CN117243978B - 一种纳米阿胶及其制备和在再生障碍性贫血治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种纳米阿胶及其制备和在再生障碍性贫血治疗中的应用。纳米阿胶的制备方法包括以下步骤：将阿胶粉碎后溶解于水中，进行水热反应，反应液冷却后离心，过滤，干燥，获得所述纳米阿胶。本发明制备了尺寸大约2.2nm的纳米阿胶，具有极好的水溶性和稳定性。药理实验证明，纳米阿胶既可以促进造血干细胞增值和红系分化，增加红细胞的生成，又具有抗氧化性，可以保护细胞免受氧化应激的损伤，减少红细胞的凋亡，以多重功效共同治疗再生障碍性贫血。本发明提高了传统阿胶的治疗效果，并且可以以多种给药方式(静脉注射和口服)治疗再生障碍性贫血，有望发展阿胶新剂型和新产品，并拓展其临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种纳米阿胶及其制备和在再生障碍性贫血治疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
再生障碍性贫血(Aplastic anemia)简称再障(AA)是一种由多种病因所致的骨髓造血功能衰竭性综合征，临床上以贫血、出血、感染为主要表现，病情严重的会危及生命。再障发病原因复杂，病程周期长、易复发，患者的生存受到严重威胁。目前的治疗手段有输血、干细胞移植等，但这些手段存在效率低、易复发、成本高等问题。因此，开发新的治疗手段来改善再生障碍性贫血的现状是目前的研发重点。
中药治疗再生障碍性贫血已经取得了一定的临床疗效。中药来源于天然药及其加工品，包括植物药、动物药、矿物药等。与西医的合成药物相比，这些天然药物往往具有独特的优势。中药资源是一座宝库，纯天然和毒副作用相对较少是其最大的优势，也是中药赖以生存和发展并留传至今的根源所在，目前对中药的研究得到越来越多的重视。其中，阿胶是我国传统地道药材，最早被记录在《神农中草经》中，与人参、鹿茸合称为中药三宝，具有补血止血、滋阴润燥等功效，自古以来被称为“滋补国宝，补血圣药”，具有极高的开发和利用价值。
虽然传统阿胶的研究历史悠久，其中通常富含氨基酸、蛋白质、多肽、多糖等成分，可表现出补血止血、抗氧化、抗衰老、增强抵抗力、活血化瘀、调节免疫等生物活性。然而，作为驴皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，阿胶应用还存在瓶颈。一方面是其水溶性较差，另一方面其本身的活性胶原蛋白分子量较大(几万到十几万)，脾胃虚弱的人群难以吸收，以至于其生物利用度和功效无法充分发挥。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种纳米阿胶及其制备和在再生障碍性贫血治疗中的应用。本发明发展了一种纯物理的阿胶纳米化制备技术，制备了尺寸大约2.2nm的纳米阿胶，具有极好的水溶性和稳定性。药理实验证明，纳米阿胶既可以促进造血干细胞增值和红系分化，增加红细胞的生成，又具有抗氧化性，可以保护细胞免受氧化应激的损伤，减少红细胞的凋亡，以多重功效共同治疗再生障碍性贫血。本发明提高了传统阿胶的治疗效果，并且可以以多种给药方式(静脉注射和口服)治疗再生障碍性贫血，有望发展阿胶新剂型和新产品，并拓展其临床应用价值。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种纳米阿胶的制备方法，包括以下步骤：
将阿胶粉碎后溶解于水中，进行水热反应，反应液冷却后离心，过滤，干燥，获得所述纳米阿胶。
优选的，阿胶溶解于水中的比例为1g:40-60mL。
优选的，所述水热反应的温度为190-210℃，时间为11-13h。
优选的，所述离心的转速为9000-11000rpm，时间为9-11min。
优选的，使用0.22μm聚醚砜滤针式膜过滤。
优选的，所述干燥为冷冻干燥。
第二方面，本发明提供了一种纳米阿胶，通过如第一方面所述的制备方法获得。
第三方面，本发明提供了如第二方面所述的纳米阿胶在制备再生障碍性贫血治疗产品中的应用。
