglanir. Burada kullanildigi sekliyle "ekspresyon yapisi" terimi, bir hücre içinde islevsel olarak bagli oldugu bir nükleik asidi (örnegin bir raportör gen ve/veya bir karsi- seçilebilir raportör gen) ifade etme yetenegine sahip olan bir nükleik aside karsilik gelir. Mevcut tarifname baglaminda, bir ekspresyon yapisinin, bir plazmid, bakteriyofaj, fajmid, kozmid, virüs alt-genomik veya genomik fragman veya heterolog muhafaza edebilen ve/veya ekspres bir biçimde edilebilir bir sekilde heterolog DNA”yi çogaltabilen diger nükleik asidi içerebilecegi veya olabilecegi anlasilmalidir.

Bulusun gerçeklestirilmesi için uygun bir ekspresyon yapisinin olusturulmasi için 00614-P-0003 yöntemler, teknikte tecrübeli kisilerce anlasilacaktir ve örnegin Ausubel et al. tarafindan (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley lnterscience, ISBN Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001) tarif edilmektedir. Örnegin, ekspresyon yapisinin bilesenlerinin her biri, örnegin PCR kullanilarak uygun bir sablon nükleik asitten amplifiye edilir ve daha sonra örnegin bir plazmid veya bir fajmid gibi uygun bir Böyle bir ekspresyon yapisi için uygun olan vektörler bu alanda bilinmektedir ve/veya burada tarif edilmistir. Örnegin, bir memeli hücresinde mevcut açiklamanin yönteme uygun bir ekspresyon vektörü, örnegin, lnvitrogen tarafindan saglanan pcDNA vektör süitinin bir vektörü, pCI vektör süitinin (Promega) bir vektörü, pCMV vektör süitinin (Clontech) bir vektörü, bir pM vektörü (Clontech), bir pSI vektörü (Promega,) bir VP 16 vektörü (Clontech) veya pcDNA vektör süitinin bir vektörüdür (Invitrogen).

Teknikte uzman olan kisi, örnegin, Life Technologies Corporation, Clontech veya Promega gibi bu tür vektörlerin ek vektörlerini ve kaynaklarini bilecektir.

Izole edilmis nükleik asit molekülünü veya bunun aynisini içeren bir gen yapisini bir hücreye ekpresyon için dahil etmek için araçlar, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Belirli bir organizma için kullanilan teknik, bilinen basarili tekniklere baglidir. Rekombinan DNA'nin hücrelere dahil edilmesi için araçlar arasinda, digerlerine ek olarak mikroenjeksiyon, DEAE-dekstranin aracilik ettigi transfeksiyon, lipofektamin (Gibco, MD, USA) ve/veya selfektin (Gibco, MD, USA), PEG aracili DNA alimi gibi lipozomlarin aracilik ettigi transfeksiyon, DNA kapli tungsten veya altin parçaciklari (Agracetus Inc., WI, USA) kullanilarak elektroporasyon ve mikro parçacik bombardimani bulunur. 00614-P-0003 Alternatif olarak, bulusun bir ekspresyon yapisi bir viral vektördür. Uygun viral vektörler teknikte bilinmektedir ve ticari olarak temin edilebilir. Bir nükleik asidin verilmesi ve bu nükleik asidin bir konak hücre genomuna entegrasyonu için geleneksel viral bazli sistemler, örnegin bir retroviral vektör, bir lentiviral vektör veya bir adeno-iliskili viral vektörü içerir. Alternatif olarak, bir adenoviral vektör, bir konakçi hücreye epizomal olarak kalan bir nükleik asidin dahil edilmesi için yararlidir. Viral vektörler, hedef hücreler ve dokularda etkili ve çok yönlü bir gen transferi yöntemidir. Ek olarak, birçok farkli hücre tipinde ve hedef dokularda yüksek transdüksiyon verimliligi gözlemlenmistir. Örnegin, bir retroviral vektör genellikle 6-10 kb'ye kadar yabanci dizi için paketleme kapasitesine sahip cis-etkili uzun terminal tekrarlari (LTR'ler) içerir.

