CN101310007A - 使用来自脐带血的基质细胞将来自脐带血的有核细胞增量(expanding)及移植(engrafting)的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是提供一种用以增量及移植(engrafting)由脐带血中取得诸如祖细胞的有核细胞的方法，其中，该组细胞例如造血细胞，而所述方法是通过将有核细胞以及同样从脐带血中取得的黏附性基质细胞共培养，其中，该黏附性基质细胞诸如间充质干/祖细胞。

Description

使用来自脐带血的基质细胞将来自脐带血的有核细胞增量(expanding)及移植(engrafting)的方法

相关申请案

本申请主张于2005年4月19日申请，案号为60/673,014且案名为「脐带血单核细胞的活体外增量」以及于2005年6月30日申请，案号为60/695,506且案名为「使用来自脐带血的基质细胞将来自脐带血的有核细胞增量及移植(engraft)的方法」的美国临时申请案的优先权，且借着参考这两篇的全部内容，将其整合于此。

技术领域

本发明关于一种利用来自脐带血的贴附性基质细胞以促使同样由脐带血中取得的有核细胞的增量及移植物移入(engraftment)。

背景技术

一些美国专利，诸如美国专利5,486,359号、5,591,625号、5,736,396号、5,811,0949号、5,827,740号、5,837,539号、5,908,782号、5,908,784号、5,942,225号、5,965,436号、6,010,696号、6,022,540号、6,087,113号、5,858,390号、5,804,446号、5,846,796号、5,654,186号、6,054,121号、5,827,735号以及5,906,934号揭露可将间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化成数种祖细胞，例如肌肉祖细胞、结缔组织细胞的祖先或是肝卵圆细胞。肌肉祖细胞进一步分化成心脏、骨骼和平滑肌，而结缔组织细胞的祖先可分化成骨骼。

当移植(transplanted)到胎羊中时，成人的骨髓间充质干细胞移植(engraft)到许多的器官中，且其随着组织特异体系进行分化。在动物模式中，在共移植(co-transplantation)后它们会增加供给者造血细胞的移植物移入(engraftment)，且在免疫缺乏小鼠中，它们会迁移到肌肉退化区域以进行肌肉分化。在人类，骨髓间充质干细胞已用于骨髓摧毁性治疗后，以再生骨髓微环境。

美国申请案09/985,335号(于此并入参考)揭露已知为非限制性体干细胞(unrestricted somatic stem cells，USSCs)的体干细胞，其可从人体脐带血、胎盘血以及/或是新生儿的血中取得。非限制性体干细胞不同于但是可以分化成间充质干或是祖细胞、造血体系干或是祖细胞、神经干或是祖细胞、或是内皮干或是肝祖细胞。非限制性体干细胞扮演造血体系的祖细胞、间充质干细胞以及神经干细胞。这个独特的多功能可能性，以及于不同分化条件下将这些细胞增量成不论是仍维持为干细胞或是作为定型细胞的技术，将允许这些细胞的精确特性化、标准化以及应用，以用于再生医学中的制造以及干细胞治疗的实施。

发明内容

我们已确认存在于脐带血(umbilical cord blood，UCB)中的黏附性基质细胞可用于支持同样出现于脐带血中的有核细胞的增量。我们也已确认从脐带血取得的黏附性基质细胞也可用于增加需要有核细胞移植的患者对得自脐带血的有核细胞的移入(engraftment)。

因此，本发明的第一方向，其特征在于培养来自脐带血的有核细胞的方法，其涉及制备包含有核细胞与黏附性基质细胞的共培养，其中有核细胞与黏附性基质细胞都是取自脐带血，且有核细胞与黏附性基质细胞分别添加到该共培养中。

于第一方向的一个实施例中，所述方法也可包含在培养有核细胞与黏附性基质细胞的同时、培养期间间歇地，或是在培养之后，将生长培养基接触一种选择成份，以选出有核细胞或是黏附性基质细胞，其中该选择成份包含多种选择性分子，其对有核细胞或是黏附性基质细胞具有特定的亲和性。

本发明的第二方向，其特征在于增加一受试者体内供给者有核细胞的移植物移入(engraftment)的方法，其通过对该受试者投药一个具有来自脐带血的有核细胞以及来自脐带血的黏附性基质细胞的组合物。

于本发明的第一与第二方向的一实施例中，有核细胞包含诸如祖细胞(亦即造血干细胞)的不成熟细胞，或是诸如粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞的成熟细胞。有核细胞也可选自CD34^-细胞、CD34⁺细胞以及Lin^-细胞。在一较佳实施例中，有核细胞为CD34⁺，Lin^-细胞。在另一较佳实施例中，有核细胞为约占共培养40％的造血干细胞。

于本发明的第一与第二方向的另一实施例中，黏附性基质细胞包含诸如非限制性体干细胞的间充质干细胞。在另一较佳实施例中，非限制性体干细胞特征为CD13⁺、CD29⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD166⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、CD45^-、CD34^-、以及CD14^-。另外，非限制性体干细胞更可具有表达细胞外基质蛋白(fibulin-2)，且缺乏表达透明质酸合成酶，与纤维调节素(fibromodulin)的特征。

于本发明的第一与第二方向的又一实施例中，相较于没有黏附性基质细胞的有核细胞单培养将具有的有核细胞的数目来说，共培养这些细胞产生较大数目的有核细胞。

于本发明的第一与第二方向的再一实施例中，黏附性基质细胞或是有核细胞是从脐带血中分离取得或是由从脐带血中分离取得的细胞衍生而来。

于本发明的第一与第二方向的另一实施例中，实质上于培养前黏附性基质细胞或是有核细胞是由其它细胞种类分离出来。

于本发明的第一与第二方向的又一实施例中，黏附性基质细胞或是有核细胞是人类细胞。

于本发明的第一与第二方向的另一实施例中，当黏附性基质细胞与有核细胞共培养至少一天，较佳为一周，更佳为两周，最佳为一个月后，其与在没有黏附性基质细胞存在下培养有核细胞的增量相比，共培养黏附性基质细胞与有核细胞使有核细胞的增量增加2倍，较佳为10倍或是100倍，更佳为100倍或1,000倍，最佳为1,000,000倍。

于另一实施例中，在共培养步骤后，将有核细胞(例如祖细胞)移到一个分隔的培养基中，并将有核细胞培养于使其分化成一预先决定的细胞种类的条件下。

在其它实施例中，有核细胞与黏附性基质细胞在共培养前先增量。在又一实施例中，共培养发生在至少一细胞因子存在下，例如选自粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、白介素2(interleukin 2，IL-2)、白介素3(interleukin 3，IL-3)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、FLT-3配位体、转化刺激因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、巨核细胞生长和发育因子(megakaryocyte growth anddevelopment factor)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、HOX-B4以及Wnt等的细胞因子。在一较佳实施例中，细胞因子为G-CSF。

于另一较佳实施例中，在共培养后，对一病患投药有核细胞与黏附性基质细胞以治疗或是预防疾病或是失调(例如血管、肌肉、肝脏、胰脏或是神经的疾病或是失调)、或是重建病患的免疫系统。在一较佳实施例中将有核细胞与黏附性基质细胞分离，且只对病患投药有核细胞以治疗或是预防疾病或是失调，或是重建病患的免疫系统。

在另一实施例中，有核细胞或是黏附性基质细胞皆适合用于人类病患。

本发明的第三方向，其特征在包含有核细胞与黏附性基质细胞的组合物，其中黏附性基质细胞与有核细胞是从脐带血中取得，且该组合物适于以灌注(infusion)或是移植物移入(engraftmenet)至一受试者。

在一实施例中，黏附性基质细胞包含间充质干细胞，例如非限制性体干细胞。在另一实施例中，非限制性体干细胞具有CD13⁺、CD29⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD166⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、CD45^-、CD34^-、以及CD14^-的特征。另外，非限制性体干细胞更可具有表达细胞外基质蛋白，且缺乏表达透明质酸合成酶，与纤维调节素(fibromodulin)的特征。

在另一实施例中，有核细胞为祖细胞(例如造血干细胞)。在一较佳实施例中，祖细胞选自CD34^-细胞、CD34⁺细胞或Lin^-细胞。在另一较佳实施例中，祖细胞为CD34⁺，Lin^-细胞。

在另一实施例中，有核细胞或是黏附性基质细胞对受试者(subject)而言是同种或是自体同源的。

在另一实施例中，有核细胞或是黏附性基质细胞为经基因修饰过的细胞。

就“投药”来说，其意指提供一人类病患一医药制备物，其单独包含所述祖细胞、或是包含其与非限制性体干细胞的组合，或是适当配方的它们的后代或是衍生物。较佳投药方法可取决于多种因素而改变，例如医药制备物的组成份、潜在或确实的疾病位置以及疾病的严重度。

就“有效量”来说，其意指足以产生有益或所欲的临床或生化结果的量。可以投药有效量一次或多次。为了本发明的目的，有效量为投药产生有益祖细胞移植物移入(engraftmenet)的非限制性体干细胞的量或是非限制性体干细胞与供给者祖细胞的组合的量。

就“移植物移入(engraftment)”来说，其意指埋植(implantation)细胞至身体中，以及/或是以注射(injected)的细胞代替已失去或是受伤的细胞。在细胞移植(transplation)到哺乳类后(例如人类)，随着时间过去，移植后(engrafted)的细胞存在一特定位置。

就名词“已增量族群”来说，其意指一细胞族群，例如本发明的祖细胞，其中至少50％的细胞已经分裂至少一次。

一个分子是一种所欲细胞种类的一个“标识”，若其出现在欲细胞种类的细胞上的细胞比例足够高，且其出现在非所欲种类的细胞上的细胞比例够低，而使得吾人可以从包含所欲细胞与非所欲细胞的一细胞族群中通过选出该细胞族群中具有该标识的细胞而达到所欲纯度的所欲细胞种类。一个标识可于诸如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的所欲细胞种类上表达，也可于诸如50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的非所欲细胞种类上表达。

如果在所欲细胞种类的细胞表面上，每个细胞少于50个标识分子的话，所欲细胞种类对于表达于细胞表面的所述标识就是阴性或是缺乏表达所述标识。用于侦测表达于细胞表面的标识分子的技术已广为本领域所知，例如包括有流式细胞技术(flow cytometry)。本领域具有通常知识者也可使用酵素放大染色技术(enzymatic amplificationstaining techniques)加上流式细胞技术以将表达低数量标识分子的细胞与不表达标识分子的细胞间作区别(参考Kaplan，Front.Biosci.7：c33-c43，2002；Kaplan et al，Amer.J.Clin.Pathol.116：429-436，2001；and Zola et al，J.Immunol.Methods 135：247-255，1990)。

就“造血干/祖细胞”来说，其意指来自脐带血的黏附性基质细胞，其包含造血干细胞，就如同为Wernet(美国专利申请案公开号2005/0142118)、Caplan et al.(美国专利案号No.5,486,359)、Ericeset al.(Br.J.Haematology 109：235-42，2000)、Naughton et al.(美国专利案号5,962,325)、Hariri et al.(美国专利申请案公开号2005/0019908)、Weiss et al.(美国专利申请案公开号2004/0136967)、Baksh et al.(美国专利申请案公开号2004/0137612)，以及Atala etal.(美国专利申请案公开号2005/0124003)所识别的那些细胞，于此并入各篇作为参考。

就“肌肉细胞”而言，其意指骨骼、平滑或心脏细胞。就“肌肉疾病”而言，其意指影响或是涉及诸如心脏、骨骼或平滑肌肉的肌肉疾病或是失调。肌肉疾病的例子包含诸如肌肉萎缩症(例如裘馨氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(BMD)、肢带型肌肉萎缩症与先天性肌肉萎缩症)、先天性肌肉病变，以及重症肌无力的运动神经疾病(neuromuscular disease)、诸如心脏病、主动脉瘤(马方氏症)心肌缺血症、郁血性心衰竭、心脏瓣膜疾病以及心律不整的心肌症，以及代谢性肌肉疾病。

就“神经细胞”而言，其意指神经元(例如感觉神经元、运动神经元或是中间神经元)或是中枢或是外围神经系统的支持细胞。神经元的例子包含锥状细胞、贝式细胞(Betz cell)、星状细胞(stellatecells)、水平细胞、颗粒细胞、柏金氏细胞、脊椎运动神经元，以及神经节细胞。支持细胞的例子包含神经胶细胞、寡树神经胶质细胞、星状神经胶细胞(astrocytes)、卫星细胞、微小胶细胞，以及许旺细胞(Schwann cells)。

就“神经疾病”而言，其意指影响或是涉及中枢或是外围神经系统的疾病或是失调。神经疾病的例子包含多发性脑梗塞失智症(MID)、血管型失智症、脑血管外伤(cerebrovascular injury)、阿滋海默症(AD)、神经线纤维瘤病、亨丁顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、中风、帕金森氏症(PD)、发育中神经系统病症(pathologies ofthe developing nervous system)以及创伤，例如头部创伤。其它神经疾病的例子为影响眼睛组织的疾病，例如视柄、视网膜层、晶状体(lenses for eye)以及内耳。在某些实施例中病患可能患有神经退化疾病、外伤性损伤、神经毒损伤、局部缺血、发育失调、影响视力的失调、脊髓损伤或疾病或是髓鞘脱失性疾病。

