CN113061574A - Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品，属于生物医药领域。本发明提供了Vc(维生素C)衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品，通过将一定剂量的Vc衍生物连续添加到培养液，可促进红系分化，提高红系体外分化体系的再生效率，提高细胞增殖能力及提高红系分化相关基因表达，提高体外红细胞再生效率，为治疗贫血提供新的思路。

Description

Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品。
背景技术
维生素C，也称为抗坏血酸，分子式C6H8O6(Ascorbate)。众所周知，缺乏维生素C，在临床上主要引起出血和骨骼病变，严重缺乏者会出现贫血。维生素C缺乏性贫血的形成有两大可能因素，一是维生素C缺乏患者的皮肤、深部组织甚至胃肠道出血引起的贫血；其次是维生素C参与铁和叶酸代谢，能使难以吸收的三价铁还原为易于吸收的二价铁，从而促进了铁的吸收，并能使亚铁络合酶等巯基处于活性状态，其中大部分会用于血红蛋白的合成。同时维生素C能促进叶酸还原为四氢叶酸后发挥脱氧核糖核酸合成的作用，故缺乏维生素C时会引起缺铁性贫血及巨幼红细胞性贫血，及时补充维生素C可以改善此类贫血症状。但是，维生素C在红系造血中会引起哪些作用及作用机制还有待进一步研究。
例如，中国专利申请201710576758.3公开了维生素C在制备培养基中的用途，所述培养基用于促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞造血分化。该专利的发明人通过实验发现，在人多能干细胞造血分化的单层分化培养体系中，添加维生素C可有效促进人的多能干细胞诱导分化成CD34+CD43+的HPC，维生素C对促进人多能干细胞(包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞)的定向造血分化具有重要作用。但是依然存在增殖和诱导分化效率低的问题。
维生素C衍生物，是以维生素C为原料用现代科学技术加工而成，无论口服还是通过皮肤吸收进入人体后，均能通过磷酸酯酶迅速酶解游离出维生素C，发挥维生素C所特有的生理生化功能。其中维生素C磷酸酯镁(抗坏血酸磷酸酯镁盐，L-Ascorbic acid 2-phosphate magnesium salt，或Magnesium ascorbyl phosphate)，具有无臭，无味，有吸湿性，溶于水，易溶于稀酸，不溶于乙醇、氯仿或乙醚等有机溶剂，在光、热和空气中较稳定的特点。然而，目前对于维生素C磷酸酯镁的研究还停留在添加剂阶段，主要用于护肤品或饲料添加剂中，利用其消除氧自由基的特点，起到去皱、抗衰老等作用；而对于维生素C磷酸酯镁的其它用途则鲜见报道。
由于血液来源紧张以及输血相关疾病的发生导致人们对血源的需求，以及目前存在的红细胞增殖和诱导分化效率低等问题，本发明提出Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用，提高体外红细胞再生效率，为治疗贫血提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供Vc(维生素C)衍生物在促进红细胞再生中的应用及产品，通过将一定剂量的Vc衍生物连续添加到培养液，可促进红系分化，提高红系体外分化体系的再生效率。
首先，本发明提供Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用。
优选的，所述应用是通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平实现的。
其中，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种。
优选的，所述应用包括用来促进造血干细胞和/或红系分化。其中，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得，进一步优选为来源于脐带血。
优选的，所述Vc衍生物选自维生素C钠、维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠，维生素C磷酸酯钙，抗坏血酸多聚磷酸酯中的至少一种，进一步优选为维生素C磷酸酯镁。
优选的，所述应用中，Vc衍生物的添加方式是用培养基配成浓缩液，滤菌后按终浓度直接加入细胞培养基中。