Minimum cls-etkili LTR'ler, bir vektörün replikasyonu ve paketlenmesi için yeterlidir, daha sonra, ekspresyon yapisini, uzun vadeli ekspresyonu saglamak için hedef hücreye entegre etmek için kullanilir. Yaygin olarak kullanilan retroviral vektörler arasinda murin lösemi virüsü (MuLV), gibbon ape lösemi virüsü (GaLV), simian immün yetmezlik virüsü (SrV), insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve bunlarin kombinasyonlari bulunur (örnegin, bakiniz örnegin, Buchscher Nükleik asit verilmesi için çesitli adeno-iliskili virüs (AAV) vektör sistemleri de gelistirilmistir. AAV vektörleri, teknikte bilinen teknikler kullanilarak kolaylikla Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 00614-P-0003 Tarifnamenin bir ekspresyon yapisinin verilmesi için yararli olan ek viral vektörler, Örnegin, vaksinia virüsü ve kus çiçegi virüsü ya da bir alfavirüs ya da bir konjugat virüs vektörü gibi virüslerin Virüs ailesinden türetilenleri içerir Hücreler ve Cözülebilir Faktörlerin Terapötik/Profilaktik Potansiyelinin Degerlendirilmesi Hücreler veya çözülebilir faktörlerin düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bozukluklarin baslangici veya ilerleyisini tedavi etme veya önleme veya geciktirme kabiliyetinin degerlendirilmesine yönelik yöntemler teknikte uzman kisiler için görünür olacaktir. Örnegin hücreler veya çözülebilir faktörler, bunlarin osteoblastik fonksiyonu arttirma kabiliyeti için degerlendirilir.

Bir örnekte osteoprogenitör hücreler (örnegin Cbfel/RunXTyi ifade eden), hücreler ve/Veya çözülebilir faktörler ile temas ettirilir ve bunlarin osteoblastlara farklilasma kabiliyetleri test edilir. Örnegin hücreler, osteriks ve/veya Coll ve/veya BSP ve/veya M-CSF ve/veya alkalin fosfataz ifadesinin gelisimine yönelik degerlendirilir.

Bir örnekte hücreler ve/Veya çözülebilir faktörler, osteoblastlar ile temas ettirilir ve bunlarin tip 1 kollajen ve/veya osteokalsin üretimi üzerindeki etkileri, örnegin immüno analiz ve/Veya immünohistokimya veya immünofloresan kullanilarak degerlendirilir. 00614-P-0003 Ilave bir örnekte hücreler ve/veya çözülebilir faktörler, bir hücre disi matriksinde kültürlenen osteoblastlar ile temas ettirilir ve bunlarin matriksin minerallesmesini arttirma kabiliyetleri örnegin Alziarin Red veya von Kossa boyama ile boyanarak degerlendirilir.

Hücreler ve/veya çözülebilir faktörler ayrica örnegin Zaheer et al., Nat. görüntüleme islemi gibi bir analiz kullanilarak bunlarin in vi'vo osteoblast aktivitesi üzerindeki etkileri için degerlendirilebilir.

Hücreler ve/veya çözülebilir faktörler ayrica örnegin x-isini ve/veya iki enerjili X- isini absorbsiyometre (DEXA) kullanilarak bunlarin kemik olusumu üzerindeki etkileri tespit edilecek bunlarin in vivo osteoblast aktivitesi üzerindeki etkileri için degerlendirilebilir. Örnegin hücreler veya çözülebilir faktörler (örnegin faktörlerin bir karisimi veya tek bir faktör veya faktörlerin bir fraksiyonu (örnegin afinite saflastirma veya kromatografi ile türetilen), bir metabolik kemik bozukluguna sahip bir modele uygulanir ve bir veya daha fazla semptom üzerindeki etki degerlendirilir. Örnek niteliginde insan disi hayvan modelleri, ovariyektomi yapilmis kemirgenler (Örnegin siçanlar), immobolizasyon ile indüklenen kemik kaybi modelleri ve/veya Turner European Cells and Materials, 1: 66-91, 2001 ,de kontrol edilen modelleri Mevcut tarifnamenin ayrica düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun tedavisi, önlenmesi veya geciktirilmesi için bir hücre veya çözülebilir bir faktörün tanimlanmasi veya izole edilmesine yönelik bir yöntem sagladigi önceki açiklanmadan teknikte uzman kisi için görünür olacaktir, yöntem asagidaki adimlari içerir: 00614-P-0003 (i) düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bozukluktan muzdarip bir test öznesine uygulanmasi ve öznedeki bozukluk semptomunun degerlendirilmesi; (ii) öznenin düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozukluk semptomunun (i) hücre veya çözülebilir faktörün uygulanmadigi bozukluktan muzdarip bir kontrol öznesinin düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bozukluk semptomu ile karsilastirilmasi, burada kontrol öznesi ile karsilastirildiginda test öznesindeki semptomdaki bir gelisme, hücre veya çözülebilir faktörün bozuklugu tedavi ettigini gösterir.

Hücre, herhangi bir örnege göre burada açiklanan herhangi bir hücre olabilir.

Hücresel Bilesimler Mevcut tarifnameye ait bir örnekte kök hücreler ve/veya bunun progeni hücreleri, bir bilesim formunda uygulanir. Bir örnekte bu tür bir bilesim, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ve/veya eksipiyan içerir. uygulanmasini ve/veya biyolojik aktivitesini kolaylastirmak için teknikte geleneksel olarak kullanilan madde bilesimlerini ifade eder (bakiniz, örnegin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980). Bir tasiyici, ayni zamanda, aktif bilesigin istenmeyen yan etkilerini de azaltabilir. Uygun bir tasiyici, örnegin stabildir, örnegin, tasiyici içindeki diger bilesenlerle reaksiyona giremez. Tasiyici, tedavi için kullanilan dozaj ve konsantrasyonlarda alicilar için önemli lokal veya sistemik yan etki üretmez.

