TWI828062B - 用於生產外泌體的方法及其所製得的外泌體暨其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於生產外泌體的方法，其包括：將禽類胚胎間質幹細胞(AMSCs)培養於一含有2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)的培養基中，而得到AMSCs的細胞培養物；以及自該細胞培養物中收取外泌體。本發明亦揭示由上述方法所製得的外泌體可被用來改善皮膚病況。

Description

用於生產外泌體的方法及其所製得的外泌體暨其應用
本發明是有關於一種用於生產外泌體(exosomes)的方法，其包括：將禽類胚胎間質幹細胞(Avian embryo mesenchymal stem cells, AMSCs)培養於一含有2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)的培養基中，而得到AMSCs的細胞培養物；以及自該細胞培養物中收取外泌體。本發明亦有關於使用該外泌體來改善皮膚病況(skin condition)。
外泌體(exosomes)是由細胞所分泌出的一種奈米級囊泡(nanosized vesicles)，屬於胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的一種，存在於各種生物液體(biological fluids)[包括羊水(amniotic fluid)、尿液(urine)以及血液]中，其中富含蛋白質、脂質、mRNAs以及miRNAs等成分。
尺寸-選擇性分離處理(size-selective separation)[例如，過濾(filtration)、透析(dialysis)以及層析法(chromatography)]以及密度-選擇性分離處理(density-selective separation)[例如，離心(centrifugation)]皆已被用來將外泌體從幹細胞的培養物中分離出，以利外泌體的活性探討。已有研究指出，不同來源或類型的幹細胞所生產出的外泌體分別會具有不同的生物活性。例如，在Wang Y. et al. (2017), Stem Cell Res. Ther., 8:189中，Wang Y.等人發現衍生自人類胚胎幹細胞-誘導的間質幹細胞(human embryonic stem cell-induced mesenchymal stem cells)的外泌體具有緩解骨關節炎(osteoarthritis)的效用。在Kim Y.J. et al. (2017), Biochem. Biophys. Res. Commun., 493：1102-1108中，Kim Y.J.等人發現衍生自人類臍帶血間質幹細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells)的外泌體具有促進皮膚回春(skin rejuvenation)的效用。
就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經將2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)[其是一種存在於何首烏( Polygonum multiflorum)中之屬於多羥基二苯乙烯類(polyhydroxystilbene group)的活性成分]以及禽類胚胎間質幹細胞(Avian embryo mesenchymal stem cells, AMSCs)應用外泌體的生產。
發明概要
於本發明中，申請人發現，使用2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)來培養禽類胚胎間質幹細胞(Avian embryo mesenchymal stem cells, AMSCs)能夠有效地促進AMSCs細胞生產出大量且含有較多成分種類(包括蛋白質與RNA)的外泌體，且其能夠有效地促進皮膚再生(skin regeneration)與傷口癒合(wound healing)、減少皮膚皺紋(skin wrinkles)、改善掉髮(hair loss)以及抗皮膚發炎(skin inflammation)，因而被預期能夠應用於改善各種皮膚病況(skin condition)。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於生產外泌體的方法，其包括： 將禽類胚胎間質幹細胞(AMSCs)培養於一含有2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)的培養基中，而得到AMSCs的細胞培養物；以及 自該細胞培養物中收取外泌體。
在第二個方面，本發明提供一種外泌體，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
在第三個方面，本發明提供一種如上所述的外泌體供應用於製備一用來改善皮膚病況之組成物的用途。
在第四個方面，本發明提供一種用於改善皮膚病況的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的外泌體。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種用於生產外泌體(exosomes)的方法，其包括： 將禽類胚胎間質幹細胞(Avian embryo mesenchymal stem cells, AMSCs)培養於一含有2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)的培養基中，而得到AMSCs的細胞培養物；以及 自該細胞培養物中收取外泌體。
