CN110613736A

CN110613736A - 一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物、制剂及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110613736A
Application number: CN201911043626.XA
Authority: CN
Inventors: 陈运贤; 张祥忠; 管玉先
Original assignee: Guangzhou Chen Yunxian Life Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Chen Yunxian Life Technology Co Ltd
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2019-12-27

Abstract

本发明提供了一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物、制剂及制备方法和应用，属于骨髓衰竭疾病治疗技术领域。本发明所述组合物包括间充质干细胞和维生素C。本发明组合物中的维生素C能够改善间充质干细胞生长环境，从而改善骨髓微循环。本发明所述制剂包括上述方案所述组合物和生理盐水。本发明的组合物或制剂用于治疗骨髓衰竭性疾病，没有毒副作用，能够有效缓解患病动物模型病症，实现长期带病生存，提高生存质量，延长寿命，具有良好的应用前景。

Description

一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物、制剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及骨髓衰竭疾病治疗技术领域，尤其涉及一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物、制剂及制备方法和应用。

背景技术

骨髓衰竭症是指由于各种病理因素损害造血干细胞及造血微环境使骨髓造血功能受抑制，表现为骨髓造血功能障碍，血干细胞的数量或功能缺陷，不能产生足够的血细胞，导致某一系血细胞减少或全血细胞减少，常见的是再生障碍性贫血，还包括部分以骨髓衰竭为主要表现的骨髓增生异常综合症(MDS)和阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)。

再生障碍性贫血(简称再障，下同)分为遗传性和获得性两大类，前者有基因或染色体异常，占儿童再障病人20％，占成人再障5％；获得性再障仅20％左右有明确的病因，如药物(抗肿瘤化疗、氯霉素等)、射线(包括肿瘤放疗)、化合物(苯、甲醛等)、病毒感染等，也称为继发性再障，其余绝大部分原因不明称为原发性再障。70％以上获得性再障的发病与免疫因素有关，存在细胞及体液免疫异常及造血基质异常，导致了CD34⁺细胞过度凋亡，即造血干/祖细胞数量降低甚至耗竭，骨髓造血功能衰竭。根据血细胞减少的程度又分为重型再障(SAA)和非重型再障(NSAA)，SAA若得不到及时、有效的治疗，6个月内死亡率达90％以上。

遗传性再障免疫抑制治疗无效，必须选择allo-HSCT(异基因造血干细胞移植)，50岁以下获得性重型再障首选HLA相合同胞供者allo-HSCT，70％～90％患者可取得治愈，但由于我国的计划生育政策，HLA相合同胞供者严重缺乏；其他造血干细胞供者来源，如HLA相合的非血缘供者、HLA不全相合的亲缘单倍体供者，因移植排斥率及移植物抗宿主病(GVHD)等并发症较高，仅作为IST治疗无效患者的挽救治疗，而脐带血造血干细胞移植治疗再障移植排斥率极高。也有研究发现在免疫移植治疗(IST)过程中联合脐带血输注，能促进粒细胞更快恢复，降低死亡率。强效免疫抑制治疗(IST)适合于50岁以上和没有合适供者的患者，由于在我国严重缺乏HLA相合同胞供者，实际上大多数SAA只能选择IST，但是只有约1/3患者达到较好的缓解，1/3患者部分缓解，还有1/3患者无效，即使起效，也需要3-6个月才见明显疗效，而有效者当中约20％～40％复发，10％发生晚期恶性转化。因此，再障患者的总体疗效不佳，迫切需要开发新的治疗手段。

以骨髓衰竭为主要表现的骨髓增生异常综合症(MDS)和阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的治疗首选allo-HSCT，少部分MDS也可选择免疫抑制治疗，同样面临上述再障遇到的缺乏HLA相合同胞供者和IST疗效不佳等问题，退一步选择HLA相合的非血缘供者、HLA不全相合的亲缘单倍体供者，就必须面对移植排斥及移植物抗宿主病(GVHD)等严重并发症。因此，上述疾病也迫切需要开发新的治疗方法或药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物、制剂及制备方法和应用，该组合物或制剂能够重建骨髓微环境造血功能，恢复造血稳态。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物，包括以下成分：间充质干细胞和维生素C；