Bu tarifname için uygun tasiyicilar arasinda, geleneksel olarak kullanilanlar, örnegin, su, tuzlu su, sulu dekstroz, laktoz, Ringer çözeltisi, tamponlu bir çözelti, 00614-P-0003 hiyalüronan ve glikoller, özellikle çözeltiler için (izotonik oldugunda) örnek niteliginde sivi tasiyicilardir. Uygun farmasötik tasiyicilar ve eksipiyanlar arasinda, nisasta, selüloz, glukoz, laktoz, sükroz, jelatin, malt, pirinç, un, tebesir, silika jel, magnezyum stearat, sodyum stearat, gliserol monostearat, sodyum klorür, gliserol, propilen glikol, su, etanol ve benzerleri bulunur.

Baska bir örnekte, bir tasiyici, örnegin bir hücrenin büyütüldügü veya süspansiyon haline getirildigi bir ortam bilesimidir. Örnegin, böyle bir ortam bilesimi, uygulandigi bir öznede herhangi bir yan etki olusturmaz. Örnek niteliginde tasiyicilar ve eksipiyanlar, bir hücrenin canliligini ve/Veya bir hücrenin metabolik sendrom ve/veya obeziyeti azaltma, önleme veya geciktirme kabiliyetini olumsuz olarak etkilemez.

Bir örnekte, tasiyici veya eksipiyan, hücrelerin ve/veya çözünebilir faktörlerin uygun bir pH'ta muhafaza edilmesi için bir tampon aktivitesi saglar, böylece bir biyolojik aktivite ortaya çikar, örnegin tasiyici veya eksipiyan, fosfat tamponlu salindir (PBS). PBS atraktif bir tasiyiciyi veya eksipiyani temsil eder, çünkü bu hücreler ve faktörler ile en az etkilesime girer ve hücrelerin ve faktörlerin hizli bir sekilde serbest kalmasina izin verir, böyle bir durumda, bulusa ait bilesim örnegin bir enjeksiyon ile kan akisina, bir dokuya veya bir dokunun çevresinde veya bitisik bir bölgeye dogrudan uygulamak için bir sivi olarak üretilebilir.

Kök hücreler ve/Veya bunlarin progen hücreleri de aliciya uyumlu olan ve aliciya zararli olmayan ürünlere dönüsen doku iskeleleri içine dahil edilebilir veya eklenebilir. Bu iskeleler, alici öznelere transplante edilecek hücreler için destek ve koruma saglar. Dogal ve/veya sentetik biyolojik olarak çözünebilen iskeleler, bu tür iskelelerin örnekleridir.

Bulusun uygulanmasinda çesitli farkli iskeleler basarili bir sekilde kullanilabilir. Örnek niteliginde iskeleler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte biyolojik, 00614-P-0003 parçalanabilir iskeleleri içerir. Dogal biyobozunur iskeleler kollajen, fibronektin ve laminin iskeleleri içerir. Bir hücre transplantasyonu iskelesi için uygun sentetik madde, kapsamli hücre büyümesini ve hücre fonksiyonunu destekleyebilinelidir.

Bu tür iskeleler ayni zamanda emilebilirdir. Uygun yapi iskeleleri, örnegin gibi poliglikolik asit iskeleleri ya da polianhidridler, poliorthoesterler ve polilaktik asit gibi sentetik polimerleri içerir.

Baska bir örnekte, hücreler bir jel iskele içinde (Upjohn Company'den Gelfoain gibi) verilebilir.

Burada açiklanan yöntemler için yararli olan hücresel bilesimler, tek baslarina veya diger hücrelerle karisim halinde uygulanabilir. Mevcut tarifnamenin bilesimleri ile birlikte verilebilen hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, diger multipotant veya pluripotent hücreleri veya kök hücreleri veya kemik iligi hücrelerini içerir. Farkli tipteki hücreler, uygulamadan hemen önce veya kisa bir süre sonra, bulusa ait bilesim ile karistirilabilir veya bunlar, uygulamadan önce bir süre boyunca birlikte kültürlenebilir.

Bir örnekte bilesim, hücrelerin etkili bir miktarini veya terapötik olarak veya profilaktik olarak etkili miktarini içerir. Örnegin bilesim, yaklasik 1 X 105 kök hücre (örnegin STRO-l+ hücre)/kg ila yaklasik 1 X 107 kök hücre (örnegin STRO- l+hücre)/kg veya yaklasik 1 X /kg ila yaklasik 5 X /kg içerir. Uygulanacak tam hücre miktari, hastanin yasi, agirligi ve cinsiyeti ve düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bozuklugun ölçüsü ve ciddiyeti dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir.

