CN113881633B - 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及造血干细胞干性扩增培养技术领域，具体地说就是一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法。一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基，包括如下组分：基础培养基、添加在所述基础培养基中的细胞因子和聚乙烯醇，所述细胞因子包括血小板生成素、干细胞生长因子和FMS样酪氨酸激酶3配体。一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，包括如下步骤：S1、制备培养基；S2、分离CD34⁺细胞；S3、扩增培养。采用本发明提供的造血干细胞体外干性扩增的培养基，能够显著提高CD34⁺CD45RA^‑CD90⁺细胞群体外扩增的数量和比例。

Description

一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法

技术领域

本发明涉及造血干细胞干性扩增培养技术领域，具体地说就是一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法。

背景技术

造血干细胞（Hematopoieticstemcell，HSC）是一小群具有高度自我更新和多向分化潜能的最原始的造血细胞，造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源。造血干细胞移植是治疗血液系统疾病、遗传性疾病、免疫性疾病的有效方法。目前，造血干细胞的主要来源有骨髓、外周血以及脐带血。与骨髓和外周血来源的造血干细胞相比，脐带血来源的造血干细胞具有以下优势：来源较广、采集简便、对供者无损伤及副作用；实物储存，能够保证按时按需快速供给；由于胎盘屏障保护受病毒等病原微生物感染的机会低，相对纯净安全；淋巴细胞抗原性弱，功能相对不成熟，人类白细胞抗原（HLA）配型要求低，移植物抗宿主病（GVHD）发生率低且程度轻；具有更高的体外增殖潜能和体内造血重建能力。然而，脐带血造血干细胞临床应用中存在着单份脐带血造血干细胞的数量对于大体重患者不足、造血功能恢复时间长的瓶颈问题。因此，需要对造血干细胞进行扩增，以获得足够数量的造血干细胞用于移植。

目前对于造血干细胞的体外扩增已经研究了多年，但最优的体外扩增方法和体系仍没有形成共识，能应用于临床使用的扩增方法和体系更是缺乏，最主要的原因在于造血干细胞在扩增过程中会导致明显分化，无法进行干性扩增。

CD34⁺是普遍认同的造血干细胞的表面标记，然而，CD34⁺细胞是一个异质性的细胞群，该群体中包括多能祖细胞（Multipotentprogenitor，MPP）、短周期造血干细胞（ST-HSC）和长周期造血干细胞（LT-HSC），其中，具有自我更新能力的长周期造血干细胞（LT-HSC）数量，决定了造血干细胞移植的成功率。而近期，有研究工作者鉴定出一种特定的造血干细胞亚群：CD34⁺CD45RA^-CD90⁺，其在移植后在体内重建了整个血液系统和免疫系统，并持续地维持新形成的血液系统和免疫系统（SRadtke, etal. A distinct hematopoietic

stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhumanprimates.Science Translational Medicine.2017,DOI：10.1126/scitranslmed.aan1145），说明了CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞是比CD34⁺细胞具有更强干性的细胞群。因此，进行造血干细胞的体外扩增时，若能优先扩增CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群而不是CD34⁺细胞，即，CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的扩增倍数高于CD34⁺细胞群的扩增倍数，这样体外扩增后的细胞将更能维持造血干细胞的移植能力，有利于造血干细胞的移植，提高移植成功率。

但现有技术中的造血干细胞培养基多为针对CD34⁺细胞扩增的培养基，缺少针对CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群干性扩增培养基及培养方法。

发明内容

为解决上述CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的优先扩增问题，本发明提供了一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基，包括如下组分：基础培养基、添加在所述基础培养基中的细胞因子和聚乙烯醇，所述细胞因子包括血小板生成素、干细胞生长因子和FMS样酪氨酸激酶3配体，其中所述血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度比为（7~14）：1：（7~14）。

作为优化，其中：

所述的血小板生成素的浓度为80~110ng/ml；

所述的干细胞生长因子的浓度为8~11ng/ml；

所述的FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为80~110ng/ml；

所述的聚乙烯醇的浓度为1~5mg/ml。

作为优化，所述的基础培养基为无血清培养基，所述的基础培养基采用DMEM、IMDM、F12、stemline II和HIPP-T009中的一种。

作为优化，包括如下组分：无血清基础培养基、100ng/ml的血小板生成素、10ng/ml的干细胞生长因子、100ng/ml的FMS样酪氨酸激酶3配体和1mg/ml聚乙烯醇。

一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，包括上述任意一项所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基，其特征在于：包括如下步骤：

