CN115197909B - 一种nk细胞的体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种NK细胞的体外培养方法。本发明公开了一种NK细胞的体外培养方法，所述方法在培养过程中引入抗坏血酸和刺激细胞，并通过在培养体系中添加抗坏血酸和两次添加刺激细胞，促进了NK细胞大量增殖，并提高NK细胞的产率；本发明所述方法培养获得的NK细胞中杂质细胞(包括T细胞、NKT细胞，B细胞和单核细胞)总比例显著降低；NK细胞的纯度大于92％；CD16，CD69，NKG2D，NKp46等活化指标均明显表达；且获得的NK细胞对K562细胞具有显著杀伤作用，产生显著的脱粒效应。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种NK细胞的体外培养方法。
背景技术
外周血是遍布在机体全身的血液，通常可捐献再生。外周血中含有可以重建人体造血和免疫系统的各种细胞，可用于提高免疫力，治疗80多种疾病。其中自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)属于人体介导固有免疫细胞，与机体抵抗恶性肿瘤、病毒感染和免疫调节密切相关。其免疫表型特征主要为CD3-/CD56+/CD16+，是一种不表达T细胞受体，也不表达B细胞受体的淋巴细胞亚群。他们具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。随着CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中的成功应用，目前大家把越来越多的目光投向了NK细胞中。NK细胞过继免疫疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。
随着NK细胞的临床需求增多，如何提高NK细胞的体外培养扩增是目前最为关注的问题。NK细胞在于正常人体中通常处于免疫静止状态，约占血液中淋巴细胞的5％～15％。而在NK过继性免疫治疗中充足的细胞数量和高纯度是NK杀伤肿瘤细胞作用的重要因素。但对于高纯度NK细胞的培养，目前面临的困难更多，主要包括：1.纯度越高的细胞扩增难度越大；2.目前多使用基因改造的肿瘤细胞系K562系或EBV转化的淋巴母细胞系病毒来刺激NK细胞的高速扩增。但这些因素的加入，对细胞产品带来了安全性的隐忧。因此，寻求一种在体外获得高纯度和高扩增倍数的NK细胞培养的有效方法，仍然目前研究的热点。
本发明提供一种增加高纯度NK细胞扩增倍数的方法，通过在培养体系中添加抗坏血酸，显著降低了培养过程中NK细胞的死亡，使最终细胞产品中的碎片比大大降低。同时，通过两次添加刺激细胞的方法，可以充分模拟NK细胞生长的生理性刺激过程，使得高纯度的NK细胞可以大量扩增，以获得的充足高纯度NK细胞。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高纯度NK细胞的体外培养方法，具体包括以下内容：
一种NK细胞的体外培养方法，所述方法包括：在NK细胞的体外培养体系中加入抗坏血酸。
优选地，所述方法还包括：在NK细胞的体外培养体系中加入刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST；其中，所述刺激细胞NKS为辐照处理后的外周血单个核细胞，所述刺激细胞NKST为外周血单个核细胞体外培养后获得的细胞。
优选地，所述方法包括：将NK细胞与刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST共同接种于NK细胞培养基中进行培养至21天，收获NK细胞；其中培养至第3天，开始向培养体系中添加抗坏血酸；培养至第8天，再次添加刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)将NK细胞与刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST共同接种于含有rhIL2、rhIL21、rhIL15和人AB血清的细胞培养基中，初始培养；所述培养体系中细胞总浓度为1.0×106-1.5×106个/ml，所述NK细胞与刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST的比例为4：1-5：1；