Bir örnekte özneye hücrelerin düsük bir dozu uygulanir. Örnek niteliginde 00614-P-0003 Bazi örneklerde hücreler, hücrelerin bir öznenin dolasimina girmesine izin vermeyen bir bölme içinde bulunur, ancak hücreler tarafindan salgilanan faktörlerin dolasima girmesine izin verir. Bu sekilde, çözünebilir faktörler, hücrelerin, öznenin dolasimina faktörleri salgilamasina izin vererek bir kisiye uygulanabilir. Böyle bir hazne, bir öznede bir bölgeye, örnegin, transplante edilen organin içine veya yakinina yerlestirilen çözünebilir faktörlerin lokal seviyelerini arttirmak için esit olarak implante edilebilir.

Tarifnaineye ait bazi örneklerde hücresel bilesiinlerle tedaviye baslamadan önce bir hastanin immün sistemini baskilamak gerekli olmayabilir veya arzu edilmeyebilir. Buna göre, bazi durumlarda, kök hücreler veya bunlarin progeni ile alloj enik, hatta ksenojenik transplantasyon tolere edilebilir.

Bununla birlikte, baska durumlarda, hücre terapisini baslatmadan önce bir hastaya farmakolojik olarak immün baski uygulamak ve/veya bir öznenin hücresel bilesimie karsi immün yanitini azaltmak arzu edilebilir veya uygun olabilir. Bu, sistemik veya lokal immünosüpresif ajanlarin kullanilmasiyla gerçeklestirilebilir veya hücrelerin kapsüllenmis bir cihaz içinde verilmesiyle gerçeklestirilebilir.

Hücreler, hücre ve terapötik faktörler tarafindan gerekli olan besin ve oksijene nüfuz edebilen bir kapsül içinde kapsüllenmis olabilir, ancak hücre bagisiklik hümoral faktörleri ve hücreleri için geçirgen degildir. Bir örnekte enkapsülan hipoalerjeniktir, hedef dokuda kolaylikla ve stabil bir sekilde yerlesir ve implante edilen yapiya ilave koruma saglar. Bu ve nakledilen hücrelere immün tepkisini azaltmak ya da ortadan kaldirmak için diger araçlar, teknikte bilinmektedir. Bir alternatif olarak, hücreler immünojenisitelerini azaltmak için genetik olarak degistirilebilir. 00614-P-0003 Cözünebilir Faktörlerin Bilesimleri Mevcut tarifnaineye ait bir örnekte, kök hücre-türevi ve/veya progen hücre-türevli üst faz veya çözünür faktörler, Örnegin uygun bir tasiyici ve/Veya eksipiyan içeren bir bilesim formunda uygulanir. Bir örnekte, tasiyici veya eksipiyan, çözünebilir faktörlerin veya üst fazin biyolojik etkisini olumsuz yönde etkilemez.

Bir örnekte, bilesim, bir çözünebilir faktörü veya bir üst faz bilesenini, örnegin bir proteaz inhibitörünü stabilize etmek için bir madde bilesimi içerir. Bir örnekte, proteaz inhibitörü, bir özne üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacak bir miktarda dahil edilmez.

Kök hücre-türevi ve/veya progen hücre-türevli üst faz ya da çözünür faktörleri içeren bilesimler, örnegin, kültür ortami içinde ya da stabil bir tasiyici ya da tampon çözeltisi, örnegin fosfat tamponlu salin gibi uygun sivi süspansiyonlari olarak hazirlanabilir. Uygun tasiyicilar yukarida tarif edilmistir. Baska bir örnekte, kök hücre-türevi ve/veya progen hücre-türevli üst faz ya da çözünür faktörleri içeren süspansiyonlar, enjeksiyon için yagli süspansiyonlardir. Uygun lipofilik çözücüler veya araçlar arasinda susam yagi gibi bitkisel yaglar; veya etil oleat veya trigliseritler gibi sentetik yagli asit esterleri; veya lipozomlar bulunur.

Enjeksiyon için kullanilacak süspansiyonlar ayrica, sodyum karboksimetil selüloz, sorbitol veya dekstran gibi süspansiyonun Viskozitesini arttiran maddeler de içerebilir. Istege bagli olarak, süspansiyon ayrica, yüksek konsantrasyonlu çözeltilerin hazirlanmasina olanak saglamak üzere bilesiklerin çözünürlügünü arttiran uygun stabilizatörler veya maddeler de içerebilir.