較佳地，由上述方法所製得的外泌體的含量可在1×10 8顆/mg以上，更佳地，在1×10 9至1×10 10顆/mg的範圍內。在某些具體例中，該外泌體的含量為5.08×10 9顆/mg。
依據本發明，AMSCs細胞可具有8.3×10 7至8.3×10 9內的數量。較佳地，AMSCs細胞具有一為1×10 8的數量。
依據本發明，該培養基可包含有濃度範圍落在0.1至50 µM內的THSG。在某些具體例中，該培養基包含有25 μM的THSG。
依據本發明，THSG可利用本技藝中所慣用的分離純化方法而從何首烏( Polygonum multiflorum)中被分離純化出來。在此方面，可以參考，例如，Tsai P.W. et al. (2018), Molecules, 23(3)：571。
另擇地，THSG可得自於商業上可購得的產品，例如，購自於成都普瑞法科技開發有限公司(Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.)的產品何首烏苷(二苯乙烯苷)(貨號為BP0039)。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。有關培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如，Gao Y. et al. (2013), Biomed. Res. Int., doi: 10.1155/2013/626258。
依據本發明，該培養可在一範圍落在36℃至37℃內的溫度下被進行。在某些具體例中，該培養是在37℃下被進行。
依據本發明，該培養可被進行歷時24至96小時。在某些具體例中，該培養被進行歷時36小時。
依據本發明，該分離處理的操作程序與參數條件可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參考，例如，Wang Y. et al. (2017)(同上述)。
依據本發明，該外泌體可藉由尺寸-選擇性(size-selective)或密度-選擇性(density-selective)的分離處理而被收取。
較佳地，該尺寸-選擇性分離處理(size-selective separation)可選自於由下列所構成的群組：過濾(filtration)[例如，超過濾(ultrafiltration)以及切向流過濾(tangential flow filtration, TFF)]、透析(dialysis)[例如，透濾法(diafiltration)]以及層析法(chromatography)[例如，尺寸-排除層析法(size-exclusion chromatography, SEC)]，以及它們的組合。
較佳地，該密度-選擇性分離處理(density-selective separation)可選自於由下列所構成之群組中的離心處理(centrifugation)：超高速離心(ultracentrifugation)以及密度梯度離心(density gradient centrifugation)。
在某些具體例中，該分離處理是切向流過濾(TFF)以及尺寸-排除層析法(SEC)的組合。
較佳地，TFF可使用100至500 kDa的分子量截斷值(molecular weight cut-off value)。在某些具體例中，TFF是使用500 kDa的分子量截斷值。
較佳地，TFF可在50至200 mL/分鐘的轉速下被進行。在某些具體例中，TFF是在80至120 mL/分鐘的轉速下被進行。
較佳地，SEC可在15至25℃的管柱溫度下被進行。在在某些具體例中，SEC是在25℃的管柱溫度下被進行。
本發明亦提供一種外泌體，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
依據本發明，該外泌體的粒徑範圍是落在50至245 nm內。較佳地，落在50至150 nm內。
依據本發明，該外泌體具有一範圍落在50至100 nm內的平均粒徑。在某些具體例中，該外泌體的平均粒徑為72 nm。
依據本發明，該外泌體可進一步進行一選自於下列的乾燥處理而呈粉末狀：冷凍-乾燥(freeze-drying)、噴霧乾燥(spray-drying)、真空乾燥(vacuum drying)以及流化床乾燥(fluid bed drying)。在某些具體例中，該外泌體被進行冷凍-乾燥。
此外，本發明亦提供一種如上所述的外泌體供應用於製備一用來改善皮膚病況(skin condition)之組成物的用途。
依據本發明，該皮膚病況包括下列至少一者：傷口(wound)、老化(aging)、掉髮(hair loss)以及發炎(inflammation)。
如本文中所使用的，術語“老化”意欲涵蓋自然發生的內在皮膚老化(intrinsic skin aging)，以及由環境因素(特別是紫外線的照射)所引起的外在皮膚老化(extrinsic skin aging)。皮膚老化的症狀包括，但不限於：毛細血管擴張(telangiectasia)、表皮變薄、皮膚萎縮(skin atrophy)、膠原纖維(collagen fiber)與彈性纖維(elastic fiber)的減少、彈性組織變性(elastosis)、皮膚彈性(skin elasticity)變差、皮膚質地(skin texture)變粗糙、乾燥(dryness)、皺紋產生(wrinkle formation)以及色素改變(pigmentary change)[例如，雀斑(lentigines)、斑點(freckles)、色素過少(hypopigmentation)或色素過多(hyperpigmentation)]等。