(2)培养至第3天，向培养体系中添加抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清，或含有抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的细胞培养基，且每2-3天重复上述操作，保持培养体系中细胞总浓度大于等于1×106个/ml，继续培养；
(3)培养至第8天，再次向培养体系中添加刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST，使NK细胞与刺激细胞NKS和/或刺激细胞NKST的浓度比为4：1-10：1；同时向培养体系中添加含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的细胞培养基，维持培养体系中细胞总浓度为1.0×106-1.5×106个/ml；继续培养；
(4)每2-3天检测细胞的浓度和状态，当培养基颜色发黄且细胞浓度超过2×106个/ml时，添加培养体系总体积0.5倍的含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的无血清培养基，继续培养至第14天；
(5)每2-3天检测细胞的浓度和状态，当培养基颜色发黄且细胞浓度超过2×106个/ml时，添加培养体系总体积0.75倍的含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的无血清培养基，继续培养至第21天，收取细胞。
优选地，所述步骤(1)中，所述培养体系中rhIL2、rhIL21、rhIL15和人AB血清的终浓度分别为200-1000IU、2-10ng/ml、5-20ng/ml、1-5％。
优选地，所述步骤(2)-(4)中，所述培养体系中抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的终浓度分别为10-20μg/ml、200-1000IU、5-20ng/ml、1-5％。
优选地，所述步骤(5)-(6)中，所述培养体系的PH值为6.9-7.2。
优选地，所述细胞培养基为SCGM培养基或NK MACs medium。
优选地，所述NK细胞通过外周血单个核细胞分离获得，所述的分离步骤包括：使用Ficoll密度梯度离心法直接分离外周血单个核细胞；根据磁珠法，对外周血单个核细胞PBMCs进行CD3阴性细胞和CD56阳性细胞两步分选，分选后的细胞为NK细胞。
优选地，所述刺激细胞NKST的培养方法包括：
①将分离的外周血单核细胞加入培养瓶中，加入含自体血清、rhIL2和rhIL15的细胞培养基，保持细胞终浓度为1.0×106-1.5×106个/ml，进行培养；
②每隔2-3天进行补液：当培养基颜色变黄时，添加刺激细胞用培养基，继续培养；
③培养至7-14天，辐照处理培养体系，离心收集细胞即为刺激细胞NKST。
其中，所述培养瓶为经过TC处理且包被有人CD3单克隆抗体和人纤联蛋白。
优选地，所述刺激细胞培养体系中自体血清、rhIL2和rhIL15的终浓度分别为1-2％、200-1000IU和5-20ng/ml。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种增加高纯度NK细胞扩增倍数的方法，所述方法中通过添加抗坏血酸，显著降低了培养过程中NK细胞的死亡，使最终产品中的碎片比例大大降低；同时，通过两次添加刺激细胞的方法，可以充分模拟NK细胞生长的生理性刺激过程，使得高纯度的NK细胞可以大量扩增，以获得的充足高纯度NK细胞；本发明所述方法培养获得的NK细胞中杂质总比例显著降低，NK细胞的纯度大于92％；CD16，CD69，NKG2D，NKp46等NK细胞活化标记明显表达；且获得的NK细胞对K562细胞具有显著杀伤作用，产生脱粒效应。
附图说明
图1NK细胞体外培养流程图；