Steril enjekte edilebilir çözeltiler, gerekli oldugu takdirde, yukarida tarif edilen bilesenlerin biri veya bir kombinasyonu ile uygun bir çözücü içinde gerekli miktarda üst faz veya çözülebilir faktörler eklenerek, ardindan filtre edilmis sterilizasyon ile hazirlanabilir. 00614-P-0003 Genel olarak, dispersiyonlar, üst faz veya çözünebilir faktörlerin, bazik bir dispersiyon ortami ve yukarida sayilanlardan gerekli diger içerikleri içeren steril bir vehiküle eklenmesiyle hazirlanir. Steril enjekte edilebilir solüsyonlarin hazirlanmasi için steril tozlar söz konusu oldugunda, örnek niteliginde hazirlama yöntemleri, aktif içerik maddesinin bir tozunu ve bunun daha önceden steril olarak filtrelenmis bir çözeltisinden herhangi bir ilave içerik maddesini veren vakumlu kurutma ve dondurarak kurutmadir. Açiklamanin alternatif bir yönüne uygun olarak, üst faz veya çözünebilir faktörler, çözünürlügünü arttiran bir veya daha fazla ek bilesik ile formüle edilebilir.

Diger örnek tasiyicilar veya eksipiyanlar, örnegin, in Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw- Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Phannaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.°de açiklanmaktadir.

Terapötik bilesimler tipik olarak üretim ve depolaina kosullari altinda steril ve stabil olmalidir. Bilesim, bir çözelti, mikroemülsiyon, lipozom veya baska bir sirali yapi olarak formüle edilebilir. Tasiyici, örnegin su, etanol, poliol (örnegin gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlarin uygun karisimlarini içeren bir çözücü veya dispersiyon ortami olabilir. Uygun akiskanlik, örnegin, lesitin gibi bir kaplamanin kullanilmasiyla, dispersiyon durumunda gerekli parçacik boyutunun korunmasi ve yüzey aktif maddelerin kullanilmasi ile korunabilir. Bazi durumlarda, örnegin, sekerler, mannitol gibi polialkoller, sorbitol veya sodyum klorür gibi izotonik ajanlari bilesime dahil edilir. Enjekte edilebilir bilesimlerin uzun süreli emilimi, bilesime, örnegin 00614-P-0003 monostearat tuzlari ve jelatin gibi emilimi geciktiren bir maddeye dahil edilerek saglanabilir. Ayrica, çözünebilir faktörler, örnegin yavas salinimli bir polimer içeren bir bilesim içinde bir zaman salinim formülasyonunda uygulanabilir. Aktif bilesikler, bilesikleri, implantlar ve mikro-kapsüllü dagitim sistemleri dahil olmak üzere kontrollü bir salinim formülasyonu gibi hizli salinima karsi koruyacak tasiyicilarla hazirlanabilir. Etilen vinil asetat, polianhidritler, poliglikolik asit, kollajen, polimetoesterler, polilaktik asit ve polilaktik, poliglikolik kopolimerler (PLG) gibi biyo-bozunabilir, biyo-uyumlu polimerler kullanilabilir. Bu tür formülasyonlarin hazirlanmasi için birçok yöntem patentlidir veya teknikte uzman kisilerce genel olarak bilinmektedir. Üst faz veya çözünebilir faktörler, örnegin, çözünebilir faktörlerin yavas salinmasini saglamak için uygun bir matris ile kombinasyon halinde uygulanabilir.

Bilesimlerin EL( Bilesenleri Kök hücre-türevli üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya bunun progeni, diger faydali ilaçlar veya biyolojik moleküller (büyüme faktörleri, trofik faktörler) ile uygulanabilir. Diger ajanlar ile uygulandiginda bunlar tek bir farmasötik bilesim halinde veya ayri farmasötik bilesimler halinde es zamanli olarak veya sirali olarak diger ajanlar ile birlikte uygulanabilir (diger ajanlarin uygulanmasindan önce veya sonra). Birlikte uygulanabilen biyoaktif faktörler anti-apoptotik ajanlar (örnegin, EPO, EPO mimetik cisimcik, TPO, [GF -I ve [GF- inhibitörleri, TGF-beta inhibitörleri, statinler, IL-6 ve IL-l inhibitörleri, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS ve NSAIDiler (non- steroidal anti-inflamatuar ilaçlar; örnegin, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); immünosupresif/immünomodülatör ajanlar (örnegin, kalsineurin inhibitörleri, örnegin siklosporin, takrolimus; mTOR inhibitörleri (örnegin, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); anti-proliferatifler (örnegin, azatioprin, 00614-P-0003 mikofenolat m0fetil); kortikosteroidler (örnegin, prednisolon, hidrokortizon); antikorlar örnegin monoklonal anti-IL-ZRalfa reseptör antikorlari (örnegin, basiliksimab, daklizumab), poliklonal anti-T-hücre antikorlari (örnegin, anti- timosit globulin (ATG); anti-lenfosit globulin (ALG); monoklonal anti-T hücre antikoru OKT3)); anti-trombojenik ajanlar (örnegin, heparin, heparin türevleri, ürokinaz, PPack (dekstrofenilalanin prolin arjinin klorometilketon), antitrombin bilesikler, platelet reseptör antagonistleri, anti-trombin antikorlari, antiplatelet reseptör antikorlari, aspirin, dipiridamol, protamin, hirudin, prostaglandin inhibitörleri ve platelet inhibitörleri); ve anti-oksidanlar (örnegin, probukol, vitamin A, askorbik asit, tokoferol, koenzim Q-lO, glutatiyon, L-sistein, N- asetilsistein) ve ayrica lokal anestetik ilaçlari içerir.