S1、制备培养基：使血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙烯醇的终浓度分别为80~110ng/ml、8~11ng/ml、80~110ng/ml、1~5mg/ml，使胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺的添加终浓度为8~12mg/L、4~6mg/L、0.005~0.008mg/L、1.8~2.2mg/L，谷氨酰胺的添加终浓度为280~310mg/L，得到细胞培养基；

S2、分离CD34⁺细胞：从新鲜健康新生儿脐带血中分离出CD34⁺细胞；

S3、扩增培养：将步骤S2中得到的CD34⁺细胞接种至步骤S1中得到的细胞培养基中进行扩增培养，得到扩增后的造血干细胞。

作为优化，步骤S1中所述的细胞培养基的制备方法包括如下步骤：

A1、配置储备液：将血小板生成素、干细胞生长因子、FM样酪氨酸激酶3配体的无菌冻干粉分别用无血清培养基配置成15mg/ml、1mg/ml、和15mg/ml的储备液，备用；将聚乙烯醇用超纯水配置成100mg/ml，在超净台中使用一次性0.45µm的无菌过滤头过滤除菌后备用；

A2、配置培养基：将步骤A1中配置的储备液、聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺和谷氨酰胺分别添加至无血清基础培养基中，使血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙烯醇的终浓度分别为80~110ng/ml、8~11ng/ml、80~110ng/ml、1~5mg/ml，使胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺和谷氨酰胺的添加终浓度为8~12mg/L、4~6mg/L、0.005~0.008mg/L、1.8~2.2mg/L和280~310mg/L。

作为优化，所述步骤S3中扩增培养的条件为37℃、CO₂浓度5%。

作为优化，所述的步骤S3中扩增培养的时间为3~7天。

作为优化，步骤S2中CD34⁺细胞的分离方法包括如下步骤：

B1、脐带血预处理：将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品100ml无菌条件下注入250ml离心管中，室温1200rpm离心10分钟，弃去上层血浆，加入生理盐水将血细胞沉淀稀释至原体积的2倍，用移液管吹打混匀，得到血细胞悬浊液；

B2、血细胞悬浊液离心：将步骤B1处理得到的血细胞悬浊液缓慢加载到预先准备好的0.4倍体积的淋巴细胞分离液上，注意使分层保持清晰，室温2000rpm离心20分钟，因密度不同，离心管中分为四层，最上一层为盐水、血浆，其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成，第三层为淋巴细胞分离液，第四层是沉淀的红细胞和粒细胞；

B3、分离单个核细胞：用移液管将步骤B2处理的血细胞悬浊液用移液管吸取最上层大部分液体弃去，然后将第二层的交界细胞层转移到50ml离心管中，每管细胞悬液不超过25ml，向细胞悬液中添加生理盐水补至50ml，混匀，室温1200rpm离心10分钟，离心后弃去上清液，加生理盐水重悬，混匀后室温1200rpm离心10分钟，弃去上清液，得到单个核细胞；

B4、分离CD34⁺造血干细胞：将步骤B3中得到的单个核细胞采用50µl人CD34⁺磁珠和50µl封闭液及150µl 0.5%牛血清蛋白的混合液重悬，4℃孵育30min；孵育完成后加入10ml0.01mol/L磷酸盐缓冲液，混匀后1500rpm离心10分钟，弃去上清液，500µl 0.5%牛血清蛋白重悬，转移至置于磁铁上的经0.01mol/L磷酸盐缓冲液润洗过的分离柱上，待液体完全流出，使用500µl 0.5%牛血清蛋白对分离柱洗涤2次，洗涤完成后将分离柱置于收集管中，加入1ml 0.5%牛血清蛋白，用柱塞将液体推入收集管中，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

本方案的有益效果是，一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法，具有以下有益之处：

（1）通过在培养基中添加细胞因子血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体，并控制其比例，使血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度相同，且远大于干细胞生长因子的浓度（7~14倍），能够起到针对造血干细胞CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的特定培养作用，使CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的扩增倍数远高于CD34⁺细胞的扩增倍数；

（2）特定浓度比例的血小板生成素、干细胞生长因子与FMS样酪氨酸激酶3配体协同作用，既能促进造血干细胞的扩增，又能避免造血干细胞的过度分化，能够显著提高造血干细胞CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群体外扩增的数量和比例；

（3）通过使用无血清基础培养基并添加聚乙烯醇，一方面无血清培养基消除了血清生产中不可控成分及血清白蛋白导致造血干细胞分化的不利影响，另一方面添加聚乙烯醇弥补了培养基中血清白蛋白缺失对细胞生长所需物理环境的改变，使得造血干细胞能在接近人体血液的环境中扩增而又不过度分化；

