CN116179488A - 外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括：准备细胞培养瓶；向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL‑2，人重组IL‑15和胎牛血清，开始培养；培养至第2天‑3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL‑2，人重组IL‑15，胎牛血清和L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯，维持细胞总浓度并继续培养；将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；检测细胞的浓度和状态，添加所述培养液并继续培养；收集所有细胞，完成培养。本发明提供的体外扩增方法能够稳定地大量体外扩增外周血自然杀伤细胞，并且过程中能够有效减少细胞碎片的形成。
Description
技术领域
本发明涉及体外扩增领域，尤其涉及一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法。
背景技术
恶性肿瘤已成为我国主要死亡原因之一，目前尚无理想的治疗方式。近年来，免疫细胞治疗在血液肿瘤中取得的成功，受到广大研究者的青睐。自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)，即NK细胞是一种淋巴细胞亚群，具有抵抗病原微生物和消除癌细胞的能力，而不受MHC限制，通过产生溶酶颗粒和干扰素γ发挥功能。NK细胞过继免疫疗法是很有前途的恶性肿瘤治疗邻域，多项临床研究表明，对某些癌症患者具备良好的安全性和初步疗效。
随着NK细胞的需求日益增多，如何提高NK细胞体外培养扩增数量是目前最为关键的问题。NK细胞培养面临着诸多问题，如：高纯度的细胞难以用于体外扩增培养及滋养细胞(辐照后的癌细胞系)刺激NK细胞扩增，但滋养细胞的加入带来产品不稳定性及安全性问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其能够稳定地大量体外扩增外周血自然杀伤细胞，并且过程中能够有效减少细胞碎片的形成。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
S1、准备细胞培养瓶；
S2、按第一细胞浓度向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL-2，人重组IL-15和胎牛血清，开始培养；
S3、培养至第2天-3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL-2，人重组IL-15，胎牛血清和L-抗坏血酸-2-磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；
S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过预设体积时，将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；
S5、随后的2-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.9-1.1倍体积的所述培养液并继续培养；
S6、随后的1-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.4-0.6倍体积的所述培养液并继续培养；
S7、培养至第20-23天时，收集所有细胞，完成培养。
在一种实施方式中，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为0.9％-6％；
所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为15ug/ml-55ug/ml。
优选地，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为1％-5％；
所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为50ug/ml。
在一种实施方式中，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为9％-11％。
优选地，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为10％。
在一种实施方式中，所述第一细胞浓度为2×106cells/ml-2.5×106cells/ml
所述第二细胞浓度为0.9×106cells/ml-1.1×106cells/ml；
所述第三细胞浓度为1.9×106cells/ml-2.1×106cells/ml；
所述预设体积为190ml-210ml。
在一种实施方式中，步骤S1中，所述准备细胞培养瓶由下述方法完成：
取无菌T175，在底面加入4ml-6ml磷酸缓冲盐溶液润湿瓶底，再加入Lymactin-NK抗体1ml-2ml，轻柔混匀后放入培养箱中孵育至少4小时。
在一种实施方式中，所述外周血自然杀伤细胞的获得方法包括以下步骤：
外周血分离得到单核细胞；