就“祖细胞”而言，其意指具有多重体系分化以及自我更生能力，以及重新产生组织的能力的细胞。虽然本发明中对祖细胞的描述大部分有关于使用脐带血祖细胞，然而本发明并不受限于此，且可包含其它来源的祖细胞，包含但不限于造血干细胞、肝脏干细胞、胰脏干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、外围血液干细胞、脐带血干细胞或是其混合。再者本发明并不受限来自任何特定来源的任何特定祖细胞的移植(transplatation)，而可包含来自“多重干细胞来源”的祖细胞互相混合的混合物。所以非限制性体干细胞可用来与从单一或多重干细胞来源取得的祖细胞共移植(cotransplantation)，以增加移植物移入(engraftment)量。

就“样本”或“生物性样本”而言，其意指任何取自个体、体液、细胞株、组织培养或其它可能含有祖细胞的来源的生物性样本。

“干细胞”或“多潜能干细胞(pluripotent stem cell)”可互相替换使用，其意指具有能力产生一个有机体的二种或是更多细胞种类的细胞。

就“受试者”而言，其意指脊椎动物，较佳为哺乳类，更佳为人类。

就“实质已纯化”而言，其意指所欲细胞(例如祖细胞以及/或是非限制性体干细胞)增进至少30％，较佳为增进至少50％，更佳为增进至少75％，最佳为增进至少90％或甚至是95％。

就“治疗上有效蛋白”而言，其意指一多肽，其改善或是维持表达该多肽的细胞的健康或是邻近该表达多肽细胞的细胞的健康。治疗上有效蛋白的例子包含但不受限于刺激因子、细胞因子、抗凋亡因子、集落刺激因子、荷尔蒙、抗病毒蛋白、脂皮素(lipocortins)、脂素(lipotropins)、白介素、干扰素、刺激因子、激酶、纤维性囊肿跨膜传导调节蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、细胞表面蛋白、人类胰脏酵素以及脑内啡。更特别为生长荷尔蒙(GH，例如人类生长荷尔蒙)、干扰素(IFN，例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、白蛋白、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNF-α或TNF-β)、α-抗胰蛋白酶(α antitrypsin)、水蛭素、红细胞生成素、血小板生成、粒细胞集落刺激因子、尿激酶、第八凝血因子、第九凝血因子、淀粉酵素解脂酵素、乳糖酵素、人类血清白蛋白、脂肪酸释放激素、醛固酮、肾上腺皮促素(ACTH)、绒毛膜性腺激素、促肾上腺皮质素释放素、促肾上腺皮质素、六碳糖激酶、葡萄糖激酶、促滤泡素释放素、促滤泡素、升糖素促性腺素释放素(glucagon gonadoliberin)、促性腺素、脑下腺激素、胰岛素、黄体生成素释放激素、生长激素释放因子、组织胺释出因子(histamenreleasing factor)、促黄体素、促黑激素、副甲状腺素、腮腺激素、泌乳激素、促乳素释放素、促乳素抑制素、促生长素释放素、促生长素(somatotropin)、甲促素、(TPA)、组织型纤维蛋白酶原活化剂、缪勒管抑制质(MIS)、体抑素、降钙素、(CGRP)、降钙素基因相关肽、β降钙素基因相关肽、恶性肿瘤因子的高血钙症(1-40)(PTH-rP)、副甲状腺素相关蛋白(107-139)(PTH-rP)、副甲状腺素相关蛋白(107-111)(PTH-rP)、促甲状腺激素、胆囊收缩素、苷丙胺激素讯息相关肽(galanin message associated peptide)、苷丙胺激素前体肽原(60-105)(preprogalanin 65-105)、胃泌素I、胃泌素释放肽、升糖素类多肽(GLP-1)、人胰抑制素、胰多肽、肽YY、组氨酸甲硫胺酸肽(peptide histidine methionine，PHM)、分泌素、肠血管活性多胜(VIP)、催产素、加压催产素、脑内啡醯胺(enkephalinamide)、(马特吩醯胺metorphinamide)(肾上腺皮质吩adrenophine)、α-促黑素细胞因子(alpha-MSH)心房利钠因子(5-28)(ANF)、胰淀素、淀粉质P成分(SAP-1)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、神经胜肽Y、K物质(神经激素A(NeurokininA))、p物质、甲促素刺激素(TRH)、组织胺释出因子、促滤泡成熟激素、瘦体蛋白、血管紧缩素I、血管紧缩素II、β脑内啡、β黑细胞促素(β-MSH)、内皮素I、苷丙胺激素、胃抑制性胜(GIP)、脑素(neurophysins)、表皮刺激因子、血小板源刺激因子、纤维组织母细胞刺激因子、肝细胞刺激因子、类胰岛素刺激因子1、GLUT-2、升糖素类多肽(GLP)-1、胰岛素促进因子1(IPF1)、激素原转化脢2(PC2)、激素原转化脢3(PC3)、多肽甘氨酸酰胺化单加氧酶(peptidylglycin alpha-amidating monooxygenase，PAM)、升糖素类多肽-1受体、葡萄糖依赖性胰岛素刺激多肽受体、杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)、磺脲类受体(SUR)、生长激素释放因子受体(GHRFR)、生长素释放激素(GHRH)、生长素释放激素受体(GHRHR)以及血管升压素。

就“转植基因(transgene)”而言，其意指通过人工短暂或是永久地插入到细胞中的任何核酸分子的片段(例如DNA)，且如果其插入到基因组或是维持在细胞核外，则其变成该有机体的一部分。这样的转植基因可包含对转植有机体而言部分或是全部异种(外来)的一基因，或可能是表达与该有机体内生性基因同源的一基因。

就“基因转植细胞(trsnagenic cell)”而言，其意指包含转植基因的细胞。例如以一个可连结一异种核酸分子的表达载体转化(transformed)的细胞可以用来产生具有改变的表现型特性的细胞族群。只要由基因转植有机体衍生出的细胞还包含该转植基因，则其也是一基因转植细胞。

就“移植物(transplant)”或“移植(transplanting)”而言，其意指投药一或多细胞(或其的一部分)、细胞产物、组织或由移植(graft)到人类宿主的细胞衍生出来的细胞培养产物。特别地，移植物(transplant)是经由如这里所述操作细胞而产生。这些细胞可进一步被操作以包含异种遗传物质，例如转植基因。

就“治疗”而言，其意指一种取得有益或所欲临床结果的方法。对本发明目的来说，有益或所欲临床结果包含但不受限于不论是可侦测或是不可侦测的缓和症状、缩小疾病范围、稳定疾病状况(亦即不恶化)、延缓或是减慢疾病发展、改善或减轻疾病状况、缓解(无问部分或是完全)。“治疗”也可意指延长存活，这是相较于没有治疗的预期存活来说。需要治疗的包含已经具有失调的那些，以及应该预防该失调的那些。“减轻”疾病意指疾病状况的范围以及/或是非所欲的临床表现变少，以及/或是与没有治疗的情况相比下，发展的时间过程变慢或是延长。典型地，“治疗”必须额外投药有效祖细胞给病患，以再生组织。

就“脐带血细胞”或是“胎盘血(placental blood)细胞”而言，我们意指分娩后仍留在脐带与胎盘中的血。如同骨髓，已知脐带血为祖细胞以及或是干细胞的丰富来源。

就“血管细胞”而言，其意指内皮细胞。内皮细胞沿血液与林巴管排列且在诸如脑、心脏、肝脏、胰脏、肺脏、脾脏、胃、肠以及肾脏的器官的发育中出现并扮演一个重要角色。

就“血管疾病”而言，其意指影响或涉及维管系统的一种疾病或失调。血管疾病的例子包含未稍血管疾病(peripheral vasculardisease)、周边动脉疾病、静脉疾病(例如深部静脉栓塞)、局部缺血、心血管疾病、组织器官移植物移入排斥(tissue organ engraftmentrejection)或是缺血再灌流损伤的后遗症。于另一实施例中，未稍血管疾病为动脉粥状硬化、血栓栓塞疾病或是伯格氏病(Buerger’sdisease)(血栓闭塞性血管炎)。于又一实施例中，心血管疾病为心肌梗塞、心脏病，或是冠状动脉疾病。

附图说明

图1A与图1B分别为脐带血衍生黏附性细胞于培养条件下经过一周与四周的显微图(x 400)。

图2为来自脐带血的非限制性体干细胞的生长曲线图。脐带血衍生非限制性体干细胞以10⁴细胞/平方公分(cells/cm²)的密度培养于盘子中；复制出的细胞以每四天收成一次的方式培养24天，以决定黏附性细胞的数目。结果以平均值±标准误差(mean±SEM)表示。

图3为脐带血造血干/祖细胞的增量趋势图。其中-K-：添加有外生性细胞因子的共培养系统；-R-：不添加外生性细胞因子的共培养系统；-G-：控制组系统。

图4为粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)以及高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony-forming cells，HPP-CFC)的增量图。其中A：GM-CFC；B：HHP-CFC；a：来自起始CD34⁺细胞部分的集落数；b：在添加有外生性细胞因子的共培养系统中的增量细胞所产生的集落数；c：在不添加外生性细胞因子的共培养系统中的增量细胞所产生的集落数；以及d：在控制组系统中的增量细胞所产生的集落数。

图5为以甲苯胺蓝染色的经诱导细胞的显微图(x 400)。经诱导细胞分泌出以甲苯胺蓝染色为阳性的异染性基质(metachromaticmatrix)。

图6显示以胶原基因特定引子的作出的RT-PCR的结果。

图7显示移植(transplanted)或是未移植已增量造血干/祖细胞的经放射处理NOD/SCID小鼠中的白细胞族群的恢复图。

图8显示于NOD/SCID小鼠的骨髓与外围血液中的人类细胞特定Alu序列片段的PCR侦测图。参见lane1与lane 2，PCR分析证明人类造血细胞出现在经移植(transplanted)于培养系统中增量的HSPCs的NOD/SCID小鼠中；Lane4以从人类脐带血细胞抽出的DNA作为正向控制组；lane 1为没有移植(transplantation)的负向控制组，lane 5为DNA标志。

实施方式

我们已确定存在脐带血中的黏附性基质细胞可用来支持同样也存在于脐带血中的有核细胞的增量。黏附性基质细胞与有核细胞可分别制备然后加入一共培养中，其产生细胞的增量程度变大，这是相较于如果单独培养有核细胞所观察到的结果来说。

本发明中所使用的来自脐带血的黏附性基质细胞包含间充质干/祖细胞(MSPCs)，就如同为Wernet(美国专利申请案公开号2005/0142118)、Caplan et al.(美国专利案号No.5,486,359)、Ericeset al.(Br.J.Haematology 109：235-42，2000)、Naughton et al.(美国专利案号5,962,325)、Hariri et al.(美国专利申请案公开号2005/0019908)、Weiss et al.(美国专利申请案公开号2004/0136967)、Baksh et al.(美国专利申请案公开号2004/0137612)，以及Atala etal.(美国专利申请案公开号2005/0124003)所识别的那些细胞，于此并入各篇作为参考。

本发明中可使用的取自脐带血的有核细胞是包含免疫细胞(例如多潜能干细胞，诸如造血干细胞(包含例如CD34^-细胞或CD34⁺细胞，以及Lin^-细胞)，以及成熟细胞(例如粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞))。

本发明中所使用的黏附性基质细胞包含间充质干/祖细胞(MSPCs)。间充质干/祖细胞可于活体外(ex vivo)大量增殖，且当其于许可条件下培养时，保留其分化成多重体系的能力，包含骨、软骨、腱、肌肉、神经以及基质细胞。间充质干/祖细胞具有强大的治疗潜力，这是因为它们的自我更生以及分化成多重组织的能力。

本发明已确定取自脐带血的黏附性基质细胞，例如间充质干/祖细胞，例如非限制性体干细胞，可支持包含祖细胞的有核细胞，以及其它存在于脐带血中的成熟有核细胞的活体外增量，其中祖细胞诸如造血干祖细胞、CD34^-细胞或CD34⁺细胞，以及Lin^-细胞，成熟有核细胞包含粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞。当黏附性基质细胞与有核细胞共移植(co-transplanted)时，取自脐带血中的黏附性基质细胞，例如间充质干/祖细胞，也可用来增加存在于脐带血中的有核细胞的移植物移入(engraftment)，例如祖细胞(诸如造血干祖细胞、CD34^-细胞或CD34⁺细胞，以及Lin^-细胞)以及成熟细胞(例如粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞)。最后从人类脐带血分离出的间充质干/祖细胞可随时于试管中(in vitro)增量且被诱导分化成软骨素原细胞(chrondogenic cell)。