（4）通过本申请的培养基扩增后得到的造血干细胞CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群比CD34⁺细胞群具有更高的扩增倍数，表明本发明提供的扩增培养基和方法，具有干性扩增造血干细胞的优势，具有更强的重建造血系统和免疫系统的潜能。

附图说明

附图1为实施例1的造血干细胞样本在本发明提供的培养基中体外扩增得到的扩增结果图。

附图2为实施例2的造血干细胞样本在本发明提供的培养基中体外扩增过程得到的扩增结果图。

附图3为实施例3的造血干细胞样本在本发明提供的培养基中体外扩增得到的扩增结果图。

附图4为对比例1造血干细胞样本的扩增结果图。

附图5为对比例2造血干细胞样本的扩增结果图。

其中，横坐标为培养时间，左侧纵坐标为细胞数量，右侧纵坐标为细胞扩增倍数，细胞数量的单位为10⁴/ml，黑色柱状条为CD34⁺细胞量，白色柱状条为CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞量，黑色实线为CD34⁺细胞扩增倍数，黑色虚线为CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞扩增倍数。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例1：

将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品100ml无菌条件下注入250ml离心管中，室温1200rpm离心10分钟，弃去上层血浆，加入生理盐水将血细胞沉淀稀释至原体积的2倍，用移液管吹打混匀。

将血细胞悬液缓慢加载到预先准备好的0.4倍体积的淋巴细胞分离液上，注意使分层保持清晰。室温2000rpm离心20分钟，因密度不同，离心管中分为四层，最上一层为盐水、血浆；其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成，第三层为淋巴细胞分离液，第四层是沉淀的红细胞和粒细胞。

用移液管吸取最上层大部分液体弃去，然后将第二层的交界细胞层转移到50ml离心管中，每管细胞悬液不超过25ml，向细胞悬液中添加生理盐水补至50ml，混匀，室温1200rpm离心10分钟；离心后弃去上清液，加生理盐水重悬，混匀后室温1200rpm离心10分钟，弃去上清，得到单个核细胞；

将上述得到的单个核细胞采用50µl人CD34⁺磁珠和50µl封闭液及150µl 0.5%牛血清蛋白的混合液重悬，4℃孵育30min；孵育完成后，加入10ml 0.01mol/L磷酸盐缓冲液，混匀后1500rpm离心10分钟，弃去上清液，500µl 0.5%牛血清蛋白重悬，转移至置于磁铁上的经0.01mol/L磷酸盐缓冲液润洗过的分离柱上，待液体完全流出，500µl 0.5%牛血清蛋白洗涤2次后，将分离柱置于收集管中，加入1ml 0.5%牛血清蛋白，用柱塞将液体推入收集管中，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

将新鲜健康新生儿脐带血样品经上述步骤得到CD34⁺细胞，接种于细胞培养基中进行扩增培养，细胞培养基采用无血清培养基IMDM培养基，添加血小板生成素浓度至81.2ng/ml，添加干细胞生长因子至浓度为10.9ng/ml，添加FMS样酪氨酸激酶3配体至浓度80.5ng/ml，添加聚乙烯醇至3mg/ml，添加胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺至终浓度分别为9mg/L、5.2mg/L、0.0069mg/L和2.1mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度310mg/L。

24孔板中细胞接种量为5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，于第3天、第5天、第7天取样检测。

实施例2：

将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品使用与实施例1相同的CD34⁺细胞的分离方法进行处理，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

将新鲜健康新生儿脐带血样品经上述步骤得到CD34⁺细胞，接种于细胞培养基中进行扩增培养，细胞培养基采用无血清培养基F12培养基，添加血小板生成素浓度至109ng/ml，添加干细胞生长因子至浓度为8.2ng/ml，添加FMS样酪氨酸激酶3配体至浓度110ng/ml，添加聚乙烯醇至5mg/ml，添加胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺至终浓度分别为11.8mg/L、4.9mg/L、0.0062mg/L和2.1mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度289mg/L。

24孔板中细胞接种量为5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，于第3天、第5天、第7天取样检测。

实施例3：

将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品使用与实施例1相同的CD34⁺细胞的分离方法进行处理，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

将新鲜健康新生儿脐带血样品经过上述步骤得到CD34⁺细胞，接种于细胞培养基中进行扩增培养，细胞培养基采用无血清培养基HIPP-T009培养基，添加血小板生成素浓度至101ng/ml，添加干细胞生长因子至浓度为10.3ng/ml，添加FMS样酪氨酸激酶3配体至浓度102.1ng/ml，添加聚乙烯醇至1mg/ml，添加胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺至终浓度分别为10mg/L、5.5mg/L、0.0067mg/L和2.0mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度292mg/L。