依據本發明，該組成物是一藥妝品組成物(cosmeceutical composition)。
依據本發明，該藥妝品組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑(gelling agent)、活性劑(active agent)、抗氧化劑(antioxidant)、遮蔽劑(screening agent)、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料(fragrances)以及氣味吸收劑(odor absorbers)。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥妝品組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、面膜(mask)、貼片(patch)、貼布(pack)、繃帶(bandage)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、分散液(dispersion)、懸浮液(suspension)、滴劑(drop)、慕斯(mousse)、油膏(salve)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)以及眼影(eyeshadow)等。
依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)或口服投藥(oral administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥的劑型[包括注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液]，且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
本發明亦提供一種用於改善皮膚病況的方法，其包括對一有此需要的個體投予(administering)一如上所述的外泌體。
如本文中所使用的，術語“投予”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該外泌體的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的病況之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.  在下面的實施例中所使用的2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, THSG)是參考Tsai P.W. et al. (2018)(同上述)來進行分離與純化而被製得。 2.  幹細胞的來源：
在下面的實施例中所使用的禽類胚胎間質幹細胞(Avian embryo mesenchymal stem cells, AMSCs)以及人類牙髓幹細胞(Human dental pulp stem cells, DPSCs)分別是參考Gao Y. et al. (2013)(同上述)以及Lin C.Y. et al. (2019), J. Endod., 45：435-441而被分離出。 3.  人類皮膚纖維母細胞(Human skin fibroblast, HSFs)的來源與培養：
在下面的實施例中所使用的HSFs細胞(BCRC 08C0011)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。HSFs細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(Corning ®, Cat. No. 10-017-CM)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/mL盤尼西林(penicillin)以及100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)]的75T培養瓶(75T flask)中，並在培養條件設定為37℃、5% CO 2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，進行細胞繼代培養(subculture)。 4.  人類毛囊真皮乳突細胞(Human follicle dermal papilla cells, HFDPCs)：