当共培养时黏附性基质细胞支持有核细胞增量

当黏附性基质细胞与有核细胞共培养时，取自脐带血的黏附性基质细胞，例如间充质干/祖细胞，例如非限制性体干细胞，可支持取自脐带血的诸如祖细胞与成熟细胞的有核细胞的活体外增殖与分化，其中祖细胞诸如造血干祖细胞(例如CD34^-细胞或CD34⁺细胞，以及Lin^-细胞)，成熟细胞例如粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞。当共培养时，黏附性基质细胞支持有核细胞的活体外增量是于存在或是没有外生性细胞因子下发生，(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、白介素2(interleukin2，IL-2)、白介素3(interleukin 3，IL-3)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、FLT-3配位体、转型刺激因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、巨核细胞生长和发育因子(megakaryocyte growth and development factor)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)。特别地是，添加外生性G-CSF可增进共培养时黏附性基质细胞促使有核细胞增量的能力。可被包含于共培养中的额外因子包含HOX-B4以及Wnt等的细胞因子。在与黏附性基质细胞共培养下，有核细胞的增量可被支持至少该细胞的15继代。共培养产生至少2倍增量的有核细胞，较佳为5倍、10倍、20倍或是50倍增量，且最佳为100倍、1,000或是1,000,000倍增量，或是多于有核细胞经过至少连续一天的量，较佳为一或二周，最佳为一个月，这是相对于经过相同时间在没有黏附性基质细胞出现时所发现的增量。相较于没有黏附性基质细胞的有核细胞的培养来说，有核细胞与黏附性基质细胞的共培养将产生较大数目的增量细胞。

起始包含诸如祖细胞与成熟细胞的有核细胞与例如MSPCs的黏附性基质细胞的共培养可通过于一适当容器，例如生物反应器中先制备一层黏附性基质细胞。一但基质细胞黏附上去，可将有核细胞添加至该容器中。取代地，可将有核细胞与黏附性基质细胞两者同时添加至容器中并进行培养。

共培养有核细胞与黏附性基质细胞也可在有核细胞与黏附性基质细胞没有直接接触的情况下实施，例如以一个半通透膜分隔的双层培养皿(transwell plate)。在此实施例中，这些细胞仍维持液体接触，这是因为它们皆浸泡在相同的培养基中。所以，这些细胞可共享刺激因子、ECM化合物，以及其它分泌出的因子。

在共培养后，可分离不论是有核细胞或是黏附性基质细胞，以产生用于投药病患的实质已纯化细胞族群。取代地，可将有核细胞与黏附性基质细胞一起投药。不论是在共培养前或是在共培养后都可将有核细胞或是黏附性基质细胞增量以增加它们的数目，在有核细胞为祖细胞的例子中，例如造血细胞，较佳地，不允许祖细胞进行分化一直到其于共培养中增量后。一但该细胞倍增量，可将它们与黏附性基质细胞分离，并诱导其分化，或是也可在黏附性基质细胞出现情况下诱导它们分化。这些细胞也可以为分化状态将其投药病患。

使用来自脐带血的黏附性基质细胞的共移植(cotransplantation)以及移植物移入(engraftment)

相对于在没有黏附性基质细胞情况下移植(tranpanted)有核细胞而言，当将取自脐带血诸如间充质干/祖细胞的黏附性基质细胞与同样取自脐带血诸如祖细胞或是成熟细胞的有核细胞共移植(cotransplantation)时，会增加有核细胞的移植物移入(engraftment)，其中间充质干/祖细胞例如为非限制性体干细胞，祖细胞例如造血干祖细胞(诸如CD34^-细胞或CD34⁺细胞，以及Lin^-细胞)。黏附性基质细胞也在有核细胞上显示耐受效果。所以黏附性基质细胞可以在使用同种的供给者细胞来移植(transplantation)时用来增强移植对抗移植(graft-versus-graft)的耐受度。同种的供给者细胞可从不同来源取得并将其结合，而它们对彼此的免疫耐受度可通过共移植(cotranaplantation)黏附性基质细胞而增强。

虽然较低的输入细胞数目是相关于较高的移植物移入(engraftment)延迟率或是失败率，然受试者对所移植(transplanted)的供给者细胞的免疫反应已变成可被投药的供给者细胞的数目的主要限制因子。现在黏附性基质细胞在有核细胞上的耐受效果允许较大数目细胞的移植(transplantation)。

黏附性基质细胞，例如间充质干/祖细胞，在同种的免疫反应上发挥强而有力的抑制效果。所以，可通过将诸如祖细胞以及/或是成熟细胞的供给者有核细胞与黏附性基质细胞共移植(cotransplantation)而抑制移植对抗移植反应，该反应通常发生于供给者细胞的移植(transplantation)背景下。当共同投药时，例如间充质干/祖细胞的黏附性基质细胞也促使一更高的有核细胞供给者有核细胞移植物移入(engraftment)的总水平。共移植(cotransplantation)黏附性基质细胞促使显着较高的有核细胞移植物移入(engraftment)水平，而这些更高的水平可充分地相关于更平衡的移植物移入(engraftment)以及多能淋巴骨髓重建(multipotent lympho-myeloid reconstitution)的显示。

纯化黏附性基质细胞

黏附性基质细胞，例如间充质干/祖细胞，可如同美国专利申请公开号2002/0164794所揭露的方式分离与纯化，于此并入该专利以作为参考。举例来说，黏附性基质细胞可通过密度梯度分离、培养黏附性细胞以及通过施加刺激因子进行二次培养的步骤而加以分离与纯化。于建立汇合成片(confluent)的细胞层，取得黏附性基质细胞的该分离步骤是以使用针对CD13(阳性)、CD45(阴性)以及CD29(阳性)的表面抗原的抗体通过型态以及表现型分析而受控制。

在本发明的一实施例中，非限制性体干细胞为所述用来共培养与带核以及/或是祖细胞移植物移入(engraftment)的间充质干/祖细胞。非限制性体干细胞对于造血体系的特定标识，例如CD45，呈阴性，因此，其不同于可能也从胎盘脐带血中分离出的造血干细胞。CD14是另一个不能在非限制性体干细胞上侦测到的表面抗原。非限制性体干细胞更具有对一套出现于细胞表面的抗原，例如CD13、CD29、CD44及CD49e为阳性的特征。非限制性体干细胞的制备物更以出现某些诸如表皮刺激因子受体(EFG-R)、血小板源刺激因子受体α(PDGF-RA)、以及胰岛素刺激因子受体(IGF-R)5的受体分子的mRNA转录子为特征。这些细胞点型地也表达转录因子，例如RT-PCR所侦测到的Y-box转录因子(Y-box transcription factor 1，YB1)，Runt相关转录因子(runtrelated transcription factor 1，Runxl)，以及急性骨髓性白血病1转录因子(acute myeloid leukemia 1 transcription factor，AML1C)。非限制性体干细胞的制备物典型地对软骨素原转录因子(chondrogenic transcription factor)Cart-1的转录子以及神经标识，例如神经纤维丝(neurofilament)、突触素(synaptophysin)、酪氨酸氢氧化脢(tyrosine hydroxylast，TH)以及神经胶微纤维酸性蛋白(glial fibriallary acidic protein，GFAP)成阴性。

表1：以RT-PCR对非限制性体干细胞的转录型态分析

RT-PCR的结果是通过预料的寡核酸引子以及来自非限制性体干细胞(USSCs)的mRNAs以及来自其它组织(例如骨、软骨、大脑或是脐带血单核细胞)的mRNA的正向控制组而达成。

名称	USSCs的PCR结果	其它组织的PCR结果
			血小板源刺激因子受体α	+	+(成人骨)
胰岛素刺激因子受体	+	+(成人骨)

神经纤维丝	-	+(成人肝脏)
			CD105	+	+(脐带血单核细胞)
神经胶微纤维酸性蛋白	-	+(胎大脑)
			突触素	-	+(胎大脑)
酪氨酸氢氧化脢	-	+(胎大脑)
			YB1	+	+(胎大脑)
Runx1	+	+(成人骨)
			AML1c	+	+(成人骨)
第二型骨形成蛋白受体(BMPR II)	+	+(成体软骨)
			第一型胶原蛋白(collagen type I)	+	+(成人骨)
Cart-1	-	+(脐带血单核细胞)
			软骨黏附蛋白(Chondroadherin)	-	+(成人骨)
CD49e	+	+(成人骨)

非限制性体干细胞的制备物以及骨髓衍生基质干细胞(MSCs)的RAN表达已直接通过使用计量生物芯片微数组(Affymetrix GeneChip^TM)而相比较(Caplan，1991)。已知可在USSCs上但不能在MSCs上侦测到细胞外基质蛋白-2基因(基因库编号X82494)的转录子。先前已在纤维组织母细胞上证实细胞外基质蛋白-2的生产(Pan et al.，1993)。Northern blot analysis of mRNA以北方转印法分析来自各种人类组织的mRNA揭示在心脏、胎盘与卵巢组织中有大量4.5kb转录子(Zhanget al.，1994)。在怀孕4-10周人体胚胎中使多株抗体已可在光学显微镜下发现所述蛋白。起初，细胞外基质蛋白-2是在神经亲皮(neurophithelium)、脊神经节，以及外围神经元侦测到(Misoge et al.，1996)。

在大鼠动物模式中，大鼠肝脏的肌肉纤维组织母细胞(myofibroblasts)(rMF)与细胞外基质蛋白-2位在一起。这些细胞位于肝门范围(portal field)、主静脉壁以及偶尔位在薄壁组织(parenchyma)上。在纤维症的早期，可在发展中的伤痕(developingscars)侦测到肝脏的肌肉纤维组织母细胞。在纤维症的后期，肝脏的肌肉纤维组织母细胞在伤痕中的细胞中占大部分(Knittel et al.，1999)。在另一动物模式中，小鼠细胞外基质蛋白-2表现于胚胎心脏发育期间的心内膜垫(endocardial cushions)基质中上皮细胞转形成间充质细胞的期间。细胞外基质蛋白-2也会由分别源自神经脊细胞(neural crest cells)与心外膜细胞(epicardial cells)的发展中主动脉弓部血管(aortic arch vessels)的平滑肌祖细胞，以及冠状动脉内皮细胞(coronary endothelial cells)所合成(Tsuda et al.，2001)。

透明质酸合成酶(Hyaluronan Synthase)基因(D84424)与纤维调节素(Fibromodulin)基因(UO 5291)的转录子，以及INFLS(WO3846)的转录子并未在非限制性体干细胞中侦测到，却在MSCs中侦测到有高量。北方转印分析指出透明质酸合成酶无所不在地表现在人类组织中(Itano and Kimata，1996)。这个酵素的产物，即透明质酸(Hyaluronan)，适用于多种功能，包含填补空洞、润滑关节以及供应一个可令细胞透过其迁移的基质(Hall et al.，1995)。纤维调节素小的细胞间充质蛋白多糖(interstitial proteoglycans)家族的一员。已显示这个蛋白具广泛组织分布，观察到最高量是出现在关节软骨(articular cartilage)、腱以及韧带(Sztrolovics et al.，1994)。INFLS的转录子已从人类胎体肝脏中克隆出来。

相较于在MSCs中的表现量，CD24基因(L33930)是以很低的量表现在非限制性体干细胞中。CD24表现于许多B-体系(B-lineage)细胞中，以及成熟的粒细胞上(Van der Schoot et al.，1989)。

非限制性体干细胞以不表现第一型人类白细胞表面抗原(humanleukocyte antigen class I，HLA-class I)为特征。与非限制性体干细胞相反，先前讨论的由骨髓以及肌肉组织分离出的MSCs在其表面上表现非常高量第一型人类白细胞表面抗原。非限制性体干细胞也表现时期专一性早期抗原(stage specific early antigen 4，SSEA4)。

典型地，非限制性体干细胞具有纤维组织母细胞的外型，且以黏附方式增殖。

非限制性体干细胞可以出现在代表其它体干细胞前驱物的多种混合物中，例如多种表现AC 133与CD34的造血体系、间充质祖体干细胞、神经元祖体干细胞或其组合。基于可分化成其它不同体干细胞的可能性，这样的组合提供高度再生潜能。

对于本发明来说有用的某些药剂包含与祖细胞一起的非限制性体干细胞。所述药剂可更包含制药上或是医药上可接受的载体物质或是辅助物质。当非限制性体干细胞与祖细胞一起投药时，可直接投药或是与医药上可接受的载体或是佐剂一起投药。添加额外的治疗上活性物质可能是有利的。

收集与增量脐带血细胞

The脐带血细胞可以本领域已知方法收集，可参见示例(Koike etal.，Acta Paediatrica Japonica 25：275-282，1983)，且其可以例如美国专利号5,674,750、美国专利号5,925,567以及美国专利号6,338,942所描述的方法增量。诸如祖细胞的有核细胞以及诸如MSPCs的黏附性基质细胞可从脐带血取得，且可根据本发明被使用。有核细胞可在黏附性基质细胞存在与没有黏附性基质细胞的情况下于细胞生长条件下增量，细胞生长条件意指促使细胞增殖(有丝分裂活性)的条件。