24孔板中细胞接种量为5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，于第3天、第5天、第7天取样检测。

对比例1：

将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品使用与实施例1相同的CD34⁺细胞的分离方法进行处理，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

将新鲜健康新生儿脐带血样品经过上述步骤得到CD34⁺细胞，接种于细胞培养基中进行扩增培养，细胞培养基采用无血清培养基HIPP-T009培养基，添加血小板生成素浓度至21.5ng/ml，添加干细胞生长因子至浓度为20ng/ml，添加FMS样酪氨酸激酶3配体至浓度19.6ng/ml，添加聚乙烯醇至2mg/ml，添加胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺至终浓度分别为8.5mg/L、5.3mg/L、0.0071mg/L和2.1mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度299mg/L。

24孔板中细胞接种量为5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，于第3天、第5天、第7天取样检测。

对比例2：

将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品使用与实施例1相同的CD34⁺细胞的分离方法进行处理，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

将新鲜健康新生儿脐带血样品经过上述步骤得到CD34⁺细胞，接种于细胞培养基中进行扩增培养，细胞培养基采用无血清培养基IMDM培养基，添加血小板生成素浓度至98ng/ml，添加干细胞生长因子至浓度为80ng/ml，添加FMS样酪氨酸激酶3配体至浓度22ng/ml，添加聚乙烯醇至3mg/ml，添加胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺至终浓度分别为9.4mg/L、4.8mg/L、0.0068mg/L和1.9mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度289mg/L。

24孔板中细胞接种量为5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，于第3天、第5天、第7天取样检测。

实施例1~3、对比例1~2中设计的干细胞的取样检测方法包括如下步骤：

（1）从单个核细胞中获得的CD34⁺细胞或者扩增培养后的细胞悬液，取10µl进行细胞计数；

（2）另取10µl，0.01mol/L磷酸盐缓冲液补至100µl，分别向其中加入PE标记的CD90⁺抗体、FITC标记的CD34⁺抗体及APC标记的CD45RA^-抗体各3µl，避光孵育20min，

（3）向步骤（2）中所得溶液内加入100µl缓冲液，使用流式细胞仪检测细胞表型。

（4）根据扩增前后细胞计数及流式细胞仪检测CD34⁺细胞和CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞的比例值，分别计算出总细胞数、CD34⁺细胞的扩增倍数和CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞的扩增倍数。

通过上述取样检测方法计算得到上述实施例1~3、对比例1~2的CD34⁺细胞和CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的培养结果如下：

表1：实施例1培养结果

表2：实施例2培养结果

表3：实施例3培养结果

表4：对比例1培养结果

表5：对比例2培养结果

通过上述取样检测方法计算得到上述实施例1~3、对比例1~2的CD34⁺细胞和CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的最高扩增倍数如下表：

表6：实施例1~3、对比例1~2的CD34⁺细胞和CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群的最高扩增倍数

项目	CD34<sup>+</sup>细胞扩增倍数	CD34<sup>+</sup>CD45RA<sup>-</sup>CD90<sup>+</sup>细胞群扩增倍数
			实施例1	3.14倍	7.78倍
实施例2	3.65倍	14.00倍
			实施例3	5.57倍	17.90倍
对比例1	21.62倍	9.70倍
			对比例2	14.34倍	6.61倍

由上述实施例及对比例的培养结果可知，采用本申请的培养基及培养方法，能够优先扩增干性更强的CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群，显著提高造血干细胞体外扩增所得的干性细胞的数量和比例。

造血干细胞领域的研究人员皆知，CD34⁺是普遍认同的造血干细胞的表面标记，然而，CD34⁺细胞是一个异质性的细胞群，其中，具有自我更新能力的长周期造血干细胞数量，决定了造血干细胞移植的成功率。另外，有研究者鉴定出一种特定的造血干细胞亚群CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群，其在移植后在体内重建了整个血液系统和免疫系统，并持续地维持新形成的血液系统和免疫系统，说明了CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞的干性比CD34⁺更强。本专利中扩增后的造血干细胞CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞群比CD34⁺细胞群具有更高的扩增倍数，表明本发明提供的扩增培养基和方法，具有干性扩增造血干细胞的优势，具有更强的重建造血系统和免疫系统的潜能。

上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (6)

1.一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基，其特征在于：由基础培养基、添加在所述基础培养基中的细胞因子、聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺和谷氨酰胺组成；

所述细胞因子由血小板生成素、干细胞生长因子和FMS样酪氨酸激酶3配体组成，其中所述血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度比为（7~14）：1：（7~14），所述的血小板生成素的浓度为80~110ng/ml，所述的干细胞生长因子的浓度为8~11ng/ml，所述的FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为80~110ng/ml，所述的聚乙烯醇的浓度为1~5mg/ml；