在下面的實施例中所使用的HFDPCs細胞是購自於PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)(Cat. No. C-12071)。HFDPCs細胞被培養於含有毛囊真皮乳突細胞生長培養基(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium, FDPCGM)(PromoCell GmbH, Cat. No. C-26501)[添加有1%生長培養基補充混合物(Growth Medium SupplementMix)(PromoCell GmbH, Cat. No. C-39625)、100 U/mL盤尼西林以及100 μg/mL鏈黴素]的75T培養瓶中，並在培養條件設定為37℃、5% CO 2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚時，進行細胞繼代培養。 一般實驗方法： 1.  統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有數據是採用IBM ®SPSS ®Statistics version 19.0 (SPSS Inc., IL, USA)來進行統計分析，並藉由雙尾史徒登氏t-試驗(two-tailed Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 添加 THSG 對於禽類胚胎間質幹細胞 (AMSCs) 在生產外泌體 (exosomes) 上的影響 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項當中所得到的AMSCs細胞分成1個對照組以及1個實驗組。將各組的AMSCs細胞以一為5×10 6細胞/井的數量培養於含有5 mL的DMEM培養基(添加有2.5% FBS)的10-cm培養皿中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時48小時。
接著，將各組的細胞培養物(細胞數量約為1×10 8)分別更換以含有THSG的DMEM培養基，而使得各組具有一最終濃度為25 μM的THSG，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中繼續進行培養歷時36小時，繼而收取各組的培養上澄液。
之後，將所有收集到之各組的培養上澄液拿來進行下面的前處理：以1,000 g來進行離心歷時10分鐘以移除沉澱物，並重複進行1次，然後以0.22 μm的濾杯予以過濾。
接著，對所得到之各組經前處理的培養上澄液進行切向流過濾(tangential flow filtration, TFF)，藉此而得到各組的TFF濾液。TFF所使用的儀器為微型切向流過濾系統(mini tangential flow filtration system)，其配備有幫浦(轉速為80-120 mL/分鐘)，並具有500 kDa之改良的聚醚碸(modified polyethersulfone, mPES)的中空纖維膜模組(hollow fiber filter modules)。
接著，各組的TFF濾液以無菌過濾杯予以過濾，收集各組的濾液並藉由尺寸-排除層析法(size-exclusion chromatography, SEC)來進行外泌體的分離。有關SEC所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為SEC qEV管柱；洗提液(eluent)為磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)；以及管柱溫度為室溫(25℃)。之後，所得到的洗出物(eluate)被拿來進行冷凍乾燥，藉此而得到本發明呈乾燥粉末(dried powder)的外泌體(下稱本發明外泌體)。
另外，未經THSG處理的AMSCs細胞的培養上澄液亦被拿來進行相同的TFF與SEC以及冷凍乾燥以獲得外泌體(下稱對照外泌體)。 實施例 2. 本發明外泌體的成分分析
藉由外泌體蛋白質(exosomal protein)與外泌體RNA (exosomal RNA)濃度的測定來對本發明外泌體以及對照外泌體進行成分分析與比較。 實驗方法： A、 外泌體蛋白質濃度的測定：
上面實施例1所得到的兩種外泌體之外泌體蛋白質濃度的測定是藉由各取100 mg並分別溶解於RIPA溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)中，繼而依據製造商的操作指南使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組並以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(0-250 μg/mL)作為標準品來進行。 B、 外泌體 RNA 濃度的測定：
上面實施例1所得到的兩種外泌體之外泌體RNA濃度的測定是藉由各取100 mg並依據製造商的操作指南使用qEV RNA萃取套組來進行。 結果： A、 外泌體蛋白質濃度的測定：
圖1顯示依據本發明的方法與習知方法所得到的外泌體蛋白質濃度。從圖1可見，本發明外泌體中的蛋白質濃度是顯著高於對照外泌體所具者。 B、 外泌體 RNA 濃度的測定：
圖2顯示依據本發明的方法與習知方法所得到的外泌體RNA濃度。從圖2可見，本發明外泌體中的RNA濃度是顯著高於對照外泌體所具者。 實施例 3. 添加 THSG 對於不同幹細胞在生產外泌體上的影響
為了評估THSG對於不同幹細胞在生產外泌體上之效用的影響，申請人另選用了人類牙髓幹細胞(DPSCs)來進行試驗。 實驗方法：
首先，依照上面實施例1當中所述的方法來對依據上面“一般實驗材料”的第2項當中所得到的DPSCs細胞進行THSG的處理、外泌體的分離以及冷凍乾燥，藉此而得到衍生自DPSCs細胞的外泌體(下稱對照外泌體’)。
接著，將對照外泌體’以及上面實施例1所得到的本發明外泌體各取18 mg並分別懸浮於蒸餾水中，繼而使用一qNano平台(qNano platform)(Izon Science Ltd.)來進行可調式電阻脈衝感應(tunable resistive pulse sensing, TRPS)，俾以測得這兩種外泌體的含量與粒徑。 結果：