从脐带血分离单核细胞

小心地将脐带血加入菲可a(Ficoll a)溶液中(密度1.077克/立方公分)，进行密度梯度离心(450g，室温，25分钟)。收集位于接口的单核细胞(MNC)，并将其以pH 7.3的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次。

增量黏附性基质细胞的培养条件

黏附性基质细胞，例如MSPCs，可使用包含10奈克/毫升(g/ml)类胰岛素刺激因子1(IGF-I)，10ng/ml血小板衍生刺激因子(PDGF)-BB以及10ng/ml重组人类上皮刺激因子(recombinant human epidermalgrowth factor，rh-EGF)(PEI培养基)的H5100培养基，以介于1×10⁴and 1×10⁵细胞/毫升(cells/ml)的密度增量。取代地，可在起始生长培养基中增量黏附性基质细胞的制备物。

单独或是与黏附性基质细胞一起投药有核细胞

各式传输(delivery)系统为已知，且可用于投药有核细胞，不论是以其与黏附性基质细胞共培养或是在共培养其与黏附性基质细胞分开的方式。所介绍方法的方法包含但不受限于皮肤(intradermal)、肌肉(intramuscular)、腹腔(intraperitoneal)、静脉(intravenous)、皮下(subcutaneous)、鼻腔内(intranasal)、膜外(epidural)、以及口服路径。可以方便的路径投药，例如灌注(infusion)或是快速注射(bolus injection)，且可能与其它生物性有效剂一起投药。可以是系统的或是局部的投药。另外，以任何路径引入细胞至中枢神经系统可能是令人满意的，包括脑室内(intraventricular)以及脑室外(intrathecal)注射，通过脑室内导管可能促进脑室内注射。

在一特定实施例中，局部投药本发明细胞至需要治疗的区域可能是令人满意的。这可通过但是不受限于例如通过于手术期间进行局部灌注、通过注射、通过导管方式或是通过埋植物(implant)的方式达成，该埋植物为孔状、非孔状，或是胶状材质，包含膜，例如硅弹性(sialastic)膜或是纤维。再另一实施例中，细胞或是细胞制备物可以于一载体中传送，特别是脂质体(例如一封装脂质体)。

通常MSCs的投药方法可以一种类似的方式用于投药黏附性基质细胞。举例来说，干细胞的投药已描述于B.E.Strauer et al.M.的“Mrakoronare，humane autologe Stammzelltransplantation zurMyokardregeneration nach Herzinfarkt”，Dtsch.Med.Wochenschr2001，126：932-938、Quarto R.，et al.，″Repair of Large BoneDefects with the Use of Autologous Bone Marrow Stroma Cells″.N.Eng.J.Med.2001；344：385-386、Vacanti C.A.，″Brief Report：Replacement of an Avulsed Phalanx with Ti ssue-Engineered Bone″N.Eng.J.Med.2001，344：1511-1514，May 17，2001、Hentz V.R.，″Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb″，N.Eng.J.Med.2001，344：1547-1548、Brittberg M.，″Treatment of DeepCartilage Defects in the Knee with Autologous ChondrocyteTransplantation″，N.Eng.J.Medl994，331：889-895，Oct.6，1994、Freed C.R.，″Transplantation of a Tissue-Engineered PulmonaryArtery″，N.Eng.J.Med.2001，344：532-533，以及Shapiro A.M.J.，Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 DiabetesMellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive RegimenN.Eng.Med.2000；343：230-238。这些参考文献于此并入作为参考。

系统灌注

共培养有核细胞与黏附性基质细胞后，有核细胞可与黏附性基质细胞分开或是它们可以仍然一起留在制备物中，且可马上使用或是可加以储存以备将来使用。如细胞被分开，可更进一步地增量有核细胞或是黏附性基质细胞，如果想要的话，可在此的后马上使用或是可加以储存以备将来使用。在单一储存样本中的细胞数目不足的情况下，可以组合数个这样的样本以提供足够数目的细胞。再者，与其使用整个有核细胞族群以及/或是黏附性基质细胞族群，不如可使用具有丰富特定细胞种类的子族群，诸如干细胞或是其它祖细胞(例如已增量的祖细胞或MSPCs可先将其分化成一种或一种以上预先决定的细胞种类并将其投药至病患)。

在共培养后，可以灌注将有核细胞(不论是与黏附性基质细胞分开或是一起)投药至病患中，这是通过例如冠脉内(intracoronary)灌注、逆行性静脉(retrograde venous)灌注(参见例如Perm and Silva，Cwr.Opin.Hematot.11：399-403，2004)、心室内(intraventricular)灌注、脑室内(intracerebroventricular)灌注、脑脊髓内(cerebrospinal)灌注，以及颅内(intracranial)灌注。

可预见人类治疗可能需要使用如同先前所讨论的共培养方法所制备的任何细胞组成物，或是共培养后所述细胞的各种已丰富以及已增量的子族群的多重灌注。可随着时间投药数个细胞的灌注，诸如第一天一次，第五天第二次，第十天第三次。在起始的十天周期之后，可能有诸如2周到6个月的一个时间周期没有投药细胞，在所述时期后，重复所述十天投药规则(protocol)。不论投药是单次灌注治疗或是多重灌注治疗，接受者很可能都需要免疫抑制(immunosuppression)。因应此所产生的规则将仿效目前以好比环孢灵(cyclosporin A)与FK506等剂而用于为了骨髓置换(亦即人类的移植(transplantation)细胞的前例)。

直接注射

有核细胞单独或是与黏附性基质细胞或是这些细胞的已扩充子族群一起的另一可能投药路径是通过直接外科注射(诸如心肌内(intramyocardial)或是穿心内膜(transendocardial)注射、颅内、脑内(intracerebral)或是脑池内(intracisternal)注射、肌肉注射、肝注射以及胰注射)至身体中将要治疗的组织或是区域(诸如大脑、肌肉、心脏、肝脏、胰脏以及维管系统)。投药方法可能也需要具有长达2周到6个月的治疗中断间隔的多重注射，或是由主治医生所决定的其它方式。

埋植(implantation)

也可通过将有核细胞与黏附性基质细胞埋植到疾病或是损伤部位，或是促进治疗疾病或是损伤的部位而投药到病患。

疾病治疗

如同以下所讨论的，本发明的方法可用来治疗任何人类病患，不论是因一种或一种以上所揭露的疾病或是失调所苦的小孩或是成人。

一但如上所述地通过共培养以增加细胞数目而制备有核细胞单独或是与黏附性基质细胞一起的有核细胞，可将其投药给病患以治疗疾病或是失调。较佳地，使用标准的六移植(transplantation)标识为病患分类细胞。当较佳情况为细胞显示为6/6相配(match)时，黏附性基质细胞(诸如MSPCs)于同种细胞上的耐受效果(诸如来自这个病患以外的一个供给者的共培养有核细胞)允许不显示6/6相配的细胞投药，诸如4/6相配。任何排斥的发生可通过使用如下描述的标准方法补偿，诸如投药环孢灵(cyclosporin A)与FK506。

基于黏附性基质细胞有关促进有核细胞移植物移入(engraftment)的有利效果，本发明可用来治疗由于灌注与移植物移入(engraftment)这样的细胞，这将有助于其治疗的各式疾病。这样的疾病可包含但不受限于白血病、乳癌、淋巴瘤、霍奇金氏症、再生不良性贫血(aplasticanemia)、镰刀形红血球贫血症(sickle cell anemia)、各式其它癌、血液疾病、遗传/基因基疾病(hereditary/genetic conditions)以及免疫系统失调、肺癌、多发性硬化症、红斑性狼疮、AIDS以及许多其它基因失调。

另外，投药用细胞可以是自然细胞或是可能在其各式基因上经过不会负面改变所述细胞的移植物移入(engraftment)的有效性的基因工程者。在移植(transplanting)前，带核细可与黏附性基质细胞一起培养，或是可以在移植(transplanting)前马上将它们结合。

器官/组织再生

再生本发明的祖细胞或是其后代，不论是单独或是与黏附性基质细胞或是其后代一起，可用于各式应用中。这些包含但不受限于不论是如同这里所描述的非附着形式或是附着到例如3D构造的细胞移植(transplantation)或是埋植(implantation)。典型地，于单一程序中所移植(transplanted)的10²到10⁹细胞，辅以依需求执行额外移植物(transplant)。可将根据本发明的方法所制造的组织用于修复或是置换已损害或已破坏组织、增强现有组织、引进新的或是经改变的组织、修改人工义肢、或是结合生物组织或结构。

如果有核细胞或是黏附性基质细胞是由对接受者来说为衍生自异种来源，可伴随投药免疫力抑制治疗，例如投药拒绝反应抑止药或FK50的免疫力抑制剂。然而，因为取自脐带血的祖细胞的不成熟状态，以及因为诸如MSPCs的黏附性基质细对有核细胞的耐受效果，可能不需要上述的免疫力抑制治疗。因此，在一个例子中，取自脐带血的有核细胞可在没有免疫调节(例如免疫抑制)治疗下单独或是与黏附性基质细胞一起在共培养后或是将它们结合后马上投药至一接受者。

另外，可将由取自脐带血的有核细胞或其后代所产生的新组织所制备的胞外基质(matrix)的注射投药给受试者或可将其用于进一步培养细胞。这样的细胞、组织与胞外基质可做为下列用途，例如修复与置换或是增强已因疾病或是外伤而受伤的组织、或是没有正常发育的组织、或是作为化妆品。

可将取自脐带血的有核细胞或其后代与黏附性基质细胞或其后代的制备物直接注射或投药制欲产生新组织的部位。例如但不受限于可将细胞分散于水胶(hydrogel)溶液以用于注射。取代地，于埋植前，可允许含有细胞的水胶溶液于例如一个模子(例如维管或是管状组织的概念)中硬化以形成具有细胞分散于其中的基质。一但基质硬化，可培养细胞制备物使得在埋植前有丝分裂增量细胞。水胶为有机聚合物(天然的或是合成的)，其以共价、离子、或是氢毽交联而产生3D开格式(open-lattice)结构，其网住水分子以形成胶。可用来形成水胶的材料的例子包含离子交联者，诸如褐藻酸(alginate)及其盐类的多糖、多磷酸胺(polyphosphazines)、以及聚丙烯酸酯(polyacrylates)，或是通过温度或是pH交联的嵌段聚合物(block polymers)，例如普洛尼克PLURONICS^TM或是特着尼克TETRONICS^TM(BASF Corp.，Mount Olive，N.Y.)、聚氧化乙烯-聚丙二醇(polyethylene oxide-polypropyleneglycol)嵌段共聚物。水胶材料形成方法与制备水胶的方法都已为本领域所知。

这样的细胞制备物可更包括一种或一种以上其它成份，包含精选的胞外基质成份以及药物，精选的胞外基质成份例如为一种或是一种以上本领域已知的胶原种类，以及/或是刺激因子。可以有效地混入细胞配方中刺激因子包含一种或是一种以上本领域已知或是将来发现的组织刺激因子，例如但不受限于下列成员：TGF-β家族、IGF-I与IGF-II、生长荷尔蒙、诸如BMP-13的BMP，及其类似物。取代地，可将取自脐带血的有核细胞与黏附性基质细胞基因工程以表现与制造生长荷尔蒙，诸如BMP-13或TGF-β。于本文中提供本发明有关细胞基因工程的细节。可有效地混入细胞制备物的药包含例如抗发炎化合物以及局部麻醉剂。可包含于制备物中的其它化合物包含例如提供适当pH以及等渗透压的缓冲剂、润滑剂、将细胞保持在或是靠近投药部位的黏性(viscous)材质(例如褐藻酸、琼脂以及植物胶)，以及可在投药部位产生所欲效果的其它细胞种类(例如组织形成或其物理化学特性的增进或是修改、支持细胞的存活率、或是发炎或是排斥的抑制)。