Bir örnekte herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir bilesim, düsük 0ste0blast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun tedavisi veya profilaksisi için ek bir faktör içerir.

Alternatif olarak veya ek olarak herhangi bir örnege göre burada açiklanan hücreler, salgilanan faktörler ve/veya bir bilesim, düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun bilinen bir tedavisi ile kombine edilir.

Bir örnekte herhangi bir örnege göre burada açiklanan farmasötik bir bilesim, düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugu tedavi etmek üzere kullanilan bir bilesigi içerir. Alternatif olarak herhangi bir düzenlemeye göre burada açiklanan bir tedavi/profilaksi yöntemi ek olarak, düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugu tedavi etmek üzere kullanilan bir bilesigin uygulanmasini içerir. Örnek niteliginde bilesikler burada açiklanan ve mevcut bulusa ait bu örneklere geregince degistirilerek uygulanmak üzere alinacaktir.

Bir diger örnekte herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir bilesim ek olarak bir progenitör hücrenin bir vasküler hücreye farklilasinasini indükleyen veya 00614-P-0003 arttiran bir faktör içerir. Örnek niteliginde faktörler vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet türevli büyüme faktörü (PDGF; örnegin, PDGF-BB) ve FGF içerir.

Bir diger örnekte herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir bilesim bir dokuya spesifik saglanan hücreyi (TSCC) içerir. Bu baglamda Uluslararasi Paten uygulanmasinin, TSCClnin yüksek proliferasyonuna yol açabildigini gösterir. Bir örnekte TSCC vasküler bir hücredir. Bu tür bir bilesimin bir özneye uygulanmasi, örnegin etkilenen alana artan besinlerin dagitilmasina yol açarak, artmis vaskülatür üretimine yol açabilir.

Medikal Cihazlar Mevcut tarifname ayrica herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir yöntemde kullanildiginda veya kullanima yönelik medikal cihazlari saglar. Örnegin mevcut tarifriame, bir siringa veya katater veya kök hücreleri ve/veya bunun progeni hücrelerini ve/veya bundan elde edilen çözülebilir faktörleri ve/veya herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir bilesimi içeren uygun diger bir dagitim cihazini saglar. Istege bagli olarak siringa veya katater, herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir yöntemde kullanima yönelik talimatlar ile paketlenir.

Bir diger örnekte mevcut tarifname, kök hücreleri ve/veya bunun progeni hücreleri ve/veya bundan elde edilebilir çözülebilir faktörler ve/veya herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir bilesim içeren bir implant saglar. Istege bagli olarak implant, herhangi bir örnege göre burada açiklanan bir yöntemde kullanima yönelik talimatlar ile paketleriir. Uygun implantlar, örnegin burada yukarida açiklandigi bir iskelet ve kök hücreler ve/veya bunun progeni hücreleri ve/veya bundan elde edilen çözülebilir faktörler ile olusturtulabilir. 00614-P-0003 Uygulama Modlari Bir örnekte kök hücre-türevli üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya bunun progeni bir öznenin kan akisina dagitilir. Örnegin kök hücre-türevli üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya progeni parenteral olarak dagitilir.

Parenteral uygulamanin örnek niteligindeki yollari bunlarla sinirli olmamak üzere intraperitoneal, intraventriküler, intraserebroventriküler, intratekal veya intravenöz yollari içerir. Bir örnekte kök hücre-türevli üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya progeni, intra-arteriyel olarak, bir aorta, kalbin atriyumu veya ventrikülüne veya bir kan damarina, örnegin intravenöz olarak uygulanir.

Bir kalp atriyuinu veya ventrikülüne hücre dagitimi durumunda hücreler, hücrelerin akcigerlere hizli dagilimindan kaynaklanabilen komplikasyonlari önlemek üzere sol atriyum veya ventriküle uygulanabilir.

Bir örnekte kök hücre-türevli üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya bunun progeni intravenöz olarak dagitilir.

Bir örnekte hücreden türetilen üst faz veya çözülebilir faktörler, kök hücreler veya bunun progeni, örnegin bir siringa kullanilarak veya bir kateter veya bir merkez çizgisi yoluyla dagitim alanina enjekte edilir.