优选的，所述应用中，Vc衍生物在体外细胞实验中的给药用量在正常人维生素C的血浆浓度范围内，优选100μM。
优选的，所述应用中，Vc衍生物给药时间为细胞分化期间。
再者，本发明提供Vc衍生物在制备治疗贫血药物中的应用。
优选的，所述的贫血包括失血性贫血、溶血性贫血、巨细胞贫血和再生障碍性贫血。
优选的，所述药物包括有效量的Vc衍生物和药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物可以是口服剂、注射剂、植入剂。
再者，本发明提供一种真核生物红细胞分化促进剂，包括Vc衍生物。
其中，所述真核生物为哺乳动物，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种。
优选的，所述真核生物红细胞分化促进剂的剂型为溶液。
优选的，所述真核生物红细胞分化促进剂还包括药学上可接受的辅料，进一步优选为细胞培养基。
其次，本发明还提供一种促进红细胞再生的方法，将Vc衍生物添加到培养体系中培养红细胞。
所述方法是通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平促进红细胞再生。
优选的，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种。
优选的，所述Vc衍生物选自维生素C钠、维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠，维生素C磷酸酯钙，抗坏血酸多聚磷酸酯中的至少一种，进一步优选为维生素C磷酸酯镁。
优选的，所述方法中，Vc衍生物的添加方式是用培养基配成浓缩液，滤菌后按终浓度直接加入细胞培养基中。
优选的，所述方法中，Vc衍生物在体外细胞实验中的给药用量在正常人维生素C的血浆浓度范围内，优选100μM。。
优选的，所述方法中，Vc衍生物给药时间为细胞分化期间。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在基因组学上明确了Vc衍生物对红系细胞5hmC分布模式的影响，证明了其在表观上诱导红系细胞分化的作用，为Vc衍生物在红细胞再生体系中的应用提供证据。
(2)本发明发现，Vc衍生物可以显著促进红系分化，提高细胞增殖能力及提高红系分化相关基因表达；同时测试了最佳浓度的Vc磷酸酯镁对5hmC水平的影响，结果显示可显著提高5hmC水平；另外，通过hMeDIP-seq数据分析发现最佳浓度的Vc磷酸酯镁可显著提高FOXO3基因上的5hmC水平；蛋白质免疫印迹实验发现最佳浓度的Vc磷酸酯镁可显著提高FOXO3a的蛋白水平。
附图说明
图1为Vc衍生物促进人脐带血来源的CD34+细胞红系分化的流式分析结果图；
图2为Vc衍生物促进人脐带血来源的CD34+细胞红系分化及HUDEP2类红细胞系红系分化的增殖曲线图；
图3为Vc衍生物在分化第七天促进人脐带血来源的CD34+细胞相关基因表达结果图；
图4为Vc衍生物在分化第十天促进人脐带血来源的CD34+细胞相关基因表达结果图；
图5为Vc衍生物在分化第十三天促进人脐带血来源的CD34+细胞相关基因表达结果图；
图6为Vc衍生物在分化第四天促进人脐带血来源的HUDEP2类红细胞相关基因表达结果图；
图7为Vc衍生物在分化第七天促进人脐带血来源的HUDEP2类红细胞相关基因表达结果图；
图8为Vc衍生物促进HUDEP2类红细胞的HBB蛋白的表达；
图9为最佳浓度的Vc衍生物显著提高红系细胞5hmC水平的结果图；
图10为最佳浓度的Vc衍生物显著提高红系细胞中FOXO3基因上的5hmC水平的结果图；
图11为最佳浓度的Vc衍生物显著提高红系细胞中FOXO3a的蛋白水平图。
图12为VC衍生物较VC更好的提高红系细胞相关基因表达结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1Vc衍生物促进人脐带血来源的CD34+细胞红系分化
S1:将Vc磷酸酯镁配制成100mM，根据终浓度100μM，即稀释1000倍加入到CD34+细胞诱导分化体系中，分化第3天时加入，之后在分化时间点时更换新的含相同浓度维生素C的培养基，更换时间点为第7天和第10天，分化至第13天。
S2:取第7天的10万个细胞进行CD71，CD235流式抗体的孵育10分钟后，洗去溶液中残留抗体，进行流式分析。
如图1所示，结果表明，在CD34+细胞诱导分化体系中，Vc衍生物处理较对照组(未处理)来说，能显著促进红细胞的分化。
实施例2Vc衍生物促进人脐带血来源的CD34+细胞分化体系及HUDEP2类红细胞系红系分化的增殖