图2PBMCs经过磁珠二次分选后得到的CD3阴性/CD56阳性细胞的比例；
图3培养后的NK细胞纯度检测结果图；
图4添加抗坏血酸后，NK细胞终产品中残渣结果图；
图5添加刺激细胞对NK细胞的生长的影响曲线，其中每一组条形图从上往下依次为不添加刺激细胞NK、添加两次刺激细胞NK-2F、添加一次刺激细胞NK-1F；
图6NK细胞产品中其他细胞比例检测结果图；
图7NK细胞产品活化标记结果(包括CD16，CD69，NKG2D，NKp46)；
图8NK细胞对K562细胞杀伤作用：脱粒活性检测结果。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试剂CD3单克隆抗体(OKT3)，货号为16-0037-85购买于Invitrogen，Fibronectin human(FN)，货号为354008，购买于Corning。其他试剂均为市购。
以下实施例中所述的细胞培养基包括KBM581培养基、SCGM培养基。但不局限于KBM581培养基、SCGM培养基，其他用于淋巴细胞体外培养的培养基均适用。
实施例1刺激细胞NKST的制备
1.细胞培养瓶的准备
先将培养瓶需经过TC处理；
将人的CD3单克隆抗体(OKT3)和人纤联蛋白(FN)溶于4℃的PBS溶液，配制成终浓度为100ng/ml和20μg/ml的混合溶液(包被液)，加入细胞培养瓶中，4℃包被培养瓶，包被约时间8-12h；
包被结束后，加入冷的PBS溶液洗涤3次，4℃放置，备用。
2.刺激细胞培养的准备
刺激细胞培养基包括Corning淋巴细胞培养基KBM581、2％的自体血清(自体血清制备方式为：将血浆56℃水浴灭活1-1.5h，4℃，2800rpm离心30min，留取上清部分，用于细胞培养)、rhIL2和rhIL15。
3.刺激细胞的培养方法
将Ficoll梯度离心法分离获得的外周血单核细胞(PBMCs)加入到包被好的细胞培养瓶中，加入刺激细胞培养基至培养体系中自体血清终浓度为2％，rhIL2终浓度为500IU，rhIL15终浓度为20ng/ml；保持细胞终浓度为1×106-1.5×106个/ml，置于培养箱进行培养。
每隔2-3天进行补液(如果培养基颜色明显变黄，添加培养体系总体积50％的刺激细胞用培养基)；培养至第7天，扩展培养瓶或将刺激细胞转入细胞培养袋中培养至第14天，收获刺激细胞NKST。
4.刺激细胞的处理
将培养好的刺激细胞，送去辐照，辐照剂量在10Gy。收集辐照后的细胞，用1000rmp/min离心8-10min，弃去上清，收集细胞，备用。
依据上述方法，培养收集获得刺激细胞中的主要成分为CD3+的T细胞和NKT细胞，其中25-60％的CD3+/CD56+细胞，0-3％的CD3-CD56+细胞、40-75％的CD3+CD56-细胞。具体如表1所示。
表1 刺激细胞中的主要成分
| 主要成分 | CD3+/CD56+ | CD3-CD56+ | CD3+CD56- |
| 比例范围 | 25-60％ | 0-3％ | 40-75％ |
实施例2 NK细胞培养流程
1.外周血中PBMC细胞的分离：
使用Ficoll密度梯度离心法直接分离外周血单个核细胞(PBMCs)，并进行计数，1ml外周血分离出1×106个PBMCs。
2.对PBMC进行两步磁珠分选：
根据磁珠产品说明书，对外周血单个核细胞PBMCs进行二步磁珠分选：CD3阴性细胞分选和CD56阳性细胞分选。
分选后的CD3-CD56+细胞纯度在97-99％左右。经过二次分选后的CD3-CD56+细胞约占总PBMCs的5-15％。对分选后的细胞进行培养。PBMCs细胞采用两步法磁珠分选后的结果如图1所示，结果表明，该步骤分离得到NK细胞的纯度均值大于96％。
3.NK细胞的培养及培养基组成：
初始培养基包括：基础培养基(SCGM培养基)，rhIL2，rhIL15，rhIL21，人AB血清；
NK细胞培养基主要包括：基础培养基(SCGM培养基)，rhIL2，rhIL15，人AB血清，抗环血酸。
4.NK细胞的体外培养流程：