下面表1顯示各種外泌體的含量與粒徑。從表1可見，相較於使用THSG來處理DPSCs細胞，使用THSG來處理AMSCs細胞能夠生產出明顯較多的外泌體，特別地，本發明還額外具有粒徑小於76 nm的外泌體。而就平均粒徑來看，本發明外泌體的平均粒徑是明顯小於對照外泌體’所具者。這個實驗結果顯示：依據本發明的方法能夠得到較多且粒徑又較小的外泌體。 表1. 各種外泌體的含量與粒徑
  本發明外泌體 對照外泌體’
含量(顆/mg) 5.08×10 9 4.16×10 7
粒徑範圍(nm) 53-245 76-436
平均粒徑(nm) 72 102
實施例 4. 本發明外泌體的抗皺效用 (anti-wrinkle effect) 的評估
於本實施例中，申請人使用本發明外泌體來對HSFs細胞進行處理，並觀察細胞中的第I型膠原蛋白α1 (collagen type I α1, COL1A1)、第III型膠原蛋白α1 (collagen type III α1, COL3A1)以及彈性蛋白(elastin, ELN)的表現情形，俾以評估本發明外泌體的抗皺效用。 實驗材料： 1.  製備具有不同濃度的外泌體懸浮液：
將適量之依據上面實施例1所得到的本發明外泌體懸浮於無菌超純水中並以無菌超純水來進行稀釋，藉此而得到具有不同濃度(分別為0.07、0.7以及70 μg/mL)的外泌體懸浮液。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的HSFs細胞分成1個對照組以及3個實驗組(亦即實驗組1至3)。將各組的HSFs細胞以一為1×10 5細胞/井的數量分別培養於每井含有2 mL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的6-井培養盤中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將各個實驗組的培養基分別更換以含有10 mL之依據上面“實驗材料”的第1項所製得的外泌體懸浮液(濃度分別為0.07、0.7以及70 μg/mL)的DMEM培養基[添加有0.25%木炭剝離的胎牛血清(Charcoal stripped fetal bovine serum, CS-FBS)(Thermo Fisher Scientific Inc, Cat. No. 12676029)]，其中實驗組1至3的DMEM培養基中所含有的外泌體懸浮液的濃度分別為0.07、0.7以及70 μg/mL。至於對照組的培養基則被更換以不含有外泌體懸浮液的DMEM培養基。
各組在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時48小時之後，將所形成的細胞培養物以5,000 rpm來進行離心歷時5分鐘，繼而收取所形成的細胞沉澱物並使用定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)來分析HSFs細胞中的COL1A1、COL3A1以及ELN基因的表現位準。
有關qRT-PCR的步驟如下：首先，取適量之各組的細胞沉澱物，繼而使用GENEzol™ TriRNA純化套組並依據製造商所提供的操作指南來進行總RNAs (total RNAs)的萃取。將所得到的總RNAs以RevertAid H Minus第一股cDNA合成套組並依據製造商所提供的操作指南來進行反轉錄反應(reverse transcription reaction)，以合成第一股cDNA (first-strand cDNA)。
接著，以所得到的第一股cDNA作為模板(template)，並分別以下面表2所示之COL1A1、COL3A1以及ELN基因的引子對，使用一CFX Connect™即時PCR偵測系統並依據製造商的操作指南來進行qRT-PCR。另外，18s的基因表現被使用作為內部對照組(internal control)。有關qRT-PCR的操作條件與反應條件被顯示於下面的表3中。 表2. 被用來進行qRT-PCR的引子
標的基因 NCBI登錄編號 引子 核苷酸序列 (5’→3’)
COL1A1 NM_000088.4 前向引子 COL1A1-F gtcagatgggcccccg (序列辨識編號：1)
反向引子 COL1A1-R caccatcatttccacgagca (序列辨識編號：2)
COL3A1 NM_000090 前向引子 COL3A1-F gaggatggttgcacgaaacac (序列辨識編號：3)
反向引子 COL3A1-R cagccttgcgtgttcgatatt (序列辨識編號：4)
ELN M36860 前向引子 ELN-F caggtgcggtggttcctc (序列辨識編號：5)
反向引子 ELN-R ctgggtatacacctggcagc (序列辨識編號：6)
18s NR_003286 前向引子 18s-F gtaacccgttgaaccccatt (序列辨識編號：7)
反向引子 18s-R ccatccaatcggtagtagcg (序列辨識編號：8)
表3. qRT-PCR的反應條件
內容物 體積(µL)
第一股cDNA (0.1 µg/µL) 2
前向引子(100 nM) 1
反向引子(100 nM) 1
2X QuantiNova TMSYBR ®Green PCR Master Mix預混合試劑(QIAGEN) 10
無菌水 6
操作條件：在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時5分鐘；接而進行40個循環如下：在95℃下進行變性反應歷時5秒、在60℃下進行引子黏合(primer annealing)與延伸反應(extension)歷時10秒。