所述单核细胞纯化后得到外周血自然杀伤细胞。
在一种实施方式中，所述外周血分离得到单核细胞，包括以下步骤：
采集外周血血样，将采集的血样平均分装至离心管中，离心后，吸弃上层血浆，保留下层血细胞层；
加入生理盐水混匀血细胞，在新取的离心管中加入分层液，将稀释后的血细胞缓慢加入至分层液上，再进行离心；
离心后收集第二层白膜层细胞，分别缓慢加入到离心管中，再加入生理盐水后离心，弃上清，得到单核细胞。
在一种实施方式中，所述单核细胞采用下述方法完成纯化：
对单核细胞进行二步磁珠分选，分选后细胞计数，离心吸弃多余上清。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，通过在培养过程中引入特定组分的培养液，使得体外培养外周血自然杀伤细胞时能够能提高NK细胞的扩增倍数，同时能够有效减少细胞碎片的形成。
附图说明
图1为实施例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒置显微镜观察图；
图2为对比例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒置显微镜观察图；
图3为实施例1和对比例1的自然杀伤细胞增殖倍数；
图4为实施例1和对比例1第21天时自然杀伤性细胞流式细胞术结果图；
图5为实施例1和对比例1第21天时自然杀伤性碎片化结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
S1、准备细胞培养瓶；在一种实施方式中，步骤S1中，所述准备细胞培养瓶由下述方法完成：
取无菌T175，在底面加入4ml-6ml磷酸缓冲盐溶液润湿瓶底，再加入Lymactin-NK抗体1ml-2ml，轻柔混匀后放入培养箱中孵育至少4小时。
S2、按第一细胞浓度向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL-2，人重组IL-15和胎牛血清，开始培养；
在一种实施方式中，所述外周血自然杀伤细胞的获得方法包括以下步骤：
(1)外周血分离得到单核细胞。优选地，所述外周血分离得到单核细胞包括以下步骤：
采集外周血血样，将采集的血样平均分装至离心管中，离心后，吸弃上层血浆，保留下层血细胞层；
加入生理盐水混匀血细胞，在新取的离心管中加入分层液，将稀释后的血细胞缓慢加入至分层液上，再进行离心；
离心后收集第二层白膜层细胞，分别缓慢加入到离心管中，再加入生理盐水后离心，弃上清，得到单核细胞。
(2)所述单核细胞纯化后得到外周血自然杀伤细胞。优选地，所述单核细胞采用下述方法完成纯化：对单核细胞进行二步磁珠分选，分选后细胞计数，离心吸弃多余上清。
在一种实施方式中，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为9％-11％。
人重组IL-2是一种人工合成的蛋白质，它是一种免疫调节分子。IL-2代表白细胞介素-2，是由T淋巴细胞产生的一种生长因子。它在免疫系统中发挥着重要作用，包括调节免疫细胞的增殖、分化和功能。人重组IL-15是一种人工合成的蛋白质，也是一种免疫调节分子。IL-15代表白细胞介素-15，它与IL-2非常相似，也是一种由T淋巴细胞、单核细胞和其他免疫细胞产生的细胞因子。它在免疫系统中发挥着重要作用，可以促进NK细胞的增殖和分化。而胎牛血清(FBS)则是一种富含营养因子、生长因子和细胞因子的生物学制品，被广泛用于体外培养多种细胞。搭配使用人重组IL-2、人重组IL-15和FBS可以有助于促进免疫细胞的增殖、分化和功能，并提高细胞培养的效率和质量。所述人重组IL-2、人重组IL-15的加入量过多将导致细胞过度激活，从而诱导细胞凋亡；人重组IL-2、人重组IL-15的加入量过少会导致细胞生长受限、细胞活性下降。优选地，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为10％。
S3、培养至第2天-3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL-2，人重组IL-15，胎牛血清和L-抗坏血酸-2-磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；
L-抗坏血酸(维生素C，VC)是一种抗氧化剂，可清除活性氧，对防止DNA损伤和癌症转移有着重要影响。另外，L-抗坏血酸还可以通过激活NK和T细胞以及单核细胞来刺激免疫系统。但VC的性质不稳定，并且高浓度的L-抗坏血酸可能会改变细胞的生理状态，影响其正常生长和代谢。本发明以L-抗坏血酸-2-磷酸酯替代L-抗坏血酸，L-抗坏血酸-2-磷酸酯的诱导细胞增殖效力高于L-抗坏血酸，L-抗坏血酸-2-磷酸酯具有更低的细胞毒性及高稳定性。
但是过高或过低的剂量都可能导致激活效果不佳或不可逆转的细胞损伤。在一种实施方式中，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为0.9％-6％；所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为15ug/ml-55ug/ml。优选地，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；所述胎牛血清的体积浓度为1％-5％；所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为50ug/ml。在上述范围内，本发明通过添加含有L-抗坏血酸-2-磷酸酯的培养液，使纯化的NK细胞大量扩增而有效减少细胞碎片的形成。