其中胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺的添加终浓度为8~12mg/L、4~6mg/L、0.005~0.008mg/L、1.8~2.2mg/L，所述谷氨酰胺的添加终浓度为280~310mg/L；

所述的基础培养基为无血清培养基，所述的基础培养基采用DMEM、IMDM、F12、stemlineII和HIPP-T009中的一种。

2.一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，采用权利要求1所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基，其特征在于：包括如下步骤：

S1、制备培养基：使血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙烯醇的终浓度分别为80~110ng/ml、8~11ng/ml、80~110ng/ml、1~5mg/ml，使胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺的添加终浓度为8~12mg/L、4~6mg/L、0.005~0.008mg/L、1.8~2.2mg/L，谷氨酰胺的添加终浓度为280~310mg/L，得到细胞培养基；

S2、分离CD34⁺细胞：从新鲜健康新生儿脐带血中分离出CD34⁺细胞；

S3、扩增培养：将步骤S2中得到的CD34⁺细胞接种至步骤S1中得到的细胞培养基中进行扩增培养，得到扩增后的造血干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，其特征在于：步骤S1中所述的细胞培养基的制备方法包括如下步骤：

A1、配置储备液：将血小板生成素、干细胞生长因子、FM样酪氨酸激酶3配体的无菌冻干粉分别用无血清培养基配置成15mg/ml、1mg/ml、和15mg/ml的储备液，备用；

将聚乙烯醇用超纯水配置成100mg/ml，在超净台中使用一次性0.45µm的无菌过滤头过滤除菌后备用；

A2、配置培养基：将步骤A1中配置的储备液、聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺和谷氨酰胺分别添加至无血清基础培养基中，使血小板生成素、干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、聚乙烯醇的终浓度分别为80~110ng/ml、8~11ng/ml、80~110ng/ml、1~5mg/ml，使胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺的添加终浓度为8~12mg/L、4~6mg/L、0.005~0.008mg/L、1.8~2.2mg/L，谷氨酰胺的添加终浓度为280~310mg/L，得到细胞培养基。

4.根据权利要求3所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，其特征在于：所述步骤S3中扩增培养的条件为37℃、CO₂浓度5%。

5.根据权利要求4所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，其特征在于：所述的步骤S3中扩增培养的时间为3~7天。

6.根据权利要求5所述的一种脐带血造血干细胞体外干性扩增方法，其特征在于：步骤S2中CD34⁺细胞的分离方法包括如下步骤：

B1、脐带血预处理：将用于提供待扩增造血干细胞的新鲜健康新生儿脐带血样品100ml无菌条件下注入250ml离心管中，室温1200rpm离心10分钟，弃去上层血浆，加入生理盐水将血细胞沉淀稀释至原体积的2倍，用移液管吹打混匀，得到血细胞悬浊液；

B2、血细胞悬浊液离心：将步骤B1处理得到的血细胞悬浊液缓慢加载到预先准备好的0.4倍体积的淋巴细胞分离液上，使分层保持清晰，室温2000rpm离心20分钟，因密度不同，离心管中分为四层，最上一层为盐水、血浆，其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成，第三层为淋巴细胞分离液，第四层是沉淀的红细胞和粒细胞；

B3、分离单个核细胞：用移液管将步骤B2处理的血细胞悬浊液用移液管吸取最上层大部分液体弃去，然后将第二层的交界细胞层转移到50ml离心管中，每管细胞悬液不超过25ml，向细胞悬液中添加生理盐水补至50ml，混匀，室温1200rpm离心10分钟，离心后弃去上清液，加生理盐水重悬，混匀后室温1200rpm离心10分钟，弃去上清液，得到单个核细胞；

B4、分离CD34⁺造血干细胞：将步骤B3中得到的单个核细胞采用50µl人CD34⁺磁珠和50µl封闭液及150µl 0.5%牛血清蛋白的混合液重悬，4℃孵育30min；孵育完成后加入10ml0.01mol/L磷酸盐缓冲液，混匀后1500rpm离心10分钟，弃去上清液，500µl 0.5%牛血清蛋白重悬，转移至置于磁铁上的经0.01mol/L磷酸盐缓冲液润洗过的分离柱上，待液体完全流出，使用500µl 0.5%牛血清蛋白对分离柱洗涤2次，洗涤完成后将分离柱置于收集管中，加入1ml 0.5%牛血清蛋白，用柱塞将液体推入收集管中，得到CD34⁺造血干细胞，计数。

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