由此所得到的各個PCR產物是以SYBR Green (雙股DNA結合染料)的螢光(fluorescence)來進行偵測，而分別得到各個PCR產物的循環閾值[cycle threshold ( C t) value]。相對的mRNA表現位準(relative mRNA expression level)是從各個PCR產物的循環閾值被計算出，並且使用比較性 C t方法(comparative C tmethod)而以18s基因所得到的PCR產物的循環閾值來予以標準化。接著，各個實驗組的COL1A1、COL3A1以及ELN基因的表現位準以相對於對照組所具者的倍數被計算出。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖3至圖5分別顯示在各組HSFs細胞中所測得之COL1A1、COL3A1以及ELN基因的表現位準。從圖3至圖5可見，與對照組相較之下，各個實驗組的COL1A1、COL3A1以及ELN基因的表現位準皆有顯著的升高，並且會隨著外泌體濃度的增加而更趨於明顯。這個實驗結果顯示：本發明外泌體以一劑量-依賴性的方式來促進皮膚纖維母細胞分泌膠原蛋白與彈性蛋白。申請人據此而認為：依據本發明的方法所得到的外泌體能夠藉由促進皮膚纖維母細胞分泌膠原蛋白與彈性蛋白來達到抗皺的效用。 實施例 5. 本發明外泌體在促進皮膚再生 (skin regeneration) 上的效用評估
於本實施例中，申請人藉由皮膚纖維母細胞的增生情形來評估本發明外泌體在促進皮膚再生上的效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的HSFs細胞分成1個對照組以及1個實驗組。將各組的HSFs細胞以一為5×10 3細胞/井的數量分別培養於每井含有100 μL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的96-井培養盤中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將實驗組的培養基更換以含有100 μL之依據上面實施例4的“實驗材料”的第1項所製得的外泌體懸浮液(濃度為70 μg/mL)的DMEM培養基(添加有0.25% CS-FBS)。至於對照組的培養基則被更換以不含有外泌體懸浮液的DMEM培養基。
各組在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時72小時之後，更換以含有20% MTS溶液(CellTiter 96 ®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit)的生長培養基(growth media)並予以培養歷時2小時。之後，於490 nm的波長下以一VersaMax ELISA微量盤讀取機來讀取各井的吸光值(OD 490)。
細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD 490)代入下列公式(1)而被計算出： 公式 (1) ： A=( B/C) ×100其中：A=細胞可活性百分比(%) B=各組所測得的OD 490吸光值 C=對照組所測得的OD 490吸光值
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖6顯示HSFs細胞在以本發明外泌體予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖6可見，與對照組相較之下，實驗組的細胞可活性百分比有顯著的增加。這個實驗結果顯示：本發明外泌體可以促進皮膚纖維母細胞的增生。申請人據此而認為：依據本發明的方法所得到的外泌體能夠藉由促進皮膚纖維母細胞的增生來達到促進皮膚再生的效用。 實施例 6. 本發明外泌體在促進傷口癒合 (wound healing) 上的效用評估
於本實施例中，申請人利用傷口癒合的細胞移動分析(wound-healing cell migration assay)來評估本發明外泌體在促進傷口癒合上的效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的HSFs細胞分成1個對照組以及1個實驗組。將各組的HSFs細胞以一為2.5×10 5細胞/井的數量分別培養於每井含有500 μL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的24-井培養盤中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的培養基更換以不含有血清的新鮮的DMEM培養基，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時之後，使用無菌的鑷子沿著各井直徑來刮除HSFs細胞，以沿著該培養盤的直徑產生一無細胞貼附且寬度約為500 μm的傷口區域(wound area)。接著，將實驗組的培養基更換以含有500 μL之依據上面實施例4的“實驗材料”的第1項所製得的外泌體懸浮液(濃度為70 μg/mL)的DMEM培養基(添加有0.25% CS-FBS)。至於對照組的培養基則被更換以不含有外泌體懸浮液的DMEM培養基。
之後，各組在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。在進行培養之前以及在開始培養之後的第24小時，使用一倒立顯微鏡(型號為CKX53，廠牌為OLYMPUS)並在一為40倍的放大倍數下來對各組的傷口區域進行觀察，並且使用一數位相機(型號為EP50，廠牌為OLYMPUS)來進行拍照。 結果：