S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过预设体积时，将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；在一种实施方式中，所述预设体积为190ml-210ml。
S5、随后的2-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.9-1.1倍体积的所述培养液并继续培养；
S6、随后的1-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.4-0.6倍体积的所述培养液并继续培养；
S7、培养至第20-23天时，收集所有细胞，完成培养。
在一种实施方式中，所述第一细胞浓度为2×106cells/ml-2.5×106cells/ml；所述第二细胞浓度为0.9×106cells/ml-1.1×106cells/ml；所述第三细胞浓度为1.9×106cells/ml-2.1×106cells/ml。
下面以具体实施例进一步说明本发明：
实施例1
本实施例提供了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
S1、准备细胞培养瓶，包括：取无菌T175在底面加入PBS 5ml，润湿瓶底，加入NK细胞培养抗体Lymactin-NK 1ml，轻柔混匀将液体混匀后放入培养箱中孵育至少4小时，备用；
S2、按2.3×106cells/ml向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL-2 1000IU/ml、人重组IL-1510ng/ml、FBS10％，开始培养；
所述外周血自然杀伤细胞采用下述方法获得：
(1)外周血分离单核细胞
采集外周血血样，将采集的血样平均分装至50ml离心管中，1800rpm离心10min，升7降4，离心后，吸弃上层血浆，保留下层血细胞层；
1：1加入生理盐水混匀血细胞，在新取的离心管中加入15ml Ficoll分层液，将稀释后的血细胞缓慢加入至分层液上，800rpm离心20min，升7降0；
离心后收集第二层白膜层细胞，分别缓慢加入到离心管中，用生理盐水补齐至50ml，1800rpm离心10min，弃上清，细胞计数。
(2)磁珠法纯化NK细胞
根据市售磁珠产品说明书配制分选缓冲液预冷，并对外周血单核细胞进行二步磁珠分选：CD3阴性细胞分选和CD56阳性细胞分选。分选后，细胞计数，1800rpm，10min，吸弃多余上清。
S3、培养至第2天-3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL-2，人重组IL-15，胎牛血清和L-抗坏血酸-2-磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；
具体地，Day3：根据细胞计数，补加培养基，培养基中添加重组IL-2 1000IU/ml、IL-15 10ng/ml、FBS 5％、L-抗坏血酸-2-磷酸酯50ug/ml；维持细胞总浓度1×106cells/ml继续培养；
Day4-Day7：平均2-3天添加一次培养液，根据细胞1×106cells/ml计算补加培养液，培养液中添加IL-2 1000IU/ml、IL-15 10ng/ml、FBS1％、L-抗坏血酸-2-磷酸酯50ug/ml。
S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过200ml时，根据细胞浓度1.5×106cells/ml将所有细胞从细胞培养瓶转至细胞培养袋中继续培养；
S5、随后的2-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于2×106cells/ml时，添加1倍体积的所述培养液并继续培养；
S6、随后的1-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于2×106cells/ml时，添加0.5倍体积的所述培养液并继续培养；
S7、培养至第21天时，采用离心法收集所有细胞，完成培养。
对比例1
本对比例提供了一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，与实施例1不同之处在于：步骤S3-S6中，所述培养液中不包含L-抗坏血酸-2-磷酸酯，其余均与实施例1相同。
对实施例1和对比例1扩增后的外周血自然杀伤细胞进行检测。图1为实施例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒置显微镜观察图，图2为对比例1培养至第21天时自然杀伤细胞的倒置显微镜观察图，实施例1与对比例1相比，实施例1中聚团细胞较多，单个细胞呈椭圆状，边缘清晰透亮。
表3为实施例1和对比例1的自然杀伤细胞增殖倍数，计算可知实施例1的增殖倍数为162.7倍，对比例1的增殖倍数为118.8，实施例1的体外细胞扩增效果由于对比例1。