可直接投药取自脐带血的有核细胞以及/或是黏附性基质细胞，可通过活体内与组织接触而诱导分化这些有分化能力的细胞，或是可于投药前使用试管中或是活体外方法将它们诱导分化为所欲或是预先决定的细胞种类，例如间充质细胞、造血细胞、神经细胞、或是内皮细胞等等。一但细胞已投药病患，这样的祖细胞以及/或是取自脐带血的MSPCs的后代的制备物具有缩短完成分化所需时间的潜能。将祖细胞分化成特定表现型细胞的技术是为本领域已知，例如那些揭露于美国专利5,486,359号、5,591,625号、5,736,396号、5,811,094号、5,827,740号、5,837,539号、5,908,782号、5,908,784号、5,942,225号、5,965,436号、6,010,696号、6,022,540号、6,087,113号、5,858,390号、5,804,446号、5,846,796号、5,654,186号、6,054,121号、5,827,735号、以及5,906,934的技术，它们描述多潜能细胞的转化。例如，Rodgers et al.(美国专利6,335,195号)揭露活体外培养造血与间充质多潜能细胞方法，以及通过于下列物质单独出现或是与其其它刺激因子或是细胞因子结合下生长而诱导特定体系细胞增殖与分化的方法，该物质例如血管紧缩素原、血管紧缩素I(AI)、AI类似物、AI片段及其类似物、血管紧缩素II(AII)、AII类似物、AII片段及其类似物、或是AII第二型AT2(AT2-type 2)受体拮抗剂。于一实施例中，通过本领域已知技术(例如Yang et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：8078-83，2002、Zulewski et al.，Diabetes 50：521-33，2001、以及Bonner-Weir et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97：7999-8004，2001)可投药细胞制备物以产生胰脏细胞，尤其是胰岛细胞。也可以在投药本发明的共培养或是共移植(co-transplantion)细胞后立即使用本领域已知技术促使各式其它细胞种类的产生，例如肝细胞(例如Leeet al.，Hepatology 40：1275-1284，2004)、神经元细胞(例如Thondreau et al.，分化ation 319-322-326，2004)或是内皮细胞(例如Kassem et al.，Basic CHn.Pharmacol & Toxicol.95：209-214，2004；and Pittenger and Martin，Circ.Res.95：9-20，2004)。任选地，可将分化剂共投药或随后投药给受试者以促使活体内的干细胞分化。

共培养或是共移植(co-transplanted)的有核细胞与黏附性基质细胞或其后代可用于在试管中产生新组织，接着可将该组织埋植、移植或是以其它放式插入受试者的需要组织修复、置换或是增强的部位。共培养或是共移植(co-transplanted)的有核细胞与黏附性基质细胞或其后代是接种(inoculated)到或是″种(seeded)″到3D骨架或是支架，且于试管中增殖与生长以形成可埋植到活体内的活组织。3D骨架可能是允许细胞附着于其上(或是可修改成允许细胞附着于其上者)，以及允许细胞生长成大于一层的任何材料以及/或是形状。一些可用来形成基质的不同的材料包含但不受限于：耐隆(聚醯胺)、达克隆(多元酯类)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯类、聚乙烯化合物(例如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE，铁弗隆)、色马诺克斯(thermanox，TPX)、硝化纤维、棉、聚羟基乙酸(PGA)、胶原(海绵状、辫状、或织线(woven threads)、及其类似物)、猫肠缝线、纤维素、明胶、或其它自然产生的生物可分解材料或是合成材料，例如包含各式聚羟基烷酯类。可将这些材料中的任一种织成网，例如形成3D骨架或是支架。于基质中的孔洞或是空间可为熟习本领域技艺者调整以允许或是防止细胞迁移至或通过该基质材料，于一例子中，Naughton et al.(美国专利6,022,743号)揭露一组织培养系统，于其中干细胞或是祖细胞(例如那些由脐带血细胞、胎盘细胞、间充质干细胞或是胎体细胞所衍生的细胞)是于3D支撑物上繁殖。

可将3D骨架、基质、水胶及其类似物铸模适合组织置换或是修复的形式。例如当所欲为维管移植(graft)时，可将3D骨架铸模成管状结构的形状，并种有该些共培养或共移植的祖细胞与USSCs或其后代。也可添加其它细胞到3D骨架以改善于其上形成的新组织的生长或是改变新组织的一种或是一种以上的特性。该种细胞可包含但不受限于其它细胞中的纤维组织母细胞、外皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥胖细胞以及脂肪细胞。

取代地可将该细胞封装在一个允许交换液体但防止细胞与细胞接触的装置或是微胶囊中。微封装细胞的移植为本领域已知，例如Balladur et al.，Surgery 117：189-94，199、以及Dixit et al.，Celltransplantation 1：275-79，1992。在一例子中，该细胞可容纳于如同一个身体外面装置般可在身体外维持生存的装置。较佳地，该装置连接到血液循环系统而使得有核细胞与黏附性基质细胞可在身体外维持功能性并用以协助器官衰退的症状。在另一个例子中，可将该封装细胞置于一个特定身体区划，而使它们于时间延长且存在或是没有免疫抑制或是免疫调节药下仍有功能。

于又一例子中，该些共培养或共移植的有核细胞与黏附性基质细胞或其后代可于″生物反应器″中用来与3D培养系统连结，而产生一个组织结构，其拥有人类原有组织的关键性生化、物理以及结构性质，是通过于该些原有组织典型会经历的环境条件下培养这些细胞以及产生组织。所以该3D培养系统在间歇性与周期性加压下维持，且通过传送为本发明的细胞提供足够的营养供给。当该结构的表观密度增加时，为了于各方面维持本发明细胞的足够的营养供给，一个约2-5mm厚度的置换内皮组织结构是很重要的。压力促进流经3D内皮结构的液体的流动，藉此改善埋于该结构中的细胞的营养供给以及废料移除。生物反应器可包含一些设计。典型地，培养条件将包含于该含有细胞的结构置放相似于将于活体内遭遇到的生理压力。例如，可能在仿真血管压力与剪力的条件下培养该维管结构(例如美国专例6,121,042号，其于此并入参考)。

本发明的方法可用于治疗因疾病或是外伤而需要修复或是置换的组织的受试者，例如内皮组织，或是用以提供化妆品功能，例如增强脸部或身体的其它特色。治疗可需要于活体内使用有核细胞与黏附性基质细胞及其后代以产生新组织，或是使用根据本领域目前已知或是将来发展出来的任何方法于试管中或是活体外所产生的组织。

在另一个例子中，投药根据本发明的方法所制备的有核细胞与黏附性基质细胞以修复或是置换心脏办模、维管组织或是移植(graft)。在另一个例子中，将有核细胞与黏附性基质细胞与血管生成因子(angiogenic factor)一起投药，以诱导或是促使受试者的新微血管或是新血管的形成。就″血管生成因子″而言，其意指一种促使或是诱导受试者的血管生成的刺激因子、蛋白质或是剂。可于血管生成因子注射的前、同时、或是之后投药本发明的细胞。另外，可马上投药有核细胞与黏附性基质细胞以邻接、在相同部位、或是远离血管生成因子的投药部位。

由于心脏肌肉通常不具有修复潜力，因此有核细胞与黏附性基质细胞或其后代可用于重生或是修复由于疾病或是退化而损害的横纹心脏肌肉，于这样的治疗中，投药至病患的有核细胞与黏附性基质细胞与接受者的健康组织结合在一起并取代死亡或是损伤细胞的功能，整体来看，其再生心脏肌肉。有核细胞与黏附性基质细胞是用于例如一些主要征兆的心脏肌肉的再生：(i)血性心脏埋植、(ii)郁血性心衰竭病患的治疗、(iii)防止接受冠状动脉接枝绕道手术的病患产生其它疾病(iv)结缔组织再生、(v)血管平滑肌再生、以及(vi)瓣膜再生。

用于本发明的有核细胞与黏附性基质细胞，或它们后代对于胰脏或是肝脏疾病或是失调的治疗是很有用的。举例来说，可埋植、注射或是以其它方式直接投药细胞到损伤部位，因此这些细胞将会在活体内产生新的胰脏或是肝脏组织。治疗方法包含辨识出具有胃肠的肠道外(extraintestinal gastrointestinal)、或是肝胰的(hepaticopancreatic)失调的病患，以及以治疗上有效量的包含该些细胞或它们后代的制备物投药该病患，以治疗该失调。就″胃肠的肠道外″失调而言，是指主要局限于肠(intestine)内部的其它区域的胃肠道的失调。非限制性胃肠的肠道外失调的例子包含肝胰失调、十二指肠失调、胆管失调、盲肠失调、脾脏失调、以及胃失调。″肝胰″失调是为胰脏与肝脏的失调。非限制性肝胰失调的例子包含糖尿病、胰脏炎、肝硬化、肝炎、癌症以及胰胆管(pancreatico-biliary)疾病。特定器官或是结构的″失调″包含器官或是结构完全不存在的情况。例如，为了本发明的目的，一个缺乏胰脏的人具有胰脏失调。埋植外生性组织的方法为本领域已知方法(例如参见J.Shapiro et.al.，NewEngl.J.Med.343：230-238，2000，for the transplantation ofpancreatic islets)。

本发明的有核细胞与黏附性基质细胞，或其后代可用于治疗神经疾病，在一例子中投药细胞至病患以促使中枢神经系统中，例如大脑的神经元再生(neurogenesis)或是神经胶再生(gliogenesis)。这样的治疗可投药于具有帕金森氏症、阿滋海默症的病患，或是受中风或是外伤所苦者。于神经胶细胞中，该治疗可能预计用以治疗多发性硬化症以及其它神经胶相关症状。其它可再生组织的例子是为视柄、视网膜层、晶状体(lenses for eye)以及内耳。在某些方法中，病患可能患有神经退化性疾病、外伤性损伤、神经毒损伤、局部缺血、发育失调、影响视力的失调、脊髓损伤或疾病或是髓鞘脱失性疾病。对于这些具有可能与不健全功能相关的神经疾病或是失调的病患，可投药以医药上有效量细胞制备物，而使得依据欲治疗的神经疾病或是失调产生神经元、或是其它有利的细胞种类。

使用有核细胞与黏附性基质细胞的免疫重建与序列注射

可依据这里所描述的方法，投药与黏附性基质细胞共培养以及/或是共移植的有核细胞，以重建有需要的病患的免疫系统，例如于治疗中接受骨髓剥括(ablated)的病患。如果接可用的受者自身细胞，则可使用供给者细胞。用于重建被剥括骨髓的该供给者有核细胞与黏附性基质细胞，将有效地为宿主所耐受，从而于数周或数月存活仍且没有发生免疫抑制。可将用于本发明的有核细胞与黏附性基质细胞，及其后代一次投药或是序列投药给病患以重建免疫系统。

宿主体内的供给者有核细胞与黏附性基质细胞的维持可能需要长期使用一种或是一种以上的免疫抑制剂疗法(immunosuppressantregimens)。这与接受整个器官或是细胞移植的病患的长期使用免疫抑制药或是其它疗法相类似。如上所述，虽然黏附性基质细胞于有核细胞上作用的耐受效果将使得免疫抑制药的使用变得非必要。投药免疫抑制药的必要性可依病患主治医生的评估决定，如果为必要的话，可以开始免疫抑制治疗。

分化

于本发明所用的有核细胞与黏附性基质细胞已依据本发明的方法分离并增量后，出现在共培养中的该些祖细胞能以未分化状态维持一段基本时间(例如2-4小时、1-5天、1-14天、1-6个月，或是无限期)。所欲的状况为细胞实质上未分化是发生在增量时。可使用本领域熟习技艺者已知的试验来确定发生分化的量，例如通过侦测与一特定分化阶段相关的功能，例如于细胞表面表现分化抗原或是与一特定阶段相关的蛋白的分泌，或是侦测产生各式细胞种类的能力、或是通过侦测细胞中已知与细胞分化相关的型态改变而侦测出现较分化细胞的那些试验。(参见WO 00/34443的用以测试HSC的分化/功能特性的试验)

一但已将细胞增量到所欲数量，可将这些细胞以未分化状态投药，或者是在诱导这些细胞分化成特定的细胞种类后再将其投药。任选地，如果最终分化的细胞的功能为所欲的话，可分化这些细胞至最终分化状态。

基因治疗

也可使用基因治疗来修改有核细胞与黏附性基质细胞，以提供一种或是一种以上构成疾病或是失调的基本成份的缺失蛋白。可想象可将有核细胞与黏附性基质细胞用来取代骨髓细胞，或是以改正过(corrected)的基因产物将其修正，并使用一种或是多种上述方法投药给病患以治疗或是预防疾病或是失调。经过基因转化的脐带血衍生细胞的治疗性用途包含移植这些细胞、细胞族群、或是其后代至个体中，以治疗包含由心肌损伤(myocardial damage)所引起的疾病或是失调、循环或是维管失调或是疾病、神经疾病或是失调、肝脏疾病或是失调、或是胰脏疾病或是失调的各式病理状态、以及组织再生与修护。通过上述相同的技术，可将本发明方法所用的基因改变过的细胞，或其后代，投药至需要这种细胞、或是需要由该基因改变过细胞所编码或是产生的蛋白质或是分子的接受者上。传输该改变过细胞接着将治疗病患的疾病或是失调。

示范性治疗用基因治疗疗法可能包含下列步骤：从受试者或是供给者的脐带血取得有核细胞与黏附性基质细胞，于试管中将其丰富化，通过本领域已知方法或是通过与黏附性基质细胞共培养来增量有核细胞，于有核细胞以及/或是黏附性基质细胞中转染(transduction)含有一个感兴趣基因的载体，以及再引入受试者中。通过基因治疗技术转染有核细胞以及/或是黏附性基质细胞可发生于增量前或是后。