Day0：将分选完的NK细胞和实施例1制备的刺激细胞NKST共同置于未TC处理的培养瓶中，加入初始培养基培养至培养体系中rhIL2，rhIL15，rhIL21，人AB血清的终浓度为200-1000IU、2-10ng/ml、5-20ng/ml、1-5％进行培养；培养体系要保证NK细胞和刺激细胞的总浓度在(1.0-1.5)×106个/ml，刺激细胞NKST与NK细胞比例为4：1-5：1。
Day3：根据细胞状态添加NK细胞培养基，保证培养体系中总细胞浓度不低于1×106。如果细胞浓度低于1×106，只补充NK细胞培养基中的rhIL2、rhIL5、抗坏血酸和人的AB血清，而不加入基础培养基，保证培养体系中rhIL2、rhIL5、抗坏血酸和人的AB血清的终浓度为200-1000IU、2-10ng/ml、10-20μg/ml、1-5％。
Day4-Day7：平均每2-3天添加一次NK细胞培养基，根据细胞浓度计算加入NK细胞培养基的体积，使培养体系中总细胞浓度不低于1×106个/ml；其中如果细胞浓度低于1×106个/ml，只补充NK细胞培养基中的rhIL2、rhIL5、抗坏血酸和人的AB血清；保证培养体系中rhIL2、rhIL5、抗坏血酸和人的AB血清的终浓度为200-1000IU、2-10ng/ml、10-20μg/ml、1-5％，而不加入基础培养基。
Day8：在培养的NK细胞中第二次添加实施例1制备的刺激细胞NKST，其中刺激细胞与NK细胞比例范围应在为4：1-10：1，并将NK细胞和刺激细胞记为总数，添加NK细胞培养基，使整体细胞浓度为(1.0-1.5)×106个/ml。同时将所有细胞从细胞培养瓶转至细胞培养袋中继续培养。
Day9-Day14：每2-3天检测细胞的浓度和状态，当培养基颜色明显发黄时，检测细胞浓度，当细胞浓度超过2×106个/ml，需添加0.5倍总体积的NK细胞培养基(如果原总体积为100ml，需添加50ml新培养基)；同时需要监测培养过程的PH值和葡萄糖水平，并使培养体系的PH值保持在6.9-7.2之间，防止细胞生长过程中释放大量乳酸和氨类代谢物，影响细胞生长。
Day15-Day21：每2-3天检测细胞的浓度和观察细胞状态，当细胞浓度超过2×106个/ml，且培养基颜色明显发黄时，添加0.75倍总体积的NK细胞培养基(如果原来为100ml，需添加75ml的培养基)；同时需要监测培养过程的PH值和葡萄糖水平，并使培养体系的PH值保持在6.9-7.2之间；如果培养基总体积超过培养袋体积容量，需要扩充培养袋。
在第21天的时候收取所有细胞。
具体培养流程如图2所示，NK细胞培养21天。
对比例1
除在培养体系中不添加抗环血酸外，其他步骤同实施例2。
对比例2
只在Day0步骤中添加刺激细胞NKST外，在Day8不需要再次加入刺激细胞NKST，其他同实施例2。
实施例3效果评价
1.NK细胞的纯度及扩增倍数
21天后培养获得的NK细胞的纯度如图3所示，培养获得的NK细胞纯度约为95-98％。21天后培养获得的NK细胞扩增倍数为450-1003.5倍。
2.NK细胞中的残渣率
培养获得的NK细胞中的残渣率结果如图4所示，本发明实施例2所述方法培养的NK细胞中的残渣率为19.6％，对比例1(培养体系中未添加抗环血酸)所述方法培养的NK细胞中的残渣率为35.6％；相较于对比例1(培养体系中未添加抗环血酸)，本发明所述方法使NK细胞培养体系中的残渣率显著降低，约为对比例1未添加抗环血酸的50％。
3.NK细胞生长曲线
NK细胞生长曲线结果如图5所示，相较于对比例2(培养体系中只添加一次刺激细胞，NK-1F)，本发明实施例2所述方法(两次添加刺激细胞，NK-2F)培养过程中，NK细胞培养生长迅速，扩增倍数大大增加，每个生长阶段均为对比例2所述方法的2倍以上，通过此方法达到刺激NK细胞快速生长。
4.NK细胞中其他细胞成分
实施例2所述方法获得的NK细胞中其他细胞成分检测结果如图6所示，本发明实施例2所述方法获得的NK细胞中单核细胞约为0.51％，B细胞约为0.37％。
5.NK细胞活化指标
实施例1所述方法获得的NK细胞活化标记结果如图7所示，结果表明，本发明实施例1所述方法获得的NK细胞活化标记CD16，CD69，NKG2D，NKp46等均明显表达。
6.NK细胞对K562细胞杀伤实验：脱粒活性检测