S1:将Vc磷酸酯镁配制成100mM，根据终浓度100μM，即稀释1000倍加入到CD34+细胞诱导分化体系中，分化第3天时加入，之后在分化时间点时更换新的含相同浓度维生素C的培养基，更换时间点为第7天和第10天，分化至第13天。
根据所需要的浓度加入到HUDEP2类红细胞诱导分化体系中，分化第0天时加入，之后在分化时间点时更换新的含维生素C的培养基，更换时间点为第4天，分化至第7天。
S2:分别将处理后的两种细胞以1-2million/ml的密度种于60mm培养皿，CD34+细胞分成8组：对照组(未处理)，10μM Vc衍生物组，25μM Vc衍生物组，50μM Vc衍生物组，75μMVc衍生物组，100μM Vc衍生物组，150μM Vc衍生物组以及200μM Vc衍生物组；
HUDEP2类红细胞分成7组：对照组(未处理)，10μM Vc衍生物组，50μM Vc衍生物组，100μM Vc衍生物组，150μM Vc衍生物组，200μM Vc衍生物组以及250μM Vc衍生物组；
培养期间用count-star系统进行细胞数量和活率记录。
如图2所示，结果表明，在CD34+细胞诱导分化体系及HUDEP2类红细胞诱导分化中，Vc衍生物处理较对照组(未处理)来说，能显著促进红细胞的增殖。
实施例3Vc衍生物促进人脐带血来源的CD34+细胞及HUDEP2类红细胞诱导分化体系中红系细胞表达红系分化相关基因
S1:同实施例2中S1步骤。
S2:同实施例2中S2步骤。
S3:取分化第7天，第10天，通过Trizol试剂，异丙醇，75％无水乙醇提取细胞的RNA，按照TAKARA逆转录试剂盒的逆转录步骤完成RNA的逆转录，获得cDNA，采用KAPA SYBRFAST Universal qPCR Kit完成qPCR。
结果表明，如图3-7所示，在CD34+细胞诱导分化体系及HUDEP2类红细胞诱导分化中，Vc衍生物处理较对照组(未处理)来说，在不同分化时间点，Vc衍生物处理能显著促进红系分化相关基因，如HBB、HBG、GATA1、ALAS2的表达。
实施例4维生素C促进HUDEP2类红细胞表达红系分化相关蛋白。
S1:将Vc衍生物配制成100μg/mL，根据所需要的浓度加入到HUDEP2类红细胞诱导分化体系中，分化第0天时加入，之后在分化时间点时更换新的含维生素C磷酸镁酯的培养基，第4天进行换液，培养液中只添加促红细胞生成素，分化至第7天。
S2:将处理后的细胞以合适的密度种于60mm培养皿，分成4组：对照组(未处理)，75ug/mL组，100ug/mL组,125ug/mL组。
结果表明，如图8所示，在HUDEP2类红细胞诱导分化体系中，较对照组(未处理)来说，在不同分化时间点，处理后能显著促进红系分化相关蛋白HBB的表达。
实施例5Vc衍生物显著提高红系细胞5hmC水平
S1:同实验1中S1步骤。
S2:将处理后的细胞以以1-2million/ml的密度种于60mm培养皿，分成2组：对照组(未处理)，100μM Vc衍生物处理组。
S3:取分化取分化第7天，第10天，第13天的细胞，提取其基因组DNA，采用dot blot(斑点免疫印记)方法，用5hmC特异性抗体去检测5hmC变化，最后通过显影来判断变化幅度的大小。
如图9所示，结果表明，在不同分化时间点，最佳浓度的Vc磷酸酯镁均可显著提高红系细胞5hmC水平。
实施例6Vc衍生物显著提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平
S1:同实验1中S1步骤。
S2:将处理后的细胞以以1-2million/ml的密度种于60mm培养皿，分成2组：未处理为对照组，100μM Vc衍生物为处理组。
S3:取分化取分化第10天的细胞，提取其基因组DNA，进行hMeDIP测序。利用生物信息学方法处理测序数据，将原始数据进行质量评估、低质量数据过滤、比对到基因组，然后将基因组分成固定大小的bin(5K)，计算每个bin里面的5hmC富集值，然后查看FOXO3基因上的5hmC富集值。
如图10所示，结果表明，在红系分化体系中，Vc衍生物处理较对照组(未处理)来说，Vc衍生物处理能显著提高红系细胞中FOXO3基因上的5hmC水平。
实施例7Vc衍生物显著提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平
S1:同实验1中S1步骤。
S2:同实验5中S2步骤。
S3:取分化取分化第10天的细胞，提取其蛋白质，进行蛋白免疫印迹实验。利用FOXO3a特异性抗体去检测5hmC变化，最后通过显影来判断变化幅度的大小。