例如，可将表达能够预防或是改良各式疾病或是失调病症(例如维管疾病或是失调)的产物的基因，或是预防或是促使发炎失调的基因整合到取自脐带血的有核细胞与黏附性基质细胞中。在一个例子中，这些细胞经基因工程以表现抗发炎基因产物，该产物将用来降低埋植失败的风险，或是降低于组织中导因于发炎反应的进一步退化性改变。表达一种或是一种以上抗发炎基因产物包含如对应于抗体的个体基因型(idiotype)的肽或是多肽，其中和GM-CSF、TNF-α、IL-I、IL-2或是其它发炎细胞因子。已经显示IL-I会减少蛋白多糖与第II、IX与XI型胶原的合成(Tyler et al.，Biochem.J.227：69-878，1985、Tyler et al.，Coll.Relat.Res.82：393-405，1988、Goldring etal.，J.Clin.Invest.82：2026-2037，1988、and Lefebvre et al.，Biophys.Acta.1052：366-72，1990)。虽然没有IL-I有效，TNF-α也抑制蛋白多糖与第II型胶原的合成(Yaron et al.，Arthritis Rheum.32：173-80，1989、Ikebe et al.，J.Immunol.140：827-31，1988、and Saklatvala，Nature 322：547-49，1986)。同样地，举例来说，可基因工程取自脐带血的祖细胞以及/或是MSPCs来表现编码人类补体调节蛋白的基因，以预防宿主对移植物的排斥。例如参见McCurry eta.l，Nature Medicine 1：423-27，1995。另一个例子中，可基因工程取自脐带血的有核细胞与黏附性基质细胞，以包含表现或是造成表现血管生成因子的基因或是多核苷酸序列。取代地，可基因工程取自脐带血的有核细胞与黏附性基质细胞，以表现或产生诸如VEGF、FGF、EGF、IGF的刺激因子，以及诸如TWEAK、TWEAKR、TNFR、其它抗发炎剂、或是血管生成因子的治疗剂。例如，所述刺激因子或是治疗剂的基因或是编码序列将会经由连结一个经调控激活子而起效用，所以于培养中可控制该刺激因子或剂的产生。

另一个例子中，取自脐带血的有核细胞与黏附性基质细胞是经过基因修饰或是基因工程，以包含表现对分化以及/或是维持横纹心脏肌肉细胞来说重要的蛋白质的基因。例子包含刺激因子(TGF-α、IGF-I、FGF)、心肌刺激因子(myogenic factors)(myoD、myogenin、Myf5、MRF)、转录因子(GATA-4)、细胞因子(心脏营养素-1(cardiotrophin-1))、神经调节素(neuregulin)家族成员(神经调节素1、2与3)以及同源异位(homeobox)基因(Csx、铁匠基因(tinman)、NKx家族)。

取代地，可基因工程有核细胞与黏附性基质细胞以″剔除(knockout)″促使发炎的原有基因产物的表现，例如GM-CSF、TNF、IL-I、IL-2，或是″剔除″MHC的表现以降低排斥的风险。另外，可基因工程细胞以用于基因治疗中调整受试者的基因活性程度而协助或是改善移植结果。也可将经基因工程的有核细胞与黏附性基质细胞作筛选，以选出于活体内带来改善类风湿性疾病病症或是发炎反应，以及或是逃过免疫学的检查与排斥的那些细胞株。

有许多本领域已知用于基因治疗以改变细胞的方法。这些方法包含细胞转染(例如参见Beutler，Biol.Blood Marrow Transplant，5：273-276，1999、Dao，Leukemia 13：1473-1480，1999、以及参见Morgan et al.，Ann.Rev.Biochem.62：191-217，1993、Culver etal.，Trends Genet.10：174-178，1994、以及美国专利5,399,346号(French et al.))、病毒载体的使用、以及非病毒载体的使用，例如通过脂质体载送裸DNA、受体媒介传输(receptor-mediateddelivery)、磷酸钙转染、微脂粒感染(lipofection)、细胞电击、粒子轰炸法(基因枪)、微注射、细胞融合、染色体媒介基因转移(chromosome-mediated gene transfer)、微囊媒介基因转移(microcell-mediated gene transfer)、原生质球融合、以及压力媒介基因传输。这些技术应提供将基因稳定转移到细胞中，因此该基因可由该细胞表现，且较佳地可由该细胞的后代遗传并表现。

基因治疗方法的一般回顾请参见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 12：488-505，1993、Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95，1991、Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596，1993、Mulligan，Science 260：926-932，1993，以及Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217，1993。重组DNA技术领域中可用的一般已知方法描述于Ausubel et al.(eds.)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY、与Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY中。

于下列非限制性范例中进一步描述本发明

范例1

以下提供的是经试验过的免疫表现型、关于活体外增量祖细胞(例如CD34⁺，Lin^-细胞)的支持功能、以及具有来自脐带血MSPC特性的经培养细胞的软骨素原分化。分离出脐带血的有核细胞，并将10⁷的细胞培养于具有20％胎牛血清的IMDM中。黏附性纤维组织母细胞状(fibroblastlike)集落的平均数目为每10⁶单核细胞有3.5±0.7个。

脐带血衍生的MSPC可增量至少15继代。于未分化阶段，脐带血衍生的MSPC为CD13⁺，CD29⁺，CD90⁺，CD105⁺，CD166⁺，SH2⁺，SH3⁺，SH4⁺，CD45^-，CD34^-，以及CD14^-，且其产生干细胞因子，IL-6，以及TNF-α。脐带血衍生的MSPC培养于软骨素原培养基而分化成软骨素原细胞。脐带血衍生的MSPC于试管中支持来自脐带血的CD34⁺细胞的增殖与分化。

脐带血衍生的MSPC具有支持活体内祖细胞(例如CD34⁺，Lin^-细胞)增生，以及软骨素原细胞分化的潜力。不应将脐带血视为UCB医疗废料，其可做为前驱干细胞与支持细胞的替代性来源，且可提供细胞或是基因治疗的胎体细胞的独特来源。

脐带血

做为研究用所收集的脐带血是由亲切的产科医学所提供。

杭州浙江妇科与产科医学医院系(Department of the ZhejiangGynecological and Obstetric Hospital，Hangzhou)的24位年龄中位数为27岁(介于25到30岁)且体重中位数为60kg(介于52到68kg)的临盆女性书面同意符合由位于中活人民共和国的杭州浙江公立健康局(the Human Experimentation Committee at Zhejiang Public HealthBureau，Hangzhou，P.R.China)所认可的程序将脐带血用于研究目的。所收集的脐带血为加肝磷脂血。

分离与培养脐带血衍生的MSPC

于收集后的12个小时内将中位数为72mL的脐带血(介于60-83mL)于450*g离心10分钟。将沉淀物以IMDM(Iscove’s modifiedDulbecco’s medium；HyClone，Logan，UT)稀释，然后敷设于Ficoll-Hypaque(1.077±0.001g/mL；Sigma，St.Louis，MO，USA)上，并于300xg离心20分钟。从梯度接口收集低密度单核细胞(MNC)，并以EVIDM将其清洗3次，接着以完整培养基稀释(20％胎牛血清(FBS；Sigma)于具有50μM 2-硫氢乙醇以及2mM左旋麸醯胺酸(Gibco BRL，Life Technologies，Paisley，UK)的IMDM中)。再度分散后的细胞以4.2×10⁵细胞/cm²的密度培养于25cm²的烧瓶中，并培养于37℃且100％湿度的含有5％CO₂的空气中。4天后，当细胞已经黏附到烧瓶，将悬浮与未黏附的细胞移除，并更换完整培养基。于90％满度时，以0.25％胰蛋白与1mM EDTA于37℃处理5分钟(干细胞s Technology，Vancouver，BC，Canada)以收获细胞。以PBS/1％FBS清洗收获的细胞2次，然后根据制造商的指示使用MACS实验室分离系统(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)以从中分离中CD34^-细胞。以完整培养基稀释该CD34^-细胞，并将其以5×10³细胞/cm²的密度培养于25cm²的烧瓶中，并培养于37℃且100％湿度的含有5％CO₂的空气中，以做为F₁继代。于近似汇合成片(near confluent)时收获细胞，并如上述将其培养一继代。为了量测生长动力学，将F₁、F₅、F₁₀与F₁₅继代的细胞以10⁴细胞/cm²的密度置于6孔盘。通过计算黏附性细胞数目，以每四天一次地评估生长曲线，共24天。

经培养的脐带血衍生MSPC的流式细胞技术分析

将脐带血衍生黏附性细胞(于F₁、F₅、F₁₀与F₁₅继代的结束)以胰蛋白处理，并以抗CD34-FITC、CD45-FITC、CD14-FITC、CD105-FITC、CD90-PE、CD166-PE、CD13-PE、CD29-PE(Becton Dickinson，UK)、SH2、SH3、以及SH4单株抗体(Osiris Therapeutics，Baltimore，MD，USA)染色，然后以FACScalibur流式细胞仪分析(Becton Dickinson)。

经培养脐带血衍生MSPC于条件培养基中的细胞因子的产生

当F₁、F₅、F₁₀与F₁₅继代中的黏附性细胞长满时，收集条件式培养基，其用于测量由脐带血衍生黏附性细胞所产生的任何细胞因子。根据制造商的指示以酵素免疫分析(ELISA)试剂(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)定量决定于该培养基中出现的干细胞因子、GM-CSF、IL-3、IL-6、以及TNF-α。各ELISA试剂的极限侦测量对SCF为4.0pg/mL、对IL-3为7.8pg/mL、对GM-CSF为20pg/mL、对IL-6为0.09pg/mL、对TNF-α为0.18。

脐带血衍生MSPC与CD34⁺造血细胞的共培养

选择来自F₅继代的脐带血衍生黏附性液细胞层做为调查提供给活体外HSPC增生的支持的实验。选择这个继代是考量细胞的同质状态，细胞的生长潜能、以及细胞因子的产生。如上所述地将来自脐带血的MNC分离出来。从MNC制备物中，根据制造商的指示使用与微珠连结的抗CD34抗体(Miltenyi Biotec)以及从MiniMACS管柱洗提而选出的CD34⁺细胞再次分散于添加有或是未添加100ng/mL的重组人类干细胞因子(rhSCF)、重组人类粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、以及重组人类粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(rhMGDF)(Amgen Inc.，ThousandOaks，CA，USA)的IMDM(20％FBS)中，接着将该细胞以1.6×10⁴细胞/cm²的密度与脐带血衍生黏附性MSPC种在25cm²的烧瓶中。控制系统则是将CD34⁺细胞培养于具有相同浓度的该三种外生性细胞因子的IMDM(20％FBS)中，但没有脐带血衍生黏附性MSPC。使用先前所述二步骤(two-step)培养系统(McNiece et al.，Exp.Hematol.28：1181-1186，2000)，于37℃且100％湿度的含有5％ CO₂的空气中培养脐带血衍生CD34⁺细胞。于培养的开始(第1天)与结束(第14天)以没有红血球生成素的完整甲基纤维素(Gencyte，Amherst，NY，USA)对培养基中的非黏附性细胞进行集落形成细胞试验来做为祖细胞试验。

软骨素原分化与胶原基因表现分析

MSPC分化能力是以脐带血衍生MSPC的F₁、F₅与F₁₀继代作试验(n＝5)。使用包含补充10％FBS、10ng/mL转化刺激因子β1(TGF-β1)(R&DSystems)、50μg/mL维他命C、100U/mL盘尼西林、以及100μg/mL链霉素的DMEM的软骨素原培养基来诱导软骨素原分化。于3周的诱导后，经诱导细胞是以10％福尔马林溶液固定1小时，以蒸馏水清洗一次，然后以1％甲苯胺蓝溶液染色2-3小时。通过异硫氰酸胍-酚制备总RNA。反转录是通过下列步骤实施：于0.1mol/L氰胍甲汞氰甲汞胍(methylmercuric hydroxide)存在下变性RNA与dT18引子，接着以20mmol/L β-硫醇基乙醇(β-mercaptoethanol)熄火，并依建议于总量为20μL反转录酶(Superscript II reverse transcriptase)(GIBCO，Carlsbad，CA，USA)下进行延长。聚合酶链锁反应(PCR)的实施是使用2.0μL RNA分解酶处理过的cDNA与Taq聚合酶(Perkin Elmer，FosterCity，CA，USA)，反应总量为50μL。所实施的PCR反应为于94℃起始变性20分钟，然后进行10次下列循环：于94℃，0.5分钟，于58℃，0.75分钟，以及于68℃，0.75分钟，接着进行25次下列循环：于94℃，0.5分钟，于58℃，0.75分钟，以及于73℃，0.75分钟。胶原cDNA所使用的PCR引子对如下：5’TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C 3’，以及5’AGA GTC CTA GAG TGA CTG AG 3’。以洋菜凝胶电泳将15mL的PCR反应物分成几不同部分。

统计

结果以平均值±标准误差(mean±SEM)表示。统计上比较是使用学生t检验(Student’s t test)。

脐带血衍生MSPC的黏附、纤维组织母细胞型(fibroblastic)以及生长特性

于脐带血MNC以4.2×10⁵细胞/cm²的密度接种于仅含有20％FBS而没有其它刺激因子的IMDM之后的第7-9天，细胞黏附到烧瓶，并且独自形成集落，该集落是由数打到几百纺锤状纤维组织母细胞型细胞所构成(图1A)。黏附集落的频率为3.5±0.7/10⁶MNC。于培养15-19天后，可观察到许多纤维组织母细胞状细胞。于第4周结束时，似纤维母细胞细胞(fibroblastoid)的均质层占据整个烧瓶的表面，且变成汇合成片(图1B)。