所述间充质干细胞包括0～6月龄小鼠的骨髓间充质干细胞、0～6月龄大鼠的间充质干细胞或0～30岁人的骨髓间充质干细胞；

所述组合物中间充质干细胞的浓度为4×10⁶～6×10⁶个/mL；

所述组合物中维生素C的浓度为40～60μg/mL。

优选的，所述组合物中间充质干细胞的浓度为5×10⁶个/mL。

优选的，所述组合物中维生素C的浓度为50μg/mL。

优选的，所述组合物的使用剂量以间充质干细胞的数量计，所述间充质干细胞的数量为0.5×10⁷～1.5×10⁷个/kg。

本发明还提供了上述方案所述组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述间充质干细胞和维生素C混合，得到组合物。

本发明还提供了一种治疗骨髓衰竭疾病的制剂，包括以下成分：上述方案所述的组合物和生理盐水。

优选的，所述制剂的剂型包括注射剂。

本发明还提供了上述方案所述制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组合物和生理盐水混合，得到制剂。

本发明还提供了上述方案所述组合物或所述制剂在制备治疗骨髓衰竭疾病的药物中的应用。

优选的，所述骨髓衰竭疾病包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症和阵发性睡眠性血红蛋白尿。

本发明的有益效果：本发明提供了一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物，包括以下成分：间充质干细胞和维生素C。本发明组合物中的维生素C能够改善间充质干细胞生长环境，从而改善骨髓微循环。本发明的组合物用于治疗骨髓衰竭性疾病，没有毒副作用，能够有效缓解患病动物模型病症，实现长期带病生存，提高生存质量，延长寿命，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中小鼠骨髓间质干细胞(YBMSC)分离及培养不同代次显微镜照片；

图2为实施例1中流式检测小鼠骨髓间质干细胞(YBMSC)的免疫表型结果图；

图3为实施例2中骨髓衰竭病模型小鼠和正常小鼠的外周血骨髓单核细胞变化情况图；

图4为实施例2中骨髓衰竭病模型小鼠和正常小鼠的生存曲线图；

图5为实施例3中骨髓衰竭症患者小鼠YBMSC移植后四个月内连续流式分析结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物，包括以下成分：间充质干细胞和维生素C；所述间充质干细胞包括0～6月龄小鼠的骨髓间充质干细胞、0～6月龄大鼠的间充质干细胞或0～30岁人的骨髓间充质干细胞；所述间充质干细胞的来源包括采用本领域常规制备间充质干细胞的方法制备得到或者购买获得；本发明具体实施过程中，所述0～6月龄小鼠的骨髓间充质干细胞购自于赛业生物科技有限公司(Cyagene)，货号为MUBMX-01001；所述组合物中间充质干细胞的浓度优选为4×10⁶～6×10⁶个/mL，更优选为5×10⁶个/mL；所述维生素C的浓度优选为40～60μg/mL，更优选为50μg/mL；所述维生素C的作用是改善间充质干细胞生长环境，从而改善骨髓造血微循环；所述组合物的使用剂量以间充质干细胞的数量计，所述间充质干细胞的数量优选为0.5×10⁷～1.5×10⁷个/kg，更优选为1×10⁷个/kg。

本发明中，所述间充质干细胞和维生素C经过合理配比，具有疗效好，副作用小的优点。

本发明还提供了上述方案所述组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述间充质干细胞和维生素C混合，得到组合物；本发明对所述混合的方式、温度和时间没有特殊限制，以混合均匀为准。