优选的，所述产品为药物。
优选的，所述药物的给药方式包括静脉注射或口服。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
1.本发明通过一步水热法即可实现纯物理阿胶纳米化，制备了尺寸大约2.2nm的纳米阿胶，具有极好的水溶性和稳定性。
2.本发明通过药理实验证明，纳米阿胶既可以促进造血干细胞增值和红系分化，增加红细胞的生成，又具有抗氧化性，可以保护细胞免受氧化应激的损伤，减少红细胞的凋亡，以多重功效共同治疗再生障碍性贫血。
3.本发明提高了传统阿胶的治疗效果，并且可以以多种给药方式(静脉注射和口服)治疗再生障碍性贫血，有望发展阿胶新剂型和新产品，并拓展其临床应用价值，进而加快阿胶的现代化创制进程。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为E-CDs纳米颗粒的代表性TEM和HRTEM图以及E-CDs的尺寸分布；
图2为E-CDs的紫外可见吸收光谱、及荧光激发和发射光谱，插图为在日光下(左)和365nm紫外灯下(右)拍摄的E-CDs照片；
图3为E-CDs的傅里叶变换红外光谱图；
图4为不同浓度下E-CDs总抗氧化性(a)、羟基自由基清除率(b)、超氧化物歧化酶活性(c)；
图5为不同浓度、不同孵育时间下E-CDs对NIH/3T3和K562细胞的毒性；
图6为ROS荧光染色，以表征E-CDs对细胞内活性氧的清除能力(Scale bar＝25μm)；
图7为E-CDs处理后K562细胞红系分化指标CD71(a)、CD235a(b)、FSC-A(c)的变化；
图8为各治疗组再生障碍性贫血小鼠以及正常小鼠14天内的存活率；
图9为各治疗组再生障碍性贫血小鼠以及正常小鼠14天内体重变化；
图10为各治疗组再生障碍性贫血小鼠以及正常小鼠第14天的骨髓切片的HE染色(1、Normal，2、AA+PBS，3、AA+CCA，4、AA+EPO，5、AA+CDs，6、AA+CDs-i.g.)(Scale bar＝50μm)；
图11为正常组和各治疗组小鼠血常规指标(a)红细胞数量、(b)血红蛋白浓度、(c)白细胞数量、(d)血小板数量；
图12为(a)骨髓细胞流式分析Lin-标记骨髓中未成熟的造血细胞、(b)Lin-在总的活细胞中的占比、(c)Lin+在总的活细胞中的占比；
图13为E-CDs对小鼠骨髓细胞红细胞分化的影响：Ter119+CD71+细胞的流式分析以及定量分析；
图14为E-CDs对小鼠外周血红细胞分化的影响：(a)外周血CD71+Ter119+(网织红细胞Retic)细胞和CD71-Ter119+(红细胞RBC)细胞的流式分析、各组中(b)网织红细胞和(c)成熟红细胞的相对比例；
图15为E-CDs降低ROS水平(a)骨髓细胞中各组ROS水平流式分析以及定量分析、(b)外周血中各组ROS水平流式分析以及定量分析。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
纳米阿胶(E-CDs)的合成：采用水热法合成E-CDs。将块状阿胶打磨成粉末，取0.2g阿胶粉末置于10mL去离子中，超声10分钟，使其充分溶解后倒入聚四氟乙烯高压反应釜中，于200℃温度下恒温反应12h。待反应液冷却至室温后，以10000rpm离心10分钟，并用0.22μm聚醚砜滤针式膜过滤，冷冻干燥后以备使用。
如图1所示，成功合成了尺寸分布在2.2nm左右的E-CDs。其分散性良好，呈准球形。紫外可见吸收光谱如图2所示，在278nm处的吸收带是由于sp2结构域的π-π*跃迁所致。E-CDs溶液在365nm激发下发出亮蓝色荧光。最大激发(Ex)波长为369nm，最大发射(Em)波长为440nm。
E-CDs的傅里叶红外光谱如图3所示，其表面含有丰富的含C\H\O的官能团，使其具有优异的水溶性。
实施例2
纳米阿胶的总抗氧化能力(T-AOC)测定：利用总抗氧化能力试剂盒，按照试剂盒中提供的检测方法，检测E-CDs的总抗氧化能力。实验重复三次，记录并分析数据。