于F₁、F₅、F₁₀与F₁₅继代测量(n＝5)脐带血衍生黏附性细胞的生长动力学(图2)。允许细胞分裂24天，每四天一次收获二重复的培养物，然后计算细胞数量。生长曲线显示4天的起始生长停滞期，接着为对数期，细胞以对数速率分裂8-12天。接在对数期后为的是高原期。通过接续的胰蛋白处理、种以及各培养17-20天的旋环15继代，脐带血衍生黏附性细胞可随时于活体内增量。可观察到经历15继代的细胞于于其型态上、其正向与侧向散设性质上、或是其生长型态上都不具肉眼可见改变。然而从F₁₀到F₁₅的倍数增量有减少。

为了评价脐带血衍生黏附性细胞分泌造血细胞因子的能力，抽样检查F₁汇合成片继代的条件培养基。于条件培养基中侦测到SCF、IL-6以及TNF-α，而未侦测到IL-3与GM-CSF(表1)。

表1.经培养脐带血衍生间充质干/祖细胞于条件培养基中所产生的细胞因子(pg/mL)。

F₁、F₅与F₁₀分别为F₁继代、F₅继代与F₁₀继代。SCF：干细胞因子；IL-3：白介素-3；IL-6：IL-3：白介素-6；GM-CSF：粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子；TNF-α：肿瘤坏死因子。与F₅继代相比：*p＜0.05；“-“为未侦测到。2₃

脐带血衍生MSPC的免疫表现型

来自F₁、F₅、F₁₀与F₁₅继代的脐带血衍生黏附性细胞的免疫表现型是通过流式细胞技术决定。如表2所示，脐带血衍生单层黏附性细胞对CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3以及SH4为阳性染色。从脐带血黏附性细胞的任何继代中都未侦测到CD34⁺细胞，这是因为该细胞族群已从该起始F₁继代中挑除。于F₁侦测到低量的CD 14，在F₅与F₁₀并没有显着染到，这可能是因为细胞污染。这个简介档(profile)与非造血细胞的一致，且确认造血细胞已从培养物中挑除。于培养10继代后，脐带血黏附性细胞的免疫表现型并未显着改变(p＞0.05)。

表2.脐带血衍生单层黏附性细胞表现特定表现型的比例(％)。

F₁、F₅、F₁₀与F₁₅分别为F₁继代、F₅继代、F₁₀继代与F₁₅继代。与F₁₀继代相比：*p＜0.05，°p＜0.01。

脐带血衍生MSPC支持活体外祖细胞增量的能力

为了决定来自脐带血的MSPC是否可以支持祖细胞(例如CD34^-，CD34⁺，Lin^-的HSPC)的活体外增殖与分化，F₅继代的汇合成片的单层MSPC(n＝5)是用来与人类CD34⁺脐带血细胞共培养。铺设CD34⁺细胞，并将其维持培养长达14天。以相同的培养基但没有做为基质细胞饲育层的脐带血衍生USSC，将脐带血CD34⁺细胞种在25cm²烧瓶中以做为控制组。图3显示于这三个培养系统中非黏附性细胞的生长动力学。于具有外生性细胞因子的共培养系统中所有有核细胞(TNC)的增量是高于没有外生性细胞因子的共培养系统，以及在控制组系统(p＜0.01)中的所有有核细胞(TNC)的增量。于具有外生性细胞因子的共培养系统中，增量后TNC的数目以3.16(±0.3)倍高于控制组系统中的数目。祖细胞的量是由培养的开始(第1天)与结束(第14天)的培养基中的非黏附性细胞所试验。如图4所示，来自脐带血MSPC会增加GM-CFC与HPP-CFC(p＜0.05)的增量。于该开始的CD34⁺细胞部分的GM-CFC与HPP-CFC的平均数目分别为2.3(±0.6)×10⁴与1.4(±0.3)×10⁴。在增量后，对具有外生性细胞因子的共培养系统来说有41.8(±7.5)×10⁴的GM-CFC，以及18.4(±6.11)×10⁴的HPP-CFC，而对控制组系统来说，则有22.5(±4.5)×10⁴的GM-CFC，以及9.5(±3.1)×10⁴的HPP-CFC。

相较于起始比例(CD34⁺细胞部分是为97.1％)来说，在14天的增量后，CD34⁺细胞的比例会下降(对具有外生性细胞因子的共培养系统、没有外生性细胞因子的共培养系统、以及控制组系统来说分别为5.7％、4.8％、以及2.9％)。然而该些共培养条件导致它们的CD34⁺细胞量是6.2倍高于控制组培养的量。

分化脐带血衍生MSPC为软骨细胞

通过处于适合诱导软骨素原分化的条件下培养细胞，来研究于F₁、F₅与F₁₀继代中脐带血衍生MSPC分化为软骨细胞的潜力。培养于软骨素原培养基中达3周后，可以工学显微镜看到细胞经诱导而形成似软骨细胞腔隙(lacuna)；再者，经诱导的细胞分泌异染基质，其以甲苯胺蓝染色呈阳性(图5)。为了确认这个分化，我们使用RT-PCR来分析胶原基因的表现。由经分化似软骨细胞细胞，以及未分化脐带血USSC中制备总RNA，且通过反转录合成总mRNA的cDNA。通过RT-PCR以胶原基因的特定引子从经分化的似软骨细胞细胞中放大出一个约500bp的片段(图6)。相反地，从未分化的MSPC中没有发现任何经放大的产物。这个分化为软骨细胞的能力仍保留于F₅与F₁₀继代中。

已于此证明脐带血中具有相较于正常成人骨髓高的CD34⁺，CD38^-细胞部分，其暗示脐带血可能有较丰富的非常原始的祖细胞。脐带血产物的移植物移入研究已显示，其于活体内提供长期耐用的移植，但是脐带血接受者达到嗜中性白细胞以及血小板的移植物移入的时间较长于于骨髓与外围血液产物接受者所需时间。这些结果与其它许多研究与脐带血含有较高原生干细胞有一致性。其它研究已证明可例行地培养人类脐带血以形成汇合成片的黏附性饲育层。已知成人骨髓衍生MSC可随时增量，分化成多重末端(termianl)细胞，且可于活体内支持造血干细胞的增量。来自脐带血的也具有这些特性，以及诸如支持造血干细胞增殖与分化成骨原性、脂肪源性或是神经原性细胞的功能性性质。在这个研究中，我们证明脐带血衍生MSPC也可分化成软骨素原细胞。

于成人骨髓中，通过细胞与细胞的直接交互作用以及分泌造血刺激因子与细胞因子，间充质细胞为造血干细胞及其后代的分化与增殖提供讯号。已证明于人类个体发生时，祖细胞的分化与增殖发生于些些组织学上不同的微环境中(卵黄囊、腹大动脉、胎体肝脏、胸腺、脾脏、以及骨髓)。于此显示来自脐带血的USSC支持来自相同组织的祖细胞的增殖与分化，但是于个体发生时，人类脐带血中的祖细胞与MSPC的关是仍待确定。于HSPC的增殖与造分化中，造血刺激因子与细胞因子扮演关键性的角色。使用ELISA试验来筛检SCF、IL-3、IL-6GM-CSF以及TNF-α的产生。脐带血黏附性细胞层的培养的条件培养基中只侦测到SCF、IL-6与TNF-α。关于人类骨髓衍生黏附性细胞的GM-CSF的分泌有些争议。Ye et al.于脐带血黏附性细胞层的培养的条件培养基也没有侦测到内生性IL-3与GM-CSF。然而，我们应该注意于该条件培养基中侦测到TNF-α。这考能包含表现许多造血因子，例如IL-I、IL-6、IL-8以及GM-CSF，的mRNA的细胞。由共培养的人类脐带血衍生黏附性细胞所产生或是诱导的各式刺激因子的连带调控(coordinated regulation)可支持活体外人类脐带血衍生祖细胞的增殖与分化。虽然于该非共培养系统中的细胞因子(例如IL-6与TNF-α)在该共培养系统中并未检测，与外生性细胞因子共培养的祖细胞于活体外的增量确实大于非共培养的量。没有外生性细胞因子的共培养实验也显示脐带血衍生黏附性细胞支持祖细胞的增量。也许没有被我们侦测到的其它造血刺激因子与细胞因子也在活体外祖细胞的增量上扮演一个重要的角色。共培养与非共培养系统于活体外祖细胞的增量期间细胞因子产生以及在活体外前增量上的细胞因子效果的动力学仍待确定。

在胎羊模式中，已显示成人MSC的共移植增强造血干细胞移植物移入。我们的结果确认共移植来自脐带血的祖细胞与MSPC也导致加速快的中期与长期造血干/祖细胞的移植物移入。

在不希望被任何学说有密切关是下，从脐带血中分离出一个MSPC族群。这些细胞拥有某些与成人骨髓衍生MSC相同的型态上、免疫表现型上以及功能上的特性。来自脐带血的MSPCs可为活体外祖细胞增量的建立与操作以及多潜能细胞的分化提供一个替代方法。

范例2

未培养且选择性放大的脐带血CD34⁺细胞通过与脐带血衍生USSC的共移植的增强的活体内归路(homing)

USSC展现一种发育成中胚层、内胚层、与外胚层命运的固有与指向性潜能。已对USSC影响脐带血衍生CD34⁺细胞归路NOD/SCID小鼠的骨髓与脾脏的能力做出评估。经培养的USSC与刚分离出的经CFDA标识的脐带血CD34⁺细胞共移植至以未达致死量辐射过的NOD/SCID小鼠中。于那之后个16小时后收获股骨与脾脏，然后以流式细胞分析确定CD34⁺细胞的比例。

USSCs诱导CD34⁺细胞归路骨髓以及脾脏都是显着增加的(分别为2.2±0.3倍与2.4±0.6倍；p＜0.05)。相似结果也由冷冻的USSC样本取得，在移植前先解冻USSC。USSC的增强归路不会受到大量培养继代细胞所改变，可观察到在早期(p5)与晚期(p10)USSC的继代具有相似的增强程度。

也发现USSC增强由选择性放大^TM活体外增量脐带血阴性体系(lineage-negative)细胞(Lin^-)所收获培养的第14天细胞的归路。将USSC不论是与经培养或是未受操纵细胞共移植都不会影响已归路NOD/SCID小鼠的骨髓或是脾脏的CD34⁺细胞的相对比例。再者，由于可观察到共移植CD34⁺细胞与于培养前或中期(7天)Lin^-细胞选择所收集的非培养阳性体系细胞没有任何的归路增加，USSC的效果是特别的。于此证明使用USSC增加脐带血造血干细胞的归路，以及促进于限制脐带血干细胞数目的条件下的移植物移入。

其它实施例

如果各独立公开案或专利申请案被特别地或是独自地指示要将其并入参考的话，所有于本说明书中提及的专利申请案的公开案与专利以相同的程度于此并入参考。

范例3

将来自人类脐带血(hUCB)造血干/祖细胞(HSPCs)移植至NOD/SCID小鼠中，其中hUCB通过使用间充质干/祖细胞(MSPCs)做为饲育层而加以增量。

非肥胖性糖尿病/严重复合型免疫缺乏症(NOD/SCID)小鼠是用于分析移植后NOD/SCID小鼠中造血干/祖细胞的移植与分化，造血干/祖细胞是由间充质干/祖细胞(MSPCs)做为饲育层而加以增量。

重19-24g的八周大公NOD/SCID小鼠，是取自位于浙江医疗科学研究所的实验动物的中央协会的(Central Institute forExperimental Animals in Zhejiang Academy of Medical Sciences)，将其养在指定动物中心的区域中。于无菌条件下操作AU动物。人类脐带血收集是由杭州浙江妇科与产科医学医院系的临盆女性书面同意符合由位于中活人民共和国的杭州浙江公立健康局所认可的程序将脐带血用于研究目的所亲切提供。所收集的人类脐带血为加肝磷脂血。

将来自人类脐带血的单核细胞(MNC)分离并再次分散于含有20％FBS与各100ng/niL的重组人类干细胞因子、重组人类粒细胞集落刺激因子、以及重组人类粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(rhMGDF)(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA，USA)的IMDM(20％FBS)中，接着将该细胞种在25cm²有或是没有人类脐带血MSPC黏附细胞的烧瓶中。单核细胞是培养于于37℃且100％湿度的含有5％CO₂的空气中，共14天。于培养的开始(第1天)与结束(第14天)以没有红血球生成素的完整甲基纤维素(Gencyte，Amherst，NY，USA)对培养基中的非黏附性细胞进行集落形成细胞试验，以此做为祖细胞试验。