如图11所示，结果表明，在红系分化体系中，Vc衍生物处理较对照组(未处理)来说，Vc衍生物处理能显著提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平。
对比例1Vc衍生物较Vc更好的提高红系细胞相关基因表达
S1:将维生素C磷酸镁酯配制成50mg/mL，根据所需要的浓度加入到HUDEP2类红细胞诱导分化体系中，分化第0天时加入，之后在分化时间点时更换新的含维生素C磷酸镁酯的培养基，第4天进行换液，培养液中只添加促红细胞生成素，分化至第7天。维生素C溶液与维生素C磷酸镁酯做同样处理，配置成50mg/mL。
S2:将处理后的细胞以合适的密度种于60mm培养皿，分成4组：对照组(未处理)，维生素C磷酸镁酯50ug/mL组(L-50)，维生素C50ug/mL组(vc-50),维生素C 125ug/mL组(vc-125)。
如图12所示，结果表明，在HUDEP2类红细胞诱导分化体系中，较对照组(未处理)来说，在分化第四天，维生素C磷酸镁酯组促进红系相关基因效果优于维生素C。
上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.Vc衍生物在促进红细胞再生中的应用，其特征在于，所述应用是通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平实现的。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种；
所述Vc衍生物选自维生素C钠、维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠，维生素C磷酸酯钙，抗坏血酸多聚磷酸酯中的至少一种，进优选为维生素C磷酸酯镁。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，Vc衍生物的添加方式是用培养基配成浓缩液，滤菌后按终浓度直接加入细胞培养基中，所述应用中，Vc衍生物在红细胞再生体系中的添加量在正常人维生素C的血浆浓度范围内，优选100μM；所述应用中，Vc衍生物给药时间为细胞分化期间。
4.Vc衍生物在制备治疗贫血药物中的应用，其特征在于，所述应用是通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平实现的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的贫血包括失血性贫血、溶血性贫血、巨细胞贫血和再生障碍性贫血。
6.一种真核生物红细胞分化促进剂，其特征在于，包括Vc衍生物，所述真核生物为哺乳动物，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的真核生物红细胞分化促进剂，其特征在于，所述真核生物红细胞分化促进剂的剂型为溶液；所述真核生物红细胞分化促进剂还包括药学上可接受的辅料，所述辅料优选为细胞培养基。
8.一种促进红细胞再生的方法，其特征在于，包括将Vc衍生物添加到培养体系中培养红细胞，通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平促进红细胞再生。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述红细胞为各分化阶段红系细胞，优选为爆式集落形成单位红系细胞、集落形成单位红系细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多色红细胞、正色红细胞、网织红细胞中的至少一种；
所述Vc衍生物选自维生素C钠、维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠，维生素C磷酸酯钙，抗坏血酸多聚磷酸酯中的至少一种，进一步优选为维生素C磷酸酯镁；
所述方法中，Vc衍生物的添加方式是用培养基配成浓缩液，滤菌后按终浓度直接加入细胞培养基中；
所述方法中，Vc衍生物在红细胞再生体系中的添加量在正常人维生素C的血浆浓度范围内，优选100μM；
所述方法中，Vc衍生物给药时间为细胞分化期间。
10.Vc衍生物通过促进红系分化相关基因的表达、提高红系细胞5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3基因上5hmC水平、提高红系细胞中FOXO3a蛋白水平促进红细胞再生实现红细胞再生的应用。
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