纳米阿胶的羟基自由基清除能力(HORAC)：利用TMB显色法进行羟基自由基清除活性试验，来验证E-CDs清除·OH的能力。·OH由H2O2和Fe2+之间的Fenton反应生成，该反应可以将TMB转化为氧化产物(ox TMB)，在652nm处具有特征吸收。因此，可以通过监测oxTMB在652nm处的吸收来确定·OH的剩余浓度。实验重复三次，记录并分析数据。
纳米阿胶的类超氧化物歧化酶(SOD-like)活性检测：利用总超氧化物歧化酶试剂盒，按照试剂盒中提供的检测方法，检测E-CDs的超氧化物歧化酶类酶活性。上述实验重复三次，记录并分析数据。
如图4所示，利用ABTS自由基清除率表示E-CDs的总抗氧化能力，E-CDs对ABTS自由基清除率具有浓度依赖性，在400μg/mL浓度下清除率达到55.8％左右。利用芬顿反应后TMB对羟基自由基的显色反应鉴定E-CDs对羟基自由基的清除能力，随着浓度的增加，吸光度逐渐下降证明羟基自由基减少，E-CDs的羟基自由基清除率可达59％。同样利用试剂盒检测对超氧阴离子的清除率可达53.3％，同样具有浓度依赖性。
纳米阿胶的细胞内抗氧化能力测试：细胞首先受到活性氧阳性对照Rosup试剂的刺激，使细胞内产生高水平的活性氧。然后用E-CDs处理12小时。洗去材料后，装载DCFH-DA荧光探针进行ROS荧光染色。利用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光信号强弱，并进行荧光定量分析。结果如图6所示。相比于被Rosup试剂刺激后未加处理，含有高活性氧浓度的阳性对照组相比，刺激后与E-CDs共孵育12小时的细胞DCFH的荧光强度显著降低。这表明E-CDs对细胞内过量的活性氧也有较好的清除能力。
细胞毒性实验：E-CDs的细胞毒性是通过CCK-8法使用小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)和人慢性髓系白血病细胞(K562)测定的。将细胞接种到96孔板(8000-10000个细胞/孔)中并培养过夜。然后用不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、和400μg/mL)的E-CDs处理细胞。分别培养24、48和72小时后，加入CCK-8试剂，继续培养2小时，用酶标仪检测细胞活力。实验重复三次，记录并分析数据。
纳米阿胶促进造血干细胞的红系分化：分别用0、50、100、200、400μg/mL浓度的E-CDs与K562细胞孵育72小时。收集细胞并用PBS洗涤，然后用PE偶联抗CD235a抗体和FITC偶联抗CD71抗体进行标记,在流式细胞仪上进行分析。CD 235a和CD 71是细胞红系分化的典型表面标志物，如图7中的a和b所示，于E-CDs孵育后K562细胞表明CD 235a和CD 71水平呈剂量依赖性升高。这为E-CDs在体外促进细胞红系分化的效果提供了明确的证据。
前向散射(FSC)通常用于反映流式细胞术测量中的相对细胞大小，随着分化的进行，细胞大小逐渐减小。如图7中的c所示，FSC随浓度升高而减小也同样证明了E-CDs促进细胞红系分化的效果。
小鼠再生障碍性贫血模型建立：小鼠(ICR，5周，约22g)，使其在实验室环境中适应一周。接下来，实验组连续6天腹腔注射白消安(20mg/kg)和环磷酰胺(80mg/kg)以构建再生障碍性小鼠模型，再进行分组治疗。正常小鼠对照组用同样体积PBS腹腔注射6天。
纳米阿胶对再生障碍性贫血小鼠的治疗能力：建模成功的小鼠分成5组：再障组(AA+PBS)：PBS(100μL)连续静脉注射六天；再障-阿胶治疗组(AA+CCA)：阿胶(50mg/kg,100μL)连续静脉注射六天；再障-临床药物治疗组(AA+EPO)：EPO(1000IU/kg,100μL)于第8、10、12天静脉注射；再障-纳米阿胶静脉注射治疗组(AA+E-CDs)：纳米阿胶(50mg/kg,100μL)连续静脉注射六天；再障-纳米阿胶口服给药治疗组(AA+E-CDs-i.g.)：纳米阿胶(250mg/kg,100μL)连续口服给药六天。于第14天通过颈脱位处死小鼠。取小鼠外周血检测红系分化情况和血常规指标恢复情况，取小鼠股骨进行骨髓切片HE染色观察骨髓造血恢复情况，取骨髓细胞进行流式细胞术检测评估E-CDs对骨髓造血过程的治疗能力。