Bir terapötik formülasyon için bir uygulama rejiminin seçilmesi, hastanin serum veya doku devir hizi, semptomlarin seviyesi ve varligin immünojenisitesi gibi çesitli faktörlere baglidir. Bir örnekte, bir uygulama rejimi kabul edilebilir bir yan etki seviyesi ile tutarli olarak hastaya verilen terapötik bilesigin miktarini en üst düzeye çikarir. Buna göre verilen forinülasyon miktari kismen, belirli bir varliga ve tedavi edilen durumun ciddiyetine baglidir. 00614-P-0003 Bir örnekte, kök hücre-türevli üst faz veya çözünür faktörler, kök hücreler veya bunlarin progeni tek bir bolus dozu olarak verilir. Alternatif olarak, kök hücre- türevli üst faz veya çözünür faktörler, kök hücreler veya bunlarin progeni, sürekli infuzyon yoluyla veya örnegin bir günlük, bir haftalik veya haftada 1-7 kez araliklarda dozlarla uygulanir. Örnek niteliginde bir doz protokolü, olumsuz yan etkileri önleyen maksimum doz veya doz sikligini kapsayan bir protokoldür.

Toplam haftalik doz, kullanilan bilesik/hücrenin tipine ve aktivitesine baglidir.

Uygun dozun belirlenmesi bir klinisyen tarafindan, örnegin tedaviyi etkilemek için veya tedaviyi etkiledigi öngörülen teknikte bilinen veya süphelenilen parametreler veya faktörler kullanilarak yapilir. Genel olarak doz, optimum dozdan biraz daha az bir miktarla baslar ve daha sonra herhangi bir olumsuz yan etki ile ilgili olarak arzu edilen veya optimum etki elde edilene kadar küçük artislarla arttirilir.

Mevcut bulusçular, kök hücreler ve/veya bunun progeni ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörler ile saglanan terapötik faylarin bir öznede en az dört haftada gözlendigini göstermislerdir. Buna uygun olarak bazi örneklerde hücreler haftalik olarak, on dört günde bir, her üç haftada bir kez veya her dört haftada bir kez uygulanir.

Düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun ilerleyisinin tedavi edilmesi veya geciktirilmesine yönelik tarifname örneklerine göre kök hücreler ve/veya progeni hücreleri ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörler, teknikte bilinen ve/veya burada açiklanan standart yöntemler kullanilarak bozuklugun teshisini takiben uygulanir.

Düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir bozuklugun baslangicinin önlenmesi veya geciktirilmesine yönelik bu örneklere için kök hücreler ve/veya progeni hücreleri ve/veya bundan türetilen çözülebilir faktörler bozuklugun klinik teshisinden önce uygulanir. 00614-P-0003 Mevcut tarifname asagidaki sinirlandirici olmayan örnekleri içerir. Örnekler Örnek 1: STRO-3+ Hücrelerinin Seçilmesi ile MPC'lerin Immünoseleksivonu Kemik iligi (BM), saglikli normal yetiskin gönüllülerden (20-35 yas) toplanmaktadir. Kisaca, 40 m1 BM posterior iliak krestten lityum-heparin antikoagülan içeren tüplere aspire edilir.

BMMNC, daha önce tarif edildigi gibi LymphoprepTM (Nycomed Pharma, Oslo, Norveç) kullanilarak yogunluk gradyani ayirma ile hazirlanir (Zannettino, A.C. et santrifüjlemeyi takiben, buffy tabakasi bir transfer pipeti ile çikarilir ve %5 fötal buzagi serumu (FCS, CSL Limited, Victoria, Avustralya) içeren Hank's dengeli tuz çözeltisinden (HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD) olusan "HHF" içinde üç kez yikanir.

STRO-3Jr (veya TNAP+) hücreleri, daha önce anlatildigi gibi (Gronthos et al. izole edilmistir. Kisaca, yaklasik 1-3 X 108 BMMNC, buz üzerinde 20 dakika boyunca HHF içinde %10 (v/v) normal tavsan serumu içeren bloke edici tamponda inkübe edilir. Hücreler, 1 saat süreyle buz üzerinde bloke edici tampon içinde 200 ul bir 10 ug/ml'lik STRO-3 mAb çözeltisi ile inkübe edilir. Hücreler daha sonra 400 x g'de santrifüj ile iki kez HHF içinde yikandi. HHF tamponu içine bir 1/50 keçi anti-fare y-biyotin (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Ingiltere) seyreltisi eklenir ve hücreler 1 saat süreyle buz üzerinde inkübe edilir. Hücreler iki kez MACS tamponu (Ca2+ - ve Mn2+ içermeyen PBS ile takviye edilmis %1 BSA, 5 mM EDTA ve %001 sodyum azid) içinde yikanir ve nihai haciin olan 0.9 ml MACS tamponu içinde yeniden süspanse edilir. 00614-P-0003 Hücre süspansiyonuna yüz ul streptavidin mikroboncuklari (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Almanya) ilave edilir ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Hücre süspansiyonu iki kez yikanir ve 0.5 ml MACS tainponu içinde yeniden süspansiyon haline getirilir ve daha sonra bir mini MACS kolonuna (MS Columns, Miltenyi Biotec) yüklenir ve üç kez STRO-3 mAb (19 Aralik ile FTA-7282 katilim numarasi altinda kaydedilmistir - bakiniz Uluslararasi Yayin No. WO yikandi. Baska bir 1 ml MACS tamponu eklendikten sonra kolon miknatistan çikarilir ve TNAP+ hücreleri pozitif basinç ile izole edilir. Her bir fraksiyondan alinan bir hücre alikuotu, streptavidin-FITC ile boyanabilir ve saflik akis sitometrisi ile degerlendirilebilir. Örnek 2: STRO-3 mAb tarafindan Seçilen Hücreler, STRO-llJright hücreleridir.