本发明还提供了一种治疗骨髓衰竭疾病的制剂，包括以下成分：上述方案所述的组合物和生理盐水；所述生理盐水中氯化钠的浓度优选为0.85～0.9g/mL；所述生理盐水来源于常规市售；所述生理盐水的作用是维持间充质干细胞生理活性；所述制剂的剂型优选的包括注射剂；所述制剂的使用剂量优选为1～2mL/次；所述制剂的使用方式优选为髓腔内注射。

本发明还提供了上述方案所述制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组合物和生理盐水混合，得到制剂；本发明对所述混合的方式、温度和时间没有特殊限制，以混合均匀为准。

本发明还提供了上述方案所述组合物或所述制剂在制备治疗骨髓衰竭疾病的药物中的应用；所述骨髓衰竭疾病优选的包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症和阵发性睡眠性血红蛋白尿。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1小鼠骨髓间质干细胞的分离培养

1.Day0，安乐死小鼠，取出小鼠(0～6个月月龄)的4条腿放在6cm培养皿中，把肉尽可能剥离干净，用含有10x双抗的DPBS依次洗3次后放在25℃的DMEM:F12中，使用5mL注射器用DMEM:F12将骨髓尽可能吹干净，将骨髓用70μm滤网过滤，收集骨头和滤网上的碎骨片，放在预先加入1.5mL DMEM:F12培养基的六孔板的一个孔中，用剪刀把骨头尽可能剪碎，再加入1.5mL配好的胶原酶II(在避光的1.5mLEP管中，已经用DMEM:F12配好)，这样胶原酶II的终浓度为1mg/mL，用1mL移液器将剪碎的骨片吹散，均匀扑满整个孔，小心放入培养箱中37℃消化2h。消化完成后将消化液吸弃，用DMEM:F12洗3次，加入3mLDMEM:F12+10％FBS(Gibico)完全培养基放置在37℃培养箱培养3d(尽可能放置在里面角落里，以保证3d期间不要挪动它)。

2.Day3，将培养基吸弃，骨片转移到另一个新孔再培养3d，洗掉培养基和骨片的孔用F12洗3遍，换3mL新的完全培养基继续培养6d(第三天已经可以看到在骨片下面及周围有许多MSC细胞爬出)。

3.Day6，换液，吸弃培养基，加入3mL新的完全培养基。

4.Day9，传代，吸弃培养基，用DMEM:F12洗一遍，加入0.5mL0.25％胰酶37℃消化2.5min，镜下看到大部分细胞变圆或已开始浮起，加入2mL完全培养基终止消化，用1mL移液器小心将细胞吹打下来，转移到15mL离心管，25℃，250g，5min离心。用2mL完全培养基重悬细胞沉淀，平分到2个6cm培养皿中，每个培养皿加6mL完全培养基，此时为P1代。

5.依细胞密度每2d换液一次，每6d按照1:3比例传代一次。不同代次YBMSC(bonemarrowderivedstromacell骨髓源基质细胞)进行显微镜观察拍照(参见图1)。

6.YBMSC表型鉴定(CD45/TER119/CD31-PDGFRα/β+CD105+CD51+)

1)取培养至P3代的细胞，经0.25％胰酶消化成单细胞，用DPBS洗一遍，用200μL2％FBS/DPBS重悬细胞。加入1μLFcblockerCD16/32(1:200)，冰上，孵育15min。

2)4℃，500g，5min离心，500μL2％FBS/DPBS重悬细胞，分成5管，100μL/tube，分别加入以下抗体：

100μL→unstain

100μL→tube1+0.5μLanti-PDGFR-biotin(1:200)

100μL→tube2+0.5μLanti-PDGFR-biotin(1:200)

100μL→tube3+0.5μLantiCD105-biotin(1:200)

100μL→tube4+0.5μLanti-CD51-biotin(1:200)