圖7顯示HSFs細胞在以本發明外泌體予以處理後經由傷口癒合的細胞移動分析所觀察到的結果。從圖7可見，與對照組相較之下，在實驗組中可以明顯地觀察到有傷口閉合的情形。這個實驗結果顯示：本發明外泌體能夠有效地促進纖維母細胞-媒介的傷口閉合(fibroblast-mediated wound closure)。申請人據此而認為：依據本發明的方法所得到的外泌體能夠藉由促進纖維母細胞-媒介的傷口閉合來達到促進傷口癒合的效用。 實施例 7. 本發明外泌體在改善 掉髮 (hair loss) 上的效用評估
於本實施例中，申請人藉由毛囊真皮乳突細胞的增生情形來評估本發明外泌體在改善掉髮上的效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第4項來進行繼代培養的HFDPCs細胞分成1個對照組以及1個實驗組。將各組的HFDPCs細胞以一為5×10 3細胞/井的數量分別培養於每井含有100 μL的FDPCGM培養基(添加有1%生長培養基補充混合物)的96-井培養盤中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將實驗組的培養基更換以含有100 μL之依據上面實施例4的“實驗材料”的第1項所製得的外泌體懸浮液(濃度為70 μg/mL)的FDPCGM培養基(未添加1%生長培養基補充混合物)。至於對照組的培養基則被更換以不含有外泌體懸浮液的FDPCGM培養基。
各組在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時96小時之後，更換以含有20% MTS溶液的生長培養基並予以培養歷時2小時。之後，於490 nm的波長下以VersaMax ELISA微量盤讀取機來讀取各井的吸光值(OD 490)。接著，將所測得的吸光值(OD 490)代入上面公式(1)來計算出細胞可活性百分比(%)。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖8顯示HFDPCs細胞在以本發明外泌體予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖8可見，與對照組相較之下，實驗組的細胞可活性百分比有顯著的增加。這個實驗結果顯示：本發明外泌體可以促進毛囊真皮乳突細胞的增生。申請人據此而認為：依據本發明的方法所得到的外泌體能夠藉由促進毛囊再生(hair follicle regeneration)來達到改善掉髮的效用。 實施例 8. 本發明外泌體的抗發炎效用 (anti-inflammatory effect) 的評估
於本實施例中，申請人使用本發明外泌體來對帶有脂多醣(lipopolysaccharides, LPS)-誘發的皮膚發炎的HSFs細胞進行處理，並觀察細胞中的促發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)[諸如介白素-6 (interleukin-6, IL-6)、IL-1β以及腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)]的表現情形，俾以評估本發明外泌體的抗發炎效用。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的HSFs細胞分成1個正常對照組、1個病理對照組以及1個實驗組。將各組的HSFs細胞以一為1×10 5細胞/井的數量分別培養於每井含有2 mL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的6-井培養盤中，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將實驗組的培養基更換以含有1 μg/mL LPS [大腸桿菌( Escherichia coli)血清型(serotype) 0111:B4，Sigma]以及1 mL之依據上面實施例4的“實驗材料”的第1項所製得的外泌體懸浮液(濃度為0.07 μg/mL)的DMEM培養基(添加有0.25% CS-FBS)。至於病理對照組的培養基則被更換以含有1 μg/mL LPS但不含有外泌體懸浮液的DMEM培養基，以及正常對照組的培養基被更換以不含有LPS與外泌體懸浮液的DMEM培養基。
各組在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時6小時之後，大體上依照上面實施例4當中所述的方法來進行各組細胞沉澱物的收取以及定量即時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，並分別計算出病理對照組與實驗組的IL-6、IL-1β以及TNF-α基因的表現位準相對於正常對照組所具者的倍數，不同之處在於：各組細胞沉澱物是針對IL-6、IL-1β以及TNF-α來進行qRT-PCR，而所使用的引子對被顯示在下面表4中。 表4. 被用來進行qRT-PCR的引子
標的基因 NCBI登錄編號 引子 核苷酸序列 (5’→3’)
IL-6 M54894.1 前向引子 IL-6-F acccccaggagaagattcca (序列辨識編號：9)
反向引子 IL-6-R gatgccgtcgaggatgtacc (序列辨識編號：10)
IL-1β NM_000576.2 前向引子 IL-1β-F gcagccatggcagaagtacc (序列辨識編號：11)