Deneyler, STRO-lbright hücrelerini ayiimak için STRO-3 mAb'nin tek bir reaktif olarak kullanilma potansiyelini dogrulamak için tasarlandi.

STRO-3'ün (IgGl), STRO-1”e (IgM) göre farkli bir izotip oldugu göz önüne alindiginda, STRO-3'ün klonojenik CFU-F'yi taniinlama yetenegi, MACS prosedürü kullanilarak izole edilen STRO-l+ hücreleri ile birlikte ekpresyona dayanan iki renkli FACS analizi ile degerlendirildi (Sekil 1). Nokta grafik histogrami, liste modu verileri olarak toplanan 5 x 104 olaylarini temsil eder.

Dikey ve yatay çizgiler, ayni kosullar altinda tedavi edilen izotip-eslestirilmis kontrol antikorlari, lB5 (IgG) ve 1A ile elde edilen

Claims (10)

ISTEMLER
1. . Bir öznedeki osteoblastik fonksiyonun artirilinasi yoluyla osteomalazi, osteoporoz, X-bagli hipofosfatemik rasitizm, böbrek yetmezligi ile iliskili osteodistrofi, osteit Iibroza sistika ve glukokortikoid indüklü kemik kaybi veya bir kemik kirigindan olusan gruptan seçilen düsük osteoblast seviyeleri veya aktivitesi ile iliskili bir metabolik kemik bozuklugunun tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanima yönelik STRO-lbright multipotent hücreleri ve/veya progenine yönelik zenginlestirilmis bir hücre popülasyonunu içeren bir bilesimdir, burada yöntemin bilesimin sistemik olarak uygulanmasini içerir.
2. . Istem l,e göre kullanima yönelik bilesimdir, burada metabolik kemik bozuklugu osteoporozdur ve bilesim, bir kirik riskini önler veya azaltir.
3. . Istem 1 veya istem 2”ye göre kullanima yönelik bilesimdir, burada özne bir kemik kirigindan muzdariptir ve burada kök hücrelerin popülasyonu ve/veya progeni, kemik kirigmin iyilesmesini hizlandirir ve/veya kemik kiriginin gecikmis kaynasmasini önler ve/veya kemik kiriginin kaynasmamasini önler.
4. . Istemler 1 ila 3”ten herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada bilesimin uygulanmasi, 2 haftalik uygulama içerisinde plazma osteokalsin seviyelerinde en az bes katlik bir artis ile sonuçlanir.
5. . Istemler 1 ila 4°ten herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada bilesimin uygulanmasi, uygulamadan önce plazma alkalin fosfataz seviyesi ile karsilastirildiginda 6 haftalik uygulama içerisinde plazma alkalin fosfataz seviyelerinde en az yüzde beslik bir artis veya en az yüzde onluk bir artis ile sonuçlanir.
6. Istemler 1 ila 5”ten herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada bilesim özneye birkaç kez uygulanir.
7. Istemler 1 ila 6idan herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada uygulanan bilesim, kg basina 0.1 x 106 ila 5 x 106 arasinda STRO- lhright bright multipotent hücre ve/veya progeni dozunda STRO-l multipotent hücrelerin bir popülasyonunu ve/veya progenini içerir.
8. Istemler 1 ila 69dan herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, 1bright hücreleri ve/veya progeni dozunda kök hücrelerin bir popülasyonu ve/Veya progenini içerir.
9. Istemler 1 ila Saden herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada bilesim, STRO-lbrightmultipotent hücrelerinin ve/veya progeni hücrelerinin allogeneik bir popülasyonunu içerir.
10. 10. Istemler 1 ila 93dan herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada sistemik uygulama intravenöz veya intra-arteriyeldir. Istemler 1 ila 10°dan herhangi birine göre kullanima yönelik bilesimidir, burada STRO-l'Night hücreleri genetik olarak modifiye edilmez.