冰上，孵育15min。

3)分别加入以下对应抗体：

100μL→tube1+0.5μLstreptivin-anti-FITC

+0.5μLanti-CD45-APC(1:200)，

+0.5μLanti-Ter119-APC(1:200)，

+1μLanti-CD31-APC(1:100)，

100μL→tube2+0.5μLstreptivin-anti-FITC

100μL→tube3+0.5μLstreptivin-anti-FITC

100μL→tube4+0.5μLstreptivin-anti-FITC

冰上，孵育15min，避光。

4)4℃，500g，5min离心，350μL含DAPI(1:400)的2％FBS/DPBS重悬细胞，使用流式检测表明YBMSC的免疫表型为CD31-，CD45-，Ter119-，PDGFRa+，PDGFRb+，CD51+，CD105+，是典型的间质细胞特征(参见图2)。

实施例2小鼠骨髓衰竭病模型建立

为了评估YBMSC治疗骨髓衰竭病的效果，首先建立骨髓衰竭病模型。将含有白血病基因修饰的造血干细胞移植到骨髓衰竭小鼠，构建骨髓微环境自然衰竭的小鼠模型。该模型小鼠外周血骨髓单核细胞在12～24周比野生对照组显著提高(参见图3)，并且生存曲线表明大量小鼠会发病死亡(参见图4)，发病鼠的表型跟骨髓衰竭一致。

选择自然骨髓衰竭的小鼠，进行亚致死剂量照射，然后植入经过白血病基因修饰的造血干细胞。移植后12～24周，小鼠集中发病(参见图3)，平均死亡时间为移植后159天(参见图4)，P<0.0001，n＝32。

实施例3年轻骨髓间质干细胞移植治疗骨髓衰竭病

选取实施例2的骨髓衰竭小鼠模型，发病标准是外周血髓系单核细胞百分比(Mac1+)超过60％。将实施例1制备的小鼠骨髓间质干细胞(YBMSC)及维生素C以及用于维持年轻骨髓间质干细胞生理活性的生理盐水以1×10⁷cells/kg的剂量移植骨髓衰竭动物模型。

其中实施例1制备的小鼠骨髓间质干细胞浓度为5×10⁶个/mL，维生素C浓度为50μg/mL。一次YBMSC输注剂量为1×10⁷cells/kg，骨髓腔内注射。每隔1个月输注1次YBMSC。每个月检测外周血单核细胞(Mac1+)细胞百分比。

Y轴为外周血单核细胞流式分析占整个外周血有核细胞百分比(Mac1+)。X轴为输注YBMSC后检测时间点。黑色箭头表示输注YBMSC的时间点。图5显示了三只代表性患者治疗结果。

如图5所示，三个代表性的骨髓衰竭症患者模型YBMSC移植后四个月内连续流式分析结果表明，外周血造血功能恢复，病情持续缓解，小鼠健康状态良好，不再出现弓背、皮肤炎症、食欲不振、消瘦等现象，YBMSC治疗期小鼠也实现长期带病生存。

通过上述实施例可知，本发明的制剂能够恢复骨髓衰竭小鼠造血功能，病情得到持续缓解，小鼠健康状态良好，实现长期带病生存的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于治疗骨髓衰竭疾病的组合物，包括以下成分：间充质干细胞和维生素C；

所述组合物中间充质干细胞的浓度为4×10⁶～6×10⁶个/mL；

所述组合物中维生素C的浓度为40～60μg/mL。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中间充质干细胞的浓度为5×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中维生素C的浓度为50μg/mL。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的使用剂量以间充质干细胞的数量计，所述间充质干细胞的数量为0.5×10⁷～1.5×10⁷个/kg。

5.权利要求1～4任意一项所述组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述间充质干细胞和维生素C混合，得到组合物。

6.一种治疗骨髓衰竭疾病的制剂，包括以下成分：权利要求1～4任意一项所述的组合物和生理盐水。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型包括注射剂。

8.权利要求6或7所述制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述组合物和生理盐水混合，得到制剂。

9.权利要求1～4任意一项所述组合物或权利要求6或7所述制剂在制备治疗骨髓衰竭疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨髓衰竭疾病包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症和阵发性睡眠性血红蛋白尿。