反向引子 IL-1β-R agtcatcctcattgccactgtaat (序列辨識編號：12)
TNF-α NM_000594.3 前向引子 TNF-α-F tagcccatgttgtagcaaaccc (序列辨識編號：13)
反向引子 TNF-α-R ttatctctcagctccacgcca (序列辨識編號：14)
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖9至圖11分別顯示在各組HSFs細胞中所測得之IL-6、IL-1β以及TNF-α基因的表現位準。從圖9至圖11可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IL-6、IL-1β以及TNF-α基因的表現位準皆有顯著的升高，這表示LPS成功地誘發HSFs細胞產生發炎。而與病理對照組相較之下，實驗組的IL-6、IL-1β以及TNF-α基因的表現位準皆有顯著的下降。這個實驗結果顯示：本發明外泌體能夠有效地抑制促發炎細胞激素的表現。申請人據此而認為：依據本發明的方法所得到的外泌體能夠藉由抑制促發炎細胞激素的表現來達到抗發炎的效用。
綜合以上各項實驗結果可知，本發明的方法能夠有效地促進禽類胚胎間質幹細胞(AMSCs)生產出大量且含有較多成分種類(包括蛋白質與RNA)的外泌體，且其在促進皮膚再生與傷口癒合、減少皮膚皺紋、改善掉髮以及抗皮膚發炎上皆能展現優異效用。因此，申請人認為：依據本發明的方法所得到的外泌體具有發展成為改善皮膚病況(skin condition)(包括傷口、老化、掉髮以及發炎)的產品之高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示依據本發明的方法與習知方法所得到的外泌體蛋白質濃度，其中“*”表示：當與對照外泌體作比較， p＜0.05； 圖2顯示依據本發明的方法與習知方法所得到的外泌體RNA濃度，其中“***”表示：當與對照外泌體作比較， p＜0.001； 圖3至圖5分別顯示在各組HSFs細胞中所測得之COL1A1、COL3A1以及ELN基因的表現位準，其中對照組表示未經任何處理的細胞；實驗組1至3分別表示被處理以不同濃度(亦即0.07、0.7以及70 μg/mL)之外泌體懸浮液的細胞；以及“***”表示：當與對照組作比較， p＜0.001； 圖6顯示HSFs細胞在以本發明外泌體予以處理後所測得的細胞可活性百分比，其中對照組表示未經任何處理的細胞；實驗組表示被處理以70 μg/mL之外泌體懸浮液的細胞；以及“***”表示：當與對照組作比較， p＜0.001； 圖7顯示HSFs細胞在以本發明外泌體予以處理後經由傷口癒合的細胞移動分析所觀察到的結果，其中對照組表示未經任何處理的細胞；以及實驗組表示被處理以70 μg/mL之外泌體懸浮液的細胞； 圖8顯示HFDPCs細胞在以本發明外泌體予以處理後所測得的細胞可活性百分比，其中對照組表示未經任何處理的細胞；實驗組表示被處理以70 μg/mL之外泌體懸浮液的細胞；以及“***”表示：當與對照組作比較， p＜0.001；以及 圖9至圖11分別顯示在各組HSFs細胞中所測得之IL-6、IL-1β以及TNF-α基因的表現位準，其中正常對照組表示未經任何處理的細胞；病理對照組表示被處理以1 μg/mL脂多醣(lipopolysaccharides, LPS)的細胞；實驗組表示被處理以1 μg/mL LPS以及0.07 μg/mL之外泌體懸浮液的細胞；“***”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.001；以及“###”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.001。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (11)

  1. 一種用於生產外泌體的方法，其包括：將禽類胚胎間質幹細胞(AMSCs)培養於一含有0.1至50μM的2,3,4',5-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,4',5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,THSG)的培養基中，而得到AMSCs的細胞培養物；以及自該細胞培養物中收取外泌體。
  2. 如請求項1的方法，其中該培養被進行歷時24至96小時。
  3. 如請求項1的方法，其中該外泌體是藉由尺寸-選擇性(size-selective)的分離處理而被收取。
  4. 如請求項3的方法，其中該分離處理是切向流過濾以及尺寸-排除層析法的組合。
  5. 一種外泌體，它是藉由一如請求項1至4中任一項的方法而被製得，其中該外泌體具有一範圍落在50至200nm內的粒徑。
  6. 如請求項5的外泌體，其具有一範圍落在50至100nm內的平均粒徑。
  7. 一種如請求項5至6中任一項的外泌體供應用於製備一用來改善皮膚病況之組成物的用途。
  8. 如請求項7的用途，其中，該皮膚病況包括下列至少一者：傷口、老化、掉髮以及發炎。
  9. 如請求項7至8中任一項的用途，其中該組成物是一藥妝品組成物。
  10. 如請求項7至8中任一項的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
  11. 如請求項10的用途，其中該藥學組成物是呈一供非經腸道投藥或口服投藥的劑型。
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