如图8所示，E-CDs静脉给药组存活率高达100％，其下依次为E-CDs口服给药治疗组80％，EPO治疗组70％，阿胶原液治疗组60％，治疗效果最差的为PBS治疗组即阳性对照组，存活率为40％。
如图9所示，注射化疗药物后，小鼠体重明显下降，而E-CDs静脉给药和口服给药后小鼠体重相较于其他治疗组有明显上升。
通过骨髓病理学和血常规检测精确评价E-CDs的治疗作用。如图10所示，小鼠股骨骨髓切片苏木精伊红(HE)染色显示，再障小鼠骨髓中存在大量的脂肪空泡，骨髓细胞数量明显减少。而经过E-CDs治疗的小鼠骨髓中有核细胞密布，脂滴明显减少和变小，E-CDs明显改善了再障的典型病理改变。血常规指标如图11所示，化疗药物注射后的小鼠血液三系细胞显著降低，造血功能受到抑制,血红蛋白水平也明显降低。然而通过E-CDs静脉给药和口服给药，红细胞和血红蛋白均有大幅提升，白细胞和血小板水平也相较于阴性对照组有所升高。因此，以不同的给药方式治疗再生障碍性贫血，E-CDs均具有很好的治疗效果。
骨髓造血过程中未成熟的造血细胞可以用谱系阴性(Lin-)特异性标记物来检测，Lin+代表已分化的细胞。如图12所示，与正常小鼠相比，再障小鼠中Lin-群体显著减少。经过E-CDs治疗后Lin-群体占比大幅提升，接近正常组。而阿胶原液治疗的小鼠虽然Lin-群体也大幅提高，但Lin+占比明显下降，这表明阿胶原液虽然增加了造血干细胞群体但抑制了分化进程。
CD 71和TER 119是小鼠细胞红系分化特异性抗体，如图13所示，再生障碍性贫血小鼠相比正常小鼠未成熟红细胞(CD 71+Ter119+)的总含量急剧下降。经E-CDs给药治疗后，造血功能恢复，未成熟红细胞(CD 71+Ter 119+)水平有大幅提升，接近正常组。在骨髓环境中，E-CDs表现出了良好的治疗效果，可有效恢复小鼠骨髓细胞造血功能。
网织红细胞(Retic)从骨髓释放到外周血中，发育成成熟的红细胞(RBC)，称为红细胞成熟过程。如图14所示，在正常小鼠中，血液中网织红细胞占比不超过5％。然而，由于化疗药物诱导的造血功能障碍，再障小鼠血液中Retic(CD 71+Ter 119+)的相对比例显著高于正常小鼠。而经过E-CDs给药治疗后，红细胞成熟有很大改善，比其他治疗组网织红细胞占比降低更显著，极大的促进了红细胞成熟。
如图15所示，与正常小鼠相比，由化疗药刺激的再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞(a)和全血细胞(b)中活性氧水平显著提高。众所周知，过量的活性氧会导致细胞遭受氧化应激损伤，进一步导致细胞凋亡。通过E-CDs的治疗，活性氧水平均有所下降。这对于治疗再生障碍性贫血减少血细胞损失具有积极的影响。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.纳米阿胶在制备再生障碍性贫血治疗产品中的应用，其特征在于，所述产品为药物，所述纳米阿胶的制备方法包括以下步骤：
将阿胶粉碎后溶解于水中，进行水热反应，反应液冷却后离心，使用0.22 μm聚醚砜滤针式膜过滤，干燥，获得所述纳米阿胶。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，阿胶溶解于水中的比例为1g:40-60 mL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水热反应的温度为190-210 ℃，时间为11-13 h。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述离心的转速为9000-11000 rpm，时间为9-11 min。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括静脉注射或口服。
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