移植至NOD/SCID小鼠中

于移植前24小时，以剂量间隔4小时分次剂量的⁶⁰Coγ辐射八周大的NOD/SCID公小鼠。各剂量为14.5r/min共15分钟。

通过尾巴静脉注射将经增量HSPC移植到经致死量辐射的NOD/SCID小鼠中。A组为15只经辐射小鼠，其移植非共培养方案增量细胞，B组为15只经辐射小鼠，其移植共培养方案的增量细胞，C组为15只经辐射小鼠，对其注射相同体积(200μL)的PBS/1％HAS以做为控制组。各组实施三重复。各经辐射小鼠所移植的细胞数目为200μL的8.8×10⁶细胞分散物。

NOD/SCID小鼠的造血重建

于移植后第2天，以一般间隔，从各只小鼠眼后取样收集100μL外围血液。外围血液以PBS/1％HAS稀释成250μL，然后使用Advia 120(Bayer，Leverkusen，Germany)分析造血恢复力。

利用PCR放大人类Alu重复序列基因来测试接受移植物的NOD/SCID小鼠中人类细胞的出现。于移植八周后杀掉小鼠，并收获骨髓(来自股骨与胫骨)与外围血液。分离出骨髓细胞与外围血液细胞的遗传性DNA(genetic DNA)。以从人类脐带血细胞中分离出的遗传性DNA作为正向控制组，而且以从未处理NOD/SCID小鼠骨髓细胞中分离出的遗传性DNA作为负向控制组。如下所述实施PCR放大：引子序列为5’-CTG GGCGA C AGAACG AGA TTC TAT-3’与5’-CTC ACT ACT TGG TGA CAGGTT CA-3’；反应系统(50μL)：5μL 10x放大缓冲液，3μL 25mmol/L氯化镁(MgCl₂)，2.5 U Taq DNA聚合脢，每升中dNTP的毫莫耳数(mmole/L)为0.2，每升中各引子的微莫耳数(μmol/L)为0.25，以及0.2μg的模板DNA。放大条件如下：于95℃预变性(pre-denaturation)5分钟，于95℃变性30秒，于54℃黏合45秒，以及于72℃延长45秒，共30个循环，最后于72℃，进行5分钟的延长。以2％洋菜凝胶电泳以及溴化乙锭染色则肉眼可见一条224bp的放大产物。

没有移植细胞的经辐射小鼠(C组)在辐射后的13天内死亡。于移植非共培养方案增量细胞的经辐射小鼠(A组)，3只小鼠分别在移植后第12天、第16天与第17天死亡。于移植共培养方案增量细胞的经辐射小鼠(C组)，1只小鼠在移植后第23天死亡。这两个移植组于接下来的时间中，没有观察到有任何小鼠死亡。

于移植有已增量细胞的这些组中的白细胞(WBC)在移植后第15天开始增加。在移植后第25天，白细胞的数目达到基线值，然后清楚见到其下降。直到移植后第45-55天，该数目再次回到基线值(图7)。

利用PCR放大人类Alu重复序列基因来测试接受移植物移入的NOD/SCID小鼠中人类细胞的出现与否(图8)。在移植有共培养方案增量细胞后存活的14只NOD/SCID小鼠中有12只侦测到人类Alu重复序列基因。而在非共培养方案中，人类Alu重复序列基因在移植后存活的12只NOD/SCID小鼠中有9只有侦测到。共培养方案的正向比例为85.7％，而非共培养方案的正向比例为75.0％。在没有移植的NOD/SICD小鼠中没有侦测到人类Alu重复序列基因。

来自人类脐带血的造血干/祖细胞是使用来自人类脐带血的间充质干/祖细胞做为饲育层，且接着将这些已增量细胞移植到致死量辐射的NOD/SCID小鼠中以试验以增量细胞于造血恢复上的效果。已显示共培养方案较的非共培养方案更有效地增加脐带血造血干/祖细胞的活体外增量，且MSC适合做为造血干/祖细胞增量的饲育层。

于移植有共培养方案与非共培养方案的已增量细胞的小鼠中的白细胞快速的达到该基线值(在移植后第15天开始增加，然后在第25天达到最高峰)。于该些经移植的小鼠中，来自共培养方案的已增量细胞显然较有利于白细胞的第二次增加，以及快速重建造血作用。

在另一实施例中，对NOD/SCID小鼠的辐射量以分次剂量列出，可介于约300到400雷得(rad)。在某些实施例中，总白细胞的恢复可包含每次计算嵌合体以了解人类细胞比例。

于此使用的″半致死量或致死量辐射小鼠″包含于一段时间后死亡的小鼠，例如辐射后7天，或是于辐射后1-30天，或是辐射后约7-16天。

当本发明已以特定实施例说明的同时，其应可理解其具有进一步变形，且本申请案预期涵盖大体上根据本发明原则的任何变化、应用或是适应变化，以及包含从偏离本发明所揭露但属于本领域已知或是习惯上实施者到应用与本发明相关且可如前述应用该主要特征者。

Claims (69)

1.一种用于培养来自脐带血(UCB)的有核细胞的方法，其包括：

制备包括该有核细胞与来自脐带血的黏附性基质细胞的共培养，其中该有核细胞与该黏附性基质细胞是各别加入该共培养中。

2.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞包括未成熟或成熟细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其中该未成熟细胞包括祖细胞。

4.如权利要求2所述的方法，其中该成熟细胞选自粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞选自CD34^-细胞、CD34⁺细胞或Lin^-细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其中该黏附性基质细胞包括间充质干细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其中该方法产生相较于没有该黏附性基质细胞的有核细胞的培养所出现的有核细胞的数目而言较大数目的有核细胞。

8.如权利要求6所述的方法，其中该间充质干细胞是非限制性体干细胞(USSCs)。

9.如权利要求8所述的方法，其中该非限制性体干细胞特征为CD13⁺、CD29⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD166⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、CD45^-、CD34^-以及CD14^-。

10.如权利要求9所述的方法，其中该非限制性体干细胞进一步具有表达细胞外基质蛋白，且缺乏表达透明质酸合成酶与纤维调节素的特征。

11.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞或是该黏附性基质细胞是从脐带血中分离取得或是由从脐带血中分离取得的细胞衍生而来。

12.如权利要求1所述的方法，其中于该培养前，该有核细胞或是该黏附性基质细胞是实质上从其它细胞种类中分离出。

13.如权利要求3所述的方法，其中该祖细胞为造血干细胞。

14.如权利要求13所述的方法，其中该造血干细胞包括至少40％的该祖细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其中该祖细胞包括CD34^-且Lin^-细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其中该CD34⁺且Lin^-细胞包括至少40％的该祖细胞。

17.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞或该黏附性基质细胞为人类细胞。

18.如权利要求1所述的方法，其中相较于没有与黏附性基质细胞一起培养至少一天的有核细胞的增量，当该黏附性基质细胞与该有核细胞一起培养至少一天，该共培养增加该有核细胞的增量为2倍。

19.如权利要求18所述的方法，其中该共培养增加该有核细胞的增量为10倍。

20.如权利要求19所述的方法，其中该共培养增加该有核细胞的增量为100倍。

21.如权利要求20所述的方法，其中该共培养增加该有核细胞的增量为1000倍。

22.如权利要求21所述的方法，其中该共培养增加该有核细胞的增量为1,000,000倍。

23.如权利要求3所述的方法，其中于该共培养后，转移该祖细胞至另外的培养基中，并于产生分化成为预先决定细胞种类的条件下培养。

24.如权利要求1所述的方法，其中是于该共培养前增量该黏附性基质细胞。

25.如权利要求1所述的方法，其中可于该共培养前增量该有核细胞。

26.如权利要求1所述的方法，其中该培养是发生于至少一种细胞因子存在下。

27.如权利要求26所述的方法，其中该细胞因子选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、血小板生成素(TPO)、FLT-3配位体、转化刺激因子-β(TGF-β)、巨核细胞生长和发育因子、肿瘤坏死因子(TNF-α)、HOX-B4以及Wnt。

28.如权利要求27所述的方法，其中该细胞因子为粒细胞集落刺激因子。

29.如权利要求1所述的方法，其中该培养发生至少一天。

30.如权利要求29所述的方法，其中该培养发生至少一周。

31.如权利要求30所述的方法，其中该培养发生至少二周。

32.如权利要求31所述的方法，其中该培养发生至少一个月。

33.如权利要求1所述的方法，其中于该培养后，该有核细胞与该黏附性基质细胞是投药给病患以治疗或是预防疾病或失调。

34.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞是与该黏附性基质细胞分离，且该有核细胞是投药给该病患以治疗或是预防疾病或失调。

35.如权利要求33所述的方法，其中该有核细胞与该黏附性基质细胞是投药以治疗或是预防选自脉管、肌肉、肝脏、胰脏及神经疾病或失调。

36.如权利要求3所述的方法，其中于该培养后，投药该祖细胞与该黏附性基质细胞给病患以重建该病患的该免疫系统。

37.如权利要求36所述的方法，其中该祖细胞是与该基质细胞分离，且是投药该祖细胞给该病患以重建该病患的该免疫系统。

38.如权利要求1所述的方法，更包括：

在培养该有核细胞与该黏附性基质细胞的同时、培养期间间歇地，或是之后，将生长培养基接触一选择成份，以选出该有核细胞或是该黏附性基质细胞，其中该选择成份包含对该有核细胞或是该黏附性基质细胞具有特定的亲和性的多种选择性结合分子。

39.如权利要求38所述的方法，其中该接触是与该培养同时实施。

40.如权利要求38所述的方法，其中该接触是步骤培养期间歇地实施。

41.如权利要求38所述的方法，其中该接触是在该培养后实施。

42.如权利要求38所述的方法，其中该有核细胞与该黏附性基质细胞是适合投药给人类病患。

43.一种用以增加于受试者中供给者有核细胞的移植物移入(engraftment)的方法，包括：将包括来自脐带血(UCB)的有核细胞以及来自脐带血的黏附性基质细胞的一组合物投药给该受试者。

44.如权利要求43所述的方法，其中该有核细胞包括未成熟或成熟细胞。

45.如权利要求44所述的方法，其中该未成熟细胞包括祖细胞。

46.如权利要求44所述的方法，其中该成熟细胞选自粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、巨噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及红细胞。

47.如权利要求43所述的方法，其中该有核细胞选自CD34^-细胞、CD34⁺细胞以及Lin^-细胞。

48.如权利要求43所述的方法，其中该黏附性基质细胞包括间充质干细胞。

49.如权利要求43所述的方法，其中该方法产生相较于没有该黏附性基质细胞的有核细胞的组合物中所出现的移植细胞的数目而言较大数目的移植细胞。

50.如权利要求48所述的方法，其中该间充质干细胞为非限制性体干细胞(USSCs)。

51.如权利要求50所述的方法，其中该非限制性体干细胞特征为CD13⁺、CD29⁺、CD90⁺、CDi05⁺、CD166⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、CD45^-、CD34^-、以及CD14^-。

52.如权利要求51所述的方法，其中该非限制性体干细胞更可具有表达细胞外基质蛋白，且缺乏表达透明质酸合成酶与纤维调节素的特征。

53.如权利要求43所述的方法，其中该有核细胞或是该黏附性基质细胞是从脐带血中分离取得或是由从脐带血中分离取得的细胞衍生而来。

54.如权利要求43所述的方法，其中于该投药前，该有核细胞是与该黏附性基质细胞共培养。

55.如权利要求45所述的方法，其中该祖细胞包括造血干细胞。

56.如权利要求55所述的方法，其中该造血干细胞包括至少40％的该祖细胞。

57.如权利要求45所述的方法，其中该祖细胞包括CD34⁺且Lin^-细胞。

58.如权利要求57所述的方法，其中该CD34⁺且Lin^-细胞包括至少40％的该祖细胞。

59.如权利要求1所述的方法，其中该有核细胞或该黏附性基质细胞为人类细胞。

60.如权利要求43所述的方法，其中该有核细胞或该黏附性基质细胞对受试者而言是同种的或是自体同源的。

61.一种包括有核细胞与黏附性基质细胞的组合物，其中该有核细胞与该黏附性基质细胞是取自脐带血(UCB)，且其中该组合物是适用于灌注(infusion)或是移植物移入(engraftment)至受试者中。

62.如权利要求43所述的组合物，其中该黏附性基质细胞包括间充质干细胞。

63.如权利要求62所述的组合物，其中该间充质干细胞包括非限制性体干细胞(USSCs)。

64.如权利要求61所述的组合物，其中该有核细胞或该黏附性基质细胞对受试者而言是同种或是自体同源的。

65.如权利要求61所述的组合物，其中该有核细胞包括祖细胞。

66.如权利要求65所述的组合物，其中该祖细胞是细胞包括间充质干细胞。

67.如权利要求65所述的组合物，其中该祖细胞选自CD34^-细胞、CD34⁺细胞以及Lin^-细胞。

68.如权利要求65所述的组合物，其中该祖细胞包括CD34⁺且Lin^-细胞。

69.如权利要求61所述的组合物，其中该有核细胞或该黏附性基质细胞是经基因修饰过的。

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