图4为实施例1和对比例1第21天时自然杀伤性细胞流式细胞术结果图，实施例1为CD3-CD56+CD16-:86.5％，对比例1为85.4％。上述结果表明L-抗坏血酸-2-磷酸酯的引入不会影响NK细胞表型。
图5为实施例1和对比例1第21天时自然杀伤性碎片化结果图，实施例1的细胞碎片化为2.2％，对比例1的细胞碎片化为12.3％；上述结果表明加入含有L-抗坏血酸-2-磷酸酯的特定成分的培养液有助于减少细胞碎片的形成。
综上，本发明提供的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，通过在培养过程中引入特定组分的培养液，使得体外培养外周血自然杀伤细胞时能够能提高NK细胞的扩增倍数，同时能够有效减少细胞碎片的形成。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、准备细胞培养瓶；
S2、按第一细胞浓度向外周血自然杀伤细胞中加入基础培养基重悬细胞后吸出，再添加至所述细胞培养瓶中，并加入人重组IL-2，人重组IL-15和胎牛血清，开始培养；
S3、培养至第2天-3天时，开始向培养体系中补加培养液，所述培养液包括人重组IL-2，人重组IL-15，胎牛血清和L-抗坏血酸-2-磷酸酯，维持细胞总浓度在第二细胞浓度内并继续培养；
S4、当所述细胞培养瓶内培养液的体积超过预设体积时，将所述细胞培养瓶内的细胞转移至细胞培养袋中继续培养；
S5、随后的2-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.9-1.1倍体积的所述培养液并继续培养；
S6、随后的1-7天内，每2-3天检测细胞的浓度和状态，当细胞浓度大于第三细胞浓度时，添加0.4-0.6倍体积的所述培养液并继续培养；
S7、培养至第20-23天时，收集所有细胞，完成培养。
2.如权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为0.9％-6％；
所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为15ug/ml-55ug/ml。
3.根据权利要求2所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述培养液中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为1％-5％；
所述L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为50ug/ml。
4.根据权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为900IU/ml-1100IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为9ng/ml-11ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为9％-11％。
5.如权利要求4所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S2中，所述人重组IL-2的浓度为1000IU/ml；
所述人重组IL-15的浓度为10ng/ml；
所述胎牛血清的体积浓度为10％。
6.根据权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述第一细胞浓度为2×106cells/ml-2.5×106cells/ml
所述第二细胞浓度为0.9×106cells/ml-1.1×106cells/ml；
所述第三细胞浓度为1.9×106cells/ml-2.1×106cells/ml；
所述预设体积为190ml-210ml。
7.根据权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S1中，所述准备细胞培养瓶由下述方法完成：
取无菌T175，在底面加入4ml-6ml磷酸缓冲盐溶液润湿瓶底，再加入Lymactin-NK抗体1ml-2ml，轻柔混匀后放入培养箱中孵育至少4小时。
8.根据权利要求1所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述外周血自然杀伤细胞的获得方法包括以下步骤：
外周血分离得到单核细胞；
所述单核细胞纯化后得到外周血自然杀伤细胞。
9.根据权利要求8所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述外周血分离得到单核细胞，包括以下步骤：
采集外周血血样，将采集的血样平均分装至离心管中，离心后，吸弃上层血浆，保留下层血细胞层；
加入生理盐水混匀血细胞，在新取的离心管中加入分层液，将稀释后的血细胞缓慢加入至分层液上，再进行离心；
离心后收集第二层白膜层细胞，分别缓慢加入到离心管中，再加入生理盐水后离心，弃上清，得到单核细胞。
10.根据权利要求8所述的外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述单核细胞采用下述方法完成纯化：
对单核细胞进行二步磁珠分选，分选后细胞计数，离心吸弃多余上清。
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