NK细胞对K562细胞脱粒活性检测结果如图8所示，结果表明，NK细胞与K562细胞按3:1混合后，对K562细胞有杀伤作用，产生明显脱粒效。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
Claims (2)
1.一种NK细胞的体外培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将NK细胞与刺激细胞NKST共同接种于含有rhIL2、rhIL21、rhIL15和人AB血清的细胞培养基中，初始培养；所述培养体系中细胞总浓度为1.0×106-1.5×106个/ml，所述NK细胞与刺激细胞NKST的比例为4：1-5：1；所述培养体系中rhIL2、rhIL21、rhIL15和人AB血清的终浓度分别为200-1000IU、2-10ng/ml、5-20ng/ml、1-5％；
(2)培养至第3天，向培养体系中添加抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清，或含有抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的细胞培养基，且每2-3天重复上述操作，保持培养体系中细胞总浓度大于等于1×106个/ml，继续培养；所述培养体系中抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的终浓度分别为10-20μg/m、200-1000IU、5-20ng/ml、1-5％；
(3)培养至第8天，再次向培养体系中添加刺激细胞NKST，使NK细胞与刺激细胞NKST的浓度比为4：1-10：1；同时向培养体系中添加含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的细胞培养基，维持培养体系中细胞总浓度为1.0×106-1.5×106个/ml；继续培养；所述培养体系中抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的终浓度分别为10-20μg/m、200-1000IU、5-20ng/ml、1-5％；
(4)每2-3天检测细胞的浓度和状态，当培养基颜色发黄且细胞浓度超过2×106个/ml时，添加培养体系总体积0.5倍的含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的无血清培养基，继续培养至第14天；所述培养体系中抗坏血酸、rhIL2、rhIL15、人AB血清的终浓度分别为10-20μg/m、200-1000IU、5-20ng/ml、1-5％；所述培养体系的PH值为6.9-7.2；(5)每2-3天检测细胞的浓度和状态，当培养基颜色发黄且细胞浓度超过2×106个/ml时，添加培养体系总体积0.75倍的含有rhIL2、rhIL15、人AB血清、抗坏血酸的无血清培养基，继续培养至第21天，收取细胞；所述培养体系的PH值为6.9-7.2；
所述细胞培养基为SCGM培养基或NK MACs medium；
所述刺激细胞NKST的培养方法包括：
①将分离的外周血单核细胞加入培养瓶中，加入刺激细胞用细胞培养基，保持细胞终浓度为1.0×106-1.5×106个/ml进行培养；所述刺激细胞用细胞培养基为含终浓度分别为1-2％、200-1000IU、5-20ng/ml的自体血清、rhIL2、rhIL15的Corning淋巴细胞培养基KBM581；
②每隔2-3天进行补液：当培养基颜色变黄时，添加刺激细胞用培养基，继续培养；
③培养至7-14天，辐照处理培养体系，离心收集细胞即为刺激细胞NKST；
其中，所述培养瓶为经过TC处理且包被有人CD3单克隆抗体和人纤联蛋白。
2.如权利要求1所述的NK细胞的体外培养方法，其特征在于，所述NK细胞通过外周血单个核细胞分离获得，所述的分离步骤包括：使用Ficoll密度梯度离心法直接分离外周血单个核细胞；根据磁珠法，对外周血单个核细胞PBMCs进行CD3阴性细胞和CD56阳性细胞两步分选，分选后的细胞为